DeltaFosB reguleer indirek Cck promotor aktiwiteit (2010)

Brein Res. 2010 Mei 6; 1329: 10-20.

Gepubliseer aanlyn 2010 March 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 en Colleen A. McClung2, *

Skrywer inligting ► Kopiereg en lisensie inligting ►

Die uitgewery se finale geredigeerde weergawe van hierdie artikel is beskikbaar by Brain Res

Sien ander artikels in PMC dat noem die gepubliseerde artikel.

Spring na:

Abstract

Sommige van die belangrike biochemiese, strukturele en gedragsveranderings veroorsaak deur chroniese blootstelling aan misbruikmiddels blyk te wees bemiddel deur die hoogs stabiele transkripsiefaktor ΔFosB. Vorige werk het getoon dat ΔFosB ooruitdrukking in muise vir 2 weke lei tot 'n toename in die uitdrukking van talle gene in striatum, waarvan die meeste later afgereguleer word na 8 weke van ΔFosB uitdrukking. Interessant genoeg is 'n groot aantal van hierdie gene ook opgemerk in muise wat die transkripsiefaktor CREB oordruk. Dit was egter onduidelik uit hierdie studie of korttermyn ΔFosB hierdie gene via CREB reguleer. Hier vind ons dat 2 weke van ΔFosB ooruitdrukking verhoog CREB uitdrukking in striatum, 'n effek wat verdwyn deur 8 weke. Die vroeë induksie word geassosieer met verhoogde CREB binding aan sekere teikengen promotors in hierdie brein streek. Verrassend genoeg was een gene wat 'n vermoedde CREB-teiken was gebaseer op vorige verslae, cholecystokinin (Cck), is nie deur STRB in striatum beheer nie. Om die regulering van CCK Na ΔFosB ooruitdrukking, het ons bevestig dat korttermyn ΔFosB ooruitdrukking beide toeneem CCK promotor aktiwiteit en geen-uitdrukking. Dit verhoog ook bindende aktiwiteit by 'n vermeende CREB bindingsplek (CRE) in die CCK promotor. Maar, terwyl die CRE-webwerf nodig is vir normale basale uitdrukking van CCK, dit is nie nodig vir ΔFosB induksie van CCK. Saamgestel, dui hierdie resultate aan dat, terwyl korttermyn ΔFosB induksie CREB uitdrukking en aktiwiteit by sekere geenpromotors verhoog, dit nie die enigste meganisme is waarvolgens gene onder hierdie toestande geherreguleer word nie.

sleutelwoorde: kern accumbens, transkripsie, verslawing

Spring na:

INLEIDING

Chroniese blootstelling aan misbruikmiddels veroorsaak biochemiese en strukturele veranderinge in verskeie breinstreke. Hierdie veranderinge word beskou as veranderinge in genexpressieprofiele in die mesolimbiese stelsel. Hierdie stelsel is saamgestel uit dopaminerge neurone wat uit die ventrale tegmentale area (VTA) in die middellyn tot middelpuntige neurone in die nucleus accumbens (NAc) (ventrale striatum) sowel as 'n aantal ander breinstreke projekteer. Veranderinge in die aktiwiteit van twee transkripsiefaktore, cAMP reaksie element bindende proteïen (CREB) en ΔFosB ('n Fos familie proteïen), is voorgestel om baie van die biochemiese, strukturele en gedragsveranderings wat gesien word met chroniese blootstelling aan misbruikmiddels te bemiddel nagesien deur Nestler, 2005).

CREB is 'n alomteenwoordige transkripsiefaktor wat 'n lid van die CREB / ATF-familie is. CREB homodimers bind aan variasies van 'n CRE-volgorde (konsensus: TGACGTCA) wat in die promotors van baie gene voorkom. Fosforilering van CREB (hoofsaaklik by serine 133, alhoewel ander terreine geïdentifiseer is) kan gestimuleer word deur verskeie signaleringskaskade, insluitend dié wat stroomaf is van dopamienreseptore (Cole et al., 1995). By fosforilering by serine 133 werf CREB die mede-aktiveerder CREB bindende proteïen (CBP) of verwante proteïene wat lei tot verhoogde gene-uitdrukking (hersien deur Johannessen et al., 2004). Chroniese blootstelling aan opiaat- of psigostimulerende middels van mishandeling veroorsaak oorgangsverhogings in CREB-aktiwiteit in die kernklem (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), 'n aanpassing het gedink om die beloonende eienskappe van hierdie middels te verminder en om by te dra tot die negatiewe emosionele toestand van dwelmonttrekking (Nestler, 2005).

LOnvergeetlike aanpassings aan dwelmmiddels word vermoedelik gedeeltelik bemiddel deur ΔFosB, 'n hoogs stabiele splitsingsvariant van FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Fos-familielede dimeriseer met lede van die Jun-familie om 'n aktivator-proteïen 1 (AP-1) kompleks te vorm. AP-1 transkripsiekomplekse bind aan variasies van die AP-1-responselement (konsensus: TGACTCA) om transkripsie te reguleer (hersien deur Chinenov en Kerppola, 2001). Alhoewel akute blootstelling aan dwelmmiddels lei tot die kortstondige induksie (ure) van Fos-familielede (asook verhoogde CREB-aktiwiteit), lei herhaalde geneesmiddelblootstelling tot die ophoping van die hoogs stabiele ΔFosB (Hoop et al., 1994; Perrotti et al., 2008), waarvan die uitdrukking vir weke voortduur.

Bi-transgeniese muise wat indringend ΔFosB of CREB in die volwasse striatum uitdruk, toon baie van die biochemiese en gedragsfototipes wat in herhaaldelike blootgestel word aan psigostimulante of ander dwelmmiddels. Analise van geenuitdrukkingsveranderinge in hierdie transgene diere het verskeie gene geïdentifiseer wat deur korttermyn (2 weke) ooruitdrukking van ΔFosB geïdentifiseer is, veranderings wat verband hou met 'n gepaardgaande afname in geneesmiddelbeloning. Die veranderinge in geenuitdrukking en gedragsreaksie met korttermyn ΔFosB was opvallend soortgelyk aan dié wat in diere voorkom wat CREB vir 2 of 8 weke oordruk (McClung en Nestler, 2003). In opvallende kontras het langtermyn-ooruitdrukking (8 weke) van ΔFosB die uitdrukking van baie van dieselfde gene verminder en lei tot 'n toename in dwelmbeloning (Kelz et al., 1999; McClung en Nestler, 2003).

Een gene wat in hierdie studies geïdentifiseer is, is cholesistokinien (CCK), 'n neuropeptied wat in verskeie breinstreke geproduseer word, insluitende die striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK kan dopaminerge transmissie moduleer (Vaccarino, 1992), is betrokke by dwelmbeloning en versterking (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), en word geïnduseer in die striatum deur chroniese kokaïen (Ding en Mocchetti, 1992). Daarbenewens die CCK promotor het getoon dat dit reageer op beide CREB- en AP-1-komplekse (Haun en Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Aangesien baie van die gene (insluitend CCK) wat verhoogde uitdrukking na beide CREB en korttermyn ΔFosB uitdrukking toon, was bekend of vermoed CREB-teikengenes (McClung en Nestler, 2003), wou ons bepaal of korttermyn ΔFosB uitdrukking lei tot regulering van hierdie gene (met 'n fokus op CCK) deur die regulering van CREB of deur meer komplekse meganismes van geenregulering.

Spring na:

RESULTATE

ΔFosB ooruitdrukking verhoog transbags CREB vlakke

Ons het Western blotting gebruik om te ondersoek of ΔFosB ooruitdrukking CREB proteïenvlakke in die striatum van muise verhoog. Vir hierdie studie het ons bi-transgeniese muise (lyn 11A) gebruik wat beide 'n NSE-tTA transgen en 'n TetOp-ΔFosB transgen dra. In die afwesigheid van doxycycline toon hierdie muise 'n sterk toename in ΔFosB-uitdrukking in die dynorphin-positiewe neurone in striatum (Kelz et al., 1999). Hierdie metode om ΔFosB te oorexpresseer, is breedvoerig gedokumenteer en maak voorsiening vir streekspesifieke ooruitdrukking, wat in ooreenstemming is met die ΔFosB-induksie wat gesien word in diere wat aan chroniese kokaïene blootgestel is (Hoop et al., 1994; Kelz et al., 1999). Ons het gevind dat in 11A-muise wat ΔFosB oorexpresseer, CREB proteïenvlakke aansienlik opgerig is na 2 weke van uitdrukking en hierdie vlakke het na die basislyn teruggekeer na 8 weke van uitdrukking (Figuur 1A, n = 8). Om vas te stel of die veranderinge in CREB-vlakke met korttermyn-ΔFosB-ooruitdrukking in 'n ander stelsel kan herhaal word, het ons kort voor lank ΔFosB in PC12-selle oorgedruk en gevind dat CREB-vlakke beduidend toegeneem het (p <0.05) in vergelyking met kontroles (Figuur 1B, n = 4). Hierdie resultate toon dat korttermyn ΔFosB-uitdrukking die vlakke van CREB-proteïen verhoog.

Figuur 1

Figuur 1

CREB vlakke verhoog met ΔFosB ooruitdrukking. Western blot analise van lysates van (A) muis striata van 11A muise van dox vir 2 of 8 weke of (B) PC12 selle wat ΔFosB ooruitdruk. Data in A word getoon as persentasieverandering in af dox vergeleke ...

Beide ΔFosB en CREB bind aan promotors van spesifieke teikengene in die striatum na korttermyn ΔFosB ooruitdrukking

Ons het ChIP (chromatin immunoprecipitatie) toetse van stralingweefsel gebruik om te bepaal of ΔFosB of CREB binding by sekere teikengen promotors plaasgevind het en indien hierdie binding toegeneem het na korttermyn ΔFosB ooruitdrukking. Ons het bindend by die BDNF en CCK promotors, aangesien beide gene hoogs opreguleer word na korttermyn ΔFosB ooruitdrukking, CREB ooruitdrukking of chroniese kokaïenbehandeling (McClung en Nestler, 2003). Ons het ook bindend by die CDK5 promotor, aangesien dit 'n bekende direkte teiken van ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Uiteindelik het ons bindend gemeet aan die prodynorphin promotor, aangesien vorige studies bevind het dat dit deur beide ΔFosB en CREB gebind kan word onder verskillende toestande (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP analise is uitgevoer op striata van 11A-muise wat ΔFosB vir 2 weke ooruitdruk het met behulp van teenliggaampies wat CREB of ΔFosB herken. Onder normale omstandighede het ons gevind dat ΔFosB bind aan die CDK5 en prodynorphin promotors, terwyl daar geen opspoorbare binding by die BDNF or CCK promotors (Tabel 1). Verder het ΔFosB ooruitdrukking die binding van ΔFosB by die CDK5 promotor, maar nie by die prodynorphin promotor. Ons het volgende CREB binding by hierdie promotors gemeet en gevind dat CREB bind aan die CDK5, BDNF en prodynorphin promotors, maar nie aan die CCK promotor, in normale striatum, en dat ΔFosB ooruitdrukking vir 2 weke verhoog CREB binding by die BDNF en prodynorphin promotors, maar nie die CDK5 promotor. Saam gesien, hierdie resultate toon dat ΔFosB en CREB beide kan bind tot sekere gene promotors soos prodynorphin en CDK5egter, CREB binding is spesifiek vir ander promotors soos BDNF. Verder, ΔFosB ooruitdrukking lei tot toename in ΔFosB binding by sekere promotors, soos verwag word, maar ook tot CREB binding aan spesifieke promotors, in ooreenstemming met die ΔFosB-gemedieerde CREB induksie waargeneem op hierdie tydspunt.

Tabel 1

Tabel 1

Binding van vermeende regulatoriese proteïene aan verskeie promotors in muise wat ΔFosB vir twee weke ooruitdruk.

Vorige werk het getoon dat veranderinge in geenuitdrukking veroorsaak deur langtermyn ΔFosB ooruitdrukking geassosieer word met chromatien modifikasies, veral asetilering van histon H3 by spesifieke geenpromotors (Kumar et al., 2005). Om vas te stel of dit kan reken op veranderinge in geenuitdrukking op korter termyn ΔFosB ooruitdrukking, het ons bindings gemeet aan asetileerde histoon H3 ('n histoonmodifikasie geassosieer met transkriptioneel-aktiewe chromatien), of 'n gemetileerde histoon H3 (Lys9, 'n histoonmodifikasie wat met transkripsionale inaktiewe chromatien). Ons het bevind dat ooruitdrukking van ΔFosB vir 2 weke gelei het tot geen verandering in bindings van asetileerde H3 by enige van die gene promotors wat bestudeer is nie (Tabel 1). Ons het 'n beduidende afname in die binding van gemetileerde histon H3 by die prodynorphin promotor, maar nie bindend by die CCK promotor en geen verandering in binding by die CDK5 en BDNF promotors, wat daarop dui dat dit nie 'n algemene meganisme is waarvolgens ΔFosB geneig is om kortliks die uitdrukking van die gene te reguleer nie. Ons was verbaas en was geïnteresseerd in die feit dat ons geen verskille in ons ChIP-toetse gevind het wat die toename in CCK mRNA uitdrukking in die 11A muise na 2 weke van ΔFosB uitdrukking en het besluit om hierdie meganisme verder te ondersoek.

KorttermynΔFosB styg CCK uitdrukking in verskeie stelsels

Mikrokarakterisering van bi-transgeniese 11A-muise wat ΔFosB in die striatum ooruitdruk het, het bevind dat CCK uitdrukking vlakke toeneem na 2 weke van ooruitdrukking en verminder dan geleidelik met langer periodes van ΔFosB uitdrukking (Figuur 2A, n = 3). Ons het hierdie effek vir CCK gebruik real-time PCR op 'n afsonderlike groep diere by 2 en 8 weke en het resultate op die twee tydspunte gevind wat soortgelyk is aan die microarray analise (data nie getoon nie).

Figuur 2

Figuur 2

Korttermyn-ooruitdrukking van ΔFosB styg CCK geen uitdrukking. (A) CCK mRNA uitdrukking in striatum volg ΔFosB ooruitdrukking in 11A muise vir 1, 2, 4, of 8 weke. Microarray analise is uitgevoer op striatale monsters en CCK vlakke te gebruik. ...

Om verder te ondersoek na die vermoë van ΔFosB om te reguleer CCK uitdrukking, ons het PC12 selle oorgedra transfekteer met a CCK-luciferase-verslaggewerplasmied en óf 'n ΔFosB-ekspressieplasmid of 'n gelyke hoeveelheid pCDNA. Beide twee (n = 5-9) en drie (n = 11-13) dae van ΔFosB ooruitdrukking het 'n beduidende toename in CCK-luciferase uitdrukking. Daarbenewens het drie dae van ΔFosB ooruitdrukking tot aansienlik meer gelei CCK-luciferase induksie wanneer dit vergelyk word met twee dae van oormatige ekspressie (Figuur 2B). Ooruitdrukking van ΔFosB het nie die uitdrukking van 'n promotorlose luciferase-konstruksie veroorsaak nie (data nie getoon nie). Onder geen toestande was 'n vermindering in CCK-luciferase-aktiwiteit blykbaar. Hierdie resultate toon dat korttermyn ΔFosB uitdrukking die aktiwiteit van die CCK promotor, en laat die meganisme waarlangs langtermyn ΔFosB ooruitdrukking onderdruk, ondermyn CCK uitdrukking.

ΔFosB ooruitdrukking verhoog binding op 'n vermeende CREB bindingsplek in die CCK promotor

Ons ontledings het gevind dat CCK uitdrukking word verhoog na korttermyn ΔFosB uitdrukking, maar ons ChIP toetse het bevind dat nie CREB of ΔFosB bind aan die CCK promotor. Om te bepaal of daar enige veranderinge in proteïenbinding by die CCK promotor na ΔFosB ooruitdrukking, het ons elektroforetiese mobiliteitsverskuiwingstoetse (EMSA) gebruik met 'n sonde wat die vermeende CRE-agtige webwerf teenwoordig in die CCK promotor. Met behulp van kern ekstrakte van striata van 11A muise wat ΔFosB vir 2 weke uitdruk, het ons 'n toename in binding tot die vermeende CRE-webwerf in die CCK promotor (Figuur 3 A, C, n = 4). Interessant genoeg, 11A-muise wat ΔFosB vir 8 weke uitdruk, wat 'n afname in CCK uitdrukking, het ook verhoogde binding op hierdie webwerf getoon (Figuur 3B, C, n = 4). As vergelyking ondersoek ons ​​binding aan 'n konsensus CRE-plek in muise wat ΔFosB vir 2 weke ooruitdruk het en robuuste CRE binding in striatale uittreksels gevind het, maar geen toename in binding na ΔFosB induksie nie (Figuur 3F, n = 4). Dus, ten spyte van 'n ΔFosB-geïnduceerde toename in die totale CREB-vlakke wat op hierdie tydspunt gesien is, is hierdie resultate in lyn met ons ChIP-toetse wat bevind dat verhoogde CREB binding by promotors wat ΔFosB-ooruitdrukking volg, is spesifiek vir slegs sekere gene en is nie 'n globale verskynsel nie . Om vas te stel of CREB aan die CCK promotor in ons EMSA-analise, het ons supershift-toetse met 'n CREB-spesifieke teenliggaam uitgevoer. In ooreenstemming met ons ChIP-toetse, het ons nie 'n binding van CREB tot 'n CCK sonde wat die vermeende CRE-webwerf in EMSA-toetse bevat, terwyl CREB aansienlik bind en 'n konsensus CRE-webwerf vervang het (Figuur 3D, E, n = 4). Die DNA bindende aktiwiteit by die CCK promotor is ook nie geraak deur 'n teenliggaam vir ΔFosB (data nie getoon nie) onder toestande wat in verskeie vorige studies getoon is om ΔFosB binding aan bona fide AP-1-werwe te blokkeer (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Ons het ook ChIP-toetse uitgevoer op striata van 11A-diere na 8-weke van ΔFosB-uitdrukking en vind nog steeds geen binding van CREB of ΔFosB by die CCK promotor (data nie gewys nie). Dus lei ΔFosB uitdrukking tot 'n toename in proteïenbinding by die CCK promotor na beide 2 en 8 weke van uitdrukking; Die identiteit van hierdie faktore bly egter onbekend.

Figuur 3

Figuur 3

Proteïenbinding by die CCK promotor. (A, B) Elektroforetiese mobiliteitsverskuiwingstoets met behulp van die CCK CRE-agtige webwerf met striatale weefsel van diere wat ΔFosB vir 2 weke (A) of 8 weke (B) oordruk. In (A), kompetisie met oortollige ongemerkte mededinger ...

Die vermeende CRE webwerf in die CCK promotor is nie verantwoordelik vir verhoogde promotor aktiwiteit nie

Aangesien ons 'n toename in proteïenbinding gevind het met behulp van 'n fragment van die CCK promotor, wat die vermeende CRE-webwerf bevat, na ΔFosB ooruitdrukking, wou ons bepaal of hierdie webwerf nodig is vir verhoogde CCK uitdrukking wat volg op ΔFosB ooruitdrukking. Om hierdie moontlikheid te toets, het ons PC12-selle getransfecteer met a CCK-luciferase plasmied bevat sy ongeskonde CRE-agtige webwerf of een wat 'n mutasie in die werf bevat wat enige interaksie met CREB sal afskaf. Interessant genoeg het mutasie van die CRE-agtige webwerf basaal afgeneem CCK promotor aktiwiteit deur 32% (Figuur 4A, n = 9), maar het geen invloed op die CCK promotor se induksie deur ΔFosB ooruitdrukking (Figuur 4B, n = 11-13). Dit dui daarop dat, hoewel die CCK promotor vereis 'n ongeskonde CRE-agtige webwerf vir volle basale aktiwiteit, die verhoogde promotor-aktiwiteit wat deur ΔFosB ooruitdrukking veroorsaak word, benodig nie die CRE-agtige volgorde nie.

Figuur 4

Figuur 4

Die CCK-like CRE-webwerf is nie nodig vir CCK induksie deur ΔFosB. (A) CCK-luciferase-aktiwiteit is 2 dae na transfeksie met normaal gemeet CCK-luciferase of een waarin die CRE-agtige plek gemuteer is. * p <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos bind aan die CCK promotor

Vorige studies het dit gevind CFO's mRNA toeneem met korttermyn ΔFosB uitdrukking, maar na langdurige ΔFosB uitdrukking verminder die vermoë van kokaïenbehandeling om cFos in striatum te veroorsaakMcClung en Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Daarom kan dit moontlik wees dat cFos bydra tot die toename in CCK uitdrukking na korttermyn ΔFosB uitdrukking. Ons het ChIP toetse uitgevoer met 'n teenliggaam spesifiek vir cFos en gemeet cFos bindend by die CCK promotor met en sonder korttermyn ΔFosB uitdrukking. Terwyl ons gevind het dat cFos nie aan die CCK promotor, hierdie binding het nie aansienlik toegeneem na ΔFosB ooruitdrukking (Figuur 5, n = 5). Dit dui daarop dat sedert cFos die CCK promotor, kan dit bydra tot die algemene regulering van CCK uitdrukking, maar dit is waarskynlik nie betrokke by die regulering van die CCK promotor deur ΔFosB.

Figuur 5

Figuur 5

cFos bind aan die CCK promotor. Chromatienimmunoprecipitatietoetse is uitgevoer met 'n spesifieke teenliggaam vir cFos deur gebruik te maak van stralatale weefsel van ΔFosB-ooruitdrukkende muise, ook op dox, of na 2 weke van doxverwydering. Real-time PCR analise was ...

Spring na:

BESPREKING

Hierdie studie bevestig en brei uit op vorige bevindings wat toon dat ΔFosB gene uitdrukking in die striatum reguleer en ons vind dat dit deur verskeie meganismes na korttermynuitdrukking gedoen word. Ons wys dat ΔFosB na 2 weke van oordrukking direk aan die promotors bind in sekere gene wat lei tot veranderinge in uitdrukking (di CDK5). Verder verhoog dit CREB proteïenvlakke, 'n effek waargeneem in gekweekte selle sowel as in striatum, wat lei tot verhoogde CREB binding by ander gene promotors (di dynorphin en BDNF). In 'n vorige studie het ons bevind dat korttermyn-ooruitdrukking van ΔFosB in striatum lei tot baie van die dieselfde uitdrukkings van die geenuitdrukking wat voorkom wanneer CREB ooruitdruk word, en lei tot soortgelyke gedragsresponse in maatreëls van kokaïenvoorkeur (McClung en Nestler, 2003). Dus, die huidige bevinding dat ΔFosB lei tot 'n induksie van CREB, asook die binding van CREB aan sekere geenpromotors, help om te verduidelik hoekom soveel van die geenuitdrukkingsveranderings deur hierdie twee transkripsiefaktore gedeel word.

Die induksie van CREB deur ΔFosB is interessant, aangesien dit bewys is dat dwelmmiddels veranderinge in seriene 133-gefosforileerde CREB-vlakke veroorsaak (Mattson et al., 2005) en verhoog CRE-gemedieerde transkripsie (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), sonder om algehele vlakke van CREB te verander. Dit is moontlik dat veranderinge in CREB-vlakke verbygaande is en dus maklik in ander studies gemis word. In ons hande het ons kokaïengeïnduceerde toenames in CREB mRNA in spesifieke eksperimente gesien, maar hierdie effek is hoogs veranderlike (ongepubliseerde waarneming). Aangesien beide die 11A-transgeniese muise en PC-12-selle CREB-induksie volg na korttermyn ΔFosB-ooruitdrukking, dui dit daarop dat CREB inderdaad deur ΔFosB (of 'n teiken van ΔFosB) geïnduceer word, wat nog 'n meganisme bied om dwelmgeïnduceerde veranderings in gene te verduidelik uitdrukking.

Verrassend, ons het gevind dat nie CREB of ΔFosB ook bind aan die CCK promotor alhoewel CCK uitdrukking is duidelik opreguleer na korttermyn ΔFosB uitdrukking. Cck is 'n oorvloedige neuropeptide uitgedruk in beide die VTA en NAc (Hokfelt et al., 1980) en is waarskynlik betrokke by gedragsresponse op dwelmmiddels (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). In selkultuur toetse, die CCK promotor is omvattend gekenmerk en is aangevoer om responsief te wees op CREB- en AP-1-familielede (hersien deur Hansen, 2001). Haun en Dixon (1990) het getoon dat AP-1-komplekse kan bind tot die CCK CRE-like site vitro, en dit is later getoon, met behulp van SK-N-MC neuroblastoom selle, dat die mutasie van die CRE-agtige webwerf verminderde promotorresponsiwiteit vir ooruitdrukte cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Inderdaad, ons vind ook verhoog CCK promotor aktiwiteit (Figuur 2) en bind by of om die CRE-agtige element (Figuur 3) oor ooruitdrukking van ΔFosB, 'n ander AP-1 familielid, maar ons vind geen direkte binding van ΔFosB tot die CCK promotor in vivo or vitro, selfs as dit oordruk is.

Baie werk het 'n rol vir CREB in die regulering van CCK promotor aktiwiteit. Die CCK CRE-agtige webwerf word oor gewerweldes bewaar (Hansen, 2001) en in sommige selkultuur-toetse bind beide CREB- en AP-1-komplekse aan hierdie webwerf en is nodig vir CCK promotor aktiwiteit (Haun en Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Daarbenewens het verskeie bekende aktiveerders van CCK uitdrukking (insluitend bFGF, PACAP, peptones, en depolarisasie) het getoon om op te tree via CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). ons CCK-luciferase-reporter-gene data ondersteun 'n noodsaaklike rol vir die CRE-agtige webwerf in regulering van CCK promotor aktiwiteit, aangesien mutasie van hierdie webwerf basale verminder CCK promotor aktiwiteit en CCK-luciferase-uitdrukking veroorsaak deur VP16-CREB, 'n konstitutief aktiewe vorm van CREB, is verlore wanneer hierdie webwerf gemuteer word (ongepubliseerde waarneming). Dus, ons was verbaas om te vind dat CREB nie blyk te bind tot die CCK promotor in striatale uittreksels óf by basislyn of op korttermyn ΔFosB ooruitdrukking wanneer CREB-vlakke verhoog word. Dit beweer dat vlakke van CREB per se is nie die enigste faktor in die bepaling van die hoeveelheid binding op hierdie webwerf nie, en dit word ondersteun deur die werk van ander (Cha-Molstad, et al., 2004). Sedert die promotors van ander, voorheen geïdentifiseerde CREB-teikengenes, soos BDNF en prodynorphin, het CREB verbind, ons is vol vertroue in ons bevinding dat CREB nie bindend is vir die CCK promotor in striatale kern ekstrakte. Verder, die induksie van CCK-luciferase-aktiwiteit deur ΔFosB was nie afhanklik van die ongeskonde CRE-agtige webwerf nie, wat daarop dui dat ΔFosB nie reguleer nie CCK uitdrukking deur die regstreekse binding van CREB aan die CCK promotor.

Ons onvermoë om CREB op te spoor met die CCK promotor word ondersteun deur Renthal et al. (2009), wat 'n ChIP-chip benadering gebruik het om globale veranderinge in gefosforileerde CREB (pCREB) en ΔFosB binding in striatum na chroniese kokaïen blootstelling te ondersoek. In hierdie eksperimente is DNA-proteïen-komplekse immunoprecipitated met ΔFosB- of pCREB-teenliggaampies en die geprecipiteerde DNA, na etikettering, is gehybridiseer tot 'n promotor-mikroarray. Terwyl baie voorheen gekenmerk CREB doelwit gene is geïdentifiseer met hierdie benadering (bv. BDNF, prodynorfien), CCK is nie geïdentifiseer nie. Daarbenewens is getoon dat die binding van CREB tot 'n konsensus CRE-terrein baie wissel tussen gekultiveerde sellyne (Cha-Molstad, et al., 2004). Al die vorige studies wat CREB interaksies met die CCK promotor is uitgevoer in selkultuur (nie brein waaruit ons EMSA- en ChIP-monsters afgelei is nie) en geluidsverskuiwingstoetse gebruik om proteïen-DNA-interaksies te ondersoek. Terwyl 'n EMSA die potensiaal van 'n faktor kan bepaal om aan 'n DNA-volgorde te bind, gee ChIP-toetse 'n nuwe blik op hierdie interaksies in vivo. Verder toon baie van die data of induksie van CCK promotor aktiwiteit of CREB binding aan die CCK promotor is verkry uit selle wat gestimuleer is deur faktore soos peptones (Bernard et al., 2001), depolarisasie (Hansen, et al., 2004), of 'n verskeidenheid aktiveerders van intrasellulêre seinkasse insluitende cAMP en ERK (Hansen et al., 1999). In ons eksperimente was die enigste "stimulus" wat gebruik is die ooruitdrukking van ΔFosB, wat voldoende is om te induceer CCK uitdrukking. Saamgestel, dui dit daarop dat die vermoë van CREB om te bind (en potensieel te reguleer) die CCK promotor is hoogs afhanklik van die seltipe en aktivering van spesifieke seinweë. Daarbenewens het die CCK CRE-agtige promotor element (ten minste in nie-geïnduceerde PC12 selle en in mouse striatum) is nie 'n direkte teiken van CREB of ΔFosB nie. Interessant genoeg, die regulering van FosB uitdrukking deur CREB is ook spesifiek vir seltipe en die tipe stimulasie. 'N Studie deur Andersson et al. bevind dat inspuiting van CREB antisense oligonucleotides in muisstriatum gedeeltelik die induksie van FosB volgende kokaïenadministrasie (Andersson et al., 2001). Hulle het egter ook bevind dat L-Dopa se vermoë om te induceer FosB uitdrukking in 6-OHDA-lesioned striatum is nie beïnvloed deur die teenwoordigheid van CREB antisense oligonukleotiede nie.

Aangesien CREB en ΔFosB indirek die CCK promotor, en veranderinge in chromatinstruktuur is gedokumenteer in reaksie op 'n verskeidenheid stimuli wat ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), het ons geredeneer dat ΔFosB indirek promotoraktiwiteit kan moduleer deur chromatinstruktuur te verander. In muise wat oor ΔFosB vir 2 weke uitdruk, was daar egter geen verandering in histoon H3-asetilering by die CCK promotor (Tabel 1). Dit word ondersteun deur die ChIP-chip data van Renthal et al. (2009), wat geen verandering in geaksileerde H3 binding by die CCK promotor in muise wat aan chroniese kokaïene blootgestel is. Sedert die CCK promotor is aktief in die striatum, geen repressiewe gemetileerde histoon H3 binding is verwag of waargeneem nie. Interessant genoeg het ons ook geen verandering gesien as gevolg van ΔFosB ooruitdrukking in asetileerde H3 binding by die BDNF promotor (wat verhoogde CREB binding toon) of by die CDK5 en prodynorphin promotors (wat verhoogde ΔFosB binding toon). Aangesien daar 'n magdom van histon-modifikasies is wat verband hou met veranderinge in promotoraktiwiteit (hersien deur Rando en Chang, 2009), is daar waarskynlik ander chromatin modifikasies wat verband hou met die induksie van hierdie gene. Enige enkele chromatien modifikasie, hoewel dit dikwels voorspelbaar is van die vlak van promotor aktiwiteit, mag nie verander tydens die aktivering van 'n spesifieke geen nie. In toekomstige werk sal dit interessant wees om te kyk na ander potensiële veranderinge in chromatinstruktuur rondom die CCK promotor na ΔFosB ooruitdrukking. Interessant genoeg, chroniese kokaïen (waarskynlik via ΔFosB induksie) het getoon dat die uitdrukking van sirtuin 1 en 2, klas III histoon deacetylases induuseer wat neuronale fisiologie, ERK sein en gedragsresponse op kokaïen verander (Renthal et al., 2009). Induksie van 'n histoon deacetylase sou die vermoë hê om gelyktydig die uitdrukking van 'n groot aantal gene te reguleer via globale veranderinge in chromatin struktuur.

Een moontlike kandidaat wat betrokke is by CCK regulasie na ΔFosB ooruitdrukking was die AP-1 familielid cFos. Uitdrukking van cFos word deur CREB gereguleer (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), en cFos ooruitdrukking (in ooreenstemming met ooruitdrukking van sy bindingsvennoot cJun) verhoog CCK promotor aktiwiteit (Rourke et al., 1999). Daarom, verhoogde CREB vlakke as gevolg van korttermyn ΔFosB ooruitdrukking kan cFos vlakke verhoog en lei tot verhoogde binding aan die CCK CRE-like site. CFO's mRNA word geïnduseer in muise na twee weke van ΔFosB ooruitdrukking (McClung en Nestler, 2003) en verminder in muise wat blootgestel is aan chroniese kokaïen of langtermyn ΔFosB ooruitdrukking (Renthal et al., 2008). Hier vind ons dat cFos direk verbind is met die CCK promotor in striatale weefsel, ΔFosB ooruitdrukking verhoog egter nie aansienlik bindend nie. Dit dui daarop dat terwyl cFos betrokke kan wees om te reguleer CCK uitdrukking in die algemeen, 'n verandering in binding van cFos alleen is nie waarskynlik die meganisme waardeur ΔFosB reguleer nie CCK uitdrukking. Dit is egter moontlik dat ΔFosB óf, na-translasionele veranderinge in cFos (bv. Veranderde fosforilering) kan veroorsaak óf die uitdrukking van 'n bindingsvennoot (soos cJun) of ko-aktivator proteïen veroorsaak. Aangesien die ongeskonde CRE-agtige webwerf (wat voorheen blyk te wees 'n bindende plek vir AP-1 komplekse, sien Haun en Dixon, 1990) is nie nodig vir die verhoogde CCK promotor aktiwiteit gesien met ΔFosB ooruitdrukking (soos beoordeel in ons verslaggewer gene eksperimente), is dit die rede dat ander transwerkende faktore ook deur ΔFosB gereguleer word.

Die CCK promotor fragment wat in ons luciferase-reporter-gene-eksperimente gebruik word, bevat 'n bewaarde Sp1-bindingswerf en 'n E-boks (hersien deur Hansen, 2002). In die besonder, het E-bokse opeenvolgings getoon dat dit talle transkripsiefaktore bind (hersien deur Forrest en McNamara, 2004). Met behulp van PC12 selle het ons gesien dat die mutasie van die E-boks afneem CCK promotor aktiwiteit, maar verander nie die respons van die promotor na ΔFosB (data nie getoon nie). Interessant genoeg, a CCK-luciferase-verslaggewer wat mutasies in beide die CRE-werf en E-boks bevat, het geen waarneembare basale aktiwiteit nie en reageer nie op ΔFosB ooruitdrukking (ongepubliseerde waarneming) nie. Nog 'n moontlike mediator van ΔFosB aksie op die CCK promotor is ATFs, waarvan sekere vorms in striatum geïnduceer word deur chroniese psigostimulerende blootstelling (Green et al., 2008). Ons het egter geen bewyse gevind vir ΔFosB-induksie van hierdie ATF's (data nie getoon nie), en ATF's sal nie na die gemuteerde CRE-agtige webwerf op die CCK promotor.

Een voorbehoud van hierdie studie is dat ons 'n bi-transgeniese stelsel gebruik om ΔFosB te oorexpresseer en dus moet mens konserwatief wees om parallelle tussen hierdie paradigma en die administrasie van chroniese kokaïen te teken. Die 11A-transgeniese muise bied egter die unieke geleentheid om te kyk na die spesifieke effekte van ΔFosB in die striatum, aangesien ooruitdrukking beperk is tot hierdie breingebied (Chen et al., 1998), terwyl die toediening van kokaïen veranderinge in 'n wye verskeidenheid ander breinstreke veroorsaak wat dan die striatum indirek kan beïnvloed. Verder het verskeie studies soortgelyke gedrags- en molekulêre fenotipes in die 11A-muise gedokumenteer in vergelyking met nie-transgeniese diere wat behandel word met chroniese kokaïen (Kelz et al., 1999; McClung en Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Daarbenewens Bibb et al. (2001) gerapporteer soortgelyke vlakke van striatal Cdk5 mRNA en proteïeninduksie in dieselfde 11A-stam in vergelyking met kokaïene-behandelde, nie-transgeniese rommelmaats, asook soortgelyke veranderinge in die CDK5-teikens, p35 en DARPP-32.

Ten slotte vind ons dat korttermyn ΔFosB uitdrukking lei tot die induksie van gene in die striatum deur verskeie meganismes. Dit sluit in direkte promotor binding, induksie van CREB proteïen en aktiwiteit, chromatin modifikasie, bykomend tot paaie wat nog nie bepaal moet word nie.

Spring na:

EKSPERIMENTELE PROSEDURES

diere

Manlike bi-transgeniese 11A-diere (NSE-tTA x TetOP-FosB) is in hierdie studie gebruik en word gekenmerk deur Kelz et al., 1999. Om ΔFosB te oorexpresseer, is muise tussen doxycycline tussen 3 en 6 weke oud, terwyl beheermuise op doxycycline gehandhaaf is. Alle muise is groepe gehuisves en gehandhaaf op 'n 12: 12 lig / donker siklus, ligte aan by 7 am en ligte af by 7 pm, met ad lib toegang tot kos en water. Alle muis eksperimente was in ooreenstemming met protokolle goedgekeur deur die diere sorg en gebruik komitee van die Universiteit van Texas Southwestern Medical Center in Dallas.

Reporter en ekspressie plasmiede

Die wildtipe (WT) CCK promotor-luciferase-verslaggewer is voorberei deur 'n ongeveer 200 bp PCR-fragment in die pGL3-luc-vektor (Promega) in te voeg. Hierdie fragment is verkry uit die muis genomiese DNA (primers: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' stroomop en 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' stroomaf) en aanvanklik in pGEM-T Easy vektor (Promega, #A1360) ingevoeg. Die promotor fragment is dan gekloneer in die Kpn1 / Xho1 beperking ensiem sites van pGL3-luc.

Om die CRE-puntmutasie in die CCK promotor, 'n mutagene onderlaag wat gerig is op 'n voorheen gerapporteerde CRE-agtige plek (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') is gebruik met die vervaardiging van die kitagin-kit (die gebruik van die kitagin, die gebruik van die kitagine, met behulp van die gebruik van die kitagin, is die gebruik van die kitagine met behulp van die gebruik van die kitagene, gebruik word. . Dit skakel die gerapporteerde CRE-agtige webwerf (ACTGCGTCAGC) om na ACTGAGCTCC. Alle verslaggewerplasmiede is bevestig deur DNA-volgordebepaling. Die ΔFosB-uitdrukkingsplasmied bevat 'n vollengte ΔFosB-volgorde wat in die meervoudige kloonplek van pCDNA 3.1 ingevoeg is en is voorheen beskryf (Ulery en Nestler, 2007).

Selkultuur en DNS-transfeksies

Ratfeochromocytoma (PC12) selle is in Dulbecco se aangepaste Eagle's medium F-12 gehandhaaf, aangevul met 10% perdeserum, 5% fetale bees serum en 1% penicillien / streptomisien by 37 ° C en 5% CO2. Selle is getransfekteer deur elektroporasie met behulp van 'n BTX 360-elektroporator (350V, 0 ohm en 850 μF) in 800 μL Dulbecco se fosfaatgebufferde soutoplossing in 4 mm gapingskuvette met 10 μg van die verslaggewer en 5 μg van die uitdrukkingskonstruksie. Leë vektorplasmied (pCDNA) is gebruik om totale hoeveelhede DNA te normaliseer. Na transfeksie is die selle gedurende die aangeduide tyd op 35 mm kollageen-bedekte skottelgoed gekweek.

Luciferase toetse

Twee of drie dae na transfeksie is selle 3 keer in Dulbecco se fosfaatgebufferde sout gewas, gelys (met behulp van 25 mM glisielglycin, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), versamel, en skoongemaak deur sentrifugasie. 30 μL lysaat is gekombineer met 140 μL luciferase assay buffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kaliumfosfaat, 1 mM koënsiem A, pH 7.8). Luminisensie-aktiwiteit is gemeet met behulp van 'n FLx-800 mikroplate fluorescensleser na 'n geoutomatiseerde inspuiting van 40 μL 1 mM luciferin per put. Luciferase-aktiwiteit is genormaliseer tot die totale proteïeninhoud soos bepaal deur 'n BioRad-proteïenassessering.

Elektroforetiese mobiliteitsverskuiwingstoets

Kern uittreksels uit bilaterale snye striatum van bi-transgeniese 11A-muise (wat waarby doxycycline vir 2 of 8 weke gehandhaaf word of nie) (McClung en Nestler, 2003) is voorberei volgens Huang en Walters (1996). 32P-gemerkte dubbelstrengige oligonukleotiedprobe is voorberei met behulp van die Promega Gel Shift Assay-stelsel protokol (#E3300) en probes is gesuiwer met Roche Quick Spin Columns. Die konsensus CRE en AP-1 sonde volgordes was onderskeidelik van Promega (#E328A en E320B) en die CCK CRE sekwense was (Cck-CRE sin: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Bindende reaksies en elektroforese is uitgevoer met behulp van wysigings van die Promega Gel Shift Assay stelsel prosedure (#E3300). 50,000 CPM van gemerkte sonde is gekombineer met 10 μg striatale kern ekstrak. Koue mededinger DNA of teenliggaampies is bygevoeg voor die bekendstelling van die radio-gemerkte probes. Vir supershift-eksperimente is 2 μg CREB-teenliggaampie (Upstate Biotechnology # 06-083) gebruik. Reaksies is op 4% polyakrylamidegels geelektroforeer, gedroog en aan film blootgestel (met behulp van intensiewe skerms vir 1 uur tot 2 dae).

Immunoblotting

Vir PC12-selle is 35 mm-plate getransfekteerde selle in yskoue gewas Dulbecco se fosfaatgebufferde soutoplossing en lysate is in yskoue RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoksicholaat, 1 % Triton X-100, 0.1% natriumdodecylsulfaat) wat protease-inhibeerders bevat. Na sonikasie, skoonmaak en Bradford-proteïenbepaling is lysate volledig gedenatureer en is 50 μg van elke monster elektroforeseer op 10% SDS-poliakrylamiedgels. Proteïene is oorgedra na PVDF-membraan, geblokkeer vir 1 uur in 3% nie-vet droë melk in Tris-gebufferde sout wat 0.1% Tween-20 (TBS-T-melk) bevat en oornag by 4 ° C met primêre teenliggaampies (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, gebruik om 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, gebruik om 1: 80,000) verdun in TBS-T melk. Na veelvuldige wassings in TBS-T, is vlekke een uur lank by kamertemperatuur ondersoek met behulp van alkaliese fosfatase-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies (Sigma) wat 1: 5,000 170 in TBS-T-melk verdun is. Na veelvuldige wasgoed in Tris-gebufferde soutoplossing is die kleurreaksie uitgevoer volgens die instruksies van BioRad (# 6432-XNUMX). Membraan is oornag gedroog, op 'n platskandeerder geskandeer en densitometrie met ImageJ uitgevoer (sien hieronder).

Vir striatale ekstrakte is Western blot-toetse uitgevoer soos voorheen gepubliseer (Hoop et al., 1994). Weefsel is verwyder van ontbinde muise, op ys geplaas en gesny op 'n breinmatriks teen 'n dikte van 1 mm. Weefselponsies is dan geneem en by -80 ° C gevries totdat dit gebruik word. Weefsel is sonicated op ys in 'n gewysigde wasmiddel gebaseer buffer bevat beide fosfatase en protease inhibeerders (Roche, Sigma). Na sonication is monsters gedenatureer in kookwater en gesentrifugeer by 15,000xg vir 15 minute; supernatant is daarna versamel en verwerk; proteïen konsentrasie hoeveelhede is dan gekwantifiseer met behulp van 'n Bradford-toets (Bio-Rad). Monsters is op 'n 10% akrylamied- / bisakrylamiedgel gelaai, oorgedra na 'n PVDF-membraan, geblokkeer in 5% -melk en geïnkubeer met primêre teenliggaampies (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blotte is daarna gevisualiseer met behulp van 'n chemiluminescensiestelsel (Pierce). Alle monsters is genormaliseer na GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Standaardkrommes is uitgevoer om te verseker dat ons in die lineêre reeks van die toets is.

Densitometrie analise

Vir PC12 immunoblots, is densitometrie analise uitgevoer met behulp van ImageJ met rodbard kalibrasie. Gemiddelde agtergrondsein is afgetrek van elke meting en die verhouding van CREB tot GAPDH sein is vir elke monster bereken. Vir striatale immunoblots en EMSA analise, was Scion Image 1.62c gebruik met agtergrond aftrekking.

Chromatienimmunoprecipitatie (ChIP)

ChIP toetse is uitgevoer volgens die metodes van Tsankova et al. (2004) en Kumar et al. (2005). Kortliks is bilaterale striatale monsters van 11A-muise wat op of buite doxycycline onderhou is, met 1% formaldehide gekruis en kruisbinding is met glycin geblus (finale konsentrasie van 0.125 M). Hierdie monsters is van hele breinskyfies geneem op die vlak van die kern met die korteks verwyder. Chromatien is gesny tot ongeveer 0.2 tot 1 kb fragmente via sonikasie, skoongemaak met Protein G-krale (Thermo Scientific # 22852), en invoermonsters gevries by -80 ° C. Tussen 60 en 100 μg chromatien is vir elke neerslag gebruik. 5-10 μg van elke primêre teenliggaam is gebruik (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylated H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylated H3 (LYS9): Cell Signal Technology, cFos: Santa Cruz Biotegnologie # SC-7202x). Teenliggaam-chromatienkomplekse is volgens die vervaardigingsinstruksies met proteïen G plus krale immuno-neerslaan, (Thermo Scientific # 22852). Na omgekeerde verknoping van inset- en neerslagmonsters is elke monster aan kwantitatiewe PCR (qPCR) onderwerp. Die gebruik van al hierdie teenliggaampies vir ChIP is omvattend bekragtig (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Vlakke van proteïen binding by elke geen-promotor van belang is bepaal deur die hoeveelheid geassosieerde DNA met qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA) te meet. Inset of totale DNA (nieimmunoprecipitated) en immunoprecipitated DNA is in triplicaat versterk in die teenwoordigheid van SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Ct waardes van elke monster is verkry deur die Sequence Detector 1.1 sagteware te gebruik. Relatiewe kwantifisering van template DNA is uitgevoer met behulp van die ΔΔCt metode (Tsankova et al., 2004). Primers gebruik: BDNF promotor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promotor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck-promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorfienpromotor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistiese analise

Alle data word as gemiddeld ± standaardfout van die gemiddelde aangebied. Statistiese verskil is bepaal deur die student se twee-stert t-toets (p <0.05). Wanneer meerdere vergelykings getref is, is p-waardes aangepas met behulp van Bonferroni-regstelling.

Spring na:

Bedankings

Ons wil graag Will Renthal en Arvind Kumar bedank vir nuttige besprekings. Ons wil ook NIDA bedank vir die finansiering van hierdie eksperimente.

Spring na:

voetnote

Disclaimer van die uitgewer: Hierdie is 'n PDF-lêer van 'n ongeredigeerde manuskrip wat aanvaar is vir publikasie. As 'n diens aan ons kliënte voorsien ons hierdie vroeë weergawe van die manuskrip. Die manuskrip sal kopieëring, tikwerk en hersiening van die gevolglike bewys ondergaan voordat dit in sy finale citable vorm gepubliseer word. Let asseblief daarop dat tydens die produksieproses foute ontdek kan word wat die inhoud kan beïnvloed, en alle wettige disklaimers wat van toepassing is op die tydskrif betrekking het.

Klassifikasie terme:

Afdeling: #1 Sellulêre en Molekulêre Biologie van Senuweestelsels

Spring na:

Verwysings

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP-reaksie element-bindende proteïen word benodig vir dopamien-afhanklike genexpressie in die intakte, maar nie die dopamien-gedeneerde striatum nie. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB aktiwiteit in die nucleus accumbens dop beheer gateer van gedragsresponse op emosionele stimuli. Proc Natl Acad Sci VSA A. 2002; 99: 11435-40. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokaïenbehandeling verhoog ekstrasellulêre cholecystokinien (CCK) in die nucleus accumbens dop van wakker, vry bewegende rotte, 'n effek wat verbeter word by rotte wat gedragsensitief vir kokaïen is. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones stimuleer intestinale cholecystokiniengen transkripsie via sikliese adenosien monofosfaat reaksie element-bindende faktore. Endokrinologie. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet BK, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Effekte van chroniese blootstelling aan kokaïen word deur die neuronale proteïen Cdk5 gereguleer. Aard. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Sel-tipe-spesifieke binding van die transkripsiefaktor CREB na die cAMP-responselement. Proc Natl Acad Sci VSA A. 2004; 101: 13572-7. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hoop BT, Nestler EJ. Regulering van delta FosB en FosB-agtige proteïene deur elektrokonvulsiewe aanval en kokaïenbehandelings. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgeniese diere met induceerbare, geteikende genexpressie in die brein. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Induksie van siklienafhanklike kinase 5 in die hippokampus deur chroniese elektrokonvulsiewe aanvalle: rol van ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Sluit ontmoetings van baie soorte: Fos-Jun interaksies wat transcriptie regulatoriese spesifisiteit bemiddel. Oncogeen. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronale aanpassing aan amfetamien en dopamien: molekulêre meganismes van prodynorfien-gene regulasie in ratstriatum. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Beheer van CCK-gentranskripsie deur PACAP in STC-1-selle. Am J Fisiol Gastrointest Lewerfisiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergiese regulering van cholecystokinin-mRNA-inhoud in ratstriatum. Brein Res Mol Brein Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id familie van transkripsiefaktore en vaskulêre letselvorming. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Co-vereiste van sikliese AMP- en kalsiumafhanklike proteïenkinases vir transkriptionele aktivering van cholecystokiniengeen deur proteïenhidroliseermiddels. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Induksie van aktiverende transkripsiefaktore (ATF's) ATF2, ATF3, en ATF4 in die nucleus accumbens en hul regulering van emosionele gedrag. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Oorvloei van dopamien en cholecystokinien in die ratkern kom as gevolg van akute geneesmiddeladministrasie. Sinaps. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogeen-geaktiveerde proteïenkinase en proteïenkinase A-seinweë stimuleer transkripsie van cholecystokinin via aktivering van sikliese adenosien 3 ', 5'-monofosfaat-reaksie-element-bindende proteïen. Mol Endokrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Regulering van neuronale cholecystokinien geen transkripsie. Scand J Clin Lab Belê Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Cholecystokinien geen transkripsie: promotor elemente, transkripsiefaktore en seinweë. Peptiede. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl en forskolin synergisties up-regulate cholecystokinin gene ekspressie via koördinaat aktivering van CREB en die mede-aktiveerder CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. 'N Transkripsieverbeteraar wat noodsaaklik is vir die uitdrukking van die ratkolecystokinien geen bevat 'n volgorde wat identies is aan die -296-element van die menslike c-fos-geen. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Noodsaaklike rol van die fosB-geen in molekulêre, sellulêre en gedragsaksies van chroniese elektrokonvulsiewe aanvalle. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Bewyse vir samehang van dopamien en CCK in meso-limbiese neurone. Aard. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
  25. Hoop BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Chroniese elektrokonvulsiewe beslaglegging (ECS) behandeling lei tot die uitdrukking van 'n langdurige AP-1 kompleks in die brein met veranderde samestelling en eienskappe. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
  26. Hoop BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Induksie van 'n langdurige AP-1-kompleks saamgestel uit veranderde Fos-agente proteïene in die brein deur chroniese kokaïen en ander chroniese behandelings. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Dopaminergiese regulering van AP-1 transkripsiefaktor DNA bindende aktiwiteit in ratstriatum. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definisie van die CREB-regulon: 'n genoom-wye analise van transkripsiefaktorregulerende streke. Sel. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Wat word CREB aangeskakel? Sel sein. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Teenstrydige effekte van CCK (A) en CCK (B) antagoniste op die ontwikkeling van gekondisioneerde aktiwiteit by rotte. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Bewys vir CCK (A) -receptorbetrokkenheid by die verkryging van gekondisioneerde aktiwiteit wat deur kokaïen in rotte geproduseer word. Brein Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Uitdrukking van die transkripsiefaktor deltaFosB in die brein beheer sensitiwiteit vir kokaïen. Aard. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatien remodellering is 'n belangrike meganisme onderliggend aan kokaïen-geïnduseerde plastisiteit in striatum. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hoop BT. Kokaïengeïnduceerde CREB-fosforilering in kernklemme van kokaïen-sensitiewe rotte word aangeskakel deur verhoogde aktivering van ekstrasellulêre seinverwante kinase, maar nie proteïenkinase A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Regulering van geenuitdrukking en kokaïenbeloning deur CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: 'n molekulêre skakelaar vir langtermyn aanpassing in die brein. Brein Res Mol Brein Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: 'n Molekulêre mediator van langtermyn neurale en gedragsplastisiteit. Brein Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Is daar 'n algemene molekulêre weg vir verslawing? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Transkripsionele meganismes van verslawing: rol van DeltaFosB. Philos Trans R Sos Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze ek, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Duidelike patrone van DeltaFosB induksie in die brein deur dwelms van misbruik. Sinaps. 2008; 62: 358-69. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Genoom-wye sienings van chromatinstruktuur. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HJ, 3., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB bemiddel epigenetiese desensibilisering van die c-fos-gen na chroniese amfetamienblootstelling. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genoom-wye analise van chromatienregulering deur kokaïen toon 'n rol vir sirtuins. Neuron. 2009; 62: 335-48. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinin modulasie van mesolimbiese dopamienfunksie: regulering van gemotiveerde gedrag. Farmakol toksikol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negatiewe koöperatiwiteit tussen die teenoorgestelde E-box en cAMP / TPA responsive elemente in die cholecystokinin geen promotor. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Streeks- en sellulêre kartering van CRE-gemedieerde transkripsie tydens naltreksoon-presipitêre morfien-onttrekking. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Regulering van CRE-gemedieerde transkripsie in die muisbrein deur amfetamien. Sinaps. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membraan depolarisasie en kalsium induceer c-fos transkripsie via fosforilering van transkripsiefaktor CREB. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histon-modifikasies by gene-promotorstreke in rathippokampus na akute en chroniese elektrokonvulsiewe aanvalle. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Regulering van DeltaFosB transkripsionele aktiwiteit deur Ser27 fosforilering. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nukleus verbind dopamien-CCK-interaksies in psigostimulerende beloning en verwante gedrag. Neurosci Biobehav Eerw. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: 'N noodsaaklike rol vir ΔFosB in die kern accumbens in morfinaksie. Natuur Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]