Genoegsaamheid van Mesolimbiese Dopamien Neuronstimulasie vir die Progressie tot Verslawing (2015)

Inleiding

Verslawing is 'n siekte wat in verskeie stappe ontwikkel (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Die diagnose word gemaak wanneer ontspanningsgebruik kompulsief word en voortduur ten spyte van negatiewe gevolge. Terwyl 'n toonaangewende verslawinghipotese beweer dat dwelmmiddels die siekte veroorsaak omdat dit die konsentrasie van dopamien (DA) in die brein buitensporig verhoog, is dit onduidelik of die sneller van hierdie stelsel voldoende is om die oorgang van ontspanningsgebruik na verslawing te dryf (Di Chiara en Bassareo, 2007, Volkow en Morales, 2015). Die ondersteunende bewyse vir die DA-hipotese vir dwelmversterking het oor etlike dekades opgehoop en maak staat op die aanvanklike effek van dwelms. Byvoorbeeld, verslawende middels verminder die drempel vir intrakraniale selfstimulasie (ICSS) van die mediale voorbreinbundel, 'n veselkanaal wat onder andere opgaande DA-projeksie vanaf die middelbrein bevat (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmakologie en letselstudies het toe die mesokortikolimbiese DA-stelsel as die oorsprong van hierdie kring geïdentifiseer (Wise en Bozarth, 1982). In die laat 1980's het 'n direkte maatstaf van die ekstrasellulêre DA-konsentrasie met mikrodialise bevestig dat verslawende middels die eienskap gedeel het om 'n DA-oplewing in die NAc op te wek (Di Chiara en Imperato, 1988). Dit het gelei tot die voorstel van 'n meganistiese klassifikasie van verslawende middels (Lüscher en Ungless, 2006).

Baie minder is bekend oor hoe hierdie aanvanklike effekte van dwelmgebruik die oorgang na verslawing vergemaklik. DA-onafhanklike meganismes is oorweeg omdat verslawende middels ander farmakologiese teikens het. Kokaïen bind byvoorbeeld, benewens die inhibeer van die DA-vervoerder (DAT), ook aan SERT (serotonienvervoerder) en NET (norepinefrienvervoerder) om onderskeidelik serotonien- en norepinefrienheropname te verminder, en sodoende die konsentrasie van alle belangrikste monoamiene (Han en Gu, 2006, Tassin, 2008). Soortgelyke bekommernisse kan van toepassing wees op ander psigostimulante. Boonop is daar 'n bewering dat opiate, ten minste in die beginfase, DA-onafhanklik is (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee en van der Kooy, 2012). Die DA-hipotese is ook uitgedaag op grond van genetiese muismodelle, waar, na inmenging met die DA-stelsel, sommige vorme van dwelm-aanpasbare gedrag steeds sigbaar was. Byvoorbeeld, DAT-uitklopmuise dien self kokaïen toe (Rocha et al., 1998), en die afskaffing van DA-sintese hetsy farmakologies (Pettit et al., 1984) of geneties (Hnasko et al., 2007) het nie daarin geslaag om dwelmselfadministrasie te voorkom nie. of gekondisioneerde plekvoorkeur. Terwyl beter karakterisering van hierdie transgeniese muise en generasie van dubbele monoamien-vervoerders uitklophoue sommige van hierdie kwessies opgelos het (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), is die genoegsaamheid van DA om kardinale kenmerke van verslawing te veroorsaak, onbekend. Om kwessies van nie-spesifisiteit te omseil, het ons dus besluit om muise toe te laat om VTA DA neurone self te stimuleer deur 'n optogenetiese benadering te gebruik.

Onlangse studies het getoon dat aktivering van DA-neurone in die middelbrein plekvoorkeur kan veroorsaak (Tsai et al., 2009) of instrumentele gedrag kan versterk (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Terwyl hierdie selektiewe aktivering van DA-weë intrakraniale selfstimulasie (ICSS) studies bevestig wat meer as 30 jaar gelede uitgevoer is in die afbakening van die beloningstelsel (Fouriezos et al., 1978), skiet hulle tekort en demonstreer die induksie van laat-stadium adaptiewe gedrag wat definieer verslawing, en hulle het ook nie die onderliggende neuronale aanpassings geïdentifiseer nie. Hier het ons optogenetiese manipulasie gebruik om nie net voorsiening te maak vir direkte toetsing van die toereikendheidskriterium vir fasiese DA-sein in die aanvang van versterking nie, maar ook om te toets vir die oorgang na verslawing.

'n Opvallende waarneming van die latere stadiums van die siekte is dat selfs met die mees verslawende middels slegs 'n fraksie van gebruikers verslaaf raak (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Menslike verslaafdes sal voortgaan om dwelms te gebruik ten spyte van negatiewe gevolge (sien American Society for Addiction Medicine se "Definition of Addiction," DSM5, American Psychiatric Association, 2013), wat tipies verband hou met sosiale en sielkundige nederlae wat dikwels met tyd vertraag word. Net so, by knaagdiere word ongeveer een uit vyf diere wat selftoediening van kokaïen verkry uiteindelik as verslaaf geklassifiseer (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; maar sien George et al., 2014). Volharding van dwelm-inname ten spyte van negatiewe gevolge kan ook in knaagdiere gemodelleer word deur 'n eenvoudige afkeer stimulus aan die verbruikskedule in te voer. Terwyl die menslike siekte meer kompleks is, is die assosiasie van straf met verbruik 'n eenvoudige model van 'n kernkomponent van verslawing.

Hier het ons 'n ligte voetskok gebruik om die gevolg daarvan op selftoediening van kokaïen, sukrose en optogenetiese selfstimulasie te evalueer. Ons ondersoek verder of DA-neuron-selfstimulasie twee verslawende verwante gedrag kan veroorsaak - cue-verwante beloning soek en kompulsiwiteit wat verband hou met verbruik ten spyte van negatiewe gevolge - en karakteriseer die neurale plastisiteit wat met hierdie gedrag geassosieer word.

Results

Om DA-neuronaktiwiteit te beheer, het ons 'n Cre-induseerbare adeno-geassosieerde virus (AAV) ingespuit met 'n dubbel-floxed omgekeerde oop leesraam (DIO) wat bevat ChR2 saamgesmelt tot verbeterde geel fluoresserende proteïen (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) in die VTA van DAT-Cre muise. Daarbenewens is 'n optiese vesel geplaas om die VTA (ChR2, Sien Eksperimentele Prosedures). Spesifisiteit van die ChR2 uitdrukking is bevestig deur die ko-lokalisering van eYFP met Tyrosien Hydroxylase (TH), 'n ensiem wat benodig word vir DA-sintese (Figuur 1A). 

Eerstens, om die laserstimulasieprotokol vas te stel, is muise in 'n operante boks geplaas waar hulle 'n aktiewe hefboom kon druk, wat 'n aantal laserstimulasies veroorsaak het wat gevarieerd was (1, 2, 8, 32, 60 of 120 sarsies) elke twee sessies. Om 'n fasiese vuurpatroon na te boots (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009) wat tipies deur natuurlike beloning veroorsaak word (Schultz, 1998), het ons burststimulasie gebruik. Een sarsie het bestaan ​​uit vyf laserpulse van 4 ms, by 20 Hz, en is twee keer per sekonde herhaal. Ons het gevind dat muise hul hefboom-drukgedrag aangepas het as 'n funksie van sarsies per laserstimulasie, en sodoende die totale aantal sarsies wat ontvang is, beheer (Figuur 1B). Hierdie gedrag het herinner aan selftoediening van verslawende middels, wanneer die dosis per infusie gevarieer is (Piazza et al., 2000). Vir die daaropvolgende eksperimente het ons gekies om 30 sarsies per hefboompers toe te dien, wat 'n halwe maksimum aantal sarsies (Figuur 1B). Om die vertraging in DA-toename na te boots wat tipies waargeneem word wanneer middels binneaars toegedien word (Aragona et al., 2008), het ons die laserstimulasie met 5 s vertraag en 'n flitsende aanduidingslig vir 10 s bygevoeg (Figuur 1C).

Gedurende 12 opeenvolgende dae is muise toegelaat om 'n maksimum van 80 keer in 2 uur self te stimuleer. Muise het vinnig die tempo van laserstimulasie verhoog en 80 laserstimulasies (LS) bereik voor die einde van die eerste uur van 'n sessie (Syfers 1D en 1E). Die onderskeid tussen die aktiewe en onaktiewe hefboom is vinnig verkry en die aantal aktiewe hefboomperse het dienooreenkomstig toegeneem met toenemende vaste verhouding (FR1, 2, 3) skedules (Syfers 1F en 1G). In kontrole-eksperimente met DAT-Cre− muise of muise wat ChR2 uitgedruk het in γ-aminobottersuur (GABA) neurone (GAD-Cre+ muise, om die inhiberende neurone van die VTA te teiken), was die tempo van selfstimulasie laag en het voortdurend afgeneem oor sessies. Dit was ook van toepassing op twee Cre+ diere waar post hoc validering getoon het dat die VTA nie met ChR2-eYFP besmet is nie (nie getoon nie). Boonop is geen diskriminasie tussen die aktiewe en onaktiewe hefboom opgespoor nie (Syfers S1A en S1B).

Ons het opgemerk dat DAT-Cre + muise meer gereeld op die aktiewe hefboom gedruk het as wat nodig is vir die laserstimulasie. Trouens, sulke "futiele" aktiewe hefboomperse het meer as 30% van alle aktiewe hefboomperse uitgemaak (Figuur S2A) en het plaasgevind—namate sessies gevorder het—meestal tussen cue en laserstimulasie aanvang (Syfers S2B en S2C). Hierdie enkelvoudige gedrag het tydens verkryging ontwikkel en kan impulsiewe reaksies weerspieël.

Saamgevat, versterk barsingsaktiwiteit in VTA DA-neurone sterk hefboomreaksie.

Okklusie van VTA DA Neuron Self-stimulasie deur kokaïen

Om te toets of VTA DA neuron selfstimulasie skarnier op dieselfde breinkringe wat deur verslawende middels geteiken word om gedrag te versterk, het ons kokaïen intraperitoneaal (ip) ingespuit onmiddellik voor selfstimulasiesessies (gratis toegang tot laser vir 45 minute, Figuur 2A). By die basislyn het goed opgeleide diere ongeveer 400 keer gedruk om 85 LS in 45 min onder die FR3-skedule te verkry. Na kokaïeninspuiting het die werkverrigting op 'n dosisafhanklike wyse aansienlik afgeneem tot ongeveer 30 LS vir 100 hefboomdrukke met die hoogste dosis (Figuur 2B). Hierdie okklusie was die meeste uitgesproke gedurende die eerste 30 minute van die sessie, wat die farmakokinetika van die geneesmiddel weerspieël (Figuur 2C). Hierdie eksperiment dui aan dat versterking deur optogenetiese selfstimulasie en versterking deur kokaïen onderliggende neurale stroombane deel.

Om optogenetiese selfstimulasie verder met verslawende middels te vergelyk, het ons volgende gevra of muise sou terugval tot selfstimulasie van VTA DA-neurone na 'n paar weke van onttrekking. Aangesien leidraad-geassosieerde dwelmsoektog 'n gevestigde model van terugval is (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013), het ons muise terug in die operante kamer geplaas 30 dae na die laaste self- stimulasiesessie, waar aktiewe hefboomdruk nou die leidraadlig geaktiveer het sonder laser stimulasie (Figuur 3A). Robuuste leidraad-geassosieerde soekgedrag, gedemonstreer deur 'n hoë koers van aktiewe hefboomperse, was slegs sigbaar in muise met uitdrukking van eYFP-ChR2 in VTA DA neurone (DAT-Cre+ maar nie DAT-Cre− muise nie, Figuur 3B).

Vorige studies het die oorsaaklike verband getoon tussen cue-geassosieerde terugval en sinaptiese plastisiteit wat deur kokaïen opgewek word in 'n subtipe NAc-neurone wat die DA D1R uitdruk (Pascoli, Terrier et al., 2014). Daarom, om hierdie sinaptiese plastisiteit te evalueer, het ons DAT-Cre muise gegenereer waarmee gekruis is Drd1a-tdTamatie muise om die mediumgrootte stekelrige neurone (MSN'e) subtipe in die NAc te identifiseer. In plaas van die soektoets, is snye van die NAc voorberei waar D1R-MSN'e rooi was, in kontras met groen vesels van VTA DA neurone wat met flox-ChR2-eYFP besmet is (Figuur 3C). Heelsel-pleister-klem-opnames ex vivo het 'n regstellende stroomspanningsverwantskap vir AMPAR-opgewekte postsinaptiese strome (AMPAR-EPSC's) en 'n verhoogde AMPAR/NMDAR-verhouding (Syfers 3D en 3E), in die D1R-MSN'e, ​​maar nie in die D2R-MSN'e nie. Soortgelyke bevindinge wat voorheen verkry is na onttrekking van kokaïen-selfadministrasie, is getoon om die gekombineerde invoeging van GluA2-ontbrekende en GluA2-bevattende AMPAR's aan te dui, by afsonderlike insette op D1R-MSN's (Pascoli, Terrier et al., 2014).

Selfstimulasie ten spyte van Straf

Middelgebruik ten spyte van negatiewe gevolge is nog 'n belangrike kenmerk van verslawing (sien DSM5-definisie, American Psychiatric Association, 2013). Rotmodelle is gevestig (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013) waar 'n elektriese skok wat in die kokaïen-selfadministrasieskedule ingestel is kokaïen onderdruk verbruik by sommige diere. Na 12 dae van aanvanklike blootstelling (verkryging), is muise toegelaat om drie bykomende sessies by FR3 te hê, maar met 'n verminderde sessie-afsnypunt (60 min of 40 belonings maksimum). Hierdie drie sessies het gedien as 'n basislyn vir die daaropvolgende vier sessies, waar elke derde laserstimulasie gepaard is met 'n voetskok (500 ms; 0.2 mA) voorspel deur 'n nuwe leidraad (Figuur 4A). Die intensiteit en duur van die voetskok is aangepas om hefboomdruk heeltemal te onderdruk vir sukrosebeloning (sien ook data hieronder). Die strafskedule het gelei tot twee teenoorgestelde gedragsreaksies (Figuur 4B). Sommige muise het vinnig opgehou reageer toe die straf ingestel is (genoem "sensitief"), terwyl ander aanhou reageer het om die maksimum aantal laserstimulasies te verkry en as "weerstandig" teen straf beskou kan word. Die twee trosse diere het ten volle na vore gekom aan die einde van die vier strafsessies (Figuur 4C). "Weerstandige muise" het die aantal laserstimulasies behou (minder as 20% vermindering) terwyl "sensitiewe muise" selfstimulasie met meer as 80% verminder het. Met hierdie kriteria kon slegs een dier (grys kolletjies) nie toegeken word nie. Hierdie waarneming demonstreer dat gedwonge uitbarstingsaktiwiteit wat veroorsaak word deur selfstimulasie van VTA DA-neurone voldoende is om volharding van verbruik te veroorsaak ten spyte van negatiewe gevolge in 'n fraksie van muise. As 'n kontrole, in 'n onafhanklike groep muise wat weerstand of sensitiwiteit gevestig het vir die straf wat met selfstimulasie geassosieer word, is nosisepsie geëvalueer met behulp van die stertswaai-toets. Geen verskil in die latensie om die stert wat in warm water gedompel is te onttrek tussen sensitief en weerstandbiedend is opgespoor nie (Figuur S3).

Ons het vervolgens, post hoc, gevra of enige spesifieke kenmerk tydens die verkrygingsfase van selfstimulasie die weerstand teen straf kon voorspel het. Sensitiewe en weerstandbiedende muise het 'n identiese aantal aktiewe en onaktiewe hefboomdrukke tydens basislynsessies gemaak, en alle muise het die maksimum van 80 LS (Syfers S4A en S4B), in 'n soortgelyke tyd (Syfers S4A en S4C). Terwyl die fraksie van futiele aktiewe hefboompers weer nie anders was in die twee sub-populasies nie (Syfers 4D en S4D), het die aantal futiele hefboomdrukke voor die aanvang van die laserstimulasie aansienlik hoër geword in weerstandige muise teen die einde van die verkrygingsessies (Syfers 4E en S4E). Aangesien hierdie gedrag tydens verkryging ontwikkel het, kan dit saam met aangebore impulsiwiteit (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014) bydra om die weerstand teen straf te vestig. Daarbenewens is 'n progressiewe verhouding proef op dag 11 uitgevoer om die motivering vir die optogenetiese stimulasie te kwantifiseer (Richardson en Roberts, 1996). Weerstandige muise het 'n breekpunt vertoon wat nie statisties verskil van sensitiewe muise nie (Figuur S4F).

Weerstand teen straf vir kokaïen, maar nie vir sukrose nie

Om te toets of die paradigma van verbruik ten spyte van skadelike gevolge saam met impulshefboomdruk ook kompulsiewe inname van 'n verslawende dwelm kan voorspel, het 'n nuwe groep muise 12 dae van kokaïen-selfadministrasie ondergaan. Eksperimentele parameters vir die verkryging van kokaïen self-administrasie is gestel op 'n maksimum van 80 infusies van kokaïen binne 4 uur tydens verkryging en op 40 infusies binne 2 uur tydens die drie basislyn sessies wat die vier straf sessies voorafgegaan het (Syfers 5A en S5A). Weereens het twee groepe na vore gekom nadat hulle kokaïenbeloning met elektriese skokke gekoppel het. Inderdaad, 5 uit 22 muise is geklassifiseer as weerstandbiedend (minder as 20% afname vanaf basislyn), terwyl 17 as sensitief gekwalifiseer het (meer as 80% afname) en een dier het tussenin geval (13 infusies op dag 19) (Figuur 5B). Ons het toe gesoek na gedragsvoorspellers van weerstand teen straf. Tussen die twee groepe was die aantal infusies, die tempo van infusie en die aantal aktiewe of onaktiewe hefboomperse nie verskil nie (Syfers S5B–S5D), en die breekpunte was soortgelyk (Figuur S5E). Wat verskil het, was die evolusie van die verspreiding in tyd van die futiele druk op die aktiewe hefboom. In die eerste vier sessies het futiele hefboomperse gereeld gedurende die tyd-uitperiodes in beide weerstandige en sensitiewe muise afgeneem, terwyl slegs sensitiewe muise aan die einde van die verkryging hierdie gedrag gehandhaaf het (Syfers 5C en 5D en S5F). Daarenteen was weerstandige muise geneig om hul totale aantal futiele hefboomperse te verhoog (Syfers 5C en S5D), veral in die laaste kwartaal van die uittelperiode (Figuur 5D). Alhoewel dit kwalitatief soortgelyk is aan die waarneming wat voorheen gemaak is met die optogenetiese stimulasie van DA-neurone (sien hierbo), is die groepering van die nuttelose perse gedurende die vroeë tyd-uit-periode nie met kokaïen gesien nie, heel waarskynlik as gevolg van die stadiger kinetika waarmee die dwelmmiddel verhoogde DA-vlakke. Nietemin kan soortgelyke gevolgtrekkings gemaak word op grond van hierdie unieke evolusie van futiele hefboompersverspreiding gedurende die kort tydperk wat "die interne opsporing van die DA-oplewing" voorafgaan. Ons waarnemings dui dus daarop dat die verspreiding van die futiele aktiewe hefboomperse dwelmgebruik voorspel ten spyte van negatiewe gevolge.

Uiteindelik het ons die eksperiment herhaal met ad libitum-gevoede muise wat kan druk vir 'n sukrose-beloning. Sodra straf ingestel is, het alle muise opgehou om die sukrose self toe te dien (Figuur 5E), wat aantoon dat hierdie skedule die inname van 'n nie-noodsaaklike natuurlike beloning onderdruk het, maar die opsporing van kompulsiewe inname van 'n verslawende dwelm of sterk DA-neuronstimulasie moontlik gemaak het.

Saamgevat demonstreer hierdie resultate dat VTA DA-selfstimulasie voldoende is om kompulsiwiteit te veroorsaak, soos getoon deur die weerstand teen straf in 'n subset van muise (68%). Net so, ná kokaïen SA, het sommige muise weerstand teen straf geword (23%), wat nooit die geval was ná sukrose SA nie (Figuur 5F).

Om die breinarea vas te stel wat die besluit kan beheer om in selfadministrasie te volhard ten spyte van negatiewe gevolge, het ons eers generiese "neuronale aktiwiteit" gemonitor deur die aantal neurone te tel waarin die strafsessie die uitdrukking van die onmiddellike vroeë geen cFos in 15 veroorsaak het. verskillende streke. Muise is 90 min na die einde van die laaste strafsessie intrakardiaal met PFA geperfuseer. Die kontrolegroepe het naïewe diere ingesluit, sowel as muise wat aan sensitiewe of weerstandige muise gejuk is om die moontlike verwarrende effek van die aantal skokke wat ontvang is, te beheer.

Terwyl die aantal cFos-positiewe neurone in die meeste van die gekose streke die hoogste was in skywe van weerstandbiedende muise in vergelyking met naïewe muisskywe, het twee tipes reaksies na vore gekom, waarvan die prelimbiese korteks (PL) en die laterale OFC voorbeelde is. In die PL het ons 'n soortgelyke toename van cFos-positiewe selle in weerstandige muise en hul gejukte kontroles gevind, terwyl in die OFC hierdie toename slegs sigbaar was in die weerstandige en nie die ooreenstemmende gejukte muise nie (Syfers 6A en 6B). Om hierdie verskil te kwantifiseer, is alle data eers genormaliseer na uitdrukkingsvlakke in naïewe diere. Dan is die verhouding bereken tussen die weerstandige oor sensitiewe gedeel deur die juk tot weerstand oor juk tot sensitief (Verhouding_CFO's = (R/S) / (JR/YS), Figuur 6B). Hierdie prosedure het die cingulate korteks, die OFC en VTA geïdentifiseer as die streke wat in weerstandbiedende maar nie in sensitiewe muise geaktiveer word nie en waar daar min verskil was in beide groepe jukkontroles (soortgelyke lae cFos-positiewe neurone in juk, in werklikheid) . Om die VTA te vind is nie verbasend nie, aangesien dit die streek van lasergestimuleerde neurone is. Dit is in ooreenstemming met 'n vorige verslag wat toon dat ChR2-stimulasie cFos-aktivering veroorsaak (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). 'n Lae verhouding_CFO's is gevind in streke waar die aktivering soortgelyk in sensitief en weerstandbiedend was (soos CeA en PAG). Die verhouding_CFO's was ook laag wanneer die aktivering gepaard gegaan het met 'n groot verskil in die jukkontroles (soos die PL, Figuur 6C vir opgesomde verhouding_CFO's data). 'n Soortgelyke cFos-uitdrukking in weerstandige en juk-weerstandige muise is dus heel waarskynlik gedryf deur die aantal voetskokke en het min te doen gehad met die weerstand teen straf. Saamgevat, die hoë verhouding_CFO's in die OFC stel voor dat neurale aktiwiteit in hierdie streek geassosieer word met weerstand teen straf en kan dus die oorgang na verslawing bevoordeel.

Om die substraat van die verhoogde neuronale aktiwiteit in die OFC te identifiseer in die muise wat straf weerstaan, het ons snye van die PL en L-OFC 24 uur na die laaste strafsessie voorberei om te toets vir intrinsieke prikkelbaarheid. Die twee streke is gekies as gevolg van hul baie duidelike patroon van c-Fos uitdrukking in die vorige eksperimente. Die neuronale prikkelbaarheid is gekwantifiseer deur die aantal aksiepotensiale (AP's) te tel wat ontlok word deur die inspuiting van toenemende hoeveelhede stroom (van 0 tot 600 pA) in heelselopnames. Hierdie opnames het 'n volgehoue ​​hipo-opwekking in piramidale neurone van die PL van weerstandige muise (en hul jukbeheer) geopenbaar in vergelyking met sensitiewe of naïewe muise (Figuur 7A). Die rustende membraanpotensiaal (RMP) van aangetekende neurone was nie verskillend tussen die eksperimentele groepe nie (Figuur 7B). Hierdie resultate dui sterk daarop dat die prikkelbaarheid van neurone in die PL direk korreleer met die aantal skokke wat ontvang is, en miskien nie met die besluit om straf te weerstaan ​​nie. Dit weerspieël heel waarskynlik 'n negatiewe terugvoeraanpassing wat veroorsaak word deur neuronale opwekking wat deur die voetskokke die vorige dag ontlok is. Daarenteen was neurone van L-OFC net meer prikkelbaar in weerstandige muise. Prikkelbaarheid van neurone van muise met juk was nie anders as prikkelbaarheid van neurone van naïewe muise nie, wat 'n effek van die voetskok self uitsluit (Syfers 7C en 7D). Hierdie verhoogde aktiwiteit van OFC-neurone lê waarskynlik onder die cFos-uitdrukking en kan die weerstand teen straf dryf.

Om te toets vir oorsaaklikheid tussen verhoogde OFC neuron prikkelbaarheid en weerstand teen straf, het ons die inhiberende DREADD (ontwerper reseptore uitsluitlik geaktiveer deur ontwerper dwelms: CamKIIα-hM4D) in piramidale neurone van die OFC van DAT-Cre + muise uitgedruk (Figuur 8A). In akute snye van die OFC het badtoediening van CNO (klozapien-N-oksied) 'n stadige uitwaartse stroom geïnduseer, heel waarskynlik bemiddel deur GIRK-kanale, wat omgekeer is deur barium (Ba)²⁺), 'n nie-spesifieke blokker van kaliumkanale (Figuur 8B). Die CNO het ook die toevoer/afvoerkromme na regs verskuif (Figuur 8C). Die DAT-Cre+ muise besmet met AAV1/CamKIIα-hM4D-mCherry in die OFC (Figuur 8D) verworwe DA neuron selfstimulasie paradigma gevolg deur twee opeenvolgende blokke met die strafskedule, die eerste in die teenwoordigheid van CNO en die tweede sonder CNO. Die twee blokke is met 6 dae sonder straf onderbreek (Figuur 8E). Aan die einde van die eerste strafblok, in die teenwoordigheid van CNO, was slegs 5 van 16 muise weerstandbiedend (Figuur 8F, linkerpaneel). Daarenteen, sonder OFC-inhibisie, is gedurende die tweede strafperiode 14 uit 16 as "weerstandig" geklassifiseer (Syfers 8F, regter paneel, en 8G). Met ander woorde die fraksie van weerstandbiedende muise was aansienlik laer in die teenwoordigheid van CNO in vergelyking met die eerste groep van 34 muise wat voorheen in dieselfde toestande getoets is (tussen-groep vergelyking, Figuur 8H) en het soortgelyk geword aan die eerste kohort sonder CNO (binne-groep-vergelyking). Laastens, vir die nege muise wat van sensitief na weerstandig verander het, het CNO nie die stertswaai-latensie verander tydens onderdompeling in warm water nie (Figuur 8I).

Saamgevat demonstreer hierdie eksperiment dat die aktiwiteit van piramidale neurone van die OFC die besluit dryf om selfstimulasie voort te sit ondanks negatiewe gevolge wat 'n sleutelkenmerk van die oorgang na verslawing by knaagdiere verteenwoordig.

Bespreking 

’n Onlangs voorgestelde verslawingsmodel onderskei drie stappe in die vordering van die siekte: sporadiese ontspanningsdwelmgebruik, gevolg deur verskerpte, volgehoue, geëskaleerde dwelmgebruik, en uiteindelik kompulsiewe gebruik geassosieer met verlies van beheer (Piazza en Deroche-Gamonet, 2013; maar sien George et al., 2014). Ons studie toon dat stimulasie van VTA DA neurone voldoende is om hierdie vordering met 'n relatief vinnige tydsverloop te dryf.

Deur 'n natuurlik voorkomende uitbarstingspatroon na te boots, word 'n doeltreffende vrystelling van DA in teikenstreke van die VTA, soos die NAc, opgeroep (Bass et al., 2010). DA-vlakke in die NAc regeer dus waarskynlik die selfstimulasie, net soos knaagdiere self die volgende infusie van kokaïen of heroïen toedien sodra die DA-konsentrasie onder die drempel daal (Wise et al., 1995). Dit word ook ondersteun deur ons waarneming dat kokaïen, ingespuit ip, selfstimulasie kan afsluit. Dus, DA-neuron-selfstimulasie stem baie ooreen met dwelm-self-administrasie, alhoewel die kinetika daarvan beslis vinniger is as enige farmakologiese stof, insluitend kokaïen, soos voorgestel deur die verskillende tempo van reaksies wat in die huidige studie waargeneem word.

Terwyl ons DA-neurone van die VTA selektief geteiken het, kan hul optogenetiese selfstimulasie groepe selle met verskillende fisiologiese funksies geaktiveer het. Daar is byvoorbeeld onlangs voorgestel dat sommige DA-neurone kodeer vir aversiewe stimuli (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Hierdie selle projekteer na mPFC, terwyl VTA DA-neurone wat na laterale NAc-dop uitsteek, positiewe versterking bemiddel (Lammel et al., 2012). Dit sal interessant wees om selfstimulasie en vordering met selektiewe teiken te assesseer (Gunaydin et al., 2014). Aangesien ons manipulasie alle VTA DA-neurone geaktiveer het, net soos kokaïen op alle DAT-uitdrukkingsneurone inwerk, is dit denkbaar dat sommige DA-neurone versterkingsleer sal dryf terwyl ander DA-neurone afkeerleer sal dryf. Die netto effek sal steeds 'n versterking van die gedrag wees; die "aversieneurone" kan egter bydra tot die induksie van 'n opponentproses (Koob, 2013, Wise en Koob, 2014).

Na gedwonge onthouding, het heruitleg aan die konteks die soeke na die selfstimulasie veroorsaak, 'n gevestigde knaagdiermodel van dwelm-terugval. Opmerklik is die onderliggende neurale plastisiteit nie onderskeibaar van die een wat waargeneem is na onttrekking van kokaïen self-administrasie (Pascoli, Terrier et al., 2014). Dit dra by tot 'n studie wat voorheen identiese sinaptiese plastisiteit in VTA DA-neurone gerapporteer het wat deur 'n enkele sessie van optiese stimulasie of 'n eerste inspuiting van 'n verslawende dwelm veroorsaak is (Brown et al., 2010). 'n Patroon van sinaptiese aanpassings is besig om na vore te kom wat c aanpasbare gedrag algemeen is vir alle verslawende dwelms.

'n Opvallende kenmerk van ons studie is die tweespalt in die reaksie op 'n aversiewe stimulus wat sterk genoeg is om die verbruik van nie-noodsaaklike natuurlike beloning by alle diere te ontwrig. In ons omgewing het weerstandbiedende muise nie 'n aansienlik hoër motivering vir die selflewering van beloning getoon nie, wat kontrasteer met 'n studie met kokaïen by rotte (Pelloux et al., 2007). Die gedragsvoorspeller vir weerstand teen straf in muise was egter futiele hefboomdruk gedurende die 5 s wat die aanvang van die DA-neuronstimulasie voorafgegaan het. Die onvermoë om te wag tot beloningslewering kan dus gesien word as 'n merker van impulsiwiteit (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton en Vezina, 2014). Ons was geïntrigeerd deur die waarneming dat impulsiewe inname eers na verskeie sessies van selfstimulasie ontwikkel het. Dit laat die moontlikheid ontstaan ​​dat weerstand teen straf (en by uitbreiding kwesbaarheid vir verslawing) dalk nie ten volle aangebore is nie, maar ontwikkel tydens die aanvanklike fases na verslawing. As dit die geval is, kan die tweespalt wat deur ons en ander waargeneem word (Deroche-Gamonet et al., 2004) dalk nie net deur genetiese faktore bepaal word nie. Dit sal ook verduidelik dat 'n soortgelyke fraksie van individue verslaaf raak aan geneties relatief homogene muisstamme en geneties sekerlik meer diverse menslike bevolkings.

As weerstand teen straf die individuele kwesbaarheid vir verslawing openbaar, wat na raming bo 20% by mense is, selfs met kokaïen (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), dan is die veel hoër verhouding wat hier gevind word. kan die krag van die direkte en selektiewe DA neuronstimulasie weerspieël. Met ander woorde, selektiewe DA neuronstimulasie kan baie meer verslawend wees as enige dwelm. Dit kan verklaar word deur die nie-selektiewe werking van farmakologiese stowwe. In die geval van kokaïen, byvoorbeeld, kan ander monoamiene as DA eintlik die induksie van verslawing vertraag. Inderdaad, serotonien kan DA-afhanklike aanpasbare gedrag teenstaan ​​soos om te reageer vir gekondisioneerde beloning, selfstimulasie en gekondisioneerde plekvoorkeur (Wang et al., 1995, Fletcher en Korth, 1999, Fletcher et al., 2002) deur die assosiasie te fasiliteer van leidrade vir aversiewe stimuli (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternatiewelik kan die verskil lê in die verskil van kinetika tussen optogenetiese selfstimulasie en farmakologiese induksie van ekstrasellulêre DA-verhoging. Sulke verslawende-kragvariasie kan ook tussen verskillende dwelmmiddels bestaan ​​(George et al., 2014).

Alhoewel ons nie formeel verskille in DA-vrystelling en/of relatiewe sein kan uitsluit om by te dra tot die vestiging van strafweerstand nie, is hierdie scenario onwaarskynlik omdat die histologiese validering van die infeksie van diere wat in die studie ingesluit is, getoon het. eYFP-ChR2 uitdrukking in die hele VTA. Boonop het die optogenetiese stimulasieprotokol wat ontwerp is om DA-vrystelling te versadig, gelei tot selfstimulasie wat uitgeloop het op unimodaal verspreide waardes vir die breekpunt, wat die aansporingsmotivering weerspieël.

Nog 'n verrassende resultaat is dat die aantal elektriese voetskokke gekorreleer is met die prikkelbaarheid van die neurone in die PL. Verminderde prikkelbaarheid van piramidale neurone en verhoogde AMPAR/NMDAR-verhouding in piramidale neurone van dieselfde selle is waargeneem in "verslaafde rotte", maar hierdie studies het nie beheer vir die effek van elektriese skokke per se nie (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). Die nie-dissosiasie kan dus verklaar word deur die dubbele rol van die mPFC in beide besluitprosesse en vreesintegrasie (Peters et al., 2009). Vir die omgekeerde korreleer verandering in prikkelbaarheid van piramidale neurone in die infralimbiese korteks met voetskokke (Santini et al., 2008). Hierdie bewyse sluit nie die moontlikheid uit dat mPFC 'n prominente rol speel vir die besluit van inname-najaging nie. Ons cFos-analise en waarnemings van intrinsieke prikkelbaarheid dui egter op die OFC en cingulate korteks. Verder het inhibisie van neuronale prikkelbaarheid in die OFC met DREADD weerstand teen straf voorkom. Hierdie oorsaaklike verband verteenwoordig 'n belangrike stap in die begrip van die sellulêre meganismes wat verantwoordelik is vir die oorgang na verslawing. Toekomstige studies sal nodig wees om te toets of dit ook van toepassing is op die hele reeks verslawende middels.

Ons bevindinge stem ooreen met waarnemings dat 'n wanfunksie van die OFC koste-voordeel besluitneming kan benadeel (Seo en Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) en kan kompulsiewe gedrag veroorsaak (Burguière et al., 2013) ). By mense is dwelmmisbruik gekoppel aan verswakte besluitneming en veranderde OFC-funksie (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Saamgevat kom die aktiwiteit van OFC-neurone na vore as 'n sleutelbepaler vir die oorgang na kompulsiewe dwelmgebruik (Everitt et al., 2007). Dit sluit nie 'n rol vir dwelm-ontlokte plastisiteit by opwindende afferente op MSN's uit wat hier en in ander studies waargeneem word nie (Kasanetz et al., 2010). Dit sal interessant wees om te evalueer of manipulasies wat daarop gemik is om die prikkelbaarheid van die OFC te beheer, motivering by verslaafdes beïnvloed.

Hier stel ons DA-neuron-selfstimulasie voor as 'n kragtige model om die stadiums wat tot verslawing lei, te bestudeer. Ons reproduseer kernkomponente van dwelmverslawing, soos terugval, sinaptiese plastisiteit en volharding van verbruik ten spyte van negatiewe gevolge. Alhoewel die model beslis nie geskik is om effekte spesifiek vir 'n gegewe geneesmiddel te bestudeer nie (bv. vergelyk opioïed met psigostimulante), het dit verskeie voordele. Dit maak voorsiening vir 'n presiese tydelike beheer van die beloningslewering, dit aktiveer baie spesifiek slegs die VTA DA-neurone, en laaste maar nie die minste nie, bied dit die moontlikheid om muise vir 'n baie langer tyd te bestudeer as met dwelm self-administrasie. Deur te fokus op die bepalende gemeenskaplikheid van verslawende middels, is die hoop om die neurale meganismes onderliggend aan ook nie-stof-afhanklike vorme van verslawing te ontrafel (Alavi et al., 2012, Robbins en Clark, 2015) en sodoende by te dra tot 'n algemene teorie van die siekte. Optogenetiese siektemodelle laat dus 'n beslissende stap toe vir 'n deeglike begrip van die neuronale disfunksie betrokke by laat stadiums van verslawing en sal nuwe, rasionele behandelings vir 'n siekte wat tans sonder genesing lei, lei.

VP, JT en AH het die gedragseksperimente uitgevoer terwyl VP die elektrofisiologiese opnames gedoen het en die analise gekoördineer het. Die studie is ontwerp en geskryf deur alle skrywers.

Die werk is ondersteun deur toekennings van die Switserse Nasionale Stigting en die ERC gevorderde toekenning (MeSSI), Carigest SA, die Akademiese Vereniging van Genève, en die Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT is 'n MD-PhD-student wat deur die Switserse Konfederasie betaal word.

Dokument S1. Aanvullende eksperimentele prosedures en figure S1-S6

Tabel S1. Statistiese ontledings