Proc Natl Acad Sci VSA A. 2005 Februarie 1; 102(5): 1737-1742.
Abstract
Kokaïen, 'n dwelmmisbruik, verhoog die sinaptiese dopamienvlakke in die striatum deur dopamien heropname by aksonterminale te blokkeer. Siklien-afhanklike kinase 5 (Cdk5) en sy aktivator p35, proteïene wat betrokke is by fosforilering van substrate in postmitotiese neurone, is bevind dat dit gereguleer word na chroniese blootstelling aan kokaïen. Om die effekte van Cdk5 en p35 induksie op striatale dopamien sein te ondersoek, het ons twee onafhanklike transgeniese muislyne gegenereer waarin Cdk5 of p35 spesifiek in neurone oordruk is. Ons berig hier dat die verhoogde Cdk5 aktiwiteit, as gevolg van p35, maar nie van Cdk5 ooruitdrukking nie, lei tot die verswakking van kokaïen-gemedieerde dopamien sein. Verhoogde Cdk5-gemedieerde fosforilering van dopamien en cAMP-gereguleerde fosfoproteïen, molekulêre massa 32 kDa (DARPP-32) by Thr-75, het gepaard gegaan met verlaagde fosforilering van DARPP-32 by Thr-34. Verhoogde Cdk5-gemedieerde fosforilering van ekstrasellulêre sein-gereguleerde kinase kinase 1 by Thr-286 was vergesel van verminderde aktivering van ekstrasellulêre sein gereguleerde kinase 1 / 2. Hierdie effekte het bygedra tot die verswakking van kokaïen-geïnduceerde fosforilering van cAMP reaksie element-bindende proteïene sowel as 'n mindere induksie van c-fos in die striatum. Hierdie resultate ondersteun die idee dat Cdk5 aktiwiteit betrokke is by veranderde genexpressie na chroniese blootstelling aan kokaïen en gevolglik die langdurige veranderinge in neuronale funksie onderliggend aan kokaïenverslawing beïnvloed.
Kokaïen verhoog sinaptiese dopamienvlakke in die striatum en verander genuitdrukking in die dopaminoceptiewe neurone deur intracellulêre weë te aktiveer wat die aanvanklike sein van die dopamien D1-reseptor na die kern versprei (1). Chroniese blootstelling aan kokaïen reguleer verskeie transkripsiefaktore, wat lei tot die langdurige veranderinge in geenuitdrukking wat aan die neuronale aanpassings van kokaïenverslawing gedink word (2). ΔFosB, geïdentifiseer as sodanig 'n transkripsiefaktor (3), is getoon om die gedragsresponsiviteit van diere na kokaïen te verbeter (4, 5). Daarom word verwag dat identifikasie van die teikengene wat deur ΔFosB induksie gereguleer word, bydra tot 'n groter begrip van die molekulêre meganisme wat onderliggend aan kokaïenverslawing is. Onlangs is die chroniese behandeling van diere met kokaïen getoon om die uitdrukking van siklienafhanklike kinase 5 (Cdk5) en sy aktivator p35 in die striatum te reguleer deur die induksie van ΔFosB (6, 7).
Cdk5 is 'n lid van die Cdk familie van seriene / threonine kinases. In teenstelling met ander CD's wat hoofreguleerders van selsiklus vordering is, is Cdk5 hoofsaaklik betrokke by fosforilering van substrate in postmitotiese neurone (8). Die neuronale spesifisiteit van Cdk5 aktiwiteit word verkry deur die assosiasie met sy aktiveerders, óf p35 of p39, wat oorwegend uitgedruk word in postmitotiese neurone (8). Benewens die noodsaaklike rol van Cdk5 in breinontwikkeling (9, 10), it is ook betrokke by dopaminergiese oordrag in postnatale brein (11, 12). Inhibisie van Cdk5 aktiwiteit lei tot verhoogde dopamien vrystelling in die striatum, wat 'n presynaptiese funksie van Cdk5 aandui as 'n negatiewe regulator van dopamien vrystelling (11). Verder moduliseer Cdk5 die effektiwiteit van postsynaptiese dopamien sein deur fosforilering van dopamien- en cAMP-gereguleerde fosforroteïen, molekulêre massa 32 kDa (DARPP-32) by Thr-75, wat DARPP-32 omskakel in 'n inhibitor van cAMP-afhanklike kinase (PKA) (12).
Hierdie waarnemings dui daarop dat Cdk5 en p35 stroomafwaartse reguleerders is van die langdurige aktivering van dopamien sein na chroniese blootstelling aan kokaïen en dus in kokaïenverslawing. Om verder die rol van Cdk5 op striatal dopamien sein aan te spreek, het ons twee transgeniese muislyne gegenereer waarin Cdk5 of p35 spesifiek in neurone onderdruk is onder die beheer van die p35-promotor. Ons bevindinge het aangedui dat Cdk5 aktiwiteit opgerig is met verhoogde vlakke van p35 proteïen, maar nie Cdk5 proteïen, wat daarop dui dat die vlak van p35 proteïen tempobeperkend is vir Cdk5 aktiwiteit. Ons bied hier in vivo Bewyse dat Cdk5-aktiwiteit toegeneem het as gevolg van p35 ooruitdrukking, lei tot die verswakking van kokaïen-gemedieerde dopamien sein na die kern deur 'n remming van die PKA- en ekstrasellulêre seinreguleerde kinase (ERK) kaskade.
Materiaal en metodes
Teenliggaampies. Polyklonale teenliggaampies teen Cdk5 (C-8) en p35 (C-19) is gekoop van Santa Cruz Biotegnologie. Die fosforilering-afhanklike en afhanklike teenliggame teen ERK-kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, en cAMP-respons element-bindende proteïene (CREB) is verkry uit Cell Signal Technology (Beverly, MA). Die teenliggaampies teen fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), totale DARPP-32 (12), en c-fos (14) is gebruik soos beskryf. 'N Teenliggaam teen aktien is van Sigma aangekoop.
Eksperimentele Diere. Ons het die muis p35-gen gekloon Cdk5r1, wat p35 proteïen koder, en die genomiese struktuur daarvan gekenmerk het (15). Om die transgeniese muis te genereer met neuronale ooruitdrukking van p35 (Tgp35), die 6-kb EcoRI-EcoRI-fragment wat die 1.2-kb-promotorstreek bevat, is in 'n pGEM9Z (-) plasmied gesubkloneer, en 'n 45-bp-tag wat van SV40 afgelei is, is in die KPNEk site stroomaf van die poli (A+) sein (Fig 1A). Die merker bevat 'n SpeEk webwerf vir genotipering van die diere. Die 6-kb-fragment is uit die plasmied uitgeskei en gesuiwer, gevolg deur pronukleêre inspuiting van die transgeen om die transgeniese muise te genereer. Om die uitdrukkingsprofiel van die transgen onder die regulatoriese beheer van die 1.2-kb p35-promotor te ondersoek in vivo, 'n dubbel transgeniese muis (Tgp35; p35 - / -) is verder gegenereer deur 'n twee-stap teelstrategie te gebruik waardeur die Tgp35-muis in 'n endogene p35-nul-agtergrond regenereer. Die ander muismodelle wat in hierdie studie gebruik is, sluit in p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- en 'n transgeniese muis met neuronale ooruitdrukking van Cdk5 (TgCdk5) (TgCdkXNUMX) (9, 16, 17). Genotipes van hierdie muise is bepaal deur die uitoefening van 'n Southern blot-analise of PCR op genomiese DNA wat van die stertbiopsies afgeskei is. Muise is gehuisves onder 'n 12-h lig / 12-h donker siklus. Alle sorg is gegee in ooreenstemming met die Nasionale Institutes of Health-riglyne oor die versorging en gebruik van laboratorium- en eksperimentele diere.
Southern Blot Analysis. Genomiese DNA wat uit stertbiopsies verkry is, is verteer met EcoRI en SpeEk, elektroforese op 'n 0.9% agarose gel, en oorgedra op 'n nylonmembraan. Die membraan is met 'n willekeurige primer gehybridiseer 32P-benoemde sonde by 42 ° C oornag. Die 485-bp sonde vir genotipering van p35 knockout (p35 - / -) en Tgp35 muise is deur PCR gegenereer deur die volgende primers: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'en 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3' te gebruik. Die gehybridiseerde membraan is twee keer in 2 × SSC / 0.1% SDS by 42 ° C vir 10 min gewas, en twee keer in 0.1 × SSC / 0.1% SDS by 65 ° C vir 20 min, en blootgestel aan x-straalfilm.
Dwelm Behandeling. Kokaïen (Sigma) is in steriele sout opgelos. Diere is geïnspireer met kokaïen (15 mg / kg) of 'n gelyke volume sout op die ouderdom van 3 maande en is na die inspuiting deur middel van dekapping by verskillende tydspunte (15, 30, 60 en 120 min) dood. Brein is vinnig verwyder en verkoel in yskoue PBS. Die striata is dan ontleed en onderworpe aan Noordelike of Westerse vlekanalise. Vir immunohistochemiese analise is striatale afdelings verkry uit muise 2 h na die inspuiting.
Northern Blot Analysis. Totale RNA is onttrek uit die striata met TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en onderworpe aan Northern blot-analise soos beskryf (18). Vir die opsporing van c-fos mRNA, is 'n 189-bp fragment van muis c-fos cDNA gebruik as 'n sonde soos beskryf (19). Die vlakke van c-fos mRNA is gekwantifiseer deur die optiese digtheid van die spesifieke band te meet deur die gebruik van 'n beeldontledingstelsel met nih beeldsoftware, weergawe 1.62.
Western Blot Analysis. Striatale weefsels is sonicated in 1% SDS en gekook vir 10 min. Die proteïenkonsentrasie in elke monster is bepaal deur BCA proteïenassessering (Pierce). Gelyke hoeveelhede proteïene is geskei deur SDS / PAGE voordat dit oorgedra word op 'n nitrocellulose membraan. Die membrane is geblokkeer in 1 × PBS wat 5% afgeroomde melk en 0.05% Tween 20 bevat en met oornag by primêre teenliggaampies by 4 ° C geïncubeer. Inkubasie met peroksidase-gekonjugeerde anti-muis of konyn-IgG (Sigma) is by kamertemperatuur vir 60 min uitgevoer. 'N Sein is opgespoor deur verbeterde chemiluminescensie (Pierce), en die optiese digtheid van die bande is gekwantifiseer soos hierbo beskryf.
Cdk5 Kinase Assay. Striatale lysate is voorberei met 'n lysisbuffer bestaande uit 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenielmethylsulfonielfluoried / 1 μg / ml aprotinien / 1 μg / ml leupeptien- / fosfatase-inhibeerders (fosfatase-inhibeermengsel I en II, Sigma). Die lysate is immuunprecipitated met anti-Cdk5 (C-8) of anti-p35 (C-19) teenliggaampies. Die Cdk5 immunoprecipitates is voorberei deur die inkubasie van 300 μl van die lysaat (wat ooreenstem met 300 μg proteïen) met 'n anti-Cdk5 teenliggaampie (3 μg) oornag by 4 ° C, gevolg deur verdere inkubasie met 25 μl Protein A-agarose krale (50 % slurry in die lysis buffer; Santa Cruz Biotegnologie) vir 3 h by 4 ° C. Vir die voorbereiding van p35 immunoprecipitates is 500 μl van die lysaat (wat ooreenstem met 1 mg proteïen) geïnkubeer met anti-p35-teenliggaampie (3 μg) soos hierbo beskryf. Die immunoprecipitaten is twee keer met die lysisbuffer gewas en twee keer met 'n kinase buffer wat bestaan uit 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, gesuspendeer in 60 μl van die kinase buffer. Kinase-aktiwiteit is gemeet deur histon H1 as substraat te gebruik (18).
Immunohistochemie. Muise was narkoseer deur ip-inspuitings van avertin (250 mg / kg, Fluka) en perfusie transcardiaal met 0.1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7.4, gevolg deur Streck Tissue Fixative (Streck Laboratoriums, La Vista, NE), 'n nie- Dissected brain was verder vasgestel in dieselfde fixative oornag by 37 ° C. Daarna is die brein in paraffien ingebed, in 5-μm-dikke koronale gedeeltes gesny en onderworpe aan immunohistochemie deur die gebruik van avidin-biotien-peroksidase-komplekse tegniek (Vector Laboratories) met diaminobenzidien as 'n substraat. Die afdelings is oornag by 4 ° C geïnkubeer met 'n affiniteits-gesuiwerde poliklonale teenliggaam teen c-fos. Die vlekspesifisiteit is geassesseer deur die weglating van die primêre teenliggaam.
Results
Generasie van Transgeniese Muise met Neuronale Ooruitdrukking van P35. Die transgen wat gebruik word om verhoogde neuronale uitdrukking van p35 te behaal, het die 6-kb-fragment van die gekloonde muis p35-geen bevat wat die 1.2-kb-promotor bevat en die hele koördinerende volgorde van p35 (Fig 1 A). Die genotipes van muise is bepaal deur Southern blot-analise deur die gebruik van 'n sonde wat ontwerp is om p35- / - en Tgp35-muise van wilde-tipe muise te onderskei (Fig 1 A en B). Om die transgenekspeksie onder beheer van die 1.2-kb p35-promotor te ondersoek, het ons dubbele transgeniese muise (Tgp35; p35 - / -) gegenereer waarin p35-uitdrukking slegs van die transgen aangedryf is. Die p35 uitdrukking in Tgp35; p35 - / - muise is slegs in die brein waargeneem (Fig 1C), waar die ruimtelike uitdrukkingspatroon soortgelyk was aan dié van wilde-tipe muise (Fig 1D). Gebrek aan p35 het getoon dat dit lei tot abnormale lae struktuur in die serebrale korteks en hippokampus van muise (10). Die Tgp35; p35 - / - muise het egter 'n volledige redding van die p35 - / - breinfenotipe ('Fig 1E). Hierdie data het aangedui dat die 1.2-kb p35-promotor die uitdrukking van die transgen beheer het met 'n soortgelyke uitdrukkingsprofiel as dié van p35 van die endogene p35-geen.
Die p35 proteïenvlak is tariefbeperkend vir die op-regulering van Cdk5-aktiwiteit. Ons het die gene-doserings-effekte van die gene wat koder p35 en Cdk5 op proteïenexpressie ondersoek het in striatale uittreksels van p35 - / -, p35 +/-, wild-tipe, Tgp35, Cdk5 +/- en TgCdk5-muise op die ouderdom van 3 maande ondersoek. Die vlakke van p35 en Cdk5 proteïene korreleer goed met die geen dosisse onderskeidelik (Fig 2 A en B). Tgp35-muise het 'n ≈1.6-vouverhoging in p35 proteïenvlak vertoon in vergelyking met wilde-tipe muise, terwyl Cdk5 proteïenvlakke nie beïnvloed is deur die verskillende vlakke van p35 proteïen nie. TgCdk5-muise het 'n ≈1.9-vou toename in Cdk5 proteïenvlak vergeleke met wilde-tipe muise, terwyl p35 proteïenvlakke nie beïnvloed is deur die verskillende vlakke van Cdk5 proteïen nie. Om die effekte van verskillende hoeveelhede p35 proteïene op Cdk5 aktiwiteit te ondersoek, was Cdk5 immunoprecipitated van striatale uittreksels met anti-Cdk5 antilichaam en kinase aktiwiteit is gemeet. Net so, om die effekte van verskillende hoeveelhede Cdk5 proteïene op kinase-aktiwiteit te ondersoek, was p35 immunoprecipitated van striatale uittreksels met anti-p35-teenliggaampie, en kinase-aktiwiteit is gemeet. Cdk5 aktiwiteit korreleer goed met die vlak van p35 proteïen, maar nie met die vlak van Cdk5 proteïen (Fig 2 C en D). Hierdie resultate het aangedui dat die hoeveelheid p35 proteïen 'n tempobeperkende faktor vir Cdk5-aktiwiteit is. Ons het dus Tgp35-muise gebruik om die effekte van verhoogde Cdk5-aktiwiteit op striatale dopamien sein te ondersoek.
Kokaïen-geïnduceerde fosforylering van DARPP-32 by Thr-34 word geskenk in Tgp35-muise. Die funksie van DARPP-32 hang af van sy fosforileringstoestand by verskeie plekke (20). PKA fosforileer DARPP-32 by Thr-34, terwyl Cdk5 fosforilateer DARPP-32 by Thr-75. Dus het ons die fosforileringstoestand van DARPP-32 ondersoek in striatale uittreksels van wild-tipe en Tgp35-muise. Die vlak van fosfo-Thr-75 DARPP-32 was hoër in Tgp35 muise (Fig 3A; 1.6 ± 0.2-vou bo die waarde van wilde-tipe muise). Ons het die gevolge van verhoogde Cdk5-aktiwiteit op striatale dopamien-seinwerking vervolgens beoordeel. Ons het die kokaïen-geïnduceerde PKA-aktivering in Tgp35-muise ondersoek deur die fosforileringstoestand van DARPP-32 by Thr-34 te analiseer. Die vlak van fosfaat-Thr-34 DARPP-32 is toegeneem in wilde-tipe muise 15 min ná die kokaïen inspuiting (Fig 3B; 1.8 ± 0.2-vou bokant die basale vlak). Die effek van kokaïen op Thr-34 fosforilering van DARPP-32 is egter gedemp in Tgp35 muise (1.2 ± 0.3-vou bokant die basale vlak). Hierdie resultate het aangedui dat 'n toename in Cdk5-aktiwiteit die kokaïen-geïnduceerde PKA-aktivering waarskynlik deur die DARPP-32-fosforilering by Thr-75 (6, 12). Dit is ook moontlik dat 'n toename in presynaptiese Cdk5-aktiwiteit lei tot verminderde dopamien vrylating, en dit dra by tot die verminderde effek van kokaïen. Veral, 'n enkele inspuiting van kokaïen het nie die vlakke van p35- en Cdk5-proteïene beïnvloed nie, asook die kinase-aktiwiteit (Fig 3 C en D). Dit is in teenstelling met 'n vorige studie waarin die chroniese blootstelling aan kokaïen getoon is om die uitdrukking van p35 en Cdk56).
Op-regulering van Cdk5-aktiwiteit verminder kokaïen-geïnduceerde aktivering van ERK1 / 2. Onlangse bewyse dui aan dat dopamienreseptoraktivering in die striatum ook ander seinskaskade aktiveer, insluitend die ERK-roete (21, 22), wat 'n belangrike rol speel in die gedragsreaksie op kokaïen (23). Ons het dus ondersoek of Cdk5-aktiwiteit die kokaïen-geïnduceerde aktivering van die ERK-roete kan beïnvloed. Aktivering van die ERK-roete is waargeneem na kokaïen inspuiting in striatale uittreksels van wildtipe muise, soos blyk uit verhoogde fosforilering van MEK1 / 2 by Ser-217 en Ser-221 (1.5 ± 0.2-vou bokant die basale vlak) en van ERK1 / 2 by Thr-202 en Tyr-204 (ERK2 fosforilering: 1.5 ± 0.2-vou bokant die basale vlak) (Fig 4 A en B). Die kokaïen-geïnduceerde aktivering van MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-vou bokant die basale vlak) en van ERK1 / 2 (ERK2 fosforilering: 1.2 ± 0.2-vou bokant die basale vlak) is gedemp in Tgp35-muiseFig 4 A en B). Verder was die basale vlakke van fosfor-ERK1 / 2 laer in Tgp35-muise (0.8 ± 0.2-vou onder die waarde van wilde-tipe muise), terwyl hierdie tendens nie statisties betekenisvol was nie. Laasgenoemde resultate kan toegeskryf word aan Cdk5-afhanklike fosforilering van MEK1 by Thr-286, wat lei tot 'n afname in die katalitiese aktiwiteit (24). Om hierdie moontlikheid te evalueer, het ons die fosforileringstoestand van MEK1 by Thr-286 ondersoek en gevind dat hoër fosfor-Thr-286 MEK1-vlakke teenwoordig was in striatale uittreksels uit Tgp35-muiseFig 4C; 1.3 ± 0.1-vou bo die waarde van wilde-tipe muise). Verder is die fosforileringstoestand van MEK1 by Thr-286 nie verander deur 'n enkele inspuiting van kokaïen nie, in ooreenstemming met die bevinding dat Cdk5-aktiwiteit nie deur die behandeling geraak is nie (Fig 3D).
Voortplanting van Dopamien sein na die kern word verswak deur verhoogde Cdk5 aktiwiteit. Kokaïen-geïnduceerde aktivering van meervoudige signalerende kaskade waarby PKA en ERK betrokke is, lei tot die daaropvolgende aktivering van die transkripsiefaktor CREB in die kern deur sy fosforilering by Ser-133 (22, 25). Om te ondersoek of die Cdk5-gemedieerde inhibitiewe effekte op PKA- en ERK-aktiveringskaskades kon convergeer op CREB-fosforilering in die kern, het ons die fosforileringstoestand van CREB by Ser-133 ondersoek in striatale uittreksels van wild-tipe en Tgp35-muise. Die basale vlak van fosfor-CREB was laer in Tgp35-muise (0.7 ± 0.1-vou van die waarde van wilde-tipe muise) (Fig 5). As gevolg van inspuiting van kokaïen is die vlak van fosfor-CREB verhoog in die striatum van wilde-tipe muise (1.5 ± 0.1-vou bokant die basale vlak), maar hierdie reaksie op kokaïen is gedemp in Tgp35-muise (1.2 ± 0.1- vou bokant die basale vlak) (Fig 5).
Fosforilering van CREB by Ser-133 versterk sy transkripsiewe aktiwiteit via 'n cAMP-reaksie element in die promotorstreek van sekere gene, insluitend die c-fos-geen (26). Ons het dus die induksie van c-fos in die striatum van wilde-tipe en Tgp35-muise ondersoek na kokaïen inspuiting. By wildtipe muise het die vlak van c-fos mRNA tot 'n piekwaarde (1.8 ± 0.2-vou bokant die basale vlak) 30 min na inspuiting van kokaïen toegeneem en daarna na die inspuiting na die basale vlak teruggekeer na 120 min.Fig 6 A en B). Die vlakke van c-fos mRNA was egter ≈30% laer in Tgp35 muise as in wilde-tipe muise tot 30 min na die inspuiting (Fig 6 A en B). Die mindere induksie van c-fos in Tgp35-muise is verder bevestig deur immunohistochemie (Fig 6 C-F). Kokaïenadministrasie het c-fos immunoreaktiwiteit verhoog, sterk in die dorsomediale dorsosentrale dele van die striatum en swak in die laterale dele, in beide wildtipe en Tgp35-muise. Die kokaïen-geïnduceerde toename in die aantal c-fosimmunopositiewe selle is egter veral in die striatum van Tgp35-muise verminder (Fig 6G). Saam het hierdie resultate aangedui dat kokaïen-gemedieerde verhoging van striatale dopamien sein na die kern in Tgp35-muise geïnhibeer is, 'n moontlike gevolg van verhoogde Cdk5-aktiwiteit.
Bespreking
Cdk5 en sy aktivator p35 is geïdentifiseer as teikengene wat opgerig word deur chroniese blootstelling aan kokaïen (6). Ons rapporteer hier bewyse dat verhoogde Cdk5 aktiwiteit, as gevolg van p35 opregulasie eerder as Cdk5 opregulering, tot demping van kokaïen-gemedieerde dopamien sein in striatale neurone lei. Om die gevolge van die opgereguleerde uitdrukking van Cdk5 of p35 op striatale dopamien sein te ondersoek, is twee transgeniese muislyne, TgCdk5 en Tgp35-muise, geanaliseer. Ons het bevind dat Cdk5 aktiwiteit opgerig is in verhouding tot 'n verhoogde vlak van p35 proteïen, maar is nie beïnvloed deur 'n verhoogde vlak van Cdk5 proteïen nie. Ons vorige verslag het ook getoon dat Cdk5-aktiwiteit in TgCdk5-muisbrein laer was as in wild-tipe muisbrein wanneer die aktiwiteit gemeet is deur die gebruik van Cdk5 immunoprecipitates (17), wat daarop dui dat Cdk5 ooruitdrukking 'n verhoogde vlak van monomeer Cdk5 tot gevolg het as die p35-vlak nie verhoog word nie. Hierdie resultate het aangedui dat die vlak van p35 proteïen 'n tempo beperkende faktor is vir Cdk5 aktiwiteit.
Tgp35-muise vertoon 'n mindere induksie van beide CREB-fosforilering en c-fos in die striatum na 'n akute inspuiting van kokaïen, wat daarop dui dat die striatale respons op kokaïen geïnhibeer word deur verhoogde Cdk5-aktiwiteit. Die verswakking van kokaïen-gemedieerde dopamien-signalering in Tgp35-muise is waarskynlik behaal deur die Cdk5-gemedieerde inhibisie van meervoudige seineringskaskade wat DARPP-32, PKA en ERK insluit. Kokaïenadministrasie het PKA-fosforilering van DARPP-32 by Thr-34 in wildtipe muise toegeneem, terwyl hierdie respons in Tgp35-muise gedemp is. PKA fosforilering van DARPP-32 by Thr-34 het getoon dat die aktiwiteit van proteïenfosfatase 1 (PP1), die ensiem wat verantwoordelik is vir die defosforilering van Ser-133 van CREB27). PP1-aktiwiteit sal dus nie deur die DARPP-32 / PP1-roete in Tgp35-muise geantagoniseer word nie.
Kokaïen-geïnduseerde aktivering van ERK1 / 2 is ook verswak in Tgp35-muise. Daar is verskeie afsonderlike meganismes waardeur Cdk5 die kokaïen-geïnduceerde aktivering van ERK1 / 2 kan inhibeer. Eerstens kan Cdk5-afhanklike fosforilering van DARPP-32 by Thr-75 PKA inhibeer, wat lei tot die gevolglike remming van enige PKA-gemedieerde MEK1 / 2-aktivering wat benodig word vir ERK1 / 2-aktivering. 'N Onlangse studie het ook bevind dat fosforilering van DARPP-32 by Thr-34 benodig word vir kokaïen-gemedieerde aktivering van ERK1 / 2 deur verskeie weë wat indirekte regulering van MEK-aktivering behels, asook die regulering van striatale verrykte fosfatase, 'n tyrosien fosfatase wat direk op ERK1 / 2 optree (28). Ondersteuning vir hierdie moontlikheid word voorgestel deur die bevinding dat kokaïen-geïnduceerde fosforilering van MEK1 / 2 by Ser-217 en Ser-221 afgeskaf is in Tgp35-muise. Nog 'n moontlike pad is via Cdk5-afhanklike fosforilering van MEK1 by Thr-286, wat 'n afname in sy katalitiese aktiwiteit tot gevolg sal hê en sal lei tot die inhibisie van ERK1 / 2 aktiwiteit (24).
Inhibisie van Cdk5 aktiwiteit in die striatum het getoon dat die gedragseffekte van chroniese kokaïenbehandeling by diere versterk word (6). In ooreenstemming met die hipotese dat opregulering van Cdk5-aktiwiteit kan bydra tot neuronale aanpassing vir die teenwerking van die effekte van herhaalde kokaïenadministrasie (6), het ons bevind dat Cdk5-gemedieerde fosforilering van DARPP-32 en MEK1 bygedra het tot die verswakking van kokaïen-geïnduceerde aktivering van ERK1 / 2, wat lei tot die mindere induksie van CREB fosforilering en c-fos in die striatum. Ons bevindings ondersteun die idee dat verhoogde Cdk5 aktiwiteit, as gevolg van p35-upregulering, gene-uitdrukking in die striatum kan verander na chroniese blootstelling aan kokaïen. Dit kan voorkom deur veranderinge in die aktiwiteite van die transkripsiefaktore soos CREB en c-fos. Dus kan die Cdk5-aktivator p35, uit hoofde van sy tempobeperkende effekte op Cdk5-aktiwiteit, bydra tot langdurige veranderinge in neuronale funksie onderliggend aan kokaïenverslawing.
Erkennings
Ons bedank drs. Mary Jo Danton, Philip Grant, en Sashi Kesavapany vir kritiese lees van die manuskrip. Hierdie werk is ondersteun deur die National Institute of Health Grant Z01DE00664-05 (aan ABK), US Public Health Service Grant DA10044, en toekennings van die Simons Foundation, die Peter J. Sharp Foundation en die Picower Foundation (na PG).
Notes
Afkortings: Cdk5, siklienafhanklike kinase 5; ERK, ekstrasellulêre sein-gereguleerde kinase; DARPP-32, dopamien en cAMP-gereguleerde fosfoproteïen, molekulêre massa 32 kDa; PKA, kAMP-afhanklike kinase; MEK, ERK kinase; CREB, cAMP-respons element-bindende proteïen.
Verwysings
;
