PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Kokaïen-geïnduceerde veranderinge in gene-uitdrukking veroorsaak veranderinge in neuronale morfologie en gedrag wat kokaïenverslawing kan onderlê. Ons het 'n noodsaaklike rol vir histoon 3 lysine 9 (H3K9) -dimethylering en die lysien-dimetyltransferase G9a in kokaïen-geïnduceerde strukturele en gedragsplastisiteit geïdentifiseer. Herhaalde kokaïenadministrasie het die globale vlakke van H3K9-dimetasasie in die kernkampus verminder. Tsy afname in histoonmetilering is bemiddel deur die onderdrukking van G9a in hierdie breinstreek, wat gereguleer is deur die kokaïen-geïnduceerde transkripsiefaktor ΔFosB. Met behulp van voorwaardelike mutagenese en virale gemedieerde geen-oordrag, het ons bevind dat G9a-downregulasie dendritiese ruggraat plastisiteit van nucleus accumbens neurone verhoog en verhoogde voorkeur vir kokaïen, en sodoende 'n belangrike rol vir histoonmetilering in die langtermyn-optrede van kokaïen vestig.
Inleiding
Herhaalde kokaïenblootstelling word gekenmerk deur volgehoue veranderinge in geenuitdrukking en veranderde neuronale morfologie binne die nucleus accumbens (NAc), 'n belangrike komponent van die brein se beloningskring (1-2). Chromatin remodeling is belangrik in afwykende transkripsionele veranderinge in hierdie brein streek wat kan lei tot aspekte van kokaïenverslawing (3-9). Kokaïenregulering van chromatienstruktuur in die NAc het gedeeltelik resultate van direkte kokaïen-geïnduceerde veranderinge van die chromatien ensimatiese masjinerie, wat lei tot veranderinge in histon-asetilering en fosforilering (4, 7-9); Rolle vir ensieme wat histoonmetilering beheer, is egter nog nie ondersoek nie.
'N Onlangse genoom-wye promotor-analise met behulp van chromatienimmunoprecipitasie gekoppel aan mikroarrays (ChIP-Chip) het veranderde patrone van onderdrukkende histoon H3 lysine 9 (H3K9) en 27 (H3K27) metilering by spesifieke geenpromotors in die NAc volgende herhaalde kokaïenbehandeling geïdentifiseer (6). Ons het dus verskeie lysienmetieltransferases (KMT's) en demetielase (KDMs) geprofileer wat bekend is om H3K9 of H3K27 metilering te beheer (Fig. 1A). Slegs twee ensieme, G9a en GLP, het volgehoue transkripsionele regulering 24 uur na herhaalde kokaïenadministrasie getoon, toe die uitdrukking van albei gene beduidend afgereguleer is.. Aangesien G9a en GLP spesifiek die dimetylering van H3K9 (H3K9me2) kataliseer, is hul downregulasie deur kokaïen in ooreenstemming met verlaagde globale vlakke van eukromatiese H3K9me2 wat op hierdie tydstip waargeneem word (Fig. 1B). In teenstelling het globale vlakke van heterokromatiese H3K27 metilering onveranderd gebly deur herhaalde kokaïenblootstelling (Fig. S1 in ondersteunende aanlyn materiaal). As gevolg van sy hoë vlakke van katalitiese aktiwiteit beide vitro en in vivo (10), het ons uiteengesit om die funksionele betekenis van G9a-repressie verder te ondersoek na herhaalde kokaïenblootstelling in die NAc. Vlakke van G9a proteïen, soos vlakke van sy mRNA, was aansienlik verminder 24 uur na herhaalde kokaïenadministrasie (Fig. S2). Alhoewel G9a mRNA uitdrukking verminder is met 35% in die NAc, het immunohistochemiese analise 'n meer beskeie 15% reduksie in G9a proteïenvlakke getoon, in ooreenstemming met die waargenome 21% afname in H3K9me2 na herhaalde kokaïenadministrasie (Fig. 1B). G9a-mRNA-uitdrukking is ook in hierdie breinstreek afgereguleer deur 20% na herhaalde selfadministrasie van kokaïen (Fig. S3).
Om vas te stel of veranderinge in eukromatiese H3K9me2 korreleer met genoomwye veranderinge in geen-uitdrukking in die NAc, het ons mikroarray ontledings gebruik om gene ekspressieprofiele te ondersoek wat veroorsaak word deur 'n uitdagingsdosis kokaïen by diere met of sonder 'n geskiedenis van vorige kokaïenblootstelling (sien aanvullende geen lyste in Tabelle S1-S3). Diere wat herhaalde kokaïen ontvang het, het dramaties verhoogde genexpressie 1 uur na 'n kokaïenuitdaging getoon in vergelyking met akuut behandelde diere (Fig. 1C). Hierdie verhoogde geen-uitdrukking het nog steeds plaasgevind in reaksie op 'n kokaïen-uitdaging wat na die 1-week van onttrekking aan herhaalde kokaïen gegee is. In ooreenstemming met vorige verslae, het 'n klein persentasie gene (~ 10%) ongebreidelde transkripsionele response na herhaalde kokaïenadministrasie vertoon (Fig. 1C; sien Tabel S1) (5). Om direk die rol van G9a-downregulasie te ondersoek in die verbeterde geen-uitdrukking wat na herhaalde kokaïen waargeneem word, het muise intra-NAc-inspuitings van Herpes simplexvirus (HSV) -vektore verkry wat GFP of G9a uitgedruk het en met sout of herhaalde kokaïen behandel is om te bepaal of G9a ooruitdrukking was voldoende om die herhaalde kokaïengeïnduceerde verbetering van geenuitdrukking te blokkeer. Uit 'n stel 12 willekeurig geselekteerde gene wat verhoogde vlakke van uitdrukking na herhaalde kokaïen vertoon, het ons opgemerk dat G9a die verbeterde uitdrukking van 50% van hierdie gene aansienlik verminder het (Tabel S4).
Om stroomopwaartse transkripsie-gebeurtenisse te identifiseer wat die herhaalde kokaïen-geïnduceerde onderdrukking van G9a-uitdrukking bemiddel, het ons 'n moontlike rol vir ΔFosB, 'n hoogs stabiele splitsproduk van die onmiddellike vroeë gene ondersoek fosB. ΔFosB akkumuleer in die NAc na herhaalde blootstelling aan kokaïen, waar dit gekoppel is aan verhoogde kokaïenbeloning (11). ΔFosB kan optree as óf 'n transkripsionele aktivator of repressor, afhangende van die betrokke gen wat betrokke is (3, 5, 6, 12). Die gebruik van bittertransgeniese NSE-TTA × tetOP-ΔFosB muise, waarin ΔFosB uitdrukking selektief in die NAc en dorsale striatum van volwasse diere geïnduceerd kan word (13), het ons die impak van ΔFosB uitdrukking op kokaïen regulering van H3K9me2 en KMTs in die NAc ondersoek. ΔFosB ooruitdrukking was voldoende om die vlakke van beide H3K9me2 te verminder (Fig. 1D) en G9a uitdrukking (Fig. 1E), en sodoende die effekte van herhaalde kokaïen naboots. In teenstelling hiermee het ΔFosB nie die GLP-uitdrukking in hierdie breinstreek verminder nie, en het geen effek gehad op SUV39H1 en EZH2 nie, maar die hoof trimethyleringsenzyme vir H3K9 en H3K27 onderskeidelikFig. S4). Om hierdie data te bevestig deur gebruik te maak van 'n onafhanklike ΔFosB ooruitdrukkingsstelsel, het volwasse muise van wildtipe bilaterale intra-NAc inspuitings van Adeno-geassosieerde virus (AAV) vektore wat GFP of ΔFosB uitgedruk het. Virale-gemedieerde ooruitdrukking van ΔFosB verminderde vlakke van G9a-uitdrukking in hierdie breinstreek (Fig. 1E).
Sulke uitgesproke en spesifieke regulering van G9a het ons gevra om te ondersoek of die verandering van G9a uitdrukking spesifiek in NAc neurone die gedragsreaksies op kokaïen reguleer. Wildtipe-muise het intra-NAc-inspuitings van HSV-vektore verkry wat GFP of G9a uitdruk en is dan geanaliseer met behulp van 'n onbevooroordeelde kokaïen-gekondisioneerde plekvoorkeurparadigma, wat 'n indirekte mate van geneesmiddelbeloning bied. Virale ooruitdrukking van G9a in NAc-neurone is bevestig as gevolg van gedrags toetsing (Fig. 2A). G9a ooruitdrukking aansienlik verminder voorkeur vir kokaïen in vergelyking met diere wat GFP ooruitdruk (Fig. 2B), en verhoogde H3K9me2 vlakke in die NAc (Fig. 2C). Oormatige ekspressie van 'n katalitiese dooie mutant van G9a (G9aH1093K) (14) het nie kokaïenvoorkeur beïnvloed nie (Fig. 2B) en het geen invloed op H3K9me2 vlakke in hierdie brein streek gehad nie (Fig. 2C).
Om die rol van G9a in die gedragseffekte van kokaïen verder te bestudeer, en meer spesifiek om die herhaalde kokaïen-geïnduceerde onderdrukking van G9a-uitdrukking in die NAc te naboots, is volwasse G9afl / fl muise (14) ontvang intra-NAc inspuitings van AAV vektore wat Cre rekombinase of GFP as 'n beheer uitdruk. AAV-Cre knockdown van G9a in die NAc, wat immunohistochemically bevestig is (Fig. S5), het die effekte van kokaïen aansienlik verhoog in kondisioneringseksperimente en verminderde H3K9me2 vlakke in die NAc (Fig. 2D, E). 'N Kommersieel beskikbare farmakologiese inhibitor van G9a en GLP, BIX01294 (15-16), is gebruik om te bepaal of ensiem inhibisie op dieselfde manier gedragsreaksies op kokaïen beïnvloed. Inderdaad, farmakologiese inhibisie van G9a en GLP het die voorkeur vir kokaïen aansienlik verhoog en H3K9me2 in die NAc verminder (Fig. 2F, G).
Herhaalde toediening van kokaïen verhoog die digtheid van dendritiese stekels op die NAc-medium stekelneurone (17), 'n proses wat verband hou met funksionele veranderinge by eksitatoriese glutamatergiese sinapse op hierdie neurone (18-19) en sensitiewe gedragsreaksies op die geneesmiddel (17, 20). Ons het dus veronderstel dat afregulering van G9a-aktiwiteit in die NAc deur herhaalde kokaïen die vermoë van kokaïen om die dendritiese ruggraatdigtheid van NAc-neurone te reguleer, kan bemiddel. Met behulp van chromatienimmunoprecipitasie (ChIP) met 'n anti-G9a-teenliggaam, het ons verskeie vermeende G9a-genen teikens in die NAc geïdentifiseer, wat elk voorheen betrokke was by kokaïen-geïnduceerde dendritiese plastisiteit (Fig. 3A) (20-26). Ons het bevind dat herhaalde kokaïenadministrasie aansienlik verminderde G9a-binding, sowel as vlakke van H3K9me2, by hierdie geenpromotors (Fig. 3B). In teenstelling hiermee het akute kokaïenadministrasie G9a vinnig aan sommige van hierdie gelyktydige gene-promotors aangewend, in ooreenstemming met die verhoogde G9a-uitdrukking waargeneem in die NAc 1 uur na 'n akute dosis kokaïen (Fig. S6). Alhoewel G9a bindend by spesifieke geenpromotors korreleer met veranderinge in die uitdrukking daarvan, bly dit onduidelik of sulke gebeurtenisse bemiddel word deur veranderde globale vlakke van G9a in die NAc en / of deur verskille in G9a-werwing na akute teen herhaalde kokaïenadministrasie.
Op grond van G9a se regulering van talle plastisiteitsverwante gene in die NAc, het ons direk ondersoek of die instandhouding van G9a-uitdrukking in hierdie breinstreek na herhaalde kokaïenbehandeling voldoende was om kokaïen-geïnduceerde dendritiese ruggraatvorming te blokkeer. Met behulp van 'n kokaïenbehandelingsprotokol wat voorheen gedemonstreer is om dendritiese ruggraat induksie in die NAc te bevorder (20), het ons ruggraatdigtheid ondersoek in diere wat met HSV-GFP of HSV-G9a ingespuit is. In ooreenstemming met vorige bevindings het ons 'n beduidende toename in dendritiese ruggraatdigtheid in die NAc volgende kokaïenbehandeling waargeneem, 'n effek wat heeltemal geblokkeer is deur G9a ooruitdrukking (Fig. 3C). G9a ooruitdrukking alleen was nie voldoende om NAc dendritiese ruggraatdigtheid te verminder in die afwesigheid van kokaïen nie. Om hierdie data aan te vul, G9afl / fl muise het intra-NAc inspuitings van HSV-Cre ontvang en die ruggraatdigtheid is gekwantifiseer en vergelyk met diere wat HSV-GFP ontvang in die afwesigheid van kokaïen. Knockdown van G9a uitdrukking het aansienlik verhoogde ruggraatdigtheid op die NAc-medium, stekelrige neurone (Fig. 3C).
Gegee die bewyse dat G9a-downregulasie in die NAc na herhaalde kokaïen deur ΔFosB bemiddel word, het ons vervolgens ondersoek of hierdie transkripsiefaktor ook betrokke is by die regulering van NAc dendritiese stekels. Alhoewel ΔFosB nie voorheen verband hou met sulke dendritiese plastisiteit nie, is verskeie van sy teikens, insluitende Cdk5 en NFκB subeenhede, so betrokke. (20-23), en ΔFosB se aanhoudende uitdrukking in NAc neurone korreleer met verhoogde dendritiese ruggraatdigtheid na herhaalde kokaïenbehandeling (27). Eerstens het ons gevind dat induksie van ΔFosB in bittertransgeniese muise in die afwesigheid van kokaïen, wat die G9a en H3K9me2 uitdrukking afgereguleer het (Fig. 1D, E), verminderde G9a binding aan talle plastisiteitsverwante gene, waarvan baie ook getoon is om direkte teikens van ΔFosB self te wees (Fig. 3D) (3, 6). Ons het daarna gewys dat virale ooruitdrukking van ΔFosB in die NAc aansienlik verhoogde dendritiese ruggraatdigtheid onder basale toestande, soortgelyk aan wat waargeneem word na herhaalde kokaïenadministrasie (Fig. 3E). Aan die ander kant, ooruitdrukking in die NAc van ΔJunD, 'n dominante negatiewe mutant proteïen wat antagoniseer ΔFosB transkripsionele aktiwiteit, het die vermoë van herhaalde kokaïen geblokkeer om dendritiese ruggraatvorming te verhoog in die NAc (Fig. 3C).
Ons waarneming dat ΔFosB G9a uitdrukking reguleer in die NAc, en dat ΔFosB en G9a sommige van dieselfde doelgenes reguleer, het ons gelei om ander interaksies tussen ΔFosB en G9a te ondersoek. Na akute kokaïen, toe G9a vlakke verhoog is, bind G9a aan die fosB geen is verhoog, terwyl na herhaalde kokaïen, wanneer G9a-uitdrukking onderdruk word, bind G9a aan die fosB geen is afgeneem (Fig. 3A). Sodanige afgeneemde G9a binding ná herhaalde kokaïen is nie waargeneem nie c-FOS, waar die binding van G9a deur herhaalde kokaïen verhoog word (Fig. S7). Dit is in ooreenstemming met die feit dat, anders as fosB, c-FOS word onderdruk, nie geïnduseer nie, deur chroniese psigostimulerende blootstelling (5). ΔFosB ooruitdrukking in bittertransgeniese muise was voldoende om G9a bindend aan die fosb geen (Fig. 3D). Verder was G9a ooruitdrukking voldoende om verhoogde ΔFosB-uitdrukking te verminder na herhaalde kokaïenadministrasie (Tabel S4). Hierdie data dui op 'n outoregulatoriese lus waardeur G9a aanvanklik die induksie van ΔFosB beperk deur akute kokaïenadministrasie. Aangesien ΔFosB egter met herhaalde geneesmiddelblootstelling ophoop, onderdruk dit G9a en sodoende sy eie verdere induksie potensiaal.
Ten slotte het ons getoon dat histoonlysienmetilering in die NAc krities betrokke is by die regulering van neuronale geenuitdrukking in reaksie op kokaïen. Onderdrukking van G9a en H3K9me2 na herhaalde kokaïenadministrasie bevorder kokaïenvoorkeur, deels deur die transkripsionele aktivering van talle gene wat bekend is om afwykende vorme van dendritiese plastisiteit te reguleer. Deur 'n beter begrip te verkry van die gene wat deur sulke meganismes gereguleer word, sal ons kennis van die komplekse biologiese basis van dwelmverslawing verbeter en kan dit help om meer effektiewe behandelings van verslawende afwykings te ontwikkel.
Materiaal en metodes
Diere en behandelings
Tensy anders vermeld, is muise vier tot vyf per hok in 'n kolonie gehuisves met 'n 12-uur lig / donker siklus (ligte van 7: 00 AM tot 7: 00 PM) teen konstante temperatuur (23 ° C) met ad libitum toegang tot water en kos. Alle diere protokolle is goedgekeur deur IACUC by beide UT Southwestern Mediese Sentrum en Mount Sinai Skool vir Geneeskunde.
Vir kokaïen eksperimente [immunohistochemitrie, westelike blotting, kwantitatiewe PCR (qPCR), mikroarrayanalise en chromatienimmunoprecipitasie (ChIP)], 8- tot 10-week-ou manlike C57BL / 6J-muise is gebruik. Diere ontvang daaglikse inspuitings van óf 'sout' (7-behandelings sout, ip), 'akute' kokaïen (6-behandelings sout + een behandeling 20 mg / kg kokaïen-HCl, ip) of 'herhaalde' kokaïene (7-behandelings 20 mg / kg kokaïen-HCl, ip). Muise is geoffer op 1 uur of 24 uur na die finale behandeling. Vir microarray studies is diere daagliks behandel met 'sout' (15-behandelings sout, ip), 'akute' kokaïen (14 behandelings sout + 1 behandeling 20 mg / kg kokaïen-HCl, ip), 'herhaalde + akute' kokaïen 7 behandeling sout + 8 behandeling 20 mg / kg kokaïen-HCl, ip) of 'herhaalde onttrekking + akute' kokaïen 7 mg / kg kokaïen-HCl + 20 behandelings sout + 7 uitdaging behandeling 1 mg / kg kokaïen-HCl, ip) en is 20 uur na die finale behandeling geoffer. In gedragseksperimente is muise afsonderlik gehuisves ná chirurgie en is behandel met 1 mg / kg kokaïen-HCl, ip soos hieronder beskryf. Vir dendritiese ruggraatanalise en mikroarray-validering na HSV-GFP en HSV-G10a-GFP infeksie, is muise behandel met 'sout' (9-behandelings sout, ip) of 'herhaalde kokaïen' (5-behandelings 5 mg / kg kokaïen-HCl, ip ) in die loop van 20 dae, aangesien hierdie inspuiting protokol voorheen gedemonstreer is om ruggraatdigtheid op nucleus accumbens (NAc) neurone te verhoog binne die tydsbestek van herpes simplexvirus (HSV) transgenekspresie (HSV)Aanvullende ref S1). Muise wat gebruik word vir dendritiese ruggraatanalise, is 4 uur na die laaste behandeling geoffer.
Om plaaslike uitwissing van die G9a-transkripsie te beperk wat beperk is tot NAc-neurone, gebruik ons mutante muise homosigoties vir 'n gesplete G9a-allel, wat elders beskryf is (S2). Cre-geïnduseerde rekombinasie produseer exon 22 na 25 buite-raam splicing wat lei tot onsin-gemedieerde verval van die gemuteerde transkripsie. Ons het G9a-gesmuide muise gebruik wat heeltemal teruggekeer is na C57BL / 6J-muise. Muise is sterotaksies ingespuit in die NAc met Adeno-geassosieerde virus (AAV) vektore (serotipe 2) wat GFP of Cre-GFP tussen die ouderdom van 7 en 10 weke uitdruk. Immunohistochemiese analise is gebruik om die doeltreffendheid van Cre-gemedieerde rekombinasie te verifieer (sien Aanvullende Fig. S5). Ons het AAV ingespuitte diere 21 dae na chirurgie gebruik, aangesien rekombinasie in G9a-gesmuide muise stabiel en maksimaal was op hierdie tydstip, in ooreenstemming met gepubliseerde verslae (S3-S4). G9a en ΔJunD oorexpressie eksperimente is ook uitgevoer met behulp van HSV virus vektore wat GFP, wildtipe G9a-GFP, katalitiese dooie G9aH1093K-GFP of ΔJunD-GFP uitdruk S2 vir besonderhede rakende die ontwikkeling van G9a konstrukte). HSV ooruitdrukkende muise is 3 dae na chirurgie gebruik, aangesien ooruitdrukking maksimaal was op hierdie tydstip, soos waargeneem via immunohistochemie. As gevolg van die oorgangsaard van HSV-uitdrukking, en die aansienlik meer stabiele aard van AAV-uitdrukking, is HSV-vektore gebruik in eksperimente wat 'n vinnige korttermyn transgenekspeksie vereis, terwyl AAV-vektore gebruik is in eksperimente wat verlengde periodes van transgenekspressie vereis. Beide vektore is in uitgebreide vorige studies getoon om slegs neuronale selliggame binne die geïnjecteerde breinarea te besmet, sonder enige infeksie van afferente of efferente neurone.
Vir gedragseksperimente met die farmakologiese G9a / GLP inhibeerder, BIX01294 (25 ng / μl), was muise sterotaksies geïmplanteer met twee subkutane mini pompe, sowel as bilaterale leidings kanules in die NAc. Mini-pompe is geaktiveer 12 uur voor inplanting wat die aaneenlopende aflewering (0.25 μl / uur) van een van die voertuie (5 hidroksipropyl ß-cyclodextrine) of geneesmiddel vir 14 dae begin, gedurende watter tyd gedragsevaluerings uitgevoer is.
Vir ΔFosB ooruitdruks eksperimente [western blotting, qPCR, en ChIP], manlike bittertransgeniese NSE-TTA × tetOP-ΔFosB muise is gebruik (10 week-oue), waardeur diere in die afwesigheid van die tetrasiklienderivaat doxysiklien (8 weke van doxycycline) sterk, striatale beperkte konstitutiewe uitdrukking van ΔFosB (S5). ΔFosB ooruitdrukking in hierdie muise is bevestig via qPCR. Bevindings bevestig met behulp van NSE-TTA × tetOP-ΔFosB muise, wildtipe 8-week-oue C57BL / 6J manlike muise was sterotaksies-geïnjecteerde intra-NAc met AAV vektore wat GFP of ΔFosB-GFP uitdruk. AAV vektore is in hierdie geval gebruik om maksimale ΔFosB uitdrukking by 8 weke na chirurgie te verseker. Dit maak voorsiening vir 'n direkte vergelyking tussen virus-geïnfekteerde en bitransgeniese ΔFosB-ooruitdrukkende muise. Virale ooruitdrukking is bevestig met behulp van qPCR tydens 8 weke na-operasie (15-maat NAc-stampe is onder die inspuitingsteen ontleed). AAV-GFP en AAV-ΔFosB-GFP-muise wat nie vir qPCR gebruik is nie, is behandel met sout (14 behandeling sout, ip) of herhaalde kokaïen (14 behandelings 30 mg / kg kokaïen-HCl, ip) wat begin met 6 weke na- chirurgie. 4 dae na die finale behandeling, is die brein vasgestel met 4% paraformaldehied, gesny op 'n vibratoom en gebruik vir dendritiese ruggraatanalise.
Westerse vlek analise
14-maat NAc-stampe is geneem uit 1 mm koronale gedeeltes wat verkry is deur gebruik te maak van 'n vlekvrye staal muis brein matriks en was sonicated in 1 M HEPES lysis buffer (1% SDS) wat protease en fosfatase inhibeerders bevat. 10-30 μg monsters van totale proteïene is elektroforese op 18% SDS gels. Proteïene is na PVDF-membrane oorgedra en geïnkubeer met óf anti-H3K9me2 (monoklonaal monoklonaal, 1: 500), anti-β-tubulien (muismonoklonaal, 1: 60,000), anti-totale histoon H3 (konyn poliklonale, 1: 5,000) anti-GFP (gebruik vir die verifikasie van gelyke virale uitdrukking in ponsweefsel) (konyn poliklonale, 1: 1000), anti-H3K27me3 (konyn polyklonale, 1: 500) of anti-aktien teenliggaampies (muise monoklonale, 1: 60,000) 4 ° C (alle membrane is geblokkeer in 5% melk of 5% bees serum albumien). Membrane is dan geïnkubeer met peroksidase-gemerkte sekondêre teenliggaampies (1: 15,000-1: 60,000 afhangende van die primêre teenliggaam wat gebruik word) en bande is gevisualiseer met behulp van SuperSignal West Dura substraat. Bande is gekwantifiseer met NIH Image J-sagteware en H3K9me2 bands is genormaliseer tot aktien of β-tubulien en tot totale histon H3 om te beheer vir gelyke laai. Herhaalde kokaïen het geen effek gehad op die vlakke van aktien (Fig. S8) of totale histon 3 (Fig. S1) in die NAc. Verder het HSV-G9a-GFP en HSV-G9aH1093K-GFP infeksie geen effek op totale vlakke van β-tubulien in die NAc (Fig. S8).
immunohistochemie
Muise is besoedel met 'n dodelike dosis chloorhidraat en perfuseer met 4% paraformaldehied voordat dit ontleed word deur enkel of dubbel immunohistochemie soos voorheen beskryf (S6). Kortliks word na-vaste brein by kamertemperatuur oornag in 30% sucrose geïnkubeer voordat dit gesny word by 35 μm (brein wat gebruik word vir dendritiese ruggraatanalise, is gesny op 'n vibratoom by 100 μm afdelings in die afwesigheid van 30% sucrose). Vrydrywende NAc afdelings was gewas met 1X PBS, geblokkeer (3% normale donkieserum, 0.1% tritonX, 1X PBS) en later geïnkubeer met anti-GFP (hoender polyklonale, 1: 8000) en / of anti-G9a (konyn poliklonale , 1: 500) teenliggaampies in blokkeer oplossing. Afdelings ontleed vir dendritiese stekels is geïnkubeer met 'n konyn polyklonale anti-GFP teenliggaam by 1: 200. Na oornag-inkubasie is NAc-afdelings 3-tye gespoel vir 10-minute met 1X PBS, gevolg deur inkubasie met Cy2 en / of Cy3 fluorescent-gekoppelde sekondêre teenliggaampies in 1X PBS blokkeer oplossing vir 2 uur. Artikels wat gebruik word vir morfologie studies is oornag by kamertemperatuur in sekondêre antiliggaam geïnkubeer. Kernkolvering is behaal deur inkubasie van afdelings in 1X PBS wat DAPI (1: 50,000) bevat vir 10 minute. Afdelings is weer gewas, gevolg deur etanol dehidrasie en montering met DPX. Alle afdelings is afgebeeld met konfokale mikroskopie.
RNA isolasie en qPCR
Bilaterale 14-gauge NAc-slae is in Trizol gehomogeniseer en volgens die vervaardiger se instruksies verwerk. RNA is gesuiwer met RNAesy Micro-kolomme en spektroskopie het bevestig dat die RNA 260/280 en 260/230 rantsoene> 1.8 was. RNA is daarna omgekeer getranskribeer met behulp van 'n Bio-Rad iScript-kit. cDNA is gekwantifiseer deur qPCR met behulp van SYBR Green. Elke reaksie is in tweevoud of drievoud uitgevoer en geanaliseer volgens die ΔΔCt-metode soos voorheen beskryf met behulp van gliseraldehied-3-fosfaatdehidrogenase (GAPDH) as normaliseringsbeheer (S7). sien Aanvullende Tabel S5 vir mRNA primer sekwense.
DNA microarray analise
Vier groepe (3 onafhanklike biologiese replikate per groep) is gebruik vir die microarray studie, in totaal 12 mikroarrays. 1 uur na die laaste kokaïen inspuiting, is diere vinnig onthoof en die brein is verwyder en op ys geplaas. Disseksies van NAc is geneem met behulp van 'n 15-gauge naaldpons en is vinnig op droë ys gevries totdat RNA onttrek is. Bilaterale stampe is saamgevoeg uit vier diere per replikaat, altesaam 12-muise per groep. RNA isolasie, microarray verwerking, en data analise is uitgevoer soos voorheen beskryf (S8). Kortliks is RNA geïsoleer en gesuiwer soos hierbo beskryf en met behulp van Agilent's Bioanalyzer op kwaliteit gekontroleer. Omgekeerde transkripsie, versterking, etikettering en verbastering met Illumina MouseWG-6 v2.0-skikkings is uitgevoer met behulp van standaardprosedures deur UT Southwestern se microarray-kern. Rou data is agtergrond afgetrek en kwantiel genormaliseer met behulp van Beadstudio sagteware. Genormaliseerde data is geanaliseer met behulp van GeneSpring sagteware en geneliste is gegenereer met behulp van beduidendheidskriteria van 'n 1.3-voudige verandering afsny gekoppel aan 'n nie-streng p-waarde afsnyding van p <0.05.
Ons handhaaf 'n hoë mate van vertroue in hierdie data om verskeie redes. Eerstens is alle diere gelyktydig behandel, behandel en gedood onder dieselfde toestande. Ook, alle RNA en skikking verwerking is op dieselfde tyd uitgevoer. Tweedens het ons drievormige skikkings uitgevoer en verskeie diere per skikkingmonster gepool, waardeur die verskille weens individuele veranderlikheid en toenemende statistiese krag verminder word (S9). Derdens word die kriteria vir data-ontleding wat vir ons studie gebruik word, aanbeveel deur die MicroArray Quality Control-projek, aangesien hierdie kriteria geldig gemaak is om 'n hoë mate van inter-reproduceerbaarheid en inter- en intraplatform reproduceerbaarheid te bied (S10-S11).
Konstruksie van virusvektore
As gevolg van die virale vektorinvoeggrootte beperkinge, is koderingsreekse vir óf wildtipe G9a (G9a) of katalitiese dooie G9a (G9aH1093K) gesubkloneer in die bikistroniese p1005 + HSV-plasmieduitdrukking van GFP onder die beheer van die menslike onmiddellike vroeë cytomegaloviruspromotor (CMV) (die G9a invoeggrootte was ~ 3.96 kb, wat die maksimum invoeggrootte vir AAV-2-vektore oorskry). Die IE4 / 5-promotor dryf G9a-uitdrukking. Fragmente is subklone in die bikistroniese p1005 + HSV-plasmied via stompe eind ligasies met Klenow-behandelde PmeI- en EcoRI-verteerde G9a (vanaf pcDNA3.1) en CIP-behandelde p1005 + na EcoRI-vertering. Vir die produksie van HSV-ΔJunD-GFP, is die koderingsvolgorde van ΔJunD gevlankeer deur EcoRI-beperkingsterreine gegenereer deur PCR deur primere oligonukleotiede wat die EcoRI-werf bevat, te gebruik. Die PCR-produk is dan in die EcoRI-plek van die p1005 + -vektor gelig. Plaaslike uitdrukking van Cre rekombinase in NAc neurone is behaal deur virus-gemedieerde geen aflewering deur gebruik te maak van 'n AAV vektor soos beskryf (S12). GFP of 'n N-terminale samesmelting van GFP aan Cre is onderverdeel in 'n rekombinante AAV-2-vektor wat 'n CMV-promotor bevat met 'n splitsdonor-acceptorsvolg en polyadenileringssignaal. Alle vektorinvoegsels is bevestig deur dideoxy-sequencing. Virale vektore is geproduseer met behulp van 'n drie-transfeksie, helpervrye metode, soos voorheen beskryf (S13). Gesuiwerde virus is by -80 ° C gestoor. Virale kwaliteit is beoordeel deur aansteeklike titer geëvalueer in HEK293 selle. AAV-ΔFosB-GFP virusse is op dieselfde wyse voorberei. Vir HSV-Cre, Cre-uitdrukking is aangedryf deur 'n IRES-promotor, in teenstelling met die IE4 / 5-promotor, om Cre-uitdrukking te minimaliseer en neuronale toksisiteit te voorkom (sien S14 vir virale konstruksie). In alle gevalle is virale ooruitdrukking beide gevalideerd vitro en in vivo via qPCR, en virusse is immunohistochemies bevestig om NAc-beperkte uitdrukking na chirurgie te vertoon.
Stereotaxiese chirurgie
Onder ketamien (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) narkose, muise is geplaas in 'n klein-dier stereotaksiese instrument, en die kraniale oppervlak is blootgestel. Drie-en-dertig gauge spuitnaalde is gebruik om 0.5 μl virus tweeduisend in die NAc teen 'n 10 ° -hoek (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) teen 'n tempo van 0.1 μl / min te infuseer. Diere wat HSV-inspuitings ontvang het, was toegelaat om te herstel vir 2-dae na die operasie, terwyl muise wat gebruik word vir gedragstoetsing wat AAV-vektore ontvang het, toegelaat word om vir 20 dae te herstel voordat dit onderworpe is aan kondisionering. Hierdie tye is in ooreenstemming met die tydperke van maksimale virale gemedieerde transgene uitdrukking vir die twee vektore. Vir BIX01294 infusies, was elkeen van twee mini-pompe subkutant geplaas op die muis se rug. Kaneelplasings is behaal deur twee klein kraanholte bokant die NAc te boor, en deur die lewer van die kanule uit bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Muise is toegelaat om te herstel van chirurgie vir 4 tot 5 dae voor die aanvang van die plek-kondisioneringsprosedure vir kokaïen soos hieronder beskryf.
Voorwaarde plek voorkeur
Die plek kondisioneringsprosedure is uitgevoer soos voorheen beskryf, met die volgende wysigings (S7). Kortliks, 3 dae na intra-NAc infusies van HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP of HSV-GFP, is muise in die kondisioneringskamers geplaas, wat bestaan uit drie verskillende omgewings. Muise wat beduidende voorkeur getoon het vir een van die twee kondisioneringskamers, is uitgesluit van die studie (<10% van alle diere). Die kondisioneringsgroepe is dan gebalanseer om aan te pas vir enige kamervooroordeel wat nog bestaan. Op daaropvolgende dae is diere met sout ingespuit en in die middag vir 30 minute in een kamer ingeperk, en daarna met kokaïen (10 mg / kg, ip) ingespuit en in die aand gedurende twee dae (twee dae) in die ander kamer beperk. sout en twee kokaïenparings). Op die dag van die toets is muise vir 30 minute sonder behandeling weer in die apparaat geplaas en getoets om te bepaal watter kant hulle verkies. Lokomotoriese reaksies op kokaïen is beoordeel deur middel van balkbreuke in die kokaïen-gepaarde kamers om die doeltreffendheid van dwelmbehandeling te verseker. Vir AAV- en BIX2 CPP-eksperimente is 'n effens gewysigde protokol gebruik. Diere is weer met sout of kokaïen (20 mg / kg, ip) ingespuit en vir 01294 minute sessies tot spesifieke kamers beperk, maar is slegs een keer per dag vir 10 dae gekondisioneer, gevolg deur die toets op dag 30 (diere is gekondisioneer saans en kondisioneringsbehandelings is afgewissel). Vir alle groepe is die beweging van die basis as reaksie op soutoplossing beoordeel om te verseker dat die beweging nie deur virus- of remmerbehandeling beïnvloed word nie.
Intravenous cocaine self-administrasie
Manlike adolessente Long Evans rotte, wat 230-250 g weeg aan die begin van die eksperiment, is verkry. Hulle is gehuisves in 'n humiditeits- en temperatuurbeheerde omgewing op 'n omgekeer 12 uur lig / donker siklus (ligte af by 9: 00 am) met ad libitum toegang tot kos en water. Rotte het toegelaat om in hul nuwe omgewing te akklimatiseer en is daagliks behandel vir 1 week voor die aanvang van die eksperiment. Alle prosedures is uitgevoer in ooreenstemming met die Nasionale Instituut vir Gesondheidsgids vir die Sorg en Gebruik van Laboratoriumdiere en is goedgekeur deur Mount Sinai se Diereversorgings- en -gebruikskomitee. Die selfadministrasie toerusting was toegerus met infrarooi balke om lokomotoriese gedrag te meet. Selfadministrasie is uitgevoer soos voorheen beskryf (S15-S16) met kateters ingeplant in die regter halsaar onder isofluraan (2.4-2.7%) narkose. Kateters is gespoel met 0.1 ml soutoplossing wat 10 U heparien en ampisillien (50 mg / kg) bevat. Na 'n week van herstel na die operasie het selfadministrasie-opleiding begin gedurende die donker fase van die lig / donker siklus. Diere het daagliks 3 uur toegang tot kokaïen (0.75 mg / kg / infusie) toegelaat onder 'n vaste versterkingsskema van die verhouding-1 (FR1), waar 1 aktiewe hefboompers 'n enkele infusie van dwelm tot gevolg gehad het. Rotte het hul kokaïeninname ná 6 dae gestabiliseer (<15% variasie in responskoers gedurende 3 agtereenvolgende dae, met minstens 75% wat op die versterkte hefboom reageer). 24 uur na die finale selfadministrasiesessie is rotte vinnig onthoof, breine vinnig verwyder en verwerk vir RNA-isolasie en qPCR.
Chromatienimmunoprecipitatie (ChIP)
Vars NAc stampe was formaldehied kruisgekoppel en voorberei vir ChIP soos voorheen beskryf (S17-S18) met geringe veranderinge. Kortliks, 4 14-meter NAc-stampe per dier (5-diere wat gesamentlik per monster gekombineer is) is versamel, geknoop met 1% formaldehied en uitgeblus met 2 M glycine voordat dit by -80 ° C bevries. 1 dag voor monster sonication, skape anti-konyn / muis (afhangende van neerslag antilichaam) IgG magnetiese krale is voorberei deur die toepaslike magnetiese krale met 'n anti-G9a (konyn polyklonale ChIP graad) of anti-H3K9me2 (muis monoklonale ChIP graad) teenliggaampies oornag by 4 ° C onder konstante rotasie in blokoplossing. Weefsel sonication en chromatin skeer is uitgevoer soos voorheen beskryf (S17). Na sonication is gelyke konsentrasies van chromatien oorgedra na nuwe buise en ~ 5% van die finale produkte is gestoor om as 'invoer' kontroles te dien. Na deeglike was en resuspensie van die gekonjugeerde kraal / antilichaammengsels, is gelyke volumes antilichaam / kraalmengsels (~ 7.5 μg teenliggaam / monster) by elke chromatienmonster gevoeg en vir 16 uur onder konstante rotasie by 4 ° C geïncubeer. Monsters is verder gewas en omgekeerd gekruis teen 65 ° C oornag voor DNA-suiwering met behulp van 'n PCR suiweringskit. Na DNA-suiwering is monsters aan qPCR onderworpe en is dit genormaliseer na hul toepaslike 'invoer'-kontroles soos voorheen beskryf (S17). Normale IgG-immunoprecipitaties met behulp van 'n polyklonale anti-IgG-antistof van die muis is ook uitgevoer om te beheer vir gepaste verryking van seinversterking. Adeniene fosforibosieltransferase (APRT) is as 'n negatiewe beheer vir kokaïen- en ΔFosB-ooruitdrukseksperimente gebruik. sien Aanvullende Tabel S5 vir promotor primer sekwense.
Dendritiese ruggraatanalise
Om die rol van G9a in die regulering van neuronale morfologie in vivo te bestudeer, gebruik ons metodes wat voorheen beskryf is met die volgende veranderinge (S1). Drie dae na inspuiting van HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (alle virusse is gebruik in wildtype C57Bl / 6J-muise), of HSV-Cre-GFP (gebruik in G9afl / fl muise), toe virussexpressie maksimaal was, is muise geperfuseer, breine is kripbeskerm en later gesny by 100 μm op 'n vibratoom. Afdelings is dan immunostained met behulp van 'n teenliggaam teen GFP soos hierbo beskryf (sien Immunohistochemistry). Om die effekte van G9a ooruitdrukking en uitklop op ruggraatgetalle te bepaal, sowel as die effek van ΔJunD ooruitdrukking, het ons die aantal ruggraat gemeet op ongeveer 1-2-neuriete per neuron wat gelyk is aan minstens 299 μm sekondêre dendriete uit GFP-uitdrukende NAc-medium stekel neurone (MSNs). Aangesien MSN's morfologies verskillend is van ander neuronale populasies in die NAc, asook vorige verslae wat aandui dat HSV hoofsaaklik DARPP-32-neurone in hierdie breingebied infekteer (S19), ons is vol vertroue dat MSNs uitsluitlik in hierdie studies geassesseer is. Vir elke dier het ons ~ 6-8 neurone in 3-4 diere per groep (7 groepe) ondersoek, waarna 'n gemiddelde waarde vir elke dier vir statistiese analise verkry is. Eksperimente wat ontwerp is om die effekte van ΔFosB ooruitdrukking op NAc-ruggraatdigtheid te ondersoek, is soortgelyk aan dié wat hierbo beskryf is, met die uitsondering dat AAV-vektore gebruik word om GFP of ΔFosB-GFP vir lang tydperke (8 weke) uit te druk. Alle HSV-beelde is gevang met behulp van 'n konfokale mikroskoop met 'n 100X-olie-onderdompeling (AAV-beelde is gevang met 'n 63X-olie-onderdompeling). Beelde is verkry met die pinhole-stel by 1 arbitrêre eenheid en 'n 1024 × 1024 raamgrootte. Dendritiese lengte is gemeet met behulp van NIH Image J sagteware, en ruggraatgetalle is blind deur die primêre eksperimentator getel, aangesien skyfies voor eksperimentele skandering gekodeer is. Die gemiddelde aantal stekels per 10 μm dendriet is bereken.
Statistiese analise
Een- en tweerigting-ANOVA's is uitgevoer om betekenis te bepaal vir gekondisioneerde plekvoorkeure en dendritiese ruggraatanalise met meer as twee groepe. Studente se t toetse is gebruik vir ander vergelykings, insluitende qPCR, western blotting, dendritiese ruggraat analise wat HSV-GFP vergelyk met HSV-Cre in G9afl / fl muise, mikro-skaalontledings (sien hierbo) en chromatien-immunofresipitasie-eksperimente. Beplande student se t-toetse is gebruik na aanleiding van tweerigting-ANOVA-analise van dendritiese ruggraatdigtheid na ΔFosB-ooruitdrukking met bevestiging van beduidende belangrikste effekte van medikasiebehandeling en virus. Alle waardes wat in die figuurlegendes opgeneem word, verteenwoordig gemiddelde ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Gedetailleerde statistiese ontledings vir Vye. 1-3 In die hoof teks word gegee in: Gedetailleerde figuur legende, insluitende statistieke.
voetnote
Ek sertifiseer dat geen van die materiaal wat in die manuskrip ingesluit is getiteld nie Essensiële Rol van die Histon Methyltransferase G9a in Kokaïen-geïnduseerde Plasticiteit Voorheen gepubliseer of elders onder bespreking, insluitend op die internet.
Alle werk wat die gebruik van diere betref, is uitgevoer ooreenkomstig die institusionele en IACUC riglyne by beide die Universiteit van Texas Southwestern Medical Center en Mount Sinai School of Medicine.
Verwysings en notas
;
