(MENS) Gedrags- en strukturele reaksies op chroniese kokaïen Vereis 'n Voortgesette Loop wat ΔFosB en Kalsium / Calmodulien-Afhanklike Proteïenkinase II in die Nucleus Accumbens Shell (2013)

J Neurosci. 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, Wee S, Koob G, Turecki G, Neve R, Thomas M, Nestler EJ.

Bron

Fishberg Departement Neurowetenschappen en Friedman Brain Institute, Mount Sinai Skool vir Geneeskunde, New York, New York, 10029, Departemente van Neurowetenschappen en Sielkunde, Instituut vir Mensgenetika, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455, Komitee oor die Neurobiologie van Verslawende Siektes , The Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornië 92037 Depressiewe Disorders Program, Douglas Mental Health University Institute en McGill University, Montreal, Quebec, Kanada, H4H 1R3, en Departement Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Instituut vir Tegnologie, Cambridge, Massachusetts 02139 .

Abstract

Die transkripsiefaktor ΔFosB en die breinverrykte kalsium- / kalmodulienafhanklike proteïenkinas II (CaMKIIa) word geïnduceer in die nucleus accumbens (NAc) deur chroniese blootstelling aan kokaïen of ander psigostimulerende middels van misbruik, waarin die twee proteïene sensitiewe geneesmiddelreaksies bemiddel . Alhoewel ΔFosB en CaMKIIα albei AMPA glutamaatreceptoruitdrukking en -funksie reguleer in NAc, is dendritiese ruggraatvorming op die NAc-medium, spiny neurons (MSNs) en lokomotoriese sensitiwiteit vir kokaïen, nie tot nou toe 'n direkte verband tussen hierdie molekules verken nie. Hier demonstreer ons dat ΔFosB gefosforileer word deur CaMKIIa by die proteïenstabiliserende Ser27 en dat CaMKII is benodig vir die kokaïen-gemedieerde ophoping van ΔFosB in rat NAc.

Omgekeerd wys ons dat ΔFosB beide nodig en voldoende is vir kokaïeninduksie van CaMKIIa-gene-uitdrukking in vivo, 'n effek selektiewe vir D1-tipe MSNs in die NAc-skulp substreek.

Verder is induksie van dendritiese stekels op NAc MSNs en verhoogde gedragsresponsiviteit teenoor kokaïene na NAc-ooruitdrukking van ΔFosB beide CaMKII-afhanklik.

Belangrik, ons demonstreer vir die eerste keer induksie van ΔFosB en CaMKII in die NAc van menslike kokaïenverslaafdes, wat moontlike teikens vir toekomstige terapeutiese intervensie voorstel. Hierdie data bepaal dat ΔFosB en CaMKII betrokke is by 'n sel-tipe en brein-streekspesifieke positiewe toevoerlus as 'n sleutelmeganisme vir die regulering van die beloningskring van die brein in reaksie op chroniese kokaïen.

Inleiding

Toenemende bewyse ondersteun die siening dat veranderinge in geenuitdrukking bydra tot meganismes van dwelmverslawing (Robison en Nestler, 2011). Een belangrike bemiddelaar van hierdie veranderinge is ΔFosB, 'n Fos-familie transkripsiefaktor (Nestler, 2008). Chroniese toediening van feitlik enige misbruikmiddels veroorsaak die langdurige akkumulasie van ΔFosB in nucleus accumbens (NAc), 'n limbiese streek wat noodsaaklik is vir beloningsgedrag. Such induksie blyk spesifiek vir die klas van NAc medium spiny neuron (MSN) wat D1 dopamien reseptore uitdruk. Induktiewe ooruitdrukking van ΔFosB in hierdie D1-tipe NAc MSNs verhoog lokomotoriese en lonende reaksies op kokaïen en morfien (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), insluitend verhoogde kokaïen-selfadministrasie (Colby et al., 2003). Verder verminder die genetiese of virus blokkade van ΔFosB transkripsie-aktiwiteit die lonende effekte van hierdie middels (Zachariou et al., 2006), wat aandui dat hierdie volgehoue ​​induksie van ΔFosB 'n kritieke mediator is van die blywende veranderinge wat in NAc geïnduceerd word deur chroniese geneesmiddeladministrasie.

Die ongewone stabiliteit van ΔFosB (relatief tot al die ander Fos-familieproteïene) is beide 'n intrinsieke eienskap van die molekuul, as gevolg van die afkorting van degron-domeine teenwoordig in FosB met volle lengte (Carle et al., 2007), en 'n gereguleerde proses. ΔFosB is gefosforileer vitro en in vivo by Ser27, en hierdie reaksie stabiliseer verder ΔFosB, ~ 10-vou, in selkultuur en NAc in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Alhoewel Ser27-ΔFosB bewys is dat dit 'n substraat is vir kaseïen-kinase-2 vitro (Ulery et al., 2006), sy meganisme van in vivo fosforilering bly onbekend.

Kalsium- / kalmodulienafhanklike proteïenkinase II (CaMKII) is 'n hoogs-uitgedrukte serien / threonine kinase waarvan α- en β-isoforme dodecameriese homo- en hetero-holoenzymes vorm in vivo, en is noodsaaklik vir verskeie vorme van neuroplastisiteit (Lisman et al., 2002; Colbran en Brown, 2004). CaMKIIa word selektief in NAc-dop geïnduceerd deur chroniese amfetamien (Loweth et al., 2010), en farmakologiese blokkade van CaMKII-aktiwiteit in NAc-dop verminder gedragsensensitiasie tot amfetamien (Loweth et al., 2008) en kokaïen (Pierce et al., 1998), terwyl virale ooruitdrukking van CaMKIIa in hierdie NAc subregion lokomotoriese sensitiwiteit na en selfadministrasie van amfetamien verhoog (Loweth et al., 2010). CaMKIIα kan beloning gedrag beïnvloed deur modulasie van AMPA glutamaat reseptor subeenhede (Pierce et al., 1998), aangesien CaMKIIα-aktiwiteit lank reeds geassosieer is met AMPA-reseptorfunksie en sinaptiese-teikening in verskeie vorme van neuroplastisiteit (Malinow en Malenka, 2002).

Hierdie literatuur demonstreer verskeie parallelle tussen ΔFosB en CaMKII: beide is nodig en voldoende vir veelvuldige gedragseffekte van dwelmmiddels, beide opreguleerde dendritiese stekels in verskillende neuronale seltipes in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), en albei oefen ten minste sommige van hul gedragseffekte deur modulasie van AMPA-reseptore (Kelz et al., 1999; Malinow en Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Ten spyte van hierdie parallelle, is geen funksionele skakel tussen ΔFosB en CaMKII bekend nie. Hier vestig ons wederkerige regulasie tussen ΔFosB en CaMKII en demonstreer dat die twee proteïene 'n MSX-spesifieke MSC-spesifieke toevoerlus in NAc-dop vorm wat deur kokaïen geïnduceerd word en 'n verskeidenheid kokaïenreaksies reguleer in vivo.

Spring na:

Materiaal en metodes

Eksperiment 1: iTRAQ Proteomiese Analise van NAc Skulp en Kern Na KokaïenbehandelingFig 1A)

Volwasse (8 weke) manlike rotte is vir sewe dae 20 mg / kg kokaïen of soutvoertuig IP toegedien. 24 uur na die laaste inspuiting, NAc dop en kern was mikrodissected (Fig 1A) en flits gevries. iTRAQ ontledings is uitgevoer soos voorheen beskryf (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figuur 1

Figuur 1

Skelspesifieke induksie van CaMKII in NAc deur kokaïen

Eksperiment 2: Kwantifisering van proteïenveranderinge in rat NAc Kern en Skulp Na KokaïenbehandelingFig 1B-D)

Volwasse (8 weke) manlike rotte is een keer per dag vir sewe dae in lokomotoriese opnamekamers 10 mg / kg kokaïen of soutvoertuig-IP toegedien. Lokomotoriese reaksies op 'n enkele inspuiting van kokaïen (5 mg / kg IP) is aangeteken in die diere wat voorheen met kokaïen behandel is (genoem "chronies") en 'n gedeelte van diegene wat met sout behandel word (akute genoem) en lokomotoriese reaksies op sout alleen is aangeteken in die oorblywende chroniese sout behandelde diere (genoem "sout"). Lokomotoriese aktiwiteitstoetse is uitgevoer soos beskryf (Hiroi et al., 1997). Kortliks is volwasse manlike rotte geplaas in 18 "× 24" PAS oop veld opname bokse (San Diego Instruments) vir 30 min om te habituate, is 'n enkele IP inspuiting van sout gegee en gemonitor vir 'n addisionele 30 min, en was 'n enkel-IP-inspuiting van 5 mg / kg kokaïen en gemonitor vir 30 min.

24 uur na hierdie finale inspuiting, is rotte sonder narkose gedecapiteer om effekte van narkose op neuronale proteïenvlakke en fosfo-toestande te vermy. Brein is in 'n 1.2-mm-matriks (Braintree Scientific) gesny, en die teikenweefsel is verwyder in fosfaatbufferde soutbevattende protease (Roche) en fosfatase (Sigma Aldrich) inhibeerders met behulp van 'n 14 gauge punch vir NAc kern en 'n 12 gauge punch van die oorblywende weefsel vir NAc dop (Sien Fig 1A) en dadelik op droë ys gevries. Monsters is gehomogeniseer deur lig sonication in gemodifiseerde RIPA buffer: 10 mM Tris basis, 150 mM natriumchloried, 1 mM EDTA, 0.1% natriumdodecilsulfaat, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikoat, pH 7.4, protease- en fosfataseremmers soos hierbo. Na die toevoeging van Laemmli buffer, is proteïene geskei op 4-15% poliakrylamidegradientgels (Criterion System, BioRad) en Western Blotting is volgens die vervaardigerprotokolle volgens die Odyssey-stelsel (Li-Cor) uitgevoer.

Eksperiment 3: Kwantifisering van proteïenveranderinge in rat NAc-kern en -skulp na kokaïen-onttrekking (Fig 1E)

Volwasse (8 weke) manlike rotte is vir sewe dae 10 mg / kg kokaïen of soutvoertuig IP toegedien. 14 dae na die finale inspuiting is diere wat met sout behandel is, 'n ander soutinspuiting gegee (sout) genoem, en diere wat met kokaïen behandel is, is 'n ander soutinspuiting gegee (14 dagontrekking of 14d WD) of 'n enkele inspuiting van kokaïen genoem "14d WD Chal" vir uitdaging). Een uur na die finale inspuiting, is diere beslag gelê en Western blotting uitgevoer soos in eksperiment 2.

Eksperiment 4: Kwantifisering van proteïenveranderinge in rat NAc-kern en -skulp na kokaïen-selfadministrasie (Fig 2A-C)

Rotte is opgelei om 0.5 mg / kg / infusie van kokaïen in een uur sessies onder 'n vaste verhouding 1 skedule vir nege dae te administreer. Na nege baseline sessies, is die rotte verdeel in twee groepe gebalanseer deur kokaïen inname op die laaste twee sessies. Een groep rotte was toegelaat om kokaïen (0.5 mg / kg / infusie) self-administreer in een uur sessies (kort toegang, ShA) terwyl die ander groep rotte self-toegedien kokaïen in ses uur sessies (lang toegang, LgA ) vir tien addisionele dae (eskalasie sessies).

Breinafdelings is verwerk vir immunohistochemie soos beskryf (Perrotti et al., 2004). Hersiene is 18-24 uur perfundeer na die laaste blootstelling aan geneesmiddel, wat die afbreking van enige residuele FosB-proteïen in volle lengte veroorsaak, sodat alle oorblywende immunoreaktiwiteit ΔFosB weerspieël. Hierdie afbreking is bevestig deur Western blotting, wat geen beduidende kleuring met 'n teenliggaam getoon het teen die C-terminus van FosB in volle lengte wat nie ΔFosB herken nie (data nie getoon nie). Na sny in 35 μm afdelings, is die aantal ΔFosB immunopositiewe selle gekwantifiseer deur 'n blinde waarnemer in twee afdelings deur die NAc van elke rot, en gemiddelde waardes per 40 ×-veld is dan bereken per streek vir elke dier. Elke dier is beskou as 'n individuele waarneming vir statistiese analise. Streke van belangstelling is geïdentifiseer met behulp van Paxinos en Watson (Paxinos en Watson, 2007).

Kwantifisering van CaMKIIa immunoreaktiwiteit is uitgevoer met behulp van 'n lisensiestelsel soos beskryf (Covington et al., 2009). Geïntegreerde intensiteite van CaMKII en GAPDH is bepaal met Odyssey-sagteware. Resultate word aangebied as geïntegreerde intensiteitswaardes per mm2 en word aangebied as middel ± sem (n = 4-10 per groep). Waardes vir GAPDH is gebruik as verwysing om die CaMKII-intensiteit te normaliseer vir skyfie dikte en toestande.

Figuur 2

Figuur 2

Induksie van CaMKII in NAc-dop van selfadminerende rotte en menslike kokaïenverslaafdes

Eksperiment 5: Kwantifiserende proteïenvlakke in kokaïen-afhanklike mense (Fig 2D)

Prosedure

Postmortem menslike breinweefsel is van die Quebec Selfmoord-breinbank verkry (Douglas Geestesgesondheidsinstituut, Montreal, Quebec, Kanada). Die behoud van weefsel het wesenlik voortgegaan soos beskryf (Quirion et al., 1987). Kortliks, een keer onttrek, word die brein op nat ys in 'n Styrofoam-boks geplaas en na die fasiliteite van Quebec Selfmoordbreinbank gehaas. Hemisfere word dadelik geskei deur 'n sagittale snit in die middel van die brein, breinstam, en serebellum. Bloedvate, pineale klier, choroid plexus, half cerebellum en halwe breinstam word tipies van die linker halfrond gedek wat dan koronaal gesny word in 1 cm-dik snye voor bevriesing. Laasgenoemde halwe serebellum word sagities gesny in 1cm-dik snye voor bevriesing. Weefsels word gevries in 2-metielbutaan by -40 ° C vir ~ 60 sek. Alle gevriesde weefsels word afsonderlik in plastieksakke by -80 ° C gehou vir langtermyn stoor. Spesifieke breinstreke word ontleed uit bevrore koronale skywe op 'n vlekvrye staalplaat met droë ys oral om die temperatuur van die omgewing te beheer. Western blotting is uitgevoer soos beskryf in eksperiment 2.

kohort

Die kohort is saamgestel uit 37 manlike en 3 vroulike vakke, wat wissel tussen ouderdomme tussen 15-66 jaar. Alle vakke het skielik gesterf sonder 'n verlengde agonale toestand of langdurige mediese siekte. In elke geval is die oorsaak van die dood vasgestel deur die kantoor van Québec Coroner, en 'n toksikologiese skerm is uitgevoer met weefselmonsters om inligting oor medikasie en onwettige stofgebruik by die dood te verkry. Die vakgroep bestaan ​​uit 20-individue wat voldoen aan die SCID-I-kriteria vir kokaïenafhanklikheid. Die kontrolegroep bestaan ​​uit 20-vakke sonder geskiedenis van kokaïenafhanklikheid en geen groot psigiatriese diagnoses nie. Alle vakke is skielik dood van oorsake wat geen direkte invloed op breinweefsel gehad het nie. Groepe is aangepas vir gemiddelde vak ouderdom, verkoeling vertraag, en pH. Vir alle vakke is sielkundige outopsies uitgevoer soos voorheen beskryf (Dumais et al., 2005), wat ons toelaat om toegang te hê tot gedetailleerde gevalinligting oor psigiatriese en mediese geskiedenis, asook ander relevante kliniese en sosiodemografiese data. Kortom, 'n opgeleide onderhoudvoerder het die Gestruktureerde Kliniese Onderhoud vir DSM-IV Psigiatriese afwykings (SCID-I) met een of meer informante van die oorledene. 'N Paneel klinici het SCID-I-evaluerings, gevallestudies, skrywer se aantekeninge en mediese rekords nagegaan om konsensus psigiatriese diagnoses te verkry.

Eksperiment 6: Chromatienimmunoprecipitasie vir Rat NAc (Fig 3A-C)

Volwasse (8 weke) manlike rotte is vir sewe dae 10 mg / kg kokaïen of soutvoertuig IP toegedien. 24 uur na die laaste inspuiting, NAc-skulp en -kern is mikrodissected. Chromatienimmunoprecipitasie (ChIP) is uitgevoer om bilaterale NAc-stampe van dop of kern van sewe rotte per groep in 14 totale groepe te kombineer (98-diere, 7-kokaïenpoeljies, 7-soutwaterpole). Weefsels is verknoopt, gewas en gestoor by -80 ° C tot chromatin skeer deur sonikasie. Gesnyde chromatien is oornag geïnokubeer met teenliggame wat voorheen aan magnetiese krale gebind is (Dynabeads M-280, Invitrogen). Nie-immuun-IgG is as 'n beheer gebruik. Na omgekeerde kruisverbindings- en DNA-suiwering is qPCR gebruik om vlakke van CaMKIIa-promotor DNA te meet. Primers is ontwerp om 'n streek te versterk wat 'n AP-1-konsensus-volgorde bevat wat ~ 450 bp voor die transkripsie beginpunt (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA, Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA) geleë is.

Figuur 3

Figuur 3

Sel tipe- en streekspesifieke ΔFosB induksie van CaMKIIa in vivo

Eksperiment 7: Meting van CaMKII-transcript en proteïenuitdrukking met sel-tipe-spesifieke ΔFosB ooruitdrukking (Fig 3D)

Manlike bittertransgeniese muise afgelei van NSE-TTA (lyn A) × TetOp-ΔfosB (reël 11) en NSE-TTA (lyn B) × TetOp-vlag ΔfosB (lyn 11) muise (lyn XNUMX)Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) is op 100 μg / ml doxycycline opgevat en opgewek om ΔFosB uitdrukking tydens ontwikkeling te onderdruk. Kuilvarkens is op speenverdeling verdeel: die helfte het op doksisiklien gebly en die helfte is oorskakel na water en die diere is weke later 8 na 11 gebruik wanneer transkripsie-effekte van ΔFosB die maksimum is (Kelz et al., 1999; McClung en Nestler, 2003). Vir transkripsionele ontledings is muise vinnig onthoof, en brein is verwyder en op ys geplaas. Disseksies van NAc is geneem met 'n 14-gauge naaldpons en vinnig gevries op droë ys totdat RNA onttrek is. RNA isolasie, qPCR, en data-analise is uitgevoer soos voorheen beskryf (LaPlant et al., 2009). Kortliks, RNA is geïsoleer met TriZol-reagens (Invitrogen), verder gesuiwer met die RNAeasy-mikroset van Qiagen, en nagegaan vir kwaliteit met Agilent se Bioanalyzer. Reverse transkripsie is uitgevoer met behulp van iScript (BioRad). qPCR is uitgevoer met 'n Applied Biosystems 7900HT RT PCR stelsel met die volgende siklus parameters: 10 min by 95 ° C; 40 siklusse van 95 ° C vir 1 min, 60 ° C vir 30 sek, 72 ° C vir 30 sek; gegradeerde verwarming na 95 ° C om dissosiasie krommes te genereer vir die bevestiging van enkele PCR produkte. Immunohistochemiese ontledings van ΔFosB en CaMKIIa proteïen ekspressie is uitgevoer soos beskryf in eksperiment 4.

Eksperiment 8: Effekte van Intra-NAc D1 en D2 Dopamien Receptor Antagoniste op Kokaïen-Gemedieerde Proteïen Veranderinge (Fig 3H)

Volwasse (8 weke) manlike rotte is 10 mg / kg kokaïen of soutvoertuig ("voertuig" groep) toegedien, een keer per dag vir sewe dae. 30 min voor elke kokaïen inspuiting, was rotte IP toegedien óf die D1 reseptor antagonis SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" groep) of die D2 reseptor antagonist etiklopied (0.5 mg / kg, "D2 Ant" groep) , of 'n soutinspuiting inspuiting ("kokaïen" -groep). 24 uur na die finale inspuiting, is diere gedekapiteer en proteïene gekwantifiseer deur Western blotting soos per eksperiment 2.

Eksperiment 9: Effekte van AAV-gemedieerde ΔFosB ooruitdrukking op proteïenuitdrukking (Fig 4 A-C)

Stereotaxiese chirurgie is uitgevoer op volwasse manlike rotte (8 weke) om AAV-GFP (groen fluorescerende proteïen) of AAV-GFP-ΔFosB (AAV-GFP) te inspuitMaze et al., 2010). 33-gauge-naalde (Hamilton) was in diens vir alle operasies, waartydens 0.5 μl gesuiwerde hoëtiter-virus bilateraal oor 'n 5 min periode toegedien is, gevolg deur 'n addisionele 5 min na infusie rusperiode. Alle afstande word gemeet relatief tot Bregma: 10 ° hoek, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. 14 dae na die operasie, het diere 'n enkele IP-inspuiting van 10 mg / kg kokaïen in lokomotoriese moniteringskamers gegee om die gedragseffekte van ΔFosB ooruitdrukking te bepaal. 24 uur na hierdie finale inspuiting, is rotte per capita aangepak eksperiment 2, en weefsel-mikrodisseksie is onder fluorescensmikroskopiese leiding uitgevoer om GFP-positiewe NAc-weefsel te verkry. Western blotting is dan uitgevoer soos per Eksperiment 2.

Figuur 4

Figuur 4

ΔFosB is beide nodig en voldoende vir kokaïen-gemedieerde D1-reseptor afhanklike CaMKIIα induksie in NAc dop

Eksperiment 10: Effekte van AAV-gemedieerde ΔJunD-ooruitdrukking op kokaïen-afhanklike proteïenuitdrukking (Fig 4 D-F)

Stereotaksiese inspuiting van AAV-GFP of AAV-GFP-ΔJunD is uitgevoer soos per Eksperiment 8. 14 dae na die operasie, is diere vir sewe dae in lokomotoriese opname kamers 10 mg / kg kokaïen of soutvoertuig IP een keer per dag toegedien. Lokomotoriese reaksies op 'n enkele inspuiting van kokaïen (5 mg / kg IP) of sout is aangeteken. 24 uur na hierdie finale inspuiting, rotte is onthoof, weefsel geoes, en Westerse blotte uitgevoer soos in Eksperiment 9.

Eksperiment 11: In Vitro Proteïenkinase-toetse (Fig 5A-D)

Rekombinante CaMKIIa en ΔFosB is gesuiwer van insek selle (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), en proteïenkinase-toetse is uitgevoer (Colbran, 1993), soos voorheen beskryf. Kortliks is CaMKII op ys voorafgekink met 2.5 μM (of aangeduide konsentrasie) van ΔFosB, 1 mM Ca2+, 40 mM Mg2+, 15 μM kalmodulien, en 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilering is geïnisieer deur toevoeging van 200 μM ATP met of sonder [y-32P] ATP en toegelaat om voort te gaan vir 10 min by kamertemperatuur (Fig 5A & B) of 2 min op ys (Fig 5C & D). Produkte is opgelos deur Western blotting (Fig 5A & B) of deur autoradiogram en scintillatietelling (Fig B-D).

Figuur 5

Figuur 5

ΔFosB is 'n kragtige substraat vir CaMKIIa

Eksperiment 12: Identifikasie van Ser27 ΔFosB Fosforilering (Fig 5E)

In vitro kinase toetse is uitgevoer soos per eksperiment 11, proteïene is geskei deur SDS-PAGE, en bande wat ooreenstem met ΔFosB is uitgesny en onderwerp aan tandem massaspektrometrie. Die m / z opdragte van die ooreenstemmende ioon fragmente in al die panele is op die top van die ioonpieke gemerk. Nie alle fragmentione word gemerk as gevolg van spasiebeperkings nie. Oor die algemeen word die teks vir die fragment ioonetikette in swart gekleur, behalwe as hulle direk bewyse bevestig of voeg by die teenwoordigheid van die fosforileringsterreine van belang, in welke geval hulle in rooi gemerk is. Bewyse vir ruggraatfragmenteringsprodukte word in die volgordeuitleesing van die fosfopeptied aangebied met die bespeurde plek van fosforileringsresidu wat in rooi aangedui word met 'n enkele aminosuurbriefbenaming. Die numeriese beskrywing van die waargenome fragmentione word ook gemerk op die peptiedvolgorde as b en y ione. Die zoomfaktore vir die afdelings van die m / z-as om die onderste intensiteitsfragmentione te wys, word bo-aan elke fragmentmasspektrum gemerk. Die fragmentione wat in paneel H getoon word, bevestig die teenwoordigheid van Ser27-gefosforileerde isoform, maar binne 'n mengsel van ander gefosforileerde isoforme by plekke Ser28, Ser31, Ser34 en Thr37. Die teenwoordigheid van pa5, pa5-P, pb5 en pb5-P ione bevestig uniek die fosforilering van die Ser27 residu.

Eksperiment 13: Kwantifisering van Ser27 fosforilering (Fig 5F)

Standaard peptiede is ontwerp om die fosfaat- en nie-fosforvorme van Ser27 ΔFosB na te boots. Na sintese en suiwering is elke "swaar" idiotipiese peptied opgelos in 'n 50 / 50-acetonitril / waterbuffer en gestuur vir aminosuuranalise om absolute konsentrasie op die sintetiese peptiedvoorraadoplossing te bepaal. Elke "swaar" peptied is dan direk toegedien in die 4000 QTRAP massaspectrometer (MS) om die beste botsingsenergie vir MS / MS fragmentering en twee tot vier MRM oorgange te bepaal. Vervolgens is die netjiese "swaar" peptiede onderworpe aan LCMS op die 4000 QTRAP om peptiedseparasie te verseker. Die instrument is in die drievoudige vierhoeksmodus uitgevoer, met Q1 ingestel op die spesifieke voorloper m / z waarde (Q1 skandering nie) en Q3 gestel op die spesifieke m / z waarde wat ooreenstem met 'n spesifieke fragment van daardie peptied. In die MRM-modus is 'n reeks enkelreaksies (voorloper / fragmention oorgangs waar die botsingsenergie ingestel is om die intensiteit van die fragment-ione van belang te optimaliseer) opeenvolgend gemeet en die siklus (tipies 1-2 sek) is dwarsdeur geloop. die hele tyd van die HPLC skeiding. MRM-oorgange is bepaal uit die MS / MS-spektra van die bestaande peptiede. Twee oorgange per peptied, wat ooreenstem met hoë intensiteitsfragmentione, is dan gekies en die botsingsenergie is geoptimaliseer om seinsterkte van MRM-oorgange te maksimaliseer deur gebruik te maak van outomatisasie sagteware. Pieke wat voortspruit uit standaardpeptiede en ΔFosB-monsters wat aan CaMKII of beheer blootgestel is, is dan vergelyk om die absolute oorvloed van elke peptiedvorm in die reaksie te bepaal. Data analise op LC-MRM data word uitgevoer met behulp van AB Multiquant 1.1 sagteware.

Eksperiment 14: Induksie van ΔFosB in CaMKII ooruitdrukkende muise (Fig 5G & H)

Transgeniese muise wat T286D CaMKII oorexpresseer (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) en wilde tipe rommelmaats is opgewek in die afwesigheid van doxycycline om transgenuitdrukking toe te laat. Volwasse muise is 20 mg / kg kokaïen of soutoplossing IP een keer daagliks toegedien vir 14 dae. 24 uur na die finale inspuiting, is diere onthoof en immunohistochemie en kwantifisering van ΔFosB uitdrukking is uitgevoer soos in eksperiment 4.

Eksperiment 15: Effekte van HSV-gemedieerde ΔFosB ooruitdrukking en CaMKII remming op NAc Dendritiese Spines (Fig 6A-E)

Volwasse manlike muise (8 weke) is stereotaksies ingespuit in NAc met HSV-GFP, HSV-GFP-FosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, of HSV-GFPAC3I-ΔFosB. In hierdie konstrukte is AC3I, 'n peptied-gebaseerde inhibitor van CaMKII-aktiwiteit, gefuseer na die C-terminus van GFP. GFPAC3I is gekloneer deur PCR met die pMM400-vektor wat GFPAC3I bevat as 'n sjabloon met die volgende primers: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Die gevolglike PCR-produk is in die p1005 + en p1005 + -Δ FosB-vektore ingebou deur NheI- en BspEI-werwe te gebruik. Die konstruksie is deur sekwensering gevalideer. Stereotaksiese koördinate was: 10 ° hoek, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfusie en brein snitwerk is uitgevoer soos per eksperiment 4.

Spinale analise is uitgevoer soos beskryf (Christoffel et al., 2011). Kortliks is dendritiese segmente 50-150 μm van die soma willekeurig gekies uit HSV-geïnfekteerde selle wat GFP uitdruk. Beelde is op 'n konfokale LSM 710 (Carl Zeiss) verkry vir morfologiese analise deur NeuronStudio te gebruik met die Rayburst-algoritme. NeuronStudio klassifiseer stekels soos dun, sampioen of stompie, gebaseer op die volgende waardes: (1) -verhouding, (2) kop tot nek verhouding, en (3) kop deursnee. Stekels met nek kan as dun of sampioen geklassifiseer word, en dié sonder 'n beduidende nek word as stomp geklassifiseer. Spies met 'n nek is gemerk as dun of sampioen, gebaseer op die deursnee.

Figuur 6

Figuur 6

Blokkeer van CaMKII-aktiwiteit voorkom die morfologiese en gedragseffekte van ΔFosB in NAc

Eksperiment 16: Effekte van HSV-gemedieerde ΔFosB ooruitdrukking en CaMKII inhibisie op kokaïenresponse (Fig 6F)

Volwasse manlike muise is met virusse ingespuit eksperiment 15, en lokomotoriese response op 'n enkele 5 mg / kg inspuiting van kokaïen is gemeet soos per Eksperiment 9. Lokomotoriese data word uitgedruk as totale balkbreuk oor 30 min na kokaïen inspuiting.

Ekstra inligting

Dierbehuising

Manlike Sprague Dawley-rotte (250-275 g; Charles River Laboratories) was twee-gehuisves. Agt-week-oue C57BL / 6J manlike muise (The Jackson Laboratory) was groep gehuisves met 'n maksimum van vyf diere per hok. Alle diere is in die 1-uur-donker-siklus (23: 25 AM) by 12-7 AM ingehok vir toegang tot voedsel. en water ad libitum. Eksperimente is uitgevoer in ooreenstemming met die riglyne van die Vereniging vir Neurowetenschappen en die institusionele dieresorg- en gebruikskomitee (IACUC) op Mount Sinai.

dwelms

Dwelms is toegedien IP en opgelos in steriele sout, insluitende kokaïen (5-20 mg / kg per 10 μl vir muise, per 1 ml vir rotte, NIDA) en SCH 23390 of etiklopiedhidrochloried (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . Vir stereotaksiese chirurgie is muise in steriele sout narkose met 'n "cocktail" van ketamien (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) (Henry Schein) verdov.

teenliggaampies

CaMKIIa (totaal): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (totaal): Selsignaal 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfor-Ser27: Fosforolusies, 1: 500

GluA1 (totaal): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfa-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfa-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistiese Analise

Alle statistiese analises is uitgevoer met behulp van die Prism 6 sagteware pakket (GraphPad). Studente se t-toetse is gebruik vir alle tweevoudige vergelykings (aangedui in die resultate waar t waarde gegee word), en eenrigting-ANOVA's is gebruik vir alle veelvoudige vergelykings (aangedui in die resultate afdeling waar F-waarde gegee word).

Spring na:

Results

Chroniese Kokaïen veroorsaak CaMKII in die NAc Shell

Baie studies het aangedui dat MSN's in die NAc-dop en -kern verskillende biochemiese en fisiologiese reaksies het op chroniese blootstelling aan dwelmmiddels (mishandeling)Kourrich en Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) en dat die twee subregio's dwelmversoekende gedrag differensieel reguleer (Ito et al., 2004). Om die differensiële effekte van kokaïen op die proteïenkomponente van NAc-dop te bepaal teen kern, gebruik ons ​​Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) en tandem massaspektroskopie (MS / MS). Volwasse manlike rotte is daagliks geïnspireer met kokaïen (20 mg / kg) of sout vir 7 dae; 24 uur na die laaste inspuiting, NAc dop en kern was mikrodissected (Fig 1A) en flits gevries. Proteïene in hierdie monsters is dan gekwantifiseer met behulp van iTRAQ. Al vier CaMKII isoforms vertoon groot toenames in uitdrukking na kokaïenbehandeling wat spesifiek vir NAc-dop in vergelyking met kern was. Verskeie proteïenfosfatases, insluitende PP1 katalitiese en regulerende subeenhede en PP2A, wat voorheen geassosieer is met verskeie CaMKII-substrate in ander stelsels (Colbran, 2004), volg 'n soortgelyke patroon. Hierdie bevindings verskaf nuwe, onbevooroordeelde bewyse dat die CaMKII seinroete prominent deur kokaïen in NAc op 'n dopspesifieke wyse gereguleer word.

Om hierdie bevinding meer kwantitatief te bekragtig, het ons rote soos hierbo behandel met kokaïen (teen wisselende dosisse) of sout behandel en die lokomotoriese response gemeet aan 'n kokaïen (5 mg / kg) of soutuitdagingsdosis. Herhaalde blootstelling aan 10 mg / kg kokaïen het gelei tot die tipiese patroon van lokomotoriese sensitiwiteit (Fig 1B). Verdere studies met hierdie doseringsregime het aan die lig gebring deur die gebruik van Western blotting, wat herhaalde kokaïen selektief CaMKIIa induceer in NAc-skulp 24 uur na die finale inspuiting van kokaïen (Fig 1C en D; p = 0.0019; F = 7.943; DF = 29). Daarbenewens het fosforilering van die kanoniese CaMKII-substraat Ser831 van die GluA1-subeenheid van die AMPA-reseptor aansienlik toegeneem in NAc-dop en nie kern nie (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), terwyl CaMKIIa Thr286-autofosforilering 'n sterk maar nie beduidende neiging tot induksie in dop alleenlik (Fig 1D). Verskeie ander glutamaatreseptore was onaangeraak. In teenstelling met hierdie maatstawwe van CaMKII het dieselfde weefselmonsters induksie van ΔFosB in beide dop (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) en kern (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) van die NAc (Fig 1C en D), in ooreenstemming met vorige bevindinge (Perrotti et al., 2008).

Aangesien verskeie vorige studies van kokaïenregulering van AMPA-reseptore diere ontleed het na ~ 14 dae van onttrekking uit chroniese kokaïen (sien Bespreking), het ons hierdie biochemiese ontledings op hierdie tydstip herhaal. Ons het gevind dat, 14 dae na die finale inspuiting van kokaïen, ΔFosB verhef bly in NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), terwyl geen CaMKII of fosforilering van GluA1 Ser831 steeds toeneem nie (Fig 1E). Maar 1 uur na 'n enkele 10 mg / kg-uitdagingsdosis kokaïen, vlakke van totale CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) en van GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilering word albei verhef tot 'n mate wat soortgelyk is aan die wat gevind word na die aanvanklike chroniese kokaïenblootstelling (Fig 1E). Hierdie data dui daarop dat die NAc-dopneurone geplaas word vir CaMKII-induksie tydens verlengde periodes van onthouding, miskien via direkte priming van die CaMKII-genpromotor (sien Bespreking). Verder is die feit dat ΔFosB induksie meer aanhoudend is as CaMKII induksie, die bestaan ​​van addisionele meganismes, of dit op chromatin gebaseer is of andersins, 'n "rem" op CaMKII regulasie uitoefen, soos in die bespreking behandel.

Om hierdie waarnemings verder te versterk, het ons modelle van kokaïen-selfadministrasie ondersoek, wat die willekeurige dwelminname behels. Volwasse manlike rotte het kort of lang toegang tot kokaïen gegee; soos verwag (Ahmed en Koob, 1998), het slegs lang toegangstoestande gelei tot die toenemende selfadministrasie van die dwelm (Fig 2A). ΔFosB is in 'n groter mate deur 'n lang tyd geïnduseer teen Kort toegang tot kokaïen in beide NAc dop (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) en kern (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). In teenstelling hiermee is CaMKIIa slegs in die NAc-skulp geïnduseer deur lang toegang tot kokaïen (Fig 2B en C; p = 0.0236; F = 4.957; DF = 16). Dit is interessant om die gemiddelde daaglikse kokaïen inname te vergelyk met kort toegangsdiere (12 mg / kg IV), diere met lang toegang (~ 70 mg / kg IV) en diere wat eksperimente toegedien het (10 mg / kg) en vra hoekom laasgenoemde robuuste induksie van ΔFosB en CaMKII ontlok terwyl kort toegang nie. Hierdie afwyking is waarskynlik te wyte aan verskille in piek-kokaïenvlakke (eksperimentele-toegedien kokaïen word gegee as 'n enkele bolus-IP, terwyl selfgeadministreerde kokaïen gelewer word via meervoudige IV dosisse) of deur verskille in lengte van geneesmiddelblootstelling (7 dae vir eksperimente administrasie, 19 dae vir selfadministrasie).

Ten spyte van die groot literatuur oor ΔFosB en CaMKII in kokaïenwerking, is daar geen studies van hierdie proteïene in menslike kokaïengebruikers nie. Hier bied ons die eerste bewys aan dat vlakke van beide ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) en CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) verhoog word in NAc van kokaïenafhanklike menseFig 2D, Tabel 1). Hierdie data dui aan dat ons ondersoek van ΔFosB en CaMKII induksie deur kokaïen in knaagdier NAc klinies relevant is vir menslike kokaïenverslawing.

Tabel 1

Tabel 1

Karakterisering van monsters van menslike kokaïenverslaafdes en ooreenstemmende kontrolegroep

ΔFosB Reguleer CaMKII Transkripsie Selektief in D1-Type MSNs van NAc Shell

Die bevinding dat beide CaMKII en ΔFosB opgereguleer word deur kokaïen in die knaagdier NAc, het ons geleer om te bepaal of ΔFosB transkripsie van die CaMKII geen kan reguleer. Ons het voorheen CaMKIIa gerapporteer as 'n moontlike teiken vir ΔFosB in 'n onbevooroordeelde microarray-analise van NAc (McClung en Nestler, 2003), maar hierdie bevinding is nie verder in die studie gevalideer nie. Ons het eerstens kwantitatiewe ChIP (qChIP-ChIP gevolg deur kwantitatiewe PCR) gebruik om te bepaal of ΔFosB aan die CaMKIIa-genpromotor in NAc van volwasse manlike rotte bind, en gevind opvallend dat hierdie binding aansienlik verhoog word deur chroniese kokaïenadministrasie in die dop ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), maar nie die kern, substreek (Fig 3A). Om die meganismes wat verband hou met hierdie subregio-spesifieke verskil in ΔFosB binding aan die CaMKIIa promotor verder te verstaan, het ons qChIP gebruik om die toestand van histon-modifikasies by hierdie genomiese streek te karakteriseer. Vorige studies het kokaïeninduksie van H3-asetilering by die CaMKIIa-promotor in totale muis NAc (Wang et al., 2010). In teenstelling hiermee het ons gevind dat kokaïen H3-asetilering by die CaMKIIa-promotor selektief in NAc-kern verminder (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), met geen verandering wat in dop voorkombaar is nie, in ooreenstemming met subregion-spesifieke chromatienveranderings buite ΔFosB binding. qChIP vir die onderdrukkende punt, gedimethyliseerde H3 lysine 9 (H3K9me2), onthulde tendense vir afname in beide die dop en kern subregioene (Fig 3C).

Om vas te stel of ΔFosB CaMKIIα transkripsie reguleer in vivo, het ons twee bisransgeen muislyne gebruik wat indirek ΔFosB oordruklik uitdruk in D1 teen D2-tipe MSN's op 'n wyse wat beheer word deur doxycycline toediening in drinkwater (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Volwasse manlike muise wat ΔFosB oordruklik uitsluitlik in D1-tipe MSNs oorreed, het die vlakke van CaMKIIa mRNA in NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13) oorskadu, 'n effek wat nie gesien word in muise wat ΔFosB oorwegend uitdruk in D2-tipe MSNs nieFig 3D). Die toename in CaMKIIa-mRNA, geïnduceer deur ΔFosB-uitdrukking in D1-tipe MSNs, is gepaardgaande met 'n gepaardgaande toename in CaMKIIa-proteïen in beide NAc-dop (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) en kern (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Figs 3E en F). Hierdie data toon dat ΔFosB in staat is om CaMKIIa-genexpressie in D1-tipe MSNs in beide subregio's te bestuur, alhoewel Figuur 3B stel voor dat kokaïen-gemedieerde chromatien by die CaMKIIa-promotor verander (bv. verminderde asetilering) voorkom dat ΔFosB van opregulasie van CaMKII in die kern subregio na kokaïen voorkom.

Aangesien ons transgeniese muisdata aangedui het dat ΔFosB-induksie van CaMKII-geenuitdrukking spesifiek is vir D1-tipe MSN's in NAc, het ons daarna probeer bepaal of kokaïenafhanklike opregulering van CaMKII aktivering van die D1-dopamienreseptor benodig. Volwasse manlike rotte is soos voorheen chroniese kokaïen of sout toegedien, maar 30 minute voor elke inspuiting is rotte in die kokaïengroep IP-inspuiting van soutoplossing, die D1-antagonis SCH 23390 (0.5 mg / kg), of die D2-reseptorantagonis etiklopried gegee. (0.5 mg / kg). Diere is 24 uur na die laaste inspuiting van kokaïen geanaliseer. Western blotting het aan die lig gebring dat die D1, maar nie die D2 nie, die kokaïen-gemedieerde toename in ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18) heeltemal geblokkeer het, soos vroeër berig (Nye et al., 1995), sowel as in CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G en H). Hierdie data ondersteun die hipotese dat kokaïen 'n ΔFosB-gemedieerde toename in CaMKII-gene-uitdrukking spesifiek in D1-tipe MSN's van NAc-skaal betrek. Dit sal in toekomstige studies belangrik wees om direk hierdie sel-tipe spesifieke effek van kokaïen op CaMKII-uitdrukking binne hierdie breinstreek te demonstreer.

ΔFosB is beide noodsaaklik en voldoende vir kokaïeninduksie van CaMKII in NAc Shell

Om die gebruik van bittertransgeniese muise te vul, het ons die rol van ΔFosB bestudeer om kokaïeninduksie van CaMKIIa te bemiddel deur gebruik te maak van virus-gemedieerde geenoordrag in rotte. Ons het adeno-geassosieerde virale (AAV) deeltjies in die NAc-skulp van volwasse manlike rotte (waar skulp selektief geteiken kan word) geïnspireer om ΔFosB plus GFP of GFP alleen te oordruk. Die diere is dan 'n enkele IP-inspuiting van 10 mg / kg kokaïen gegee. Die diere wat ΔFosB / GFP ooruitdruk het, het 'n verhoogde lokomotoriese reaksie getoon in vergelyking met diere wat GFP alleenlik uitdruk (Fig 4A). 24 uur na die enkele kokaïen inspuiting, GFP-positiewe NAc weefsel is uitgesny van hierdie diere deur disseksie onder 'n fluoresserende ligbron. Westerse blotting van hierdie weefsel (Fig 4B en C) het sterk ΔFosB ooruitdrukking asook 'n beduidende toename in totale CaMKIIa proteïen vergeleke met GFP-diere (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), gelyk aan die induksie wat met chroniese kokaïenadministrasie gesien is. Daarbenewens is CaMKIIa-autofosforylering by Thr286 (dui op ensiemaktivering) verhoog deur ΔFosB ooruitdrukking (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), soos fosforilering van die CaMKII-substraat, Ser831 van GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), weer die aksies van chroniese kokaïen naboots (Fig 1C en D). Taken saam, hierdie data verskaf verdere bewyse dat ΔFosB uitdrukking in NAc dop is voldoende vir lokomotoriese sensitiwiteit vir kokaïen en vir CaMKII induksie en aktivering in hierdie subregio.

Ons het 'n soortgelyke benadering gebruik om te bepaal of ΔFosB ook nodig is vir kokaïen-gemedieerde induksie van CaMKIIa in die NAc-dop. AAV is gebruik om 'n afgeknotte JunD-proteïen te oordruk, wat ΔJunD genoem word, wat 'n negatiewe regulator van ΔFosB transkripsionele aktivering is (Winstanley et al., 2007) plus GFP of GFP alleen. Twee weke later, wanneer transgeniese uitdrukking maksimaal is, word diere kokaïen (10 mg / kg) of sout per dag vir 7 dae gegee, en getoets vir lokomotoriese response na 'n kokaïenuitdaging (5 mg / kg) 24 uur na die laaste chroniese inspuiting (Fig 4D). ΔJunD ooruitdrukking verhoed lokomotoriese sensitiwiteit vir kokaïen, en het ook CaMKIIα-induksie en aktivering in NAc-dop verhoed (Fig 4E en F; p = 0.0437; F = 2.997; totale df = 38), wat aandui dat ΔFosB transkripsie-aktiwiteit nodig is vir kokaïen-gemedieerde induksie van CaMKIIa in hierdie subregio. Interessant genoeg het ons gevind dat ΔJunD die vlakke van ΔFosB verminder onder beide sout- en kokaïenbehandelde toestande (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), wat die nuwe moontlikheid verhoog dat ΔFosB afhang van AP-1-aktiwiteit vir sy eie uitdrukkingsvlakke.

CaMKII fosforilate ΔFosB by Ser27

Die gebruik van vitro proteïen kinase toetse, het ons vasgestel dat gesuiwerde ΔFosB 'n sterk substraat vir CaMKIIa is. Inkubasie van Sy6-ΔFosB met CaMKIIα en ATP veroorsaak 'n opwaartse verskuiwing in elektroforetiese mobiliteit van ΔFosB (Fig 5A); die verskeie gevolgde bande het verskeie terreine van fosforilering voorgestel. soortgelyke vitro kinase toetse wat [γ-32P] ATP het inkorporeer van radiolabelde fosfaat in die verskuifde ΔFosB-bande (Fig 5B), wat direkte fosforilering van die proteïen aantoon. Ons het 'n fosforspesifieke antiliggaam gegenereer aan die voorheen gekarakteriseerde Ser27 van ΔFosB (Ulery et al., 2006). Terwyl hierdie antilichaam nie 'n sein lewer teen brein uittreksels wat Ser27-gefosforileerde ΔFosB bevat nie (data nie getoon nie), was ons in staat om Ser27 fosforilasie in die vitro kinase-toets met behulp van CaMKII (Fig 5B). Kinetiese ontledings van die CaMKII fosforilering van ΔFosB dui daarop dat dit 'n kragtige substraat vir die kinase is (Fig 5C), met 'n oënskynlike KM van 5.7 ± 2.0μM en KKAT van 2.3 ± 0.3min-1. Hierdie resultate is vergelykbaar met baie goed gekenmerk in vivo substrate van CaMKII (Colbran en Brown, 2004). Daarbenewens het ons vasgestel dat CaMKII fosfileer ΔFosB met 'n stoïgiometrie van 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), wat aandui dat daar ten minste drie plekke van CaMKII fosforilering binne die His is6-AFosB proteïen, in ooreenstemming met Fig 5A.

Om individuele plekke van fosforilering te ondersoek, het ons MS ontledings van monsters van ons gebruik vitro kinase toetse. Fig 5E demonstreer ΔFosB fosforilering by die voorheen gekarakteriseerde Ser27 en by verskeie bykomende terreine (data nie getoon nie). Gegewe die vorige funksionele karakterisering van Ser27, het ons op hierdie webwerf gefokus deur die genereer van gemerkte sintetiese peptiede wat die fosfor- en nie-fosfo-toestande van Ser27 naboots, en dan gebruik bekende hoeveelhede van hierdie peptiede as standaarde in MRM-ontledings van ΔFosB voor en na vitro fosforilering deur CaMKII. Volgende kwantitasie (Fig 5F) bevestig dat Ser27 'n kragtige substraat vir CaMKII is. Hierdie resultate dui daarop dat, onder meer fosforileerde residu's binne ΔFosB, Ser27 'n besonder effektiewe substraat vir CaMKII is.

CaMKII bemiddel kokaïen-akkumulasie van ΔFosB in die NAc-skulp

Aangesien CaMKII fosfileer ΔFosB vitro op 'n webwerf wat sy stabiliteit dramaties verhoog vitro en in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), het ons bepaal of CaMKII aktiwiteit ΔFosB vlakke in NAc beheer in vivo. Om hierdie vraag aan te spreek, het ons eers 'n muislyn gebruik wat 'n kalsium-onafhanklike mutant van CaMKIIa (T286D) in verskeie breinstreke insluit, insluitende NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Ons het een keer daagliks vir 20 dae eenjarige volwassenes manlike mutant- en wildtipe rommelmaats met 14 mg / kg kokaïen of sout geïnspireer, dan die diere een dag na die finale inspuiting geanaliseer. Ons het gevind dat basale vlakke van ΔFosB in die mutante diere in NAc-skulp verhoog is (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), maar nie kern nie (Fig 5G en H). Verrassend is kokaïenafhanklike induksie van ΔFosB geblokkeer in die mutante diere in beide dop en kern, wat daarop dui dat, alhoewel CaMKII direk ΔFosB-stabiliteit in NAc-dop reguleer, kan dit ook stroomop stroom van ΔFosB in kokaïen-geaktiveerde weë in beide NAc-subregio's .

CaMKII-aktiwiteit is nodig vir ΔFosB-gemedieerde struktuur- en gedragsplastisiteit

Kokaïen-induksie van dendritiese stekels op NAc-MSN's is een van die mees gevestigde dwelmgeïnduceerde aanpassings in hierdie breinstreek, en sulke ruggraatinduksie is gekorreleer met sensitiewe gedragsreaksies op die geneesmiddel (Robinson en Kolb, 2004; Russo et al., 2010) en berig dat dit selektief is vir D1-tipe MSNs (Lee et al., 2006). Ons het onlangs bewys dat kokaïeninduksie van dendritiese stekels in NAc afhanklik is van ΔFosB en die stroomafwaartse transkripsionele program (Maze et al., 2010). Alhoewel daar 'n uitgebreide literatuur is oor die betrokkenheid van CaMKII in dendritiese ruggraat morfologie en induksie in ander breinstreke en eksperimentele sisteme (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), is sy rol in NAc MSN ruggraatvorming nie bestudeer nie. Daarom het ons vasgestel of CaMKII-aktiwiteit benodig word vir ΔFosB-gemedieerde induksie van MSN dendritiese stekels deur gebruik te maak van HSV-gemedieerde ooruitdrukking van die CaMKII inhibeerpeptied AC3I gefuseer tot GFP, 'n konstruksie wat voorheen getoon is om CaMKII-aktiwiteit te inhibeer in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Virale ooruitdrukking van ΔFosB in NAc-dop van volwasse muise het 'n beduidende toename in MSN dendritiese ruggraatdigtheid veroorsaak (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A en B) soos voorheen gerapporteer (Maze et al., 2010), en hierdie toename is hoofsaaklik gedryf deur dun (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) en stomp (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) ruggraatsoorte (albei gedink onvolwasse stekels)Fig 6C-E). Geen effek is op meer volwasse, sampioene-vormige stekels gesien nie. Wanneer GFP-AC3I egter saamgepers is, is ΔFosB-induksie van stekels heeltemal opgehef (Fig 6A-E), wat aandui dat CaMKII-aktiwiteit benodig word vir ΔFosB-induksie van dendritiese stekels in NAc-dop.

Ons het dieselfde virale gereedskap gebruik om te bepaal of CaMKII-aktiwiteit benodig word vir ΔFosB se effekte op gedragsensitiwiteit vir kokaïen. 72 uur na virale inspuiting in NAc-skulp, is diere 'n enkele inspuiting van 5 mg / kg kokaïen gegee en hulle lokomotoriese aktiwiteit is aangeteken. Soos voorheen getoon met meer uitgebreide AAV ooruitdrukking van ΔFosB (Fig 4A), HSV-gemedieerde ooruitdrukking van ΔFosB verhoogde lokomotoriese sensitiwiteit vir kokaïen (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Soos met die induksie van dendritiese stekels, het inhibisie van CaMKII-aktiwiteit deur middel van gesamentlike ekspressie van GFP-AC3I die ΔFosB-gemedieerde toename in kokaïen-sensitiwiteit volledig geblokkeer. Dit dui daarop dat CaMKII-aktiwiteit benodig word vir ΔFosB-geïnduceerde veranderinge in die gedragseffekte van kokaïen.

Spring na:

Bespreking

Die huidige studie beskryf 'n nuwe feed-forward meganisme waar kokaïen ΔFosB in NAc induceer, wat die transkripsie van die CaMKIIa-gen selektief in NAc-dop opreguleer. CaMKIIα fosforilateer en stabiliseer vervolgens ΔFosB wat lei tot groter ΔFosB akkumulasie en verdere CaMKIIα induksie (Fig 6G). Die mede-escalerende vlakke van die twee proteïene tydens kroniese blootstelling aan kokaïen dra dan by tot noodsaaklike maniere om sensitiewe gedragsresponse op die geneesmiddel te gee. Dit is 'n besonder aantreklike hipotese, aangesien beide ΔFosB en CaMKII albei gedemonstreer is om benodig te word vir verhoogde gedragsreaksies op kokaïen (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), en ons repliseer hierdie bevinding vir ΔFosB in NAc-dop, spesifiek met behulp van 'n virale benadering (Figs 4 en and66).

Alhoewel transgene ΔFosB ooruitdrukking in D1-tipe MSNs CaMKII-induksie kan dryf in beide NAc-dop en kern van kokaïen-naïewe diere, in die konteks van kokaïen, die ophoping van endogene ΔFosB, wat in beide subregio's voorkom, dryf induksie van CaMKII spesifiek in NAc-dop . Hierdie verskil kan verband hou met die hoër vlakke van ΔFosB wat in ons bittertransgeniese model geïnduseer word. Dit kan egter ook die vermoë van kokaïen weerspieël om die CaMKIIa-promotor differensieel te verander in die dop teen kern MSNs om ΔFosB binding in die voormalige te bevorder of dit in laasgenoemde substreek uit te sluit. Trouens, ons ChIP-data, wat 'n kokaïen-gemedieerde deacetylering van histone by die CaMKIIa-genpromotor in slegs NAc-kern openbaar, ondersteun die moontlike betrokkenheid van 'n chromatienmeganisme. In ooreenstemming met hierdie hipotese was ΔFosB ooruitdrukking in D1-tipe MSNs in staat om CaMKIIα-induksie in NAc-kern te dryf in die afwesigheid van kokaïen (Fig 3F), wat daarop dui dat daar aktiewe wysigings van die CaMKIIa-promotor is wat hierdie induksie tydens chroniese kokaïen blootstelling voorkom. Regulering van die chromatien landskap by die CaMKII promotor kan ook verduidelik waarom CaMKII geïnduceer word deur 'n uitdagingsdosis kokaïen in NAc-dop van chroniese kokaïen-onttrekkende rotte (Fig 1E) maar nie van dwelm-naïewe diere nie (Fig 1D). Dit kan 'n epigenetiese "geen priming" effek van ΔFosB verteenwoordig (Robison en Nestler, 2011), en kan dus een molekulêre meganisme wees van die inkubasie van kokaïen-drang (Pickens et al., 2011). Aangesien hierdie chromatinverandering egter oorsaaklik verband hou met inkubasie van drang, sal dit met verloop van tyd moet toeneem. Dit sal interessant wees om te bepaal of dit die geval is, en om vas te stel of ander gene ΔFosB-afhanklike, substreekspesifieke regulasie deur kokaïen toon. Dit is ook belangrik om daarop te let dat die feed-forward lus wat ons beskryf nie lei tot 'n eindelose ophoping van CaMKII of ΔFosB (Fig 1E); die ontbinding van die molekulêre "rem" wat hiervoor verantwoordelik is, is 'n belangrike doelwit vir toekomstige studies.

Die bekende funksies van ΔFosB en CaMKII in verskeie eksperimentele stelsels en breinstreke kom op baie vlakke saam (Fig 6F). Albei molekules is nou gekoppel aan dendritiese ruggraatgroei: CaMKII interaksie met die aktien sitoskelet (Okamoto et al., 2009), reguleer ruggraatkopgrootte (Matsuzaki et al., 2004), en is beide nodig en voldoende vir plastisiteitsgeïnduceerde toenames in filopodia en sinapsnommer in hippokampale organotipiese sny kulture (Jourdain et al., 2003), wHile ΔFosB is beide nodig en voldoende vir kokaïen-geïnduceerde dendritiese ruggraatvorming in NAc MSNs (Maze et al., 2010). Daarbenewens is albei molekules geassosieer met die regulering van AMPA glutamaatreseptore. CaMKII reguleer nie die totale vlakke van AMPA-reseptor subeenhede nie, maar dryf die invoeging van AMPA-reseptore in sinapse en verhoog AMPA-kanaalkonduktansie deur GluA1 by Ser831 in hippokampale piramidale neurone in kultuur te fosforiliseer. in vivo (hersien in (Malinow en Malenka, 2002; Colbran en Brown, 2004)). Sodanige toename in die handel in GluA1 tot die sinaps is ook in chroniese kokaïene-aksie betrek (Boudreau en Wolf, 2005). Daarbenewens word gedragsreaksies vir AMPA-reseptoraktivering in NAc verbeter deur CaMKIIa-ooruitdrukking in 'n D1-dopamienreseptor afhanklike wyse (Sanger et al., 2010). Langtermyn D1-spesifieke ooruitdrukking van ΔFosB het getoon dat GluA2 transkripsie in NAc (Kelz et al., 1999), wat AMPA-reaksies bemoeilik via GluA1, terwyl ons hier wys dat korter termyn ΔFosB ooruitdrukking sowel as korter blootstelling aan kokaïene-geen effek op hierdie subeenheid het nie (Fig 1). Nietemin het ons onlangs gevind dat korttermyn ΔFosB ooruitdrukking verminder AMPA-reaksies in D1-tipe MSNs in NAc (Grueter et al., 2013). Hierdie data dui tydelik afsonderlike meganismes aan wat 'n tydsafhanklike reeks neuro-aanpassings aan kokaïen kan vorm wat verskillende aspekte van verslawingprogressie nog nie goed verstaan ​​nie. Op die gedragsvlak word beide CaMKII en ΔFosB benodig vir lokomotoriese sensitiwiteit vir kokaïen (sien hierbo), en albei word benodig vir volgehoue ​​kokaïen-selfadministrasie by knaagdiere (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), wat daarop dui dat die twee proteïene belangrik is vir beide kort- en langtermyn-gedragsaanpassings tot geneesmiddelblootstelling, alhoewel via gedeeltelik duidelike onderliggende meganismes. Vermoedelik, ΔFosB en CaMKII reguleer sulke komplekse gedragsaanpassings deur veranderinge in NAc-sinaptiese funksie, alhoewel baie verdere werk nodig is om sinaptiese fenomeen direk aan gedragsverandering te koppel.

Die CaMKII holoenziem wissel gelyktydig met 'n verskeidenheid sinaps-geassosieerde proteïene (Robison et al., 2005) wat gedink word om sy teiken na die postsynaptiese digtheid (PSD) te reguleer, 'n verskynsel wat voorgestel word vir sinaptiese plastisiteit belangrik. In die besonder is die interaksie van CaMKII met die GluN2B subeenheid van die NMDA-tipe glutamaatreseptor onlangs getoon om beide sinaptiese plastisiteit en leer te reguleer (Halt et al., 2012). Terwyl die AC3I-peptied die auto-inhibitiewe domein van CaMKII naboots en dus ensiem katalitiese aktiwiteit inhibeer, blokkeer dit ook verskeie proteïen-proteïen interaksies (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Die gedrags- en morfologiese effekte van HSV-GFP-AC3I wat hier gerapporteer word, kan dus voorkom deur verminderde fosforilering van CaMKII-teikenproteïene, veranderinge in CaMKII-teikening, of 'n verandering in die voorgestelde strukturele rol van CaMKII by sinapse (Lisman et al., 2002).

Die beperking van die voorgestelde ΔFosB-CaMKII-lus na die NAc-dop is van besondere belang, aangesien onlangse werk verskeie fisiologiese verskille tussen die NAc-dop en kern weerspieël het in reaksie op kokaïenadministrasie, 'n idee wat bevestig is deur ons onbevooroordeelde iTRAQ (Table S1) data . MSN's in die NAc-dop toon 'n depressie in vuurkapasiteit ná chroniese kokaïen wat weke lank behou word, terwyl kern MSN's van dieselfde diere 'n oorgangsverhoging (1-3-dag) vermeerder in vuurkapasiteit wat terugkeer na basale vlakke binne 2 weke (Kourrich en Thomas, 2009). Daarbenewens word talle sinaptiese proteïene differensieel gereguleer in die NAc-dop teen kern van diere blootgestel aan chroniese kokaïen, insluitende GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Aangesien chroniese amfetamien CaMKIIa spesifiek in NAc-dop induceer (Loweth et al., 2010), is dit nie verbasend dat ons 'n soortgelyke effek met kokaïen vind nie. Aangesien ΔFosB egter in beide die NAc-dop en kern deur chroniese kokaïen geïnduseer word (Perrotti et al., 2008), en aangesien ons aantoon dat CaMKIIα-induksie in dop ΔFosB-afhanklik is, bied ons bevindings nuwe bewyse vir afsonderlike transkripsiemeganismes by die CaMKIIa-promotor tussen hierdie twee subregio's, wat verantwoordelik is vir die selektiewe induksie van CaMKIIa in die dop.

Baie onlangse werk het gefokus op die verskille tussen D1- en D2-tipe NAc MSNs. Alhoewel beide D1- en D2-reseptore betrokke is in die lonende effekte van kokaïen (Self, 2010), onlangse werk toon dat optogenetiese aktivering van D1-tipe MSNs gedragsresponse op kokaïen verhoog, terwyl D2-tipe MSN-aktivering die teenoorgestelde effek het (Lobo et al., 2010). In ooreenstemming met hierdie bevindings is D1-reseptor-knock-out-muise gebrekkig in die verkryging van kokaïen-selfadministrasie (Caine et al., 2007), terwyl D2 knockouts nie is nie (Caine et al., 2002). D1-agonistadministrasie direk in NAc lei tot kokaïen-soekende gedrag in herinstellingsparadigmas (Self, 2010). Interessant genoeg, hierdie effek vereis D1-reseptor afhanklike toenames in CaMKII aktiwiteit in die NAc dop, maar nie kern (Anderson et al., 2008), 'n resultaat wat mooi lyk met die D1- en dopspesifieke ΔFosB-CaMKII-lus wat hier voorgestel word.

Ons het voorheen berig dat Ser27 in ΔFosB gefosforileer kan word deur kasease-2 (kasease-XNUMXUlery et al., 2006), maar ons vestig hier dat CaMKII fosfileer ΔFosB op hierdie en ander terreine met veel groter kinetika en stoïgiometrie en kan die hoër skynbare M repliseerr waargeneem vir ΔFosB (Fig 5A) met blootstelling aan kokaïen in vivo (Nestler, 2008). Ons weet reeds dat Ser27 fosforilasie ΔFosB stabiliteit en transkripsie-aktiwiteit verhoog (Ulery et al., 2006; Ulery en Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Toekomstige werk sal nou fokus op die identifisering en die funksionele gevolge van nuwe plekke van ΔFosB fosforilering wat deur die huidige studie aangedui word.

Die feed-forward lus wat hier beskryf word, bied 'n waarskynlike nuwe meganisme waardeur herhaalde toediening van kokaïen progressiewe abnormaliteite in die NAc dryf. As sodanig kan hierdie biochemiese pad 'n belangrike teiken vir toekomstige terapeutiese ingryping in verslawende afwykings bied. Omdat CaMKII alomtegenwoordig is en benodig word vir baie basale neuronale en gedragsfunksies, is direkte gebruik van CaMKII-inhibeerders as 'n verslawingbehandeling vermy. Ons data dui daarop dat meer subtiele teiken van die meganisme van CaMKII-induksie, wat spesifiek is vir 'n individuele seltipe en subregio van die brein se beloningskring, 'n terapeutiese doelwit kan bied wat die komplikasies van sistemiese CaMKII-inhibisie kan vermy.

Spring na:

Bedankings

Hierdie werk is ondersteun deur toekennings van die Nasionale Instituut vir Dwelmmisbruik (EJN), NIDA-Yale Proteomics Centre DA018343 (AJR en EJN) en Hartwell Foundation (AJR). Die skrywers wil Gabby Rundenko graag bedank vir die vrygewige geskenk van gesuiwerde ΔFosB en Roger Colbran vir die vrygewige geskenk van gesuiwerde CaMKIIa.

Spring na:

Verwysings

  1. Ahmed SH, Koob GF. Oorskakeling van matige tot oormatige dwelminname: verandering in hedoniese setpunt. Wetenskap. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
  2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: 'n biochemiese brug wat dopamien- en glutamaatstelsels verbind met die soek na kokaïen. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
  3. Boudreau AC, Wolf ME. Gedragsensensitiasie vir kokaïen word geassosieer met verhoogde AMPA-reseptore oppervlak uitdrukking in die kern accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
  4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Uitdrukking en karakterisering van die alfa-subeenheid van Ca2 + / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II deur gebruik te maak van die baculovirus ekspressiesisteem. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
  5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rol van dopamien D2-soortgelyke reseptore in kokaïen-selfadministrasie: studies met D2-reseptormutante muise en nuwe D2-reseptore antagoniste. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
  6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Goud LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Gebrek aan selfadministrasie van kokaïen in dopamien D1 reseptor uitklopmuise. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasoom-afhanklike en afhanklike meganismes vir FosB destabilisering: identifikasie van FosB degron domeine en implikasies vir DeltaFosB stabiliteit. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgeniese diere met induceerbare, geteikende genexpressie in die brein. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase reguleer sosiale nederlaag stres-geïnduseerde sinaptiese en gedragsplastisiteit. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  10. Colbran RJ. Inaktivering van Ca2 + / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II deur basale autofosforilering. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
  11. Colbran RJ. Proteïenfosfatases en kalsium / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II-afhanklike sinaptiese plastisiteit. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
  12. Colbran RJ, Bruin AM. Kalsium / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II en sinaptiese plastisiteit. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
  13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatale seltipe-spesifieke ooruitdrukking van DeltaFosB verhoog aansporing vir kokaïen. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
  14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepressante aksies van histoon deacetylase inhibeerders. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa-toilet. Kwantitatiewe proteomika van caveolin-1-gereguleerde proteïene: karakterisering van polimerase i en transkripsiefaktor / CAVIN-1 IN endotheel selle. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Risikofaktore vir selfmoordafhandeling in hoof depressie: 'n gevallestudie studie van impulsiewe en aggressiewe gedrag in mans. Is J Psigiatrie. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
  17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB moduleer die kern direkteur en indirekte padfunksie differensiaal. Proc Natl Acad Sci VSA. 2013 in pers. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII bindend aan GluN2B is krities tydens geheue konsolidasie. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB-mutante muise: verlies aan chroniese kokaïeninduksie van Fos-verwante proteïene en verhoogde sensitiwiteit vir kokaïen se psigomotoriese en lonende effekte. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Differensiële beheer oor kokaïen-soekende gedrag deur kernkern-kern en -skulp. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
  21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerisering en DNA-bindende eienskappe van die transkripsiefaktor DeltaFosB. Biochemie. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
  22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsium / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II dra by tot aktiwiteitsafhanklike filopodia groei en ruggraatvorming. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
  23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Uitdrukking van die transkripsiefaktor deltaFosB in die brein beheer sensitiwiteit vir kokaïen. Aard. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
  24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetiese inhibisie van CaMKII in Dorsale Striatal Medium Spiny Neurons verminder funksionele eksitatoriese sinapse en verbeter Intrinsieke Opwinding. PLoS One. 2012; 7: e45323. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Uitwissing opleiding na kokaïen self-administrasie veroorsaak glutamatergiese plastisiteit om kokaïen te voorkom. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  26. Kourrich S, Thomas MJ. Soortgelyke neurone, teenoorgestelde aanpassings: psigostimulerende ervaring differensieel verander skiet eienskappe in accumbens kern versus dop. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Onafhanklike effek van Striatal alphaCaMKII bevorder die sensibilisering van kokaïenbeloning. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rol van kernfaktor kappaB in ovariumhormoon-gemedieerde stres hipersensitiwiteit in vroulike muise. Biolpsigiatrie. 2009; 65: 874-880. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokaïen-geïnduceerde dendritiese ruggraatvorming in D1- en D2-dopamienreseptor-bevattende medium-stekel-neurone in kernklemme. Proc Natl Acad Sci VSA A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Die molekulêre basis van CaMKII funksioneer in sinaptiese en gedragsgeheue. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
  31. Lobo MK, Covington HJ, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Son H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Seltipe-spesifieke verlies van BDNF-signalering simuleer optogenetiese beheer van kokaïenbeloning. Wetenskap. 2010; 330: 385-390. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibisie van CaMKII in die nukleusakkapsel dop verminder verhoogde amfetamien inname in sensibiliseerde rotte. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Oorgangsoordrukking van alfa-Ca2 + / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II in die nucleus accumbens shell verbeter gedrag wat op amfetamien reageer. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-reseptorhandel en sinaptiese plastisiteit. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
  35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturele basis van langtermyn potensiering in enkel dendritiese stekels. Aard. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
  36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Beheer van geheue vorming deur gereguleerde uitdrukking van 'n CaMKII transgen. Wetenskap. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
  37. Maze I, Covington HJ, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Meganiese M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Noodsaaklike rol van die histoonmetieltransferase G9a in kokaïen-geïnduseerde plastisiteit. Wetenskap. 2010; 327: 213-216. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  38. McClung CA, Nestler EJ. Regulering van geenuitdrukking en kokaïenbeloning deur CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Resensie. Transkripsionele meganismes van verslawing: rol van DeltaFosB. Philos Trans R Sos Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  40. Nye HE, Hoop BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiese studies van die regulering van chroniese FOS-verwante antigeen-induksie deur kokaïen in die striatum- en nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
  41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Die rolle van CaMKII en F-aktien in die strukturele plastisiteit van dendritiese ruggraat: 'n potensiële molekulêre identiteit van 'n sinaptiese merker? Fisiologie (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
  42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB in die kernkwaliteit reguleer voedselversterkte instrumentele gedrag en motivering. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
  43. Paxinos G, Watson C. Die rotbrein in stereotaksiese koördinate. 6 Editie. Amsterdam; Boston: Akademiese Pers / Elsevier; 2007.
  44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, brein-streekspesifieke uitdrukking van 'n dominante negatiewe mutant van c-Jun in transgeniese muise verminder sensitiwiteit vir kokaïen. Brein Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
  45. Penne P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Convergente CaMK en RacGEF seine beheer dendritiese struktuur en funksie. Neigings Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
  46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induksie van deltaFosB in beloningsverwante breinstrukture na chroniese stres. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
  47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze ek, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Duidelike patrone van DeltaFosB induksie in die brein deur dwelms van misbruik. Sinaps. 2008; 62: 358-369. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hoop BT, Shaham Y. Neurobiologie van die inkubasie van dwelmmisbruik. Neigings Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalsium bemiddelde tweede boodskappers moduleer die uitdrukking van gedrags sensitiwiteit vir kokaïen. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
  50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Menslike brein reseptor autoradiografie gebruik hele helfte van die halfrond dele: 'n algemene metode wat weefsel artefakte verminder. Sinaps. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
  51. Robinson TE, Kolb B. Strukturele plastisiteit wat verband hou met blootstelling aan dwelmmiddels. Neuro Farmacologie. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
  52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripsionele en epigenetiese meganismes van verslawing. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalente interaksies van kalsium / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II met die postsynaptiese digtheid proteïene NR2B, densin-180, en alfa-aktinien-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
  54. Ross PL, Huang JN, Hese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Lien P, Martin S, Bartlet-Jones M, Hy F, Jacobson A, Pappin DJ. Multiplexed proteïen kwantitasie in Saccharomyces cerevisiae met behulp van amien-reaktiewe isobariese merk reagense. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
  55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Die verslaafde sinaps: meganismes van sinaptiese en strukturele plastisiteit in kernklemme. Neigings Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  56. Self DW. In: Die Dopamien Receptors. Neve KA, redakteur. New York: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
  57. Sanger BF, Of bulk JA, Neve RL, Vezina P. Verbygaande virale-mediated expressie van alfa-kalsium / calmodulin-afhanklike proteïen kinase II in die kern accumbens dop lei tot langdurige funksionele upregulation van alfa-amino-3-hidroksiel-5 -metyl-4-isoksasool-propionaat-reseptore: dopamien-tipe-1-reseptor en proteïenkinase A-afhanklikheid. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Meganisme en regulering van kalsium- / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II wat gerig is op die NR2B-subeenheid van die N-metiel-D-aspartaat-reseptor. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
  59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilering van DeltaFosB bemiddel sy stabiliteit in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulering van DeltaFosB transkripsionele aktiwiteit deur Ser27 fosforilering. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
  61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulering van DeltaFosB stabiliteit deur fosforilering. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
  62. Vialou V, et al. DeltaFosB in breinbeloningskringe bemiddel veerkragtigheid teen stres en antidepressante reaksies. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Chroniese-kokaïen veroorsaak H3 asetilering en transkripsionele aktivering van CaMKIIalpha in die kern accumbens is van kritieke belang vir motivering vir dwelms versterking. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reguleer wielrigting. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
  65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB induksie in orbitofrontale korteks verdra die verdraagsaamheid teenoor kokaïen-geïnduseerde kognitiewe disfunksie. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
  66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. 'N noodsaaklike rol vir DeltaFosB in die kern accumbens in morfinaksie. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
  67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Prys EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EG, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Calmodulien kinase II inhibisie beskerm teen strukturele hartsiektes. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]