DeltaFosB induksie in orbitofrontale korteks bevorder lokomotoriese sensitiwiteit ten spyte van die vermindering van die kognitiewe disfunksie wat deur kokaïen veroorsaak word. (2009)

2. metodes

Alle eksperimente is uitgevoer in streng ooreenstemming met die NIH Gids vir die Sorg en Gebruik van Laboratoriumdiere en is goedgekeur deur die Institusionele Diereversorgings- en -gebruikskomitee by UT Southwestern.

2.5. Kwantifisering van mRNA

Rotte het intra-OFC-inspuitings van AAV-GFP of AAV-ΔFosB ontvang, gevolg deur 21 twee keer daaglikse inspuitings van sout of kokaïen, presies soos beskryf vir die gedragseksperimente. Diere is 24 h gebruik na die laaste sout of kokaïen inspuiting. Rotte is deur dekapping vermoor. Die brein is vinnig onttrek en bilaterale 1 mm dik 12-maatstene van die NAc verkry en onmiddellik gevries en gestoor by -80 ° C tot RNA-isolasie. Ponsies van die OFC is ook verwyder vir analise deur DNA-mikroarray wat bevestig het dat suksesvolle virale gemedieerde geenoordrag in hierdie streek (sien (Winstanley et al., 2007) vir meer gedetailleerde resultate). RNA is onttrek uit die NAc-monsters met behulp van die RNA Stat-60-reagens (Teltest, Houston, TX) volgens die vervaardiger se instruksies. Verontreinigende DNA is verwyder met DNase-behandeling (DNA-vry, katalogus # 1906, Ambion, Austin TX). Gesuiwerde RNA is omgekeerd-transkribeer in cDNA (Superscript First Strand Synthesis, Katalogus # 12371-019; Invitrogen). Transkripsies vir gene van belangstelling is gekwantifiseer met die gebruik van real-time qPCR (SYBR Green; Applied Biosystems, Foster City, CA) op 'n Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96-goed-termosiklus. Al die primers is deur Synthon gespesialiseer (Huntsville, AL; Tabel 1 vir rye) en gevalideer vir lineariteit en spesifisiteit voor eksperimente. Alle PCR-data is genormaliseer na vlakke van gliseraldehied-3-fosfaat dehidrogenase (GAPDH), wat nie deur kokaïenbehandeling verander is nie, volgens die volgende formule: ΔC_t =C_t(geen van belang) C_t (GAPDH). Aangepaste uitdrukkingsvlakke vir beide die AAV-ΔFosB- en AAV-GFP-rotte wat kokaïen ontvang het, en die AAV-ΔFosB rotte wat chroniese sout ontvang het, is dan as volg bereken in verhouding tot die kontroles (AAV-GFP groep gegee chroniese sout): ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (kontrole groep). In ooreenstemming met aanbevole praktyk in die veld (Livak en Schmittgen, 2001), is uitdrukkingsvlakke relatief tot kontroles dan bereken met behulp van die volgende uitdrukking: 2^-ΔΔCt.

  

Tabel 1

Volgorde van primers wat gebruik word om vlakke van cDNA te kwantifiseer via real-time PCR.

3. Resultate

eksperiment 1

Chroniese kokaïenadministrasie veroorsaak sensitiwiteit vir die hiperlomotoriese effekte van akute kokaïen wat deur ΔFosB gemik word

Soos verwag kan word, is robuuste lokomotoriese sensitiwiteit waargeneem in beheerde diere na chroniese kokaïenblootstelling, met diere wat chronies behandel is met kokaïen wat verhoogde hiperaktiwiteit toon as gevolg van die akute kokaïenuitdaging (Fig. 1A, chroniese behandeling: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Diere wat ΔJunD ooruitdruk, 'n dominante negatiewe mutant van JunD wat as 'n ΔFosB-antagonis optree (Zachariou et al., 2006), in die OFC was ononderskeibaar van beheerde diere (Fig. 1C, GFP vs ΔJunD, groep: F_{1, 56} = 1.509, NS). Diere wat oordrewe ΔFosB in die OFC wat herhaalde soutinjecties ontvang het, het egter "voorgevoelig" verskyn: hulle het 'n verbeterde lokomotoriese reaksie op akute kokaïen getoon wat ononderskeibaar was van die sensitiewe respons van hul eweknieë wat behandel is met chroniese kokaïenFig. 1B, GFP vs ΔFosB chirurgie × chroniese behandeling: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; Slegs ΔFosB: chroniese behandeling: F_1,22 = 0.664, NS). ΔFosB diere was effens hiperaktief binne die eerste 15-min wat in die lokomotoriese bokse geplaas is (GFP vs ΔFosB, chirurgie: F_1,56 = 4.229, p <0.04), maar vlakke van bewegingsaktiwiteit was vergelykbaar met kontroles gedurende die 15 minute voor toediening van kokaïen (chirurgie: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Fig 1

Lokomotoriese sensitiwiteit vir kokaïen. Akute kokaïen het groter toenames in lokomotoriese aktiwiteit in beheerde diere wat chronies met kokaïen versus saline behandel is (paneel A). By diere wat oor ΔFosB (paneel B) uitdruk, word die herhaalde sout gegee (meer ...)

Aangesien kokaïen tydens die 5CSRT kokaïen gegee is, het dieselfde diere 'n betreklik verbeterde vermoë gehad om te onthou van voortydige motoriese reaksies. Hierdie hiperaktiwiteit verskyn spesifiek vir ambulatoriese bewegings, dws die soort beweging wat tipies aangeteken word in lokomotoriese sensibiliseringsstudies. Alhoewel verhoogde aktiwiteit in reaksie op stimulante middels 'n anksiese profilering kan weerspieël, verhoog die intra-OFC-oor-uitdrukking van ΔFosB nie angs soos gemeet met behulp van die verhoogde plus-doolhof of oop veldtoets nie (data nie getoon nie). Die diere was ook goed aangewend vir IP-inspuitings, en soutinjecties het nie hul kognitiewe prestasie verander nie (Winstanley et al., 2007), daarom kan hierdie motoriese effek nie toegeskryf word aan 'n algemene reaksie op 'n IP-inspuiting nie. Samevattend dui hierdie bevindinge aan dat induksie van ΔFosB in die OFC voldoende is (maar nie nodig nie) vir sensitiewe lokomotiewe wat op kokaïen reageer, alhoewel ΔFosB in dieselfde streek verdraagsaamheid teenoor die effekte van kokaïen op motivering en impulsiwiteit veroorsaak (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

Vlakke van FosB mRNA in die NAc is nie verander deur óf chroniese geneesmiddelbehandeling nie (Fig. 2A, dwelm: F_1,14 = 1.179, ns) of uitdrukking van ΔFosB in die OFC (chirurgie: F_{1, 14} = 0.235, ns). Die vlakke van ΔFosB was egter aansienlik hoër in diere wat chronies met kokaïen behandel is ooreenkomstig vorige verslae (Chen et al., 1997); Fig. 2B, dwelm: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Interessant genoeg was die hoeveelheid ΔFosB mRNA in die NAc van soutbehandelde diere laer in dié waarin hierdie transkripsiefaktor in die OFC (geneesmiddel: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Die afwesigheid van 'n interaksie met geneesmiddel × chirurgie dui egter aan dat chroniese kokaïenbehandeling dieselfde effek gehad het in beide AAV-GFP- en AAV-ΔFosB-behandelde groepe, wat die ΔFosB-vlakke eweredig verhoog het (dwelm × chirurgie: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Fig 2

Veranderinge in mRNA binne die NAc van diere wat GFP of ΔFosB in die OFC uitdruk, en chronies met sout of kokaïen behandel word. Data dui lineêre vou veranderinge in uitdrukking aan as 'n verhouding van beheermaatreëls. Gegewe data is (meer ...)

4. bespreking

Hier wys ons dat oor-uitdrukking van ΔFosB in die OFC sensitiewe rotte vir die lokomotoriese stimulante-aksies van kokaïen, wat die optrede van chroniese kokaïenadministrasie naboots. Ons het voorheen getoon dat die prestasie van dieselfde diere op die 5CSRT en vertraag-verdiskontering paradigmas minder geraak word deur akute kokaïen, en dat 'n soortgelyke toleransie-effek waargeneem word na herhaalde kokaïen blootstelling. Dus, sensitiwiteit en verdraagsaamheid teenoor verskillende aksies van kokaïen kan in dieselfde diere waargeneem word, met albei aanpassings gemedieer deur dieselfde molekuul, ΔFosB, wat in dieselfde breinstreek optree. Die feit dat beide verskynsels gelyktydig geïnduseer kan word deur een van die optrede van kokaïen op een enkele frontokortiese lokus na te boots, beklemtoon die belangrikheid van kortikale streke in die agtervolg van chroniese dwelm inname. Verder dui hierdie data aan dat verdraagsaamheid en sensitiwiteit weerspieël twee oënskynlik kontrasterende, maar nou verwante aspekte van die reaksie op verslawende middels.

Aangesien verhoogde ΔFosB-uitdrukking in die NAc krities betrokke is by die ontwikkeling van lokomotoriese sensitiwiteit, sou 'n plausibele hipotese gewees het dat oFosB in die OFC vooraf sensibiliseer diere na kokaïen deur toenemende vlakke van ΔFosB in die NAc te verhoog. Die inverse resultaat is egter gevind: vlakke van ΔFosB in die NAc was aansienlik laer in diere wat oor-uitdrukking ΔFosB in die OFC het. Die gedragsgevolge van hierdie afname in NAc ΔFosB is moeilik om te interpreteer, aangesien inhibisie van ΔFosB se aksies deur oormatige uitdrukking van ΔJunD in hierdie streek verminder baie kokaïen-effekte in muise (Peakman et al., 2003). Sekere parallelle bestaan ​​tussen hierdie waarnemings en dié wat gemaak is met betrekking tot die dopamienstelsel. Byvoorbeeld, gedeeltelike dopamien uitputting in die NAc kan lei tot hiperaktiwiteit, aangesien die toepassing van dopamienagoniste in hierdie streek kan lei (Bachtell et al., 2005; Costall et al., 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Net so kan die feit dat toenemende kortikale vlakke van ΔFosB subkortiese uitdrukking afneem, ooreenstem met die goed gevestigde bevinding dat 'n toename in prefrontale dopaminerge oordrag dikwels gepaard gaan met 'n wederkerende afname in striatale dopamienvlakke (Deutch et al., 1990; Mitchell en Gratton, 1992). Hoe so 'n terugvoermeganisme vir intracellulêre seinmolekules kan werk, is tans onduidelik, maar kan veranderinge in die algemene aktiwiteit van sekere neuronale netwerke weens verandering in gentranskripsie weerspieël. Byvoorbeeld, toenemende ΔFosB in die OFC lei tot 'n opregulering van plaaslike inhibitiewe aktiwiteit, soos blyk uit 'n toename in vlakke van die GABA_A reseptor, mGluR5-reseptor en substansie P, soos aangetoon deur mikro-analise (Winstanley et al., 2007). Hierdie verandering in OFC-aktiwiteit kan dan aktiwiteit in ander breinareas beïnvloed, wat op sy beurt kan lei tot 'n plaaslike verandering in uitdrukking van ΔFosB. Of die vlakke van ΔFosB relatiewe veranderings in dopamienaktiwiteit weerspieël, is 'n probleem wat verdere ondersoek behels.

Alle diere het 'n beduidende toename in ΔFosB mRNA vlakke in die NAc volgende chroniese kokaïenbehandeling getoon, in ooreenstemming met vorige verslae van verhoogde proteïenvlakke (Chen et al., 1997; Hoop et al., 1992; Nye et al., 1995). 'N Onlangse verslag het egter bevind dat vlakke van ΔFosB mRNA nie meer aansienlik verhoog is 24 h na chroniese amfetamienbehandeling nie, alhoewel beduidende toenames 3 h waargeneem is na die finale inspuiting (Alibhai et al., 2007). Hierdie afwyking kan die gevolg wees van die verskil in die psigostimulerende geneesmiddel wat gebruik word (kokaïen vs amfetamien), maar gegewe die korter halveringstyd van kokaïen, sou dit redelik wees om te verwag dat die effekte daarvan op geen-uitdrukking vinniger sal normaliseer as dié van amfetamien, eerder as andersom. 'N Meer aannemlike rede vir hierdie verskillende resultate is dat diere in die huidige studie twee keer per dag met 'n matige dosis medisyne vir 21 dae ingespuit is in vergelyking met 'n enkele hoë dosis inspuiting vir 7 dae (Alibhai et al., 2007). Die meer uitgebreide behandelingsbehandeling kan tot gevolg hê dat die meer uitgesproke veranderinge hier waargeneem word.

Alhoewel die veranderinge in geenuitdrukking waargeneem in die NAc na chroniese kokaïen in die algemeen ooreenstem met die voorheen gerapporteerde bevindings, is die grootte van die effekte kleiner in die huidige studie. Een moontlike rede hiervoor is dat diere slegs 24 h geoffer is ná die laaste inspuiting van kokaïen, terwyl die meeste studies twee weke sedert die laaste blootstelling aan geneesmiddels verkry het, gebruik het. Studies wat die tydsverloop van lokomotoriese sensitiwiteit ondersoek, dui aan dat meer uitgespreekte veranderinge in beide gedrag en geen / proteïenuitdrukking op hierdie later tydstip waargeneem word. Alhoewel ons 'n effense toename in mRNA vir die dopamien D rapporteer₂ reseptor in die NAc, is die algemene konsensus dat uitdrukkingsvlakke van die D₂ of D₁ reseptor word nie permanent verander na die ontwikkeling van lokomotoriese sensitiwiteit nie, alhoewel beide in D verhoog en afneem₂ reseptor nommer is kort na die einde van die sensiserende regime aangemeld (sien (Pierce en Kalivas, 1997) vir bespreking). Ons waarneming dat GluR1 en GluR2 mRNA onveranderd was ná chroniese kokaïenbehandeling op hierdie vroeë tydspunt, is ook ooreenkomstig 'n vorige verslag (Fitzgerald et al., 1996), alhoewel 'n toename in GluR1 mRNA op latere tydspunte opgespoor is na die beëindiging van chroniese psigostimulerende behandeling (Churchill et al., 1999).

Ons het egter 'n klein toename in PSD95 mRNA waargeneem in die NAc van diere wat chronies behandel is met kokaïen. PSD95 is 'n steiermolekule, en is een van die belangrikste proteïene binne die postsynaptiese digtheid van opwindende sinapse. Dit veranker verskeie glutamaatreseptore en gepaardgaande seinproteïene by die sinaps, en 'n toename in PSD95-uitdrukking word gedink om verhoogde sinaptiese aktiwiteit te weerspieël en verhoogde invoeging en stabilisering van glutamaatreseptore by sinapse (Van Zundert et al., 2004). 'N Rol vir PSD95 in die ontwikkeling van lokomotoriese sensitiwiteit is voorheen voorgestel (Yao et al., 2004).

Toename in Arc uitdrukking is ook gekoppel aan toenames in sinaptiese aktiwiteit. Alhoewel 'n toename in Arc-uitdrukking in die NAc 50 min na inspuiting met amfetamien waargeneem is (Klebaur et al., 2002), dui ons data daarop dat chroniese toediening van kokaïen nie meer permanently Arc in die NAc reguleer nie, alhoewel toenames in Arc 24 h waargeneem is na chroniese dosering met antidepressante middels (Larsen et al., 2007) en amfetamien (Ujike et al., 2002). 'N Toename in CREB-fosforilering word ook waargeneem in die NAc na akute kokaïen- en amfetamienadministrasie (Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Self et al., 1998), maar dit is miskien nie verbasend dat geen toename in CREB mRNA waargeneem is na die chroniese kokaïenadministrasie nie. Signalering deur die CREB-pad word in die aanvanklike fases van dwelmopname belangriker, met transkripsiefaktore soos ΔFosB kom om te oorheers as verslawing vorder (McClung en Nestler, 2003). Alhoewel CREB betrokke was by die belonende effekte van kokaïen (Carlezon et al., 1998), is daar geen berigte dat toenemende CREB-uitdrukking invloed op lokomotoriese sensitiwiteit het nie, alhoewel virale gemedieerde toenames in die endogene dominante negatiewe antagonis van CREB, die induktiewe cAMP vroeë repressor proteïen of ICER, verhoog die hiperaktiwiteit wat veroorsaak word deur 'n akute inspuiting van amfetamienGreen et al., 2006).

Ter opsomming, hoewel die meerderheid van die dwelmgeïnduceerde veranderinge wat ons waargeneem het, ooreenstem met voorspellings uit die literatuur, het ons geen veranderinge in geenuitdrukking binne die NAc gevind wat die sensitiewe lokomotoriese reaksie op kokaïen waargeneem in dwelm-naïewe diere wat behandel word, kan verduidelik nie met intra-OFC AAV-ΔFosB. Dit verhoog die moontlikheid dat toenemende ΔFosB in die OFC nie die motoriese sensitiwiteit via die NAc kan beïnvloed nie, alhoewel baie ander gene wat nie hier bestudeer word, moontlik betrokke mag wees nie. Oorwegende bewyse dui daarop dat modulasie van die mediale prefrontale korteks (mPFC) stollatiese aktiwiteit kan verander en sodoende bydra tot sensitiwiteit van gedrag vir psigostimulante (Steketee, 2003; Steketee en Walsh, 2005), hoewel minder bekend is oor die rol van meer ventrale prefrontale streke soos die OFC. Die NAc ontvang 'n paar projeksies van die OFC (Berendse et al., 1992). 'N Meer onlangse en gedetailleerde studie het egter baie min direkte OFC-NAc-projeksies geïdentifiseer: yl etikettering van die mees laterale deel van die NAc-dop is waargeneem na aanleiding van inspuitings van anterograde-spore in die laterale en ventrolaterale areas van die OFC en die mees ventrale OFC streek stuur minimale projeksies na die NAc-kern (Schilman et al., 2008). Die sentrale caudate-putamen ontvang baie digter innervasie. In die lig van hierdie anatomiese bewyse sou die meeste van die NAc-weefsel wat in ons PCR-reaksies ontleed is, nie direk deur die OFC geïnvesteer kon word nie, en verminder die kanse dat enige veranderinge in geenuitdrukking suksesvol opgespoor sou word.

Die OFC doen swaar projek vir streke wat hulself sterk verbind met die NAc, soos die mPFC, basolaterale amygdala (BLA), caudate putamen en subthalamic nucleus (STN). Of veranderinge in die OFC die werking van die NAc indirek kan beïnvloed deur middel van die invloed daarvan op hierdie gebiede is 'n oop vraag. Daar is getoon dat aktiwiteit in die BLA verander word na OFC-letsels, en dat dit aansienlik bydra tot die tekorte in omkeerleer wat veroorsaak word deur OFC-skade (Stalnaker et al., 2007), maar enige effekte binne gebiede soos die NAc moet nog gerapporteer word. Dit kan dalk meer produktief wees om aandag te skenk aan ander gebiede wat sterker met die OFC verband hou en wat ook sterk in motoriese beheer betrokke is. Die STN is 'n besonder belowende teiken, aangesien nie net letsels van die STN en OFC soortgelyke effekte op impulsiwiteit en Pavloviese leer veroorsaak nie (Baunez en Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaner en Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), maar psigostimulerende-geïnduceerde lokomotoriese sensitiwiteit word geassosieer met 'n toename in c-Fos-uitdrukking in hierdie streek (Uslaner et al., 2003). Toekomstige eksperimente wat ontwerp is om te ondersoek hoe dwelmgeïnduceerde veranderinge in geenuitdrukking binne die OFC die werking van stroomafwaartse gebiede soos die STN beïnvloed, is geregverdig. Die OFC stuur ook 'n geringe projeksie na die ventrale tegmentale area (Geisler et al., 2007), 'n gebied waarvan kritiek betrokke is by die ontwikkeling van lokomotoriese sensitiwiteit. Dit is moontlik dat oor-ekspressie van ΔFosB in die OFC dus lokomotoriese sensitiwiteit deur hierdie weg kan beïnvloed.

Die presiese aard van die verhouding tussen dwelmgeïnduceerde veranderinge in kognitiewe funksie en lokomotoriese sensitiwiteit is tans onduidelik, en ons het tot dusver gefokus op die OFC. Gegewe hierdie bevindinge, is dit moontlik dat veranderinge in geenuitdrukking wat verband hou met die ontwikkeling van lokomotoriese sensitiwiteit in ander breinstreke, dalk 'n mate van invloed op die kognitiewe reaksie op kokaïen het. Eksperimente wat die wisselwerking tussen kortikale en subkortiese areas ondersoek na die toediening van verslawende middels, kan nuwe lig werp op hoe die verslaafde toestand gegenereer en onderhou word, en die interaktiewe rolle wat deur sensibilisering en verdraagsaamheid in hierdie proses gespeel word.

Verwysings