Regulering van DeltaFosB stabiliteit deur fosforilering (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

Bron

Departement Psigiatrie, Sentrum vir Basiese Neurowetenskap, Universiteit van Texas Suidwes Mediese Sentrum, Dallas, Texas 75390-9070, VSA.

Abstract

Die transkripsiefaktor DeltaFosB (ook genoem FosB2 of FosB [kortvorm]) is 'n belangrike bemiddelaar van die langtermyn-plastisiteit wat in die brein geïnduceerd word deur chroniese blootstelling aan verskeie tipes psigoaktiewe stimuli, insluitende dwelms van mishandeling, spanning en elektrokonvulsiewe aanvalle . 'N duidelike kenmerk van DeltaFosB is dat dit een keer geïnduseer word, bly dit in die brein vir relatief lang tydperke in die afwesigheid van verdere stimulasie. Die meganismes wat onderliggend aan hierdie skynbare stabiliteit is, is egter onbekend gebly. Hier demonstreer ons dat DeltaFosB 'n relatief stabiele transkripsiefaktor is, met 'n halfleeftyd van ongeveer 10 h in selkultuur. Verder wys ons dat DeltaFosB 'n fosforproteïen in die brein is en dat fosforilering van 'n hoogs bewaarde serienresidu (Ser27) in DeltaFosB dit beskerm teen proteasomale afbraak. Ons verskaf verskeie lyne van bewyse wat daarop dui dat hierdie fosforilering bemiddelde word deur kasease-kinase 2. Hierdie bevindings vorm die eerste bewys dat DeltaFosB gefosforileer is en demonstreer dat fosforilering bydra tot die stabiliteit daarvan, wat die kern van sy vermoë om langdurige aanpassings in die brein te medieer, meebring.

Inleiding

Die transkripsiefaktor ΔFosB, ook aangedui FosB2 of FosB [kortvorm], is 'n C-terminus-afgeknotte splitsvariant van die onmiddellike vroeë gene fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu en Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Soos FosB in die volledige lengte, het ΔFosB 'n DNA-bindende basiese domein en 'n leucien-rits waardeur dit met Jun-proteïen dimeriseer om transcriptiefaktor-komplekse te aktiveer proteïen-1 (AP-1), wat die uitdrukking van baie gene reguleer (Morgan en Curran, 1995; Rylski en Kaczmarek, 2004). Ten spyte van die gebrek aan deel van die transaktasiedomein wat in die C-terminus van FosB voorkom, funksioneer ΔFosB as beide 'n kragtige transkripsionele aktivator en repressor in gekweekte selle en in die brein (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu en Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung en Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB word tot hoë vlakke op 'n streekspesifieke wyse in die brein geïnduseer na chroniese, maar nie akute blootstelling aan 'n verskeidenheid psigoaktiewe stimuli, insluitende stres, sekere letsels, antipsigotiese en antidepressante middels, misbruikmiddels en natuurlike belonings. (Hoop et al., 1994b; Hiroi en Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Die induksie van ΔFosB is direk verwant aan die funksionele effekte van verskeie van hierdie stimuli op die brein. Die aanhoudendheid van ΔFosB, selfs in die afwesigheid van addisionele stimulasie, onderskei dit van al die ander Fos-familie-transkripsiefaktore, wat vinnig geïnduseer word as gevolg van akute stimuli, binne enkele ure terug na basale vlakke verval, en toon gewoonlik desensibilisering na chroniese stimulasie (Hoop et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi en Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Dit maak ΔFosB 'n aantreklike kandidaat om sommige van die langdurige veranderinge in geenuitdrukking wat die stabiele neuronale aanpassings wat deur sekere chroniese stimuli veroorsaak word, te bemiddel.

Omdat die langdurige teenwoordigheid van ΔFosB voorkom in die afwesigheid van verdere induksie van sy mRNA (Chen et al., 1995), het ons gespekuleer dat, anders as die volle lengte FosB en al die ander Fos-familieproteïene, wat intrinsiek onstabiel is, ΔFosB 'n buitengewoon stabiele transkripsiefaktor kan wees (Hoop et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Verder het immunoblottende analise van akute-versus chroniese gestimuleerde breinweefsel voorgestel dat ΔFosB skofte in oënskynlike M_r (molekulêre massa) vanaf ~33 kDa in die akute toestand na ~35-37 kDa tydens chroniese behandeling (Hoop et al., 1994a; Chen et al., 1995). Omdat daar geen bewyse is vir die bestaan ​​van addisionele mRNAs wat vir hierdie verskillende isoforme kan koördineer nie, het ons verder gespekuleer dat ΔFosB posttranslasioneel gewysig is en dit dra daartoe by tot die ongewone stabiliteit. Tot op datum is egter geen biochemiese ontledings van die omset of posttranslasionele veranderinge van ΔFosB aangemeld nie. Die doel van die huidige studie was om te bepaal of ΔFosB 'n fosforproteïen is en of fosforilering 'n rol speel in sy stabiliteit.

Vorige afdelingVolgende afdeling

Materiaal en metodes

Soogdier sellyne en DNA konstrukte.

PC12-selle (Clontech, Mountainview, CA) is gekweek in DMG met hoë glukose wat l-glutamine bevat (L-Gln) en aangevul met 5% fetale bees serum (FBS), 10% perd serum (beide uit Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penisillien, en 100 μg / ml streptomisien (beide van Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa-selle (American Type Culture Collection, Manassas, VA) is gekweek in DMG met hoë glukose wat L-Gln bevat en aangevul met 10% FBS, penisillien en streptomisien. Beide sellyne is by 37 ° C in 'n vogtige 5% CO gehandhaaf₂ atmosfeer.

Vir die oorgangstransfeksies met DNA is PC12- of HeLa-selle op die ses-putplate (bedek met kollageen I vir PC12-selle) geplant om die volgende dag 90-100% -samevloei te bereik en dan met Lipofektamine 2000 (Invitrogen) getransfecteer. In sommige eksperimente (sien Vye. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB is voorlopig uitgedruk in PC12-selle via infeksie met rekombinante herpes simplexvirus (HSV).

ΔFosB- en FosB-cDNA's is verkry uit ons eie pTop-konstrukte (Chen et al., 1997), en subkloneer in 'n pcDNA3.1 vektor (Invitrogen). Hierdie PCDNA3.1-ΔFosB / FosB konstrukte is gebruik vir uitdrukking in soogdier selle en as 'n templaat vir site-gerigte mutagenese. Rekombinante HSV-ΔFosB is voorberei soos voorheen beskryf (Neve et al., 1997), en die voorbereiding het 'n titer van ~1 × 10 gehad⁸ pfu / ml.

Pulse-chase eksperimente.

Ongeveer 24 h na infeksie / transfeksie, was selle (PC12 of HeLa) in ses putplate twee tot drie keer met 2 ml PBS gewas en by 37 ° C geïnkubeer vir ~1 h in 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) aangevul met 5% gedialyseerde FBS (Hyclone, Logan, UT) om intracellulêre pole van Met en Cys uit te breek. Aan die einde van hierdie "hongersnood" -periode was dwelms (indien selle behandel moes word) bygevoeg, en selle is gemerk (pols) met 12-25 μCi van ³⁵S Proteïen Etikettering Mengsel (PERKINELMER, Wellesley, MA) vir ~1 h by 37 ° C om alle nuut gesintetiseerde proteïene te benoem. Die radiolabel is dan verwyder deur die selle twee tot drie keer met 2 ml PBS te was, en die ³⁵S-gemerkte proteïene is gevolg (chase) deur die medium te vervang met "koue" (nieradioaktiewe) medium aangevul met 5% FBS en die oes van die selle op verskillende tydpunte. Selbehandelings is gedurende die jaag gehandhaaf. Alle figure van hierdie eksperimente toon soortgelyke aanvanklike hoeveelhede van die verskillende proteïene om vergelykings van hul omsetkoerse te optimaliseer.

Diere en chroniese elektrokonvulsiewe aanvalbehandeling.

Volwasse Sprague Dawley-manlike rotte (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) is een keer per dag behandel met elektrokonvulsiewe aanvalle (ECS) vir 7-9 d. ECS is uitgevoer soos voorheen beskryf (Hoop et al., 1994a) met behulp van 'n Ugo Basile (Comerio VA, Italië) ECS-eenheid met die volgende instellings: frekwensie, 100 pulse / s; pols met, 0.5 ms; skokduur, 1.0 s; en huidige, 75 mA. Sham beheer diere is parallel behandel deur die oordrag elektrodes toe te pas sonder enige elektriese stroom.

³² P metaboliese etikettering.

Vir die etikettering van breinskyfies is rotte beslag gelê, die brein vinnig dissekteer, en 300 μm frontale kortikale skywe is saamgestel met 'n DSK-microslicer (Ted Pella, Redding, CA). Die snye is in plastiekbuisies in 2 ml fosfaat-gebrek aan kunsmatige CSF (ACSF) geïnkubeer en by 30 ° C onder konstante sagte borreling gehou met 'n O₂/ CO₂ mengsel (Hemmings et al., 1989). Die skywe (twee skywe per buis) is gemerk met 1.3 mCi vir 8-10 h in die teenwoordigheid of afwesigheid van okadaïensuur (100 ng / ml). Aan die einde van hierdie inkubasie is die skywe minstens drie keer met koue ACSF gesuiwer en dan deur sonikasie in 250 μl koue radioimmunoprecipitasie-assay (PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Igepal, 0.5% (w / v) natriumdeoksikolaat, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] aangevul voor gebruik met SDS tot 0.6%, protease inhibitor cocktail vir soogdier selle (gebruik by 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfatase-inhibitor cocktails I en II (gebruik by 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, en 2% glycerol. Homogenates word dan gekook vir 15 min en skoongemaak deur sentrifugasie by 15,000 × g vir 15 min. Proteïenkonsentrasie in die gevolglike supernatante is geassesseer met behulp van die BCA proteïenassessering (Pierce, Holmdel, NJ).

Vir die ³²P etikettering van gekweekte selle, ~24 h na infeksie / transfeksie, selle is twee tot drie keer met fosfaatvrye medium gewas en in hierdie medium vir ~1 h geïncubeer. Na hierdie hongersnoodperiode, 0.2-0.3 mCi van ³²PH₃PO₄ (PERKINELMER) is by elke put gevoeg, en selle is gemerk vir 4-12 h afhangende van die soort eksperiment (sien Fig. 1-7 vir spesifikasies). Selle is dan drie keer met PBS gewas en op ys gekleur vir 15 min met 50 μl aangevulde RIPA buffer. Lysates is versamel deur skraap en is geslaag 10 keer deur 'n 25 ga naald te skuif DNA, gekook vir 10 min, en gesentrifugeer teen 15,000 rpm vir 15-30 min by 4 ° C. Die skoongemaakte lysates (supernatante) is na 'n nuwe buis oorgedra en 'n BCA proteïenassessering (Pierce) is uitgevoer. Alle figure van hierdie eksperimente toon soortgelyke hoeveelhede totale wildtipe (WT) en S27A ΔFosB proteïene om vergelykings van hul relatiewe fosforileringsvlakke te optimaliseer.

Chemikalieë en selkultuurbehandelings.

Okadaïensuur (OA, Sigma-Aldrich) is in etanol opgelos en gebruik teen 'n finale konsentrasie van 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-bensimidasool (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) is in dimethylsulfoksied (DMSO; Sigma-Aldrich) opgelos en in selkultuur gebruik teen 'n finale konsentrasie van 50 μm. Spermien (Sigma-Aldrich) is in water opgelos en gebruik teen 'n finale konsentrasie van 200 μm. Calphostin-C (Biomol) is in DMSO opgelos en gebruik by 0.2 μm, terwyl die Xorphon 12-myristaat 13-asetaat (PMA; Promega, Madison, WI) in DMSO opgelos is en by 0.1 μm gebruik word. Myristoylated-autocamtide-2-verwante inhibitiewe peptied (m-AIP; Biomol) is in water opgelos en gebruik by 'n finale konsentrasie van 1 en 10 μm. Die breëspektrum proteïenkinase-inhibeerders H-7 en H-8 (Biomol) is in water opgelos en gebruik teen 'n finale konsentrasie van onderskeidelik 150 en 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) en epoksomisien (Peptides International, Louisville, KY) is albei opgelos in DMSO en gebruik teen 'n finale konsentrasie van onderskeidelik 12.5 en 7.5 μm. In alle eksperimente is DMSO (voertuig) by selle gevoeg soos nodig om 'n konstante hoeveelheid DMSO oor behandelings te handhaaf. vir ³²P etiketterings eksperimente, die dwelms is onmiddellik voor die etiket bygevoeg en vir die oorblywende van die etiketteringsperiode gehou. Vir pulsslag-eksperimente is dwelms bygevoeg ten tye van Cys / Met "hongersnood", deur die etiketteringsperiode gehou, en dan weer in die jaagmedium bygevoeg. Die proteasoom-inhibeerders het elke 3-4 h gedurende die jaag gespik om te vergoed vir die vinnige omset van hierdie peptiede.

ΔFosB immunoprecipitatie, immunoblotting en autoradiografie.

Vir immunoprecipitaties, is lysaten verdund 1: 5 met gewone RIPA om die SDS konsentrasie tot 0.1% te bring voordat die immunoprecipitatie (IP) word voortgesit. Om nie-spesifieke binding te beperk, is die lysate eers verwyder deur immunoprecipitering met nie-immuun IgG en proteïen G-Sepharose (Sigma-Aldrich) vir ten minste 4 h. ΔFosB is dan immunoprecipitated uit die gesuiwerde lysates met behulp van 'n bok polyklonale teenliggaam wat 'n interne epitoop teenwoordig in beide FosB en ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotegnologie, Santa Cruz, CA) herken by 0.5-1 μg IgG per 10 μg lysaat proteïen (50-300 μg totale proteïen) in 'n totale volume van 0.5 ml. IPs is liggies gemeng by 4 ° C op 'n rotor vir ten minste 8 h en dan is 15 μl proteïen G-Sepharose bygevoeg en IPs is gemeng vir ten minste nog 'n 4 h. IP's is gepellet deur te draai by 3000 × g vir 3-5 min by 4 ° C, drie keer gewas met 0.5 ml koue plat RIPA en twee keer met koue PBS wat 0.1% Tween 20 bevat. IPs word dan in 0.5 ml koue PBS gerus, oorgedra, gepellet in 'n nuwe buis en immunoprecipitated proteïene is dan geëlueer deur die toevoeging van 15-25 μl 2 × vermindering van Laemmli proteïen monster buffer. Hierdie IP-protokol het gelei tot die spesifieke en effektiewe neerslag van feitlik al die ΔFosB in die lysaat. Die immunoprecipitated proteins is onderworpe aan SDS-PAGE deur die hele IP op 'n 12.5% Tris-HCl Criterion gel (Bio-Rad, Hercules, CA) te laai en dan na PVDF of nitrocellulose oorgedra. Na die oordrag is die membraan in die lug gedroog en ³²P- en ³⁵S-radiolabelde proteïenbande is waargeneem deur autoradiografie met behulp van Kodak (Rochester, NY) autoradiografiese film, sowel as deur fosforimaging met behulp van 'n Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Totale (nie-fosforileerde en gefosforileerde) ΔFosB in sellysate of breinhomogenate is opgespoor deur immunoblotting van óf die immunoprecipitated proteïen (met dieselfde membraan wat gebruik word om die ³²P-gemerkte proteïen), of van gelyke hoeveelhede lysaat / homogenate proteïene wat aan SDS-PAGE onderworpe is en na PVDF of nitrocellulose oorgedra word. Die membraan is eers geblokkeer deur dit met 1% (w / v) vetvaste droë melk (Bio-Rad) in PBS, aangevul met 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) vir 1 h by 25 ° C, te inkubeer. Die membraan is dan oornag teen 4 ° C immuun gebots met ons eie konyn anti-FosB poliklonale teenliggaam wat gegenereer word teen aminosure 1-16 van FosB / ΔFosB (gebruik by 1: 10,000). Na primêre inkubasie is membraan vier keer vir 5 min met blokkeerbuffer gewas, en dan by 25 ° C vir ~1 h gewas met 'n bok-anti-konyn-IgG wat aan peperwortelperoksidase verbind is (gebruik by 1: 5000 in blokkeerbuffer, van Vector Laboratories, Burlingame, CA). Membraanwas dan drie keer vir 10 min met blokkeerbuffer en een keer vir 5 min met PBS. Totale ΔFosB-proteïenbande is op Kodak MR-rolprent gekonfigureer deur verhoogde chemiluminescensie (Pierce) en / of deur opsporing van fluorescensie met behulp van die ECL-Plus-reagense (Amersham Biosciences) en die Storm PhosphorImager.

Ooruitdrukking en suiwering van rekombinante ΔFosB van insek selle.

ΔFosB was oorexpressed in Sf9 insek selle as 'n N terminus heksa-His-getikte proteïen (N-His (6) ΔFosB) met behulp van die Bac-to-Bac baculovirus ekspressiesisteem (Invitrogen) en die instruksies van die vervaardiger volg. Kortliks is die ΔFosB cDNA (residue 2-237) voorafgegaan deur die affiniteit N-terminale merker MGHHHHHHAG onderverdeel in die pFASTBacTM1-vektor wat gebruik is om rekombinante baculovirus te genereer. Sf9-selle is met rekombinante virus besmet, en N-His (6) ΔFosB is gesuiwer uit sellysates deur verskeie chromatografiese stappe insluitend affiniteitskromatografie met behulp van nikkelkolom (Qiagen, Valencia, CA), anioonruiling met behulp van 'n mono-Q kolom (Amersham Bioswetenskappe), en grootte-uitsluiting met behulp van 'n gel-filtreerkolom (Amersham Biosciences).

In vitro fosforilering studies.

In vitro fosforileringsreaksies vir tydskursusse en stoichiometrie-analise is uitgevoer in 'n volume 30 μl wat 10 μm substraat (N-His (6) ΔFosB of 'n positiewe beheersubstraat bevat), 250 μm ATP en 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, die buffer verskaf deur die kinase vervaardiger, en een van die volgende kinases: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) of p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Tyd kursus reaksies is uitgevoer deur die eliminering van 5 μl aliquots uit die reaksie oplossing by die aangewese tyd punte en die toevoeging van 'n gelyke volume 4 × vermindering van Laemmli proteïen monster buffer. Michaelis-Menten kinetiese parameters vir die CK2 reaksie is bepaal onder empiries gedefinieerde lineêre bestendige toestandstoestande. Hierdie reaksies is uitgevoer vir 15 min in 'n volume 10 μl wat 2 ng / μl ensiem bevat, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, en N-His (6) ΔFosB konsentrasies wat wissel van 2.5-30 μm. Alle reaksies is by 30 ° C in 'n waterbad uitgevoer. Na SDS-PAGE en vlek van die gel met Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), is die gel gedroog, en ³²P-fosfaatinkorporasie is geassesseer deur fosforimaging analise (sien hieronder, Data kwantifisering, berekeninge en statistieke).

Tweedimensionele fosfopeptied-kaart- en fosfaamien-suur-analise.

Albei hierdie ontledings is uitgevoer soos beskryf deur Ploegh en Dunn (2000). Kortliks, droë gel fragmente wat bevat ³²P-gemerk ΔFosB (óf van vitro reaksies of uit immunoprecipitates van metabolies gemerkte selle), is uitgesny, rehidreer, gewas en onderworpe aan proptiese vertering. Die supernatant wat die tryptiese verteringsprodukte bevat, is gevriesdroog en die lyofilaat het verskeie kere gewas en weer gesuspendeer in 10 μl elektroforese buffer, pH 1.9. Voorbeeld (3 μl) is op 'n sellulose-dunlaagchromatografie (TLC) plaat (Analtech, Newark, DE) opgespoor en in een dimensie geskei deur elektroforese en die ander dimensie deur stygende TLC. Die gevolglike fosfopeptiedkaarte is deur middel van outoradiografie en fosforimaging visualiseer. Vir fosfoaminoasanalise is 2 μl van die tryptiese vertering wat in elektroforesebuffer geresuspendeer is, verder gekloof deur HCl hidrolise by 105 ° C vir 25 min in 3 m HCl onder 'n N₂ atmosfeer. Die reaksie is deur 'n sesvoudige verdunning in water gestop, en die mengsel is gevriesdroog. Die lyofilaat is weer gesuspendeer in 5 μl elektroforese buffer, pH 1.9, en opgespoor op 'n sellulose TLC plaat saam met fosfa-Ser, -Thr en -Tyr standaarde. Elektroforese is oor die helfte van die lengte van die TLC plaat uitgevoer met behulp van elektroforese buffer, pH 1.9, en dan is die plaat oorgedra in die pH 3.5 buffer, en elektroforese is uitgevoer tot voltooiing. Die fosfaamienzuurstandaarde is gesigitaliseer deur die TLC-plaat te spuit met 'n 1% (v / v) ninhidrien oplossing in asetoon, en die ³²P-gemerkte aminosuurmonsters is deur beide autoradiografie en fosforimaging visualiseer.

siRNA-geïnduceerde CK2α knock-down.

Ons het 'n RNA interferensie metode gebruik om selektief die vlakke van CK2 te selekteer (Di Maira et al., 2005). PC12-selle is op die kollageen geplant met I-bedekte ses-putplate om die volgende dag ~70-80% -samevloei te bereik, toe hulle transient getransfecteer is met 20 nm (finale konsentrasie) van nie-sigariese siRNA of siRNA wat gerig is op die mRNA van die katalitiese α subeenheid van Rat CK2, met 5 μl van die transfeksie agent SilentFectin (Bio-Rad) en volg die instruksies van die vervaardiger. Ongeveer 24 h later, is die selle transient getransfecteer met ΔFosB plasmied, soos hierbo genoem. Ongeveer 24 h later (~48 h na siRNA transfeksie), is selle onderworpe aan óf ³²P metaboliese etikettering of puls-chase analise soos hierbo beskryf. Die volgende vier CK2a siRNAs is gebruik met soortgelyke resultate: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). As 'n negatiewe beheer, het ons gebruik knaldemper negatiewe beheer #3 siRNA van Ambion (Austin, TX). Die omvang van CK2-klop is nagegaan deur immunoblotting met behulp van 'n anti-CK2 poliklonale teenliggaam (katalogus # 06-873 van Upstate) oornag by 'n 1: 1000-verdunning. β-Tubulien is oornag by 'n 05: 661-verdunning met 'n monoklonale teenliggaam (katalogus # 1-20,000 van Upstate) gebruik.

Terreingerigte mutagenese.

Mutasie van Ser27 na Ala of na Asp is bereik met behulp van 'n Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) en die instruksies van die vervaardiger volg. Om die Ser27 mutasies in die muis ΔFosB proteïen bekend te stel, is die volgende mutagenese primers gebruik. Ser27 na Ala: (reverse primer) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3. Ser27 na Asp (voorwaartse primer) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3. Die gemuteerde basisse is vetdruk, en die Ser27 kodon is kursief.

Bioinformatika.

Potensiële fosforileringsterreine en kinases vir ΔFosB is gesoek deur die muis proteïen volgorde in te dien na gespesialiseerde databasisse, insluitende ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), en NetPhosK (Blom et al., 2004).

Data kwantifisering, berekeninge en statistieke.

Die hoeveelheid proteïene teenwoordig in die PVDF- of nitrocellulosemembraan is gekwantifiseer met behulp van 'n Storm PhosphorImager en die gepaardgaande ImageQuant sagteware (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). In die selkultuur- en breinskyffosforileringstudies, word die waardes verkry vir die ³²P-gemerkte proteïene is dan gedeel deur die waardes verkry vir totale ΔFosB, en uitgedruk as 'n verhouding. In die vitro fosforilering studies, die hoeveelheid van ³²P-gemerk ΔFosB per mol ΔFosB (stoïgiometrie) is bereken soos voorheen beskryf (Sahin et al., 2004). Alle metings is geneem binne die lineariteitsreeks van die instrument wat gebruik word. Kinetiese parameters is bereken met behulp van die Michaelis-Menten-model, waarvolgens V = V_Max[S] / ([S]+K_M) en V_Max = k₂[E_Totaal]. Die halfleeftyd (t_1/2) van ΔFosB en FosB is geskat vanaf die pulsslae-grafieke (met die nie-lineêre regressie wat die data punte die beste pas) en ooreenstem met die tyd waarteen die hoeveelheid oorblywende proteïen 50% van die oorspronklike is. In al die figure is die resultate wat verteenwoordig word van minstens twee tot drie onafhanklike eksperimente. In al die grafieke is die gegewe gegewens gemiddeldes ± SEMs (3 ≤ n ≤16). Die statistiese betekenis van verskille is geassesseer met behulp van 'n ongepaarde t toets, gekorrigeer vir veelvuldige vergelykings, en die sterretjies dui aan p ≤ 0.05.

Vorige afdelingVolgende afdeling

Results

ΔFosB is 'n buitengewoon stabiele transkripsiefaktor

Alhoewel ons voorheen gespesifiseer het dat ΔFosB 'n relatief stabiele transkripsiefaktor is (Nestler et al., 2001), is 'n direkte analise van die omsetprofiel van die proteïen nog nie tot dusver uitgevoer nie. Om hierdie vraag aan te spreek, het ons pulse-chase-eksperimente uitgevoer met behulp van PC12-selle, wat omvattend gebruik is as 'n neuronagtige sellyn, waarin ΔFosB transient uitgedruk is via infeksie met 'n rekombinante herpes simplexvirus (HSV-ΔFosB). Nuut gesintetiseerde proteïene is metabolies gemerk met ³⁵S-Met / Cys, en die afbraakpatroon van ³⁵S-gemerk ΔFosB (³⁵S-ΔFosB) is gemonitor deur immunoprecipitating dit uit sellysates verkry op verskillende tydspunte na verwydering van die radio-gemerkte aminosure. Ontleding van die immunoprecipitates deur SDS-PAGE en autoradiografie het getoon dat die halfleeftyd van ΔFosB in PC12 selle ~10 h is (Fig 1). Hierdie bevindings toon dat die halfleeftyd van ΔFosB hoër is as dié van die meeste induktiewe transkripsiefaktore (sien Bespreking), insluitend die volle lengte FosB, waarvan die halfleeftyd in selkultuur aangewys is as 'n 90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Daarbenewens is dit opmerklik dat die afbraak van ΔFosB nie 'n eksponensiële vervalskurwe van die eerste graad pas nie, maar eerder is dit bifasies, met 'n stadiger afbrekingsyfer. Dit dui op die bestaan ​​van meer as een ΔFosB spesies en / of meer as een agteruitgangspad.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 1.

ΔFosB is 'n buitengewoon stabiele transkripsiefaktor. Die halfleeftyd van ΔFosB is ~ 10 h in selkultuur. ΔFosB is uitgedruk in PC12-selle deur óf infeksie met HSV-ΔFosB of oorgangstransfeksie met ΔFosB-bevattende plasmied, en selle was onderworpe aan pulsslag-eksperimente soos beskryf in Materiale en Metodes. Ekwivalente resultate is verkry ongeag die metode wat gebruik word om ΔFosB oor te druk. Die figuur toon die tydskursus (en verteenwoordigende autoradiogram) van ΔFosB degradasie. Die gegewe data is die gemiddelde ± SEM van minstens 15 individuele data punte verkry uit ten minste vyf onafhanklike eksperimente. Ter vergelyking word die gerapporteerde halveringstyd van FosB met die volle lengte aangedui.

ΔFosB is 'n fosforproteïen in die brein

Ons het veronderstel dat posttranslasionele verandering van ΔFosB kan bydra tot sy oënskynlike stabiliteit. Omdat fosforilering getoon is om die aktiwiteit van transkripsiefaktore op baie maniere te moduleer, insluitende hul stabiliteit (vir hersiening, sien Desterro et al., 2000; Whitmarsh en Davis, 2000), het ons ondersoek of ΔFosB 'n fosforproteïen is. Vir hierdie doel is ΔFosB uitdrukking geïnduseer in rotbrein deur chroniese ECS, 'n behandeling wat bekend is om hoë vlakke van ΔFosB te veroorsaak, veral in frontale korteks (Hoop et al., 1994a). Eendag na die laaste ECS-behandeling, wanneer ΔFosB vlakke hoog bly, is dun frontale kortikale snye voorberei en metabolies gemerk met ³²P-ortofosfaat. 'N Parallelle stel skywe is nie radiolabeled nie, en dit is gebruik om totale ΔFosB vlakke op te spoor. Na immunoprecipitasie met 'n spesifieke anti-FosB / ΔFosB teenliggaam en skeiding van die immunoprecipitated proteins by SDS-PAGE, gefosforyleerde ³²P-gemerkte ΔFosB is opgespoor deur autoradiografie, terwyl die totale ΔFosB deur immunoblotting opgespoor is. Hierdie analise het aan die lig gebring dat ΔFosB in die brein gefosforileer is, soos blyk uit 'n spesifieke ³²P-gemerkte band van ~35 kDa teenwoordig in die chronies behandelde breinmonsters, maar is feitlik ondetecteerbaar in die siekbeheerde kontroles (Fig 2A). Dit is in ooreenstemming met die feit dat, in die afwesigheid van chroniese stimulasie, basale vlakke van ΔFosB baie laag is. Die spesifisiteit van die immunoprecipitatiereaksie word geïllustreer deur die gebrek aan sein in die nonimmune IgG-presipitaat.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 2.

ΔFosB is 'n fosforproteïen in die brein. A, ΔFosB word in die brein gefosforileer. Endogene ΔFosB is geïnduceer in rotbrein deur chroniese ECS behandeling soos beskryf in Materials and Methods. Frontale kortikale snye is metabolies gemerk met ³²PH₃PO₄ vir 'n paar uur. Na homogenisasie van die snye was ΔFosB immunoprecipitated, en gefosforileerde ΔFosB (³²P-ΔFosB) is opgespoor deur autoradiografie (boonste paneel). Totale ΔFosB in nieradioaktiewe immunoprecipitates is opgespoor deur immunoblotting (onderste paneel). As negatiewe kontrole word die immunoprecipitaat van 'n sham-behandelde dier en nie-immuun IgG getoon. B, Kandidate fosforileringssterreine en kinases met ooreenstemmende voorspellings tellings vir die muis ΔFosB proteïen volgorde is verkry deur bioinformatiese analise. Die kandidaatwebwerwe met die hoër voorspellings tellings word in die proteïenvolgorde uitgelig en in die tabel gelys. Die DNA-bindende (basiese) domein en leucine-rits is vetgedruk in die proteïenvolgorde. C, D, ΔFosB fosforilering word verhoog deur die Ser / Thr fosfatase inhibitor OA. C, ³²P-ΔFosB vlakke in immunoprecipitates van frontale kortikale snye gemerk in die afwesigheid (Ctr) of teenwoordigheid van 100 ng / ml OA (grafiek en boonste paneel) is deur middel van outoradiografie waargeneem. Die onderste paneel toon die totale ΔFosB waargeneem in immunoprecipitates van ongemerkte snye deur immunoblotting. D, PC12-selle is besmet met HSV-ΔFosB of HSV-LacZ (vektor) en metabolies gemerk met ³²PH₃PO₄ in die afwesigheid (Ctr) of teenwoordigheid van 100 ng / ml OA. ³²P-ΔFosB vlakke in immunoprecipitates is opgespoor deur autoradiografie (grafiek, boonste paneel). Die onderste paneel toon die totale ΔFosB waargeneem in sellysate deur immunoblotting.

As 'n eerste stap in die rigting van die verduideliking van watter kinase (s) en site (s) betrokke is by ΔFosB fosforilering, het ons sy aminosuurvolgorde aan verskeie bioinformatiese ontledings onderwerp. Dit het aan die lig gebring dat hoewel ΔFosB geen Tyr fosforileringskandidaatwebwerwe bevat nie, dit verskeie Ser / Thr-kinase-konsensuswebwerwe bevat, insluitend drie CaMKII-terreine, drie CK2-werwe en twee PKC-terreine met baie hoë fosforileringvoorspellings tellings (Fig 2B). As, soos voorspel deur bioinformatika, ΔFosB slegs gefosforileer word op Ser of Thr residue, dan moet die fosforilering daarvan aansienlik gemoduleer word deur die aktiwiteit van Ser / Thr fosfatases. Om hierdie hipotese te toets, het ons voorste kortikale snye met ³²P-ortofosfaat in die teenwoordigheid of afwesigheid van OA, 'n Ser / Thr-proteïenfosfataseremmer. Soos aangedui in Figuur 2C, OA veroorsaak 'n groot (~ 2.5-vou) toename in ³²P-ΔFosB. Dit het ook 'n klein toename in totale ΔFosB-vlakke veroorsaak, wat in ooreenstemming is met vorige verslae wat die kankerverwekkende effekte van OA verbind tot die vermoë om verskeie onmiddellike vroeë gene, insluitend Fos-proteïene, te veroorsaak (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Die netto resultaat is 'n beduidende algehele toename (~60%) in gefosforileerde ΔFosB vlakke.

Ons het toe ondersoek of, in PC12-selle, wat meer vatbaar is vir eksperimentele manipulasie, ΔFosB 'n fosforilasiepatroon vertoon wat soortgelyk is aan die wat in die brein gesien is. Ons het ΔFosB in PC12 selle uitgedruk via infeksie met HSV-ΔFosB en metaboliseer die selle metabolies ³²P-ortofosfaat in die teenwoordigheid of afwesigheid van OA. Die suksesvolle uitdrukking en immunoprecipitatie van die proteïen uit HSV-ΔFosB-geïnfecteerde cellen word getoon deur die teenwoordigheid van beide in die immunoblot (Fig 2D, onderpaneel) en die autoradiograaf (boonste paneel) van 'n ~ 35 kDa-band, afwesig in die vektor-geïnfekteerde selle. Soos in die brein waargeneem, het OA 'n klein toename in totale ΔFosB-vlakke veroorsaak, maar 'n veel hoër (ongeveer tweevoudige) toename in ³²P-ΔFosB, wat 'n beduidende (~50%) netto toename in ΔFosB fosforilering tot gevolg het. Verder, in ooreenstemming met die bioinformatiese voorspellings, het behandeling van PC12 selle met 'n Tyr fosfatase inhibitor nie tot beduidende veranderinge in ³²P-ΔFosB vlakke (data nie getoon nie). Saam het hierdie bevindings aan die lig gebring dat ΔFosB gefosforileer is op Ser en / of Thr residue in brein en in PC12 selle en bevestig laasgenoemde om 'n goeie selkultuurstelsel te wees om die fosforilasie- en degradasieprofiele van ΔFosB verder te bestudeer.

CK2, maar nie PKC of CaMKII fosforileer ΔFosB vitro

Soos hierbo beskryf, het analise van ΔFosB aminosuurvolgorde hoë voorspellings tellings vir CK2-, PKC- en CaMKII-fosforileringsterreine geopenbaar. Om te bepaal watter van hierdie kinases fosfileer ΔFosB, het ons 'n reeks van vitro fosforileringsreaksies deur gebruik te maak van gesuiwerde kinases en gesuiwerde rekombinante ΔFosB. Soos aangedui in Figuur 3A, van die drie kandidaat kinases, het slegs CK2 op 'n beduidende wyse gefosforileerde ΔFosB. Daarbenewens is verskeie ander kinases getoets (bv. GSK3 en p70S6K), maar het nie aansienlik fosforilateer ΔFosB (data nie getoon nie). Bykomende karakterisering van die CK2-reaksie deur tydkursusanalise het aan die lig gebring dat hierdie kinase die inkorporering van ~0.5 mol fosfaat per mol ΔFosB kan kataliseer (Fig 3B). Die feit dat CK2 fosfileer ΔFosB vitro tot 'n aansienlike stoïgiometrie (~50%) is 'n fisiologiese relevante reaksie. Ons het die kinetika van hierdie reaksie bestudeer deur CK2 in te voeg in die teenwoordigheid van toenemende hoeveelhede gesuiwerde ΔFosB, en ons het vasgestel dat CK2 fosfileer ΔFosB met 'n V_Max van 5.8 pmol · min^-1 · Μg^-1 van ensiem, a K_M van 18.4 μm, en a k_kat van 0.2 / s (Fig 3C). Die waardes wat vir hierdie kinetiese parameters verkry word, ondersteun die fisiologiese relevansie van hierdie reaksie verder. Byvoorbeeld, die K_M van CK2 vir DARPP32, een van sy bekendste substrate, is 3.4 μm, en die k_kat is ~ 0.3 / s (Girault et al., 1989); die K_M vir ATP wissel van ~ 10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), en dat vir kaseïen wissel van ~ 10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Saam dui hierdie data aan dat ΔFosB 'n bona fide substraat vir CK2 is vitro.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 3.

CK2, maar nie PKC of CaMKII fosforileer ΔFosB vitro. Die autoradiograaf (boonste paneel) toon die gefosforileerde produk, en die Coomassie-gekleurde gels (onderste paneel) toon die totale ΔFosB teenwoordig in die reaksie. A, Gesuiwerde rekombinante ΔFosB was onderworpe aan vitro fosforilering deur verskeie kandidaatkinases (waarvan drie getoon word). B, Tydskursusse en stoichiometriese ontledings dui aan dat CK2 ΔFosB fosforiliseer vitro met 'n stoïgiometrie van ~ 50%. C, Kinetiese analise van die CK2-reaksie het getoon dat ΔFosB 'n bona fide is vitro substraat. Die linearisering van die reaksie word getoon in 'n dubbel-reciprocal plot (bottom), maar die kinetiese parameters is afgelei van die Michaelis-Menten-kromme (boonste).

CK2 modulateer die fosforilering en stabiliteit van ΔFosB in intakte selle

Om die fisiologiese relevansie van CK2-gemedieerde fosforilering van ΔFosB te bepaal, het ons vergelykende fosfopeptied kartering uitgevoer deur gebruik te maak van vitro gefosforileerde en PC12-sel-gefosforileerde ΔFosB. Na SDS-PAGE en gel-eluksie van ³²P-ΔFosB (van die vitro reaksies of uit die immunoprecipitaat van ³²P-gemerkte selle), is die proteïen verteer met trypsien, en die gevolglike fosfopeptiede is onderworpe aan tweedimensionele skeiding. Hierdie analise het getoon dat die belangrikste fosfopeptied van die CK2-reaksie gekombineer met een van twee belangrike fosfopeptiede van ΔFosB gefosforileer in PC12-selle (Fig 4A), terwyl die fosfopeptiede wat voortspruit uit die PKC- of CaMKII-reaksie (data nie getoon) nie. Daar was 'n tweede ΔFosB fosfopeptied teenwoordig in die kaart van PC12 selle, maar as gevolg van die onvermoë van enige van die kinases wat ons getoets het om 'n soortgelyke fosfopeptied te genereer vitro, weet ons nie tans of hierdie tweede fosfopeptied 'n fosforilasie-plek bevat wat verskil van die ander fosfopeptied of of dit 'n duidelike tryptiese peptied verteenwoordig wat dieselfde fosforileringsgebied bevat nie.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 4.

CK2 modulateer die fosforilering en stabiliteit van ΔFosB in intakte selle. A, CK2 maar nie PKC blyk fosforilate ΔFosB in selle te fosforileer nie. Tweedimensionele fosfopeptiedkaarte van ΔFosB gefosforileer deur CK2 of PKC vitro of deur ongeskonde PC12 selle. Die pyltjies wys die komigrasie van die CK2-gefosforileerde peptied, maar nie die PKC-gefosforileerde een met een van die ΔFosB fosfopeptiede verkry vanaf PC12-selle nie. B, ΔFosB fosforilering in PC12-selle word verhoog deur selle te behandel met die kragtige CK2-aktivatorspermine (SP) en verminder deur behandeling met die CK2-remmer DRB. In teenstelling hiermee is ΔFosB-fosforilering in PC12-selle nie beïnvloed deur behandeling met óf 'n PKC-aktivator (PMA) of die PKC-spesifieke inhibitor calphostin-C (Calph) nie. 'N Amptelike autoradiogram (boonste paneel) en immunoblot (onderste paneel) word getoon. C-F, Effek van CK2 aktiwiteit op ΔFosB stabiliteit. Die syfers toon die tydskursus (en verteenwoordigende autoradiogram) van ΔFosB degradasie. PC12-selle wat transient ΔFosB uitgedruk het, was onderworpe aan pulsslag-eksperimente wat uitgevoer is in die afwesigheid of teenwoordigheid van die CK2 inhibitor DRB (C), die CK2 aktivator spermine (D), of die breëspektrum kinaseremmer H-8 (E), wat gebruik word om te beheer vir die nie-spesifieke effekte van DRB. F, Effek van die afbreek van die katalitiese subeenheid van CK2 op ΔFosB stabiliteit. PC12-selle is getransfecteer met óf 'n nie-targeting siRNA (Ctr) of siRNA-teikengroep CK2α en 24 h wat later met 'n ΔFosB-plasmied getransfekteer is. Die boonste paneel toon immunoblots van heelselyselates wat die effek van die CK2 siRNA op CK2 en ΔFosB proteïenvlakke toon. Die ooreenstemmende immunoblot vir β-tubulien word getoon as 'n laaibeheer.

Om die fisiologiese relevansie van CK2 as 'n ΔFosB kinase verder te adresseer, behandel ons ΔFosB-uitdrukende PC12-selle met twee middels wat CK2-aktiwiteit moduleer. Soos aangedui in Figuur 4B, ΔFosB fosforilering is afgeneem deur die behandeling van PC12 selle met die sel-deurlaatbare CK2 inhibitor DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), en verhoog deur behandeling met die poliamien spermine, bekend as 'n kragtige CK2 aktivator (Cochet en Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). In teenstelling hiermee, behandeling van PC12 selle met die PKC inhibitor calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) of die PKC-aktivator PMA (Schmidt en Hecker, 1975; Beh et al., 1989) het nie tot beduidende veranderinge in ΔFosB fosforilering gelei nie. In die geval van PMA is die geringe (en nie beduidende) toename in ³²P-ΔFosB kan verantwoord word deur 'n toename in totale ΔFosB vlakke wat deur hierdie geneesmiddel veroorsaak word; Trouens, dit is gerapporteer dat fosforesters die uitdrukking van verskeie Fos-familie-proteïene induseer, insluitend FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Verder, behandeling van selle met die spesifieke sel-deurlaatbare CaMKII inhibitor m-AIP (Ishida en Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) het ook nie gelei tot afgeneemde ΔFosB fosforilering nie (data nie getoon nie). Saam is hierdie resultate in ooreenstemming met ons vitro bevindings en dui aan dat in ongeskonde selle ΔFosB waarskynlik gefosforileer word deur CK2, maar nie PKC of CaMKII nie. Die feit dat CK2 inhibisie nie heeltemal ΔFosB fosforilering voorkom nie, dui op die bestaan ​​van addisionele fosforileringsplekke in die proteïen.

Ons het vervolgens ondersoek of CK2 'n rol speel in die omset van ΔFosB en sodoende in sy stabiliteit. Vir hierdie doel het ons puls-chase-eksperimente uitgevoer met die gebruik van ΔFosB-uitdrukkende PC12-selle wat behandel is met óf die CK2-inhibeerder of die CK2-aktivator wat in die fosforileringsstudie gebruik is. Soos aangedui in Figuur 4C, behandeling van selle met die CK2 inhibitor DRB het 'n beduidende uitwerking op die omset-tempo van ΔFosB, bewys deur die verandering in vorm van sy afbreekkromme, van bifasiese na 'n kromme wat nader aan dié van 'n eksponensiële verval is. Omgekeerd het die teenwoordigheid van die CK2-aktivatorspermine 'n beduidende afname in die afbrekingsyfer van ΔFosB tot gevolg gehad, wat gelei het tot die akkumulasie van die proteïen gedurende die eerste uur van die jaag (Fig 4D).

Soos by baie kinase-aktiveerders en inhibeerders, kan spermiene en DRB metaboliese effekte hê buite die modulasie van CK2-aktiwiteit. Trouens, DRB het getoon dat die transkripsiefaktor IIH (TFIIH) -assosieerde kinase inhibeer (Yankulov et al., 1995), wat lei tot die inhibisie van RNA polimerase II-gemedieerde transkripsie. Aangesien hierdie effek die stabiliteit van ΔFosB kon beïnvloed, het ons die effek van die breë spektrum kinaseremmer H-8 (Hidaka en Kobayashi, 1992) op ΔFosB omset by 'n konsentrasie (200 μm) wat bekend is om TFIIH-geassosieerde kinase te inhibeer, maar nie CK2 (Yankulov et al., 1995). Soos aangedui in Figuur 4E, het die behandeling met H-8 nie die omset van ΔFosB beïnvloed nie. Soortgelyke resultate is verkry met H-7, 'n ander breë spektrum kinaseremmer, wat gebruik word by 'n konsentrasie wat TFIIH-geassosieerde kinase inhibeer, maar nie CK2 (data nie getoon nie). Hierdie data ondersteun verder die interpretasie dat die vermindering in ΔFosB stabiliteit wat veroorsaak word deur DRB waarskynlik die gevolg is van die inhibisie van CK2.

Om die rol van CK2 verder te bepaal in ΔFosB omset, het ons ondersoek ingestel na die gevolge om CK2 via siRNA te klop. Ons het hierdie eksperimente uitgevoer met behulp van PC12-selle wat die eerste keer getransfekteer is met kontrole (nontargeting) siRNA of 'n siRNA wat die mRNA van die katalitiese subeenheid van rat CK2 (CK2α) en 24 h teiken, wat later met ΔFosB getransfekteer is. Soos aangedui in Figuur 4F, transfeksie met die CK2α siRNA het effektief en spesifiek die CK2α proteïenvlakke afgesluit sonder om ΔFosB vlakke (toppaneel) te beïnvloed. Pulse-chase analise het getoon dat die klop van CK2 het gelei tot 'n beduidende toename in ΔFosB omset, soos blyk uit die vinniger afbraak van die proteïen. Die feit dat inhibisie van CK2-aktiwiteit (hetsy deur DRB-behandeling of siRNA) verhoog die omset van ΔFosB en lei tot die verdwyning van die stadige-snelheidskomponent van die bifasiese kromme, terwyl CK2-aktivering die stadige fase van die kromme verhoog, sterk steun verleen aan die idee dat CK2 'n rol speel in die regulering van ΔFosB stabiliteit.

CK2 fosforileer ΔFosB op Ser27

Om te begin met die identifisering van die webwerf (s) op ΔFosB gefosforileer deur CK2, het ons fosfa-aminosuur analise van rekombinante ΔFosB gefosforileer deur CK2 vitro en van ΔFosB gefosforileer in PC12 selle. Hierdie eksperimente het aan die lig gekom dat in albei gevalle die enigste fosfa-aminosuur wat opgespoor is, fosfo-Ser (Fig 5A). Hierdie bevinding, tesame met die stoichiometrie verkry vir die CK2 vitro fosforileringsreaksie (~50%) (Fig 3B) en die teenwoordigheid van slegs een belangrike plek op die CK2 fosfopeptied kaart (Fig 4A), dui daarop dat CK2 fosforilering van ΔFosB waarskynlik beperk is tot 'n enkele serienresidu. Hierdie gevolgtrekking is in ooreenstemming met die fosforilering konsensus site analise (Fig 2B), wat slegs een kandidaat serine voorspel het, dit wil sê, Ser27, vir CK2. Taksonomiese analise het getoon dat Ser27 hoogs bewaar word deur evolusie onder Fos-familielede (Fig 5B), wat daarop dui dat dit 'n belangrike fisiologiese funksie kan dra.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 5.

CK2 Fosforilate ΔFosB op Ser27. A, Fosforaminozuur analise van CK2-gefosforyleerde (vitro) en PC12-sel-gefosforileerde ΔFosB wat daarop dui dat in beide gevalle die belangrikste residu gefosforileer serine is. B, Kruis-spesie-analise van FosB / ΔFosB aminosuur volgorde het hoë bewaring van Ser27 onder Fos-familielede van menslike tot sebravis (donker hoogtepunt) bekend gemaak. Die suurresidu by posisie + 3, wat benodig word vir die CK2-konsensuswebwerf, word egter nie bewaar nie (ligte hoogtepunt). C, HeLa-selle is oorgedra met óf wild-tipe ΔFosB (WT) of ΔFosB wat 'n puntmutasie bevat om Ser27 met Ala (S27A) te vervang. Selle is metabolies gemerk met ³²PH₃PO₄ en behandel met 'n voertuig of met spermine (SP) om CK2 te aktiveer. 'N verteenwoordigende autoradiogram (boonste paneel) en immunoblot (onderste paneel) van die verkryde ΔFosB immunoprecipitates word getoon. Die immunoprecipitaat van mock-getransfecteerde selle (vektor) word getoon.

Om te bepaal of Ser27 in ΔFosB gefosforileer is, het ons hierdie residu na Ala gemixt en die gevolge op die fosforileringsstatus van die proteïen ontleed. Hiervoor gebruik ons ​​HeLa-selle (wat met hoër doeltreffendheid getransfecteer kan word) om WT of S27A mutant ΔFosB voorlopig uit te druk. Ongeveer 24 h na transfeksie, is die selle metabolies gemerk met ³²P-ortofosfaat, en heelselyselates is voorberei. Na aanleiding van immunoprecipitatie en SDS-PAGE, ³²P-ΔFosB is opgespoor deur autoradiografie en totale ΔFosB deur immunoblotting. Soos aangedui in Figuur 5C (onderste paneel), ΔFosB is nie opgespoor in die vektor-getransfekteerde selle nie, terwyl selle getransfekteer met WT of S27A mutant ΔFosB suksesvol die proteïen uitgedruk het. Ons het bevind dat die S27A mutasie 'n beduidende (~30%) verlaging veroorsaak het ³²P-ΔFosB vlakke (Fig 5C, boonste paneel en grafiek), wat aandui dat in lewende selle ΔFosB gefosforileer word op Ser27. In 'n poging om vas te stel of CXXUMUMX in selle inderdaad gefosforileer is, vergelyk ons ​​die vermoë van die CK27-aktivatorspesermien om die fosforilering van WT en S2A ΔFosB te moduleer. Soos ons voorheen in PC2-selle waargeneem het (Fig 4B), behandeling van HeLa selle met spermine verhoogde fosforilering van die WT proteïen aansienlik. Die feit dat hierdie effek aansienlik verminder is deur die S27A mutasie (Fig 5C) ondersteun die interpretasie dat Ser27 in ΔFosB 'n fisiologiese substraat vir CK2 is.

Fosforilering van Ser27 reguleer die stabiliteit van ΔFosB

Nadat vasgestel is dat die stabiliteit van ΔFosB afgeneem word wanneer CK2 geïnhibeer en versterk word wanneer CK2 geaktiveer word (Fig 4), en dat CK2 fosfileer ΔFosB op Ser27 (Fig 5), het ons voorspel dat die voorkoming van fosforilering van hierdie webwerf die proteïen moet destabiliseer. Pulse-chase-eksperimente uitgevoer met HeLa-selle wat WT of S27A mutant ΔFosB oorgedra het, het getoon dat, soos voorspel, die S27A mutasie tot 'n beduidende toename in die tempo van afbraak van ΔFosB gelei het en 'n gepaardgaande afname in die halfleeftyd van die proteïen (Fig 6A). Ons het toe ondersoek of hierdie regulatoriese meganisme ook in die meer neuronagtige PC12 sellyn voorkom. Hierdie eksperimente het getoon dat, soos ons in HeLa-selle waargeneem het, die S27A-puntmutasie 'n dramatiese afname in die halfleeftyd van ΔFosB in PC12-selle veroorsaak (van ~11 tot ~4 h) (Fig 6B). Die feit dat hierdie destabilisasie soortgelyk is aan dié wat veroorsaak word deur CK2 remming of knock-down (Fig 4) verskaf verdere ondersteuning vir die idee dat CK2-gemedieerde fosforilering van Ser27 die stabiliteit van ΔFosB reguleer. Addisionele bewyse vir die regulatoriese rol van Ser27 fosforilering op ΔFosB proteïen omset is verkry met behulp van 'n fosfomimetiese Ser27 tot Asp mutasie (S27D). Die S27D mutasie word as fosfomimeties beskou, omdat dit 'n groot negatief gelaaide (karboksielgroep) by aminosure 27 plaas en sodoende gedeeltelik die fosforilering van Ser27 naboots. Soos aangedui in Figuur 6C, die S27D mutasie het die teenoorgestelde effek van die S27A mutasie veroorsaak en het tot gevolg dat 'n proteïen aansienlik meer stabiel is as die WT proteïen. Net soos die effek wat verkry is na CK2 aktivering (Fig 4D) het die S27D-mutasie tot die ophoping gelei en sodoende ΔFosB-vlakke gedurende die eerste ure van die jaag verhoog.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 6.

Fosforilering van Ser27 reguleer die stabiliteit van ΔFosB. A, C, Pulse-chase analise wat die effek van Ser27 fosforilering op die omset van ΔFosB toon. Die afbraakprofiel en beraamde halfleeftye van wild-tipe ΔFosB (WT), die Ser27 tot Ala mutant (S27A) en die fosfomimetiese Ser27 tot Asp mutant (S27D) word getoon. Dieselfde bevindings is in HeLa-selle verkry (A) en PC12 selle (B, C).

Ser27 fosforilering stabiliseer ΔFosB deur die proteasomale afbraak daarvan te voorkom

Om die meganisme te ontleed waardeur fosforilering van Ser27 ΔFosB stabiliseer, het ons die vermoë van die proteasoom-inhibeerders MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) en epoksomisien (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) om die afbraakgraad van WT en S27A mutant ΔFosB te moduleer. Pulse-chase-eksperimente is uitgevoer met behulp van PC12-selle wat besmet is met 'n rekombinante HSV wat óf WT of S27A ΔFosB uitdruk en met óf DMSO óf een van die twee proteasoom-inhibeerders behandel word. Hierdie eksperimente het aan die lig gebring dat hoewel die afbraakgraad van die WT proteïen relatief ongevoelig is vir die teenwoordigheid van een van die twee proteasoom-inhibeerders (Fig 7A), dié van die S27A mutant is sensitief vir hierdie middels (Fig 7B). Dit dui daarop dat, in teenstelling met die WT proteïen, die S27A mutant 'n teiken van proteasomale afbraak is. Inderdaad, die behandeling van selle met MG132 of epoksomisien, het die effek van die S27A mutasie ten volle omgeskakel oor die afbrekings tempo van ΔFosB, wat bewys word deur 'n toename in die halfleeftyd van die S27A mutant van ~4 tot ~9 h vir MG132 en tot ~ 12 h vir epoksomisien (Fig 7B). Tesame dui hierdie bevindinge aan dat fosforilering van ΔFosB op Ser27 die proteïen beskerm teen proteasomale afbraak en daarom noodsaaklik is vir sy ongewone stabiliteit.

Bekyk groter weergawe:

• In hierdie bladsy
• In 'n nuwe venster

• Laai af as PowerPoint Slide

Figuur 7.

Fosforilering van Ser27 stabiliseer ΔFosB deur sy proteasomale afbraak te voorkom. A, B, Pulse-chase-analise met HSV-geïnfekteerde PC12-selle wat die afbraakprofiel toon en die geskatte halfleeftye van wild-tipe ΔFosB (A) of S27A ΔFosB (B) in die afwesigheid of teenwoordigheid van een van twee proteasoom-inhibeerders [MG132 en epoksomisien (Epoxo)]. Let op die feit dat geen geneesmiddel 'n beduidende uitwerking op die omset van wild-tipe ΔFosB het nie, terwyl die behandeling van selle met óf proteasoom-inhibeerder die stabilisering van S27A ΔFosB tot gevolg gehad het. C, 'N Model vir die rol van Ser27 fosforilering in die vermoë van ΔFosB om langtermyn breinplastisiteit te bemiddel. Sodra geïnduseer word, word 'n gedeelte van ΔFosB in die brein gestabiliseer deur die CK2-gemedieerde fosforilering van S27. Dit lei tot die akkumulasie daarvan, wat op sy beurt lei tot langdurige veranderinge in gene-uitdrukking. Hierdie stabiele veranderinge in geenuitdrukking dra by tot stabiele gedragsaanpassings. Omgekeerd lei die defosforilering van S27 deur die Ser / Thr fosfatases PP1 en / of PP2A tot destabilisering van die proteïen en die verwerking daarvan deur die proteasomale masjinerie.

Vorige afdelingVolgende afdeling

Bespreking

In die huidige studie toon ons dat ΔFosB 'n halfleeftyd van ~10 h in selkultuur het, wat dit stabiel maak in vergelyking met FosB met die volle lengte en die meeste ander induktiewe transkripsiefaktore waarvan die halfleeftyd in selkultuur so kort kan wees. soos 'n paar minute en skaars oorskry 3 h (Hann en Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts en Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Daarbenewens vind ons dat ΔFosB in die brein gefosforileer is en dat die fosforilering daarvan sensitief is vir die PP1 / PP2A inhibitor okadaïensuur. Ons selkultuurstudie toon aan dat die stabiliteit van ΔFosB deur CK2 gemoduleer word, met hoër CK2-aktiwiteit wat die proteïen stabiliseer. Laastens, ons bevindinge dui daarop dat CK2 fosfileer ΔFosB op 'n hoogs bewaarde N terminus serine (S27) en demonstreer dat fosforilering van S27 ΔFosB beskerm teen proteasomale afbraak. Ons stel dus 'n model voor waarin fosforilering van ΔFosB op S27 by CK2 'n kritiese regulerende meganisme van omset van ΔFosB is (Fig 7C). Sulke fosforilasie-gemedieerde stabilisering van ΔFosB is funksioneel belangrik, aangesien verhoogde vlakke van ΔFosB in bepaalde breinstreke getoon is om talle neuronale gene direk te reguleer in vivo en om sterk gedragseffekte uit te oefen in diermodelle van verskeie neuropsigiatriese versteurings (sien Inleiding).

Alhoewel fosforilering 'n vinnige en omkeerbare manier is om die transkripsionele aktiwiteit van sekere transkripsiefaktore te reguleer, soos CREB (cAMP reaksie element bindende proteïen) (Bohmann, 1990), die modulering van die agteruitgang van transkripsiefaktore bied 'n nog sterker (minder maklik omkeerbare) vorm van regulering (Desterro et al., 2000). Transkripsiefaktore waarvan die funksionele aktiwiteit op die vlak van hul agteruitgang gereguleer word, sluit in NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), en c-Fos (Ferrara et al., 2003), onder andere. In baie gevalle is fosforilering 'n sleutelreguleerder van die stabiliteit van 'n transkripsiefaktor, soos getoon is vir c-Fos (Okazaki en Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-verwante antigeen-1 (Fra-1) (Fles en Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), C-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), en p53 (Buschmann et al., 2001). Ons studies voeg dus ΔFosB by hierdie lys van transkripsiefaktore wie se funksionele aktiwiteit deur sy gefosforileerde afhanklike stabiliteit gereguleer word.

CK2 is 'n alomteenwoordige en grondwetlik aktiewe Ser / Thr-kinase met tot dusver 300 beweerde substrate wat geïdentifiseer is en is geïmpliseer in veelvuldige biologiese prosesse, insluitend seldood en oorlewing (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), selfoonstresreaksies (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), en DNA herstel en chromatien remodeling (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Meer as een derde van die vermeende substrates van CK2 is proteïene betrokke by die regulering van geenuitdrukking (Meggio en Pinna, 2003). Trouens, CK2 is getoon dat dit 'n prominente kernkinase is (Krek et al., 1992) (vir hersiening, sien Yu et al., 2001) en om met die bZIP-domeine van verskeie transkripsiefaktore te kommunikeer (Yamaguchi et al., 1998). CK2-gemedieerde fosforilering het ook getoon dat die afbraak (of verbetering of vermindering daarvan) van baie proteïene, insluitend IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres en Pulido, 2001), lens connexin (Yin et al., 2000), chromatien-geassosieerde proteïen HMG1 (Wisniewski et al., 1999), en verskeie transkripsiefaktore soos HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), en c-Myc (Channavajhala en Seldin, 2002). CK2 is die meeste in die brein (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), en sy aktiwiteit is betrokke by baie aspekte van breinfunksie, insluitend neuronale oorlewing (Boehning et al., 2003), differensiasie (Nuthall et al., 2004), ioon kanaal funksie (Jones en Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), en langtermyn potensiering en neuronale plastisiteit (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman en Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

Ten spyte van hierdie groeiende bewyse vir die rol van CK2 in die regulering van neuronale funksie, is min bekend oor wat die aktiwiteit beheer. CK2 word beskou as konstitutief aktief, met regulering van sy vermoë om spesifieke substrate te fosforiliseer, veral op veranderinge in sy intrasellulêre lokalisering (bv. Sitosol teenoor kern) (Ahmed en Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Hierdie inligting stel 'n belangrike vraag oor wat seine benodig word om ΔFosB-akkumulasie in die brein na chroniese stimulasie te induceer (Fig 7C). Een vereiste is herhaalde aktivering van die fosB geen en induksie van ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Ons data dui daarop dat CK2 fosforilering van ΔFosB krities is vir sy stabiliteit. Dit dui daarop dat 'n tweede sein nodig mag wees vir die langtermyn-effekte van ΔFosB op geenuitdrukking, naamlik 'n sein wat die fosforilering van proteïen deur CK2 stimuleer. Dit kan die aktivering van CK2 behels deur 'n onbekende meganisme of die translokasie daarvan na die kern. Alternatiewelik kan CK2 fosforilering van ΔFosB konstitutief wees, sodat as ΔFosB proteïen vertaal word in reaksie op elke stimulus, word 'n gedeelte daarvan gefosforileer en sodoende gestabiliseer sodat dit met herhaalde stimulasie ophoop tot hoë vlakke in geaffekteerde neurone.

Ons bevindings toon dat CK2 en S27 waarskynlik nie die enigste kinase en webtuiste is wat verantwoordelik is vir ΔFosB fosforilering nie, aangesien nie inhibisie van CK2 of die S27A mutasie in staat was om ΔFosB fosforilasie heeltemal te voorkom nie. Die feit dat die S27A mutasie 'n 30% reduksie in fosfo-FosB tot gevolg het, beweer dat S27 'n belangrike fosforileringsplek op die proteïen is. Ons ondersoek tog ander vermeende kinases en fosforileringsterreine op ΔFosB. Uiteindelik sal dit ook belangrik wees om die fosforilering van S27 en enige ander fosforileringsterreine in ΔFosB in brein te ontleed in vivo na verskillende tipes chroniese stimulasie, byvoorbeeld deur die gebruik van massaspektrometrie of fosfospesifieke teenliggaampies.

Soos hierbo genoem, is S27 in ΔFosB hoogs behoue ​​dwarsdeur evolusie en onder andere Fos-familieproteïene. Die konsensuswebwerf vir CK2 is egter nie soos volg aangedui nie Figuur 5B, slegs FosB / ΔFosB (en die Zebrafish xenolog), maar nie c-Fos of Fra-2, besit 'n suurresidu by + 3, 'n sleutel determinant van CK2 fosforilering (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Dus, die gebrek aan CK2 fosforilering op S27 kan verduidelik hoekom ander Fos familie proteïene nie so stabiel is as ΔFosB. Dit verklaar egter nie waarom FosB, wat dieselfde CK2-konsensuswebwerf as ΔFosB het nie, ook nie gestabiliseer word nie. Ons weet nie of FosB met volle lengte fosforileer word deur CK2 op hierdie bewaarde reserwe nie. Die enigste verslae van FosB (Skinner et al., 1997) en c-Fos (Okazaki en Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforilering beskryf terreine in die C-terminale gebied van hierdie proteïene, wat afwesig is in ΔFosB. Die potensiële fosforilering van volwaardige FosB en ander Fos-familieproteïene deur CK2 vereis direkte ondersoek. Selfs al is hulle gefosforileer, is die ander Fos-familieproteïene bekend dat hulle motiewe bevat by hul C termini wat die proteïene teiken vir vinnige agteruitgang (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Daar is byvoorbeeld getoon dat 'n rek van ~21 residu's in die C-terminus van alle Fos-familieproteïene, maar afwesig is in ΔFosB, dien as 'n destabiliserende domein vir c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Ons het gevind dat alhoewel hierdie volgorde op dieselfde manier die FosB-volletjie (destyds destabiliseer)Carle et al., 2004), is die afwesigheid van hierdie domein in ΔFosB nie ten volle verantwoordelik vir sy stabilisering nie. Die kombinasie van die afwesigheid van hierdie C-terminusdomein en Ser27-fosforilering lyk eerder dat dit ongeveer vyfvoudig verskil in stabiliteit tussen ΔFosB en FosB is.

Alhoewel die afbraak van Fos-familieproteïene kompleks is en nie ten volle verstaan ​​word nie, blyk proteasomale afbraak die hoofweg betrokke te wees (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Data wat hier aangebied word, waarin proteasomale inhibeerders nie die tempo van ΔFosB degradasie aansienlik verander nie, argumenteer dat, anders as ander Fos-familie proteïene, ΔFosB die 26S proteasoom ontwyk, en dit speel 'n sentrale rol in stabilisering. Ons stel dus 'n skema voor waarin die verbeterde stabiliteit van ΔFosB toeskryfbaar is aan die kombinasie van twee hoof faktore: (1) die afwesigheid van 'n C-terminale destabiliserende domein en (2) die fosforilering van S27 deur CK2.

Samevattend bied die huidige studie meganistiese insig oor waarom ΔFosB, 'n produk van die onmiddellike vroeë geen fosB, is, in teenstelling met alle ander Fos-familielede, 'n relatief langlewende proteïen. Alhoewel ander Fos-familieproteïene gedink word om vinnige, maar oorganklike stimulus-transkripsiekoppeling te bemiddel (Morgan en Curran, 1995), gee die relatiewe stabiliteit van ΔFosB die vermoë om langdurige transkripsionele veranderinge wat veroorsaak word deur chroniese stimulasie, te bemiddel. Dit ondersteun die siening dat ΔFosB funksioneer as 'n volgehoue ​​molekulêre skakelaar in die brein, wat geleidelik die akute respons in kroniese aanpassings omskakel. Identifikasie van Ser27 fosforilering as 'n sentrale meganisme vir die stabiliteit van ΔFosB maak nuwe weë oop vir die ontwikkeling van middele om die funksie van ΔFosB te reguleer en sodoende sy langtermyn-effekte op neurale en gedragsplastisiteit te moduleer.

Vorige afdelingVolgende afdeling

voetnote

• Ontvang November 21, 2005.
• Hersiening ontvang Februarie 21, 2006.
• Aanvaar April 2, 2006.

• Hierdie werk is ondersteun deur 'n Nasionale Alliansie vir Navorsing oor Skizofrenie en Depressie Jong Ondersoeker Toekenning aan PGU, 'n Nasionale Instituut vir Dwelmmisbruik (NIDA) Nasionale Navorsingsdiens Toekenning aan PGU, en toekennings van die Nasionale Instituut vir Geestesgesondheid en NIDA tot EJN Ons dank dr. James Bibb vir sy hulp met die vitro fosforileringstoetse, dr. Ming-Hu Han vir sy hulp met die voorbereiding van breinskywe wat gebruik word vir metaboliese etikettering, en dr. Rachael Neve vir haar hulp met die verpakking van die rekombinante HSV's.
• G. Rudenko se huidige adres: Instituut vir Lewenswetenskappe en Departement Farmakologie, Universiteit van Michigan, Washtenawlaan 210 # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
• Korrespondensie moet gerig word aan Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. e-pos: [e-pos beskerm]

Vorige afdeling

Verwysings

1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifisering van 'n C-terminale tripeptiedmotief wat betrokke is by die beheer van vinnige proteasomale afbraak van c-Fos protokoproteïen tydens die G (0) -to-S fase oorgang. oncogeen 20:7563-7572.

CrossRefMedline

2. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Veelvuldige agteruitgangspaaie vir Fos-familieproteïene. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

Medline

3. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) Meganisme van intrasellulêre regulering van proteïenkinase CK2: rol van stimulus-gemedieerde subnuclear assosiasie. Cell Mol Biol Res 40:539-545.

Medline

4. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) 'N Verbeterde suiweringsprosedure en eienskappe van kaseïekase II van die brein. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMedline

5. ↵

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Tydsverloop van striatale DeltaFosB-agtige immunoreaktiwiteit en prodynorfiene mRNA vlakke na die staking van chroniese dopaminomimetiese behandeling. Eur J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMedline

6. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genoom-wye uitdrukkingsskerms dui op 'n globale rol vir proteïenkinase CK2 in chromatienhervorming. J Cell Sci 116:1563-1577.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

7. ↵

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Twee isozyme van PKC wat in HL-60-selle voorkom, toon 'n verskil in aktivering deur die fosforester TPA. FEBS Lett 249:264-266.

Medline

8. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteïenkinase CK2 word saamgevoeg met klein geleidings Ca (2 +) - geaktiveerde K + kanale en reguleer kanaalgating. Neuron 43:847-858.

CrossRefMedline

9. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Langtermyn uitdrukking van Fos-verwante antigeen en oorgangse uitdrukking van delta FosB wat verband hou met aanvalle in die rat-hippokampus en striatum. J Neurochem 68:272-279.

Medline

10. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Voorspelling van post-translasionele glikosilering en fosforilering van proteïene uit die aminosuurvolgorde. proteomika 4:1633-1649.

CrossRefMedline

11. ↵

Boehning D, Maan C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Koolmonoksied neurotransmissie geaktiveer deur CK2 fosforilering van heme oxygenase-2. Neuron 40:129-137.

CrossRefMedline

12. ↵

Bohmann D (1990) Transkripsiefaktor fosforilering: 'n skakel tussen seintransduksie en die regulering van geenuitdrukking. Kanker selle 2:337-344.

Medline

13. ↵

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminale kinase fosforilering van p53 op Thr-81 is belangrik vir p53 stabilisering en transkripsie aktiwiteite in reaksie op stres. Mol Cell Biol 21:2743-2754.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

14. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Afwesigheid van 'n behoue ​​F-familie C-terminale domein dra by tot die unieke stabiliteit van deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

15. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funksionele interaksie van proteïenkinase CK2 en c-Myc in limfomagenese. oncogeen 21:5280-5288.

CrossRefMedline

16. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hoop BT, Nestler EJ (1995) Regulering van delta FosB en FosB-agtige proteïene deur elektrokonvulsiewe aanval en kokaïenbehandelings. Mol Pharmacol 48:880-889.

Abstract

17. ↵

Chen J, Kelz MB, Hoop BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chroniese Fos-verwante antigene: stabiele variante van ΔFosB geïnduceer in die brein deur chroniese behandelings. J Neurosci 17:4933-4941.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

18. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforilering van c-Fos by die C-terminus verhoog sy transformerende aktiwiteit. oncogeen 12:1493-1502.

Medline

19. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Die proteïenfosfatase 1 / 2A inhibitor okadaïensuur verhoog CREB en Elk-1 fosforilering en c-fos uitdrukking in die ratstriatum in vivo. J Neurochem 89:383-390.

CrossRefMedline

20. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Poliamien-gemedieerde proteïen fosforilasies: 'n moontlike teiken vir intracellulêre poliamienwerking. Mol Cell Endokrinol 30:247-266.

CrossRefMedline

21. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalitiese en molekulêre eienskappe van 'n hoogs gesuiwerde G-tipe kaseïen kinase van bees longweefsel. Biochim Biophys Acta 743:1-12.

Medline

22. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Striatale seltipe-spesifieke ooruitdrukking van DeltaFosB verhoog aansporing vir kokaïen. J Neurosci 23:2488-2493.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

23. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokaïen self-administrasie verhoog preprodynorfien, maar nie c-fos, mRNA in ratstriatum nie. NeuroReport 4:543-546.

Medline

24. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulering van transkripsiefaktore deur proteïendegradasie. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.

CrossRefMedline

25. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Toename in sitoplasmiese kasease-kinase II-tipe aktiwiteit vergesel neurietuitplanting na DNA-sintese inhibisie in NIA-103 neuroblastoom selle. J Neurochem 58:1820-1828.

Medline

26. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Proteïenkinase CK2 fosforilateer en opreguleer Akt / PKB. Sel Dood Verskil 12:668-677.

CrossRefMedline

27. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Beide produkte van die fosB-geen, FosB en sy kort vorm, FosB / SF, is transkriptionele aktiveerders in fibroblaste. Mol Cell Biol 11:5470-5478.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

28. ↵

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Die strukturele determinante wat verantwoordelik is vir c-Fos proteïen proteasomale afbraak verskil volgens die uitdrukkingsvoorwaardes. oncogeen 22:1461-1474.

CrossRefMedline

29. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforilasie-afhanklike teiken van c-Jun ubiquitinasie deur Jun N-kinase. oncogeen 13:1531-1535.

Medline

30. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminale kinases teiken die ubiquitinasie van hul geassosieerde transkripsiefaktore. J Biol Chem 272:32163-32168.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

31. ↵

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabiliteit van die ATF2 transkripsiefaktor word gereguleer deur fosforilering en defosforilering. J Biol Chem 275:12560-12564.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

32. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilering van DARPP-32, 'n dopamien- en cAMP-gereguleerde fosfoproteïen, deur kaseïen kinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

33. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterisering in soogdierbrein van 'n DARPP-32 seriene kinase identies aan kaseïen kinase II. J Neurochem 55:1772-1783.

Medline

34. ↵

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomisien, 'n nuwe antitumor agent van mikrobiese oorsprong. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.

Medline

35. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteïene wat deur die menslike c-myc-onkogen gekodeer word: differensiële uitdrukking in neoplastiese selle. Mol Cell Biol 4:2486-2497.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

36. ↵

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, 'n sikliese AMP-gereguleerde fosfoproteïen (Mnr = 21,000) verryk in dopamien-geïnvesteerde breinstreke. Aminosuur volgorde van die site gefosforileer deur sikliese AMP in intakte selle en kinetiese studies van sy fosforilering in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.

37. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Farmakologie van proteïenkinase-inhibeerders. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMedline

38. ↵

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Onstabiliteit van Hes7 proteïen is noodsaaklik vir die somiet segmentasie horlosie. Nat Genet 36:750-754.

CrossRefMedline

39. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atipiese en tipiese neuroleptiese behandelings veroorsaak afsonderlike programme van transkripsiefaktoruitdrukking in die striatum. J Comp Neurol 374:70-83.

CrossRefMedline

40. ↵

Hoop B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulering van onmiddellike vroeë gene-ekspressie en AP-1 binding in die ratkern as gevolg van chroniese kokaïen. Proc Natl Acad Sci VSA 89:5764-5768.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

41. ↵

Hoop BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Chroniese elektrokonvulsiewe beslaglegging (ECS) behandeling lei tot die uitdrukking van 'n langdurige AP-1 kompleks in die brein met veranderde samestelling en eienskappe. J Neurosci 14:4318-4328.

Abstract

42. ↵

Hoop BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induksie van 'n langdurige AP-1-kompleks saamgestel uit veranderde Fos-agente proteïene in die brein deur chroniese kokaïen en ander chroniese behandelings. Neuron 13:1235-1244.

CrossRefMedline

43. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilisasie van kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II deur die auto-inhibitiewe domein. J Biol Chem 270:2163-2170.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

44. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplekse meganismes vir c-fos en c-jun degradasie. Mol Biol Rep 24:51-56.

CrossRefMedline

45. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) Kaseïen kinase ii (proteïenkinase ck2) reguleer serotonien 5-ht (3) reseptor kanaal funksie in ng108-15 selle. Neurowetenskap 119:629-634.

CrossRefMedline

46. ↵

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 is 'n C-terminale IkappaB-kinase wat verantwoordelik is vir NF-kappaB-aktivering tydens die UV-respons. Mol Cell 12:829-839.

CrossRefMedline

47. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Uitdrukking van die transkripsiefaktor deltaFosB in die brein beheer sensitiwiteit vir kokaïen. Aard 401:272-276.

CrossRefMedline

48. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasome inhibisie deur die natuurlike produkte epoksomisien en dihydroeponemisien: insig in spesifisiteit en sterkte. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.

CrossRefMedline

49. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), 'n nuwe mikrobiese verbinding, is 'n baie sterk en spesifieke inhibitor van proteïenkinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.

CrossRefMedline

50. ↵

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kasease II is 'n oorwegend kernensiem. J Cell Biol 116:43-55.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

51. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteïenkinase CK2 fosforileer die hoë mobiliteitsgroep-proteïen SSRP1, wat die herkenning van UV-beskadigde DNA veroorsaak. J Biol Chem 278:12710-12715.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

52. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Chromatien remodellering is 'n belangrike meganisme onderliggend aan kokaïen-geïnduseerde plastisiteit in striatum. Neuron 48:303-314.

CrossRefMedline

53. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) Caseïn kinase-II reguleer NMDA kanaal funksie in hippocampale neurone. Nat Neurosci 2:125-132.

CrossRefMedline

54. ↵

Litchfield DW (2003) Proteïenkinase CK2: struktuur, regulering en rol in sellulêre besluite van lewe en dood. Biochem J 369:1-15.

CrossRefMedline

55. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Afbraak van c-Fos-proteïen uitgedruk deur N-metiel-d-aspartiese suur in kernfrakties van muriene hippokampus. Brain Res 905:34-43.

Medline

56. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Afwesigheid van 'n aanhoudende verhoogde 37 kDa fosverwante antigeen en AP-1-agtige DNA-bindende aktiwiteit in die brein van kainiensuur-behandelde fosB null-muise. J Neurosci 17:5407-5415.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

57. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Site-spesifisiteit van kasease-2 (TS) van rat-lewer-sitosol. 'N Studie met modelpeptied substrate. Eur J Biochem 160:239-244.

58. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulering van geenuitdrukking en kokaïenbeloning deur CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.

CrossRefMedline

59. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: 'n molekulêre skakelaar vir langtermyn aanpassing in die brein. Brein Res Mol Brein Res 132:146-154.

Medline

60. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) Een-duisend-en-een substrate van proteïenkinase CK2? FASEB J 17:349-368.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

61. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforylering van kaseïenfraksies deur 'phosvitin kinase' van rot lewer. FEBS Lett 75:192-196.

Medline

62. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforylering van tipe 2 kasease kase TS in beide sy alfa- en beta-subeenhede. Invloed van verskillende effektore. FEBS Lett 160:203-208.

CrossRefMedline

63. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosyl-bensimidasool afgeleides as inhibeerders van kasease-kasease-2 en kaseïen-kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.

Medline

64. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substraat spesifisiteit van proteïenkinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.

Medline

65. ↵

Miller C, Zhang M, Hy Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripsie-induksie van siklooksigasase-2-gen deur okadaïensuur-inhibisie van fosfatase-aktiwiteit by menslike chondrocytes: medestimulasie van AP-1- en CRE-kernbindende proteïene. J Cell Biochem 69:392-413.

CrossRefMedline

66. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Netwerkvlak veranderinge in die uitdrukking van induceerbare Fos-Jun proteïene in die striatum tydens chroniese kokaïen behandeling en onttrekking. Neuron 17:147-156.

CrossRefMedline

67. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Onmiddelike vroeë gene: tien jaar later. Neigings Neurosci 18:66-67.

CrossRefMedline

68. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) 'N Natuurlik voorkomende afgeknotte vorm van FosB wat Fos / Jun transkripsie-aktiwiteit inhibeer. Cell 64:751-759.

CrossRefMedline

69. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: 'n volgehoue ​​molekulêre skakelaar vir verslawing. Proc Natl Acad Sci VSA 98:11042-11046.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

70. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Inleiding van die glutamaat-reseptor subeenheid 1 in motoriese neurone in vitro en in vivo met behulp van 'n rekombinante herpes simplexvirus. Neurowetenskap 79:435-447.

CrossRefMedline

71. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforilering van serine 239 van Groucho / TLE1 deur proteïenkinase CK2 is belangrik vir die inhibisie van neuronale differensiasie. Mol Cell Biol 24:8395-8407.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

72. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) Die Mos / MAP kinase-pad stabiliseer c-Fos deur fosforilering en versterk sy transformerende aktiwiteit in NIH 3T3-selle. EMBO J 14:5048-5059.

Medline

73. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Die ubiquitien-proteasoom-roete word benodig vir die verwerking van die NF-kappa B1 voorloper proteïen en die aktivering van NF-kappa B. Cell 78:773-785.

CrossRefMedline

74. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Gerigte agteruitgang van c-Fos, maar nie v-Fos nie, deur 'n fosforilering-afhanklike sein op c-Jun. Wetenskap 258:1941-1944.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

75. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Voorraad JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducible, brein-streekspesifieke uitdrukking van 'n dominante negatiewe mutant van c-Jun in transgeniese muise verminder sensitiwiteit vir kokaïen. Brain Res 970:73-86.

CrossRefMedline

76. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induksie van DeltaFosB in beloningsverwante breinstrukture na chroniese stres. J Neurosci 24:10594-10602.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

77. ↵

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Brein transkripsiefaktor uitdrukking: effekte van akute en chroniese amfetamien en inspuitingstres. Brein Res Mol Brein Res 20:91-100.

Medline

78. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Na-translasie modifikasie: fosforilering en fosfatases. In: Huidige protokolle in proteïenwetenskap (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01-13.02. New York: Wiley and Sons.

79. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalitiese en molekulêre eienskappe van hoogs gesuiwerde fosvitien / kaseaseasease II van menslike epiteelselle in kultuur (HeLa) en verhouding tot ecto-proteïenkinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.

Medline

80. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status van die "proteïenkinase CK2-HMG14" -stelsel in ouderdomsverwante amnesie by rotte. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

Medline

81. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Afbraak van die basiese heliks-lus-heliks / Per-ARNT-Sim-homologie-domeindioksienreseptor via die ubiquitien- / proteasoomweg. J Biol Chem 274:36351-36356.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

82. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Die PredictProtein bediener. Nukleïensure Res 32:W321-W326.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

83. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 teikens in die brein. Front Biosci 9:8-23.

CrossRefMedline

84. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekulêre karakterisering van rekombinante muis adenosien kinase en evaluering as 'n teiken vir proteïen fosforilering. Eur J Biochem 271:3547-3555.

Medline

85. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Is daar verskeie proteolitiese weë wat bydra tot die verswakking van c-Fos, C-Jun en p53 proteïen in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.

CrossRefMedline

86. ↵

Schmidt R, Hecker E (1975) Outoksidasie van fosbolesters onder normale bergingstoestande. Kanker Res 35:1375-1377.

GRATIS volledige teks

87. ↵

Schwarz EM, Van Antwerpen D, Verma IM (1996) Constitutieve fosforylering van IkappaBalpha deur caseïne kinase II kom voor by serine 293: vereiste vir agteruitgang van vrye IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

88. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras verhoog Myc proteïen stabiliteit. Mol Cell 3:169-179.

CrossRefMedline

89. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Sikliese nukleotied-onafhanklike fosforilering van vitellien deur kaseïekasease II gesuiwer van Rhodnius prolixus-oositiete. Insekte Biochem Mol Biol 32:847-857.

CrossRefMedline

90. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, Wysheid R (1997) Transkripsionele aktivering en transformasie deur FosB proteïen vereis fosforilering van die karboksiel-terminale aktiveringsdomein. Mol Cell Biol 17:2372-2380.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

91. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteïenkinase CK2 fosforileer differensiaal proteïenmielies chromosomale hoë mobiliteitsgroep B (HMGB) proteïene wat hul stabiliteit en DNA-interaksies moduleer. J Biol Chem 277:1092-1098.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

92. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikasie van cyk, 'n siklien B2 kinase, as 'n nuwe kalsium / kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II en sy rol tydens Xenopus laevis-oocyte-veroudering. Exp Cell Res 252:303-318.

CrossRefMedline

93. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulering van c-fos en c-jun gene uitdrukking deur lipopolisakkariede en sitokiene in primêre gekultiveerde astrocytes: effek van PKA en PKC-weë. Arch Pharm Res 27:396-401.

Medline

94. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Differensiële fosforilering van ribosomale suur proteïene uit gis sel deur twee endogene proteïen kinases: kasease-kinase-2 en 60S kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.

Medline

95. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Kalfostien (UCN1028) en kalfostienverwante verbindings, 'n nuwe klas spesifieke en sterk inhibeerders van proteïenkinase C. Adv Tweede Boodskapper Fosfoproteïen Res 24:497-501.

Medline

96. ↵

Torres J, Pulido R (2001) Die tumoronderdrukker PTEN word gefosforileer deur die proteïenkinase CK2 by sy C-terminus. Implikasies vir PTEN-stabiliteit vir proteasoomgemedieerde afbraak. J Biol Chem 276:993-998.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

97. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Differensiële inhibisie van kalpain- en proteasoomaktiwiteite deur peptidielaldehiede van di-leucien en tri-leucien. J Biochem (Tokio) 119:572-576.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

98. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Afbraak van c-Fos deur die 26S proteasoom word versnel deur c-Jun en veelvuldige proteïenkinases. Mol Cell Biol 15:5682-5687.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

99. ↵

Jonger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteïenkinase CK2 as reguleerder van selle oorlewing: implikasies vir kankerterapie. Curr Kanker Drug Doelwitte 4:77-84.

CrossRefMedline

100. ↵

Flacon E, Marshall CJ (2003) Verhoogde ERK-MAP-kinase-aktiwiteit beskerm die FOS-familielid FRA-1 teen proteasomale afbraak in kolonkarsinoom-selle. J Cell Sci 116:4957-4963.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

101. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB reguleer wielrigting. J Neurosci 22:8133-8138.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

102. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulering van transkripsiefaktorfunksie deur fosforilering. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.

CrossRefMedline

103. ↵

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Twee vermeende proteïenkinase CK2 fosforileringsterreine is belangrik vir Myf-5-aktiwiteit. Biol Chem 378:1445-1456.

Medline

104. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitusiewe fosforilering van die suur sterte van die hoë mobiliteitsgroep 1 proteïene deur kasease kasease II verander hul konformasie, stabiliteit en DNA bindingspesifisiteit. J Biol Chem 274:20116-20122.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

105. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Caseïne kinase II interaksie met die bZIP domeine van verskeie transkripsiefaktore. Nukleïensure Res 26:3854-3861.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

106. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilering van A170 stres proteïen deur kasease-kinase II-agtige aktiwiteit in makrofage. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.

CrossRefMedline

107. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Die transkripsionele verlenging inhibeerder 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazole inhibeer transkripsiefaktor IIH-geassosieerde proteïenkinase. J Biol Chem 270:23922-23925.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

108. ↵

Jen J, Wysheid RM, Tratner I, Verma IM (1991) 'N Alternatiewe gesplete vorm van FosB is 'n negatiewe reguleerder van transkripsionele aktivering en transformasie deur Fos proteïene. Proc Natl Acad Sci VSA 88:5077-5081.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

109. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Caseïn kinase II fosforileer lens connexin 45.6 en is betrokke by die agteruitgang daarvan. J Biol Chem 275:6850-6856.

Samevatting / GRATIS Volledige teks

110. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksie van AP-1 transkripsiefaktor komponente tydens T-sel aktivering deur interleukien 1 en fosbolesters. Selgroei Verskil 3:677-684.

Abstract

111. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Gevolge van CK2 sein na die kernmatriks. Mol Cell Biochem 227:67-71.

CrossRefMedline

112. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Differensiële teikening van proteïenkinase CK2 na die kernmatriks by oorgangsoordrukking van sy subeenhede. J Cell Biochem 74:127-134.

CrossRefMedline

113. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: 'n noodsaaklike rol vir ΔFosB in die kernkampusse in morfienaksie. Nat Neurosci 9:205-211.

CrossRefMedline

Artikels wat verwys na hierdie artikel

• Gedrags- en strukturele reaksies op chroniese kokaïen Vereis 'n voortspoorloop wat betrokke is by (Delta) FosB en Kalsium / Calmodulien-Afhanklike Proteïenkinase II in die Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 Maart 2013, 33(10):4295-4307
  • Abstract
  • Volledige teks
  • Volledige teks (PDF)
• Striatale ooruitdrukking van {Delta} FosB Reproduceer Chroniese Levodopa-Induced Onvoltooide Bewegings Journal of Neuroscience, 26 Mei 2010, 30(21):7335-7343
• Abstract
• Volledige teks
• Volledige teks (PDF)
• Abstract
• Volledige teks
• Volledige teks (PDF)
• Abstract
• Volledige teks
• Volledige teks (PDF)
• Abstract
• Volledige teks
• Volledige teks (PDF)
• Transkripsionele meganismes van verslawing: rol van {Delta} FosB Filosofiese Transaksies van die Koninklike Genootskap B: Biologiese Wetenskappe, 12 Oktober 2008, 363(1507):3245-3255
• Volgehoue ​​kwesbaarheid vir herinstelling van metamfetamien-soekende gedrag in gliale sellyn-afgeleide neurotrofe faktor mutante muise Die FASEB Joernaal, 1 Julie 2007, 21(9):1994-2004
• Die Activator Protein-1 Transkripsiefaktor in Respiratoriese Epithelium Karsinogenese Molekulêre Kanker Ondersoek, 1 Februarie 2007, 5(2):109-120