يكشف Optogenetics عن دور الخلايا العصبية الشوكية المتراكمة المتوسطة التي تعبر عن مستقبلات الدوبامين D2 في التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين (2014)

انتقل إلى:

ملخص

وقد اقترحت التكيفات طويلة الأمد ، التي يسببها الدواء داخل النواة المتكئة (NAc) للمساهمة في السلوكيات الادمان المخدرات بوساطة. هنا استخدمنا نهج optogenetic لدراسة دور الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة NAc (MSNs) معربا عن مستقبلات الدوبامين D2 (D2Rs) في التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين. تم تسليم ناقلات الفيروسات الفيروسية المتزامنة المرتبطة بالجهية channelrhodopsin-2 (ChR2) في NAc من فئران D2R-CR المعدلة وراثيا. هذا سمح لنا بشكل انتقائي photostimulate D2R-MSNs في NAc. تشكّل D2R-MSNs دارات مثبّطة محلية ، وذلك لأن التحفيز الضوئي لـ D2R-MSN أثار التيارات ما بعد المشبكية المثبطة (IPSCs) في الـ MSNs المجاورة. Photostimulation من NAc D2R-MSN في الجسم الحي لا يؤثر على بدء أو تعبير التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين. ومع ذلك ، photostimulation خلال فترة سحب المخدرات المخففة التعبير عن التوعية السلوكية التي يسببها الكوكايين. تظهر هذه النتائج أن D2R-MSNs من NAc تلعب دورا رئيسيا في اللدونة الناجم عن الانسحاب وقد تسهم في الانتكاس بعد التوقف عن تعاطي المخدرات.

: الكلمات المفتاحية optogenetics ، الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة ، ومستقبلات الدوبامين D2 ، الكوكايين ، إدمان المخدرات

المُقدّمة

يرتبط إشارات الدوبامين (DA) بتوقعات المكافأة والسلوك الموجه نحو الهدف (Wise ، 2004. غوتو و جريس ، 2005. Berridge، 2007). واحدة من الأمراض المعروفة جيدا لاضطرابات الدوبامين هي إدمان المخدرات (روبنسون وبيريدج ، 1993, 2003). بعد التعرض المتكرر للمواد المسببة للإدمان ، تحدث تغيرات تكيفية على المستوى الجزيئي والخلوي في المسار Des mesolimbic ؛ يمكن أن تؤدي هذه إلى الاعتماد على المخدرات ، وهو اضطراب مزمن ومنتكس تتواصل فيه السلوكيات القهرية في البحث عن المخدرات وتعاطي المخدرات على الرغم من عواقبها السلبية الخطيرة (Thomas et al.، 2008. البيك، 2013). ومن ثم فإن توصيف التعديلات التي تحدث في نظام الدوبامينات الدوبامينية هو المفتاح لفهم إدمان المخدرات.

يتم التعبير عن مستقبلات دوبامين D1 (D1R) ومستقبلات D2 (D2R) بدرجة عالية في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة (MSN) من المخطط. وقد اقترح أن التكيفات طويلة الأمد التي يسببها الدواء في المخطط البطني ، والمعروفة باسم النواة المتكئة (NAc) ، تسهم في تطوير الإدمان وكذلك السلوكيات التي تسعى إلى المخدرات والانتكاس (لوبو ونستلير ، 2011. سميث وآخرون ، 2013). هيئات الخلايا الدوبامين من منطقة tegmental بطني في كثير من الأحيان معصوم NAc. أكثر من 95٪ من الخلايا داخل NAc هي MSNs ، التي تتلقى مدخلات استثنائية من أربعة مناطق رئيسية للدماغ: القشرة الفصامية الأمامية ، والجزء الفرعي البطني من قرن آمون ، و amygdala basolateral ، و thalamus (Sesack و Grace ، 2010. Lüscher و Malenka ، 2011). يمكن تقسيم MSNs داخل NAc إلى مجموعتين فرعيتين رئيسيتين: المسارات المباشرة لـ MSN التي تعبر عن D1Rs والمشروع مباشرة إلى مناطق DA في منتصف الاتجاه ، ومسارات MSN غير المباشرة التي تعبر عن D2Rs والمشروع إلى الشفافة البطنية (Kreitzer and Malenka ، 2008. سيساك وجريس ، 2010. Lüscher و Malenka ، 2011. سميث وآخرون ، 2013). نظرًا لأن MSN هي GABAergic ، فإن تنشيط الخلايا العصبية من MSN سيثبط أهدافها في اتجاه مجرى النهر وهي أيضًا GABAergic (Chevalier و Deniau ، 1990). لذلك ، فإن تنشيط D1R-MSNs سيثير الخلايا العصبية DA في الدماغ المتوسط ​​، والتي تساهم بعد ذلك في تنظيم السلوكيات المتعلقة بالثواب (Lüscher and Malenka ، 2011. بوكليش وآخرون ، 2013).

وقد كشفت الدراسات الحديثة التي استخدمت الفئران المعدلة وراثيا والتي تعبر عن إعادة تكوين الكريمة الكريمية بطريقة محددة النوع الخلوي ، عن أدوار مختلفة لكل من D1R-MSNs و D2R-MSNs في سلوك إدمان الكوكايين. وتمكن هذه الفئران من استهداف جيني لسموم معينة ، أو مسابير علم البصريات ، أو DREADD (مستقبلات المصمم التي تنشط بشكل حصري بواسطة دواء مصمم) للتعامل مع D1R-MSN أو D2R-MSN بشكل انتقائي. وقد أدى هذا النهج إلى بعض الإجماع حول دور MSN في السلوكيات الإدمانية: D1R-MSNs على ما يبدو تعزز السلوكيات الإدمانية ، في حين لم يتم اقتراح أي دور محدد (أو دور مثبط) في تطوير السلوكيات المسببة للمخدرات التي يسببها D2R-MSNs (هيكيدا وآخرون ، 2010. لوبو وآخرون ، 2010. فيرغسون وآخرون ، 2011. بوك وآخرون ، 2013). من الواضح أن التعرض للكوكايين يؤدي إلى تعديل التشابك وتعديله في التعبير الجيني لدى كل من السكان في MSN (Lobo et al.، 2010. لوبو ونستلير ، 2011. غورتر وآخرون ، 2013). على الرغم من أنه يبدو أن D1R-MSNs و D2R-MSNs يلعبان أدوارًا متعارضة في السلوكيات المسببة للكوكايين ، فإن الدور الدقيق لـ D2R-MSN غير واضح.

في السابق ، تبين أن فئران D2R بالضربة القاضية تظهر حساسية سلوكية طبيعية بوساطة الكوكايين وسلوكيات تسعى إلى الكوكايين ، مع انخفاض طفيف في الحساسية بسبب غياب D2R (Baik et al.، 1995. Chausmer وآخرون ، 2002. سيم وآخرون ، 2013). ومع ذلك ، فإن التعرض للإجهاد أثناء سحب المخدرات يمنع التعبير عن التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين وكذلك سلوكيات البحث عن الكوكايين والانتكاس في فئران D2R KO (Sim et al.، 2013). لا تؤثر الضربة المحددة لـ D2R في NAc على النشاط الحركي الأساسي ، ولا التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين ، ولكنها تمنح قدرة الإجهاد لتثبيط التعبير عن التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين (Sim et al.، 2013). هذه النتائج تشير بقوة إلى أن الحصار المفروض على D2R في NAc لا يمنع التوعية السلوكية بوساطة الكوكايين. بدلا من ذلك ، يبدو أن D2R في NAc تلعب دورا واضحا في تنظيم التعديلات المشبكية التي تسبب الإجهاد أثناء الانسحاب والتي تؤدي إلى زيادة في سلوكيات البحث عن الكوكايين والانتكاس (Sim et al.، 2013).

هنا استخدمنا optogenetics لمواصلة تقييم دور NAc D2R-MSNs في التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين. باستخدام شرائح الدماغ ، نجد أن التنشيط الضوئي لـ D2R-MSNs ينشط الدارات المثبطة المحلية داخل NAc التي تنطوي على MSN المجاورة. Photostimulation من NAc D2R-MSNs في الجسم الحي لا يؤثر على بدء أو التعبير عن التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين. ومع ذلك ، فإن التنشيط المتكرر لـ NAc D2R-MSNs أثناء فترة سحب الدواء يضعف السلوك الإدماني الناجم عن تعاطي الكوكايين. تظهر نتائجنا أن D2R-MSNs من NAc تلعب دورا رئيسيا في اللدونة الناجم عن الانسحاب وقد تسهم في الانتكاس بعد التوقف عن تعاطي المخدرات.

المواد والأساليب

الفئران

تم الحصول على الفئران المعدلة وراثيا D2-Cre BAC على خلفية C57Bl / 6 من MMRRC (مراكز الموارد الإقليمية الماوس Mutant ، B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). في التجارب السلوكية ، تم استخدام littermates تفتقر إلى DGNUMX-CR transgene كعناصر تحكم للفئران D2-Cre. تم الحفاظ على الفئران في منشأة حاجزة خالية من مسببات الأمراض في ظل ظروف ثابتة من درجة الحرارة والرطوبة ، وعلى ضوء 2-H ، الجدول الزمني الظلام 12-ح. تم تنفيذ رعاية الحيوان ومعالجته وفقا للمعايير المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في جامعة كوريا و KIST.

إعداد ناقل الفيروسات

تم تقديم pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE بسخاء من قبل Karl Deisseroth (جامعة ستانفورد). لإعداد AAV ، نمت خلايا HEK293T في وسائل الإعلام DMEM بالمضادات الحيوية و FBS. قبل يوم من إجراء عملية ترنسفكأيشن ، طُلبت أربع لوحات تتجاوز التقاء 90٪ من أطباق 10-cm إلى خمسة أطباق 15-cm وحضنت من أجل 18-22 h أو حتى 60 to 70٪ concluence. تم transfected خلايا HEK293T مع PAAV-DIO-ChR2-EYFP ، pAAV-DJ و pHelper باستخدام كاشف ترنسفكأيشن jetPEI (QBiogene). تم توطين كوكتيل DNA / DMEM / PEI واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لـ 20 min. بعد الحضانة ، تمت إضافة خليط ترنسفكأيشن إلى كل طبق 15 سم. تم حصاد الخلايا التي تم نقلها بواسطة 48 h بعد إجراء ترنسفكأيشن وحضنت بـ 0.5٪ deoxycholate من الصوديوم (Sigma؛ D6750) ووحدات 50 / ml من نوكلياز بنزوناز (Sigma؛ E1014) عند 37 ° C لـ 1 h. بعد إزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي في 3000 × g لـ 15 min ، تمت تصفية المادة الطافية من خلال مرشح PVNF 0.45 mm (Millipore). تم تنفيذ تنقية من الجسيمات AAV- DJ باستخدام أعمدة HiTrap الهيبارين التقارب (GE Healthcare). لتركيز AAV ، تم استخدام وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon ultra-15 مع قطع الوزن الجزيئي 100,000. تتركز فيروسات aliquoted والمجمدة للتخزين في −80 ° C. كانت التركيزات النهائية الفيروسية 3 ~ 6 × 1012 جزيئات الفيروس لكل مل لكل AAV.

حقن التجسيمي ووضع الألياف البصرية

تم تخدير الحيوانات عن طريق حقن IP من 1.6 ميكرولتر من Zoletil و 0.05 ميكرولتر من الزيلازين (Rompun ، Bayer) لكل جرام من وزن الجسم ووضعها في جهاز التجسيمي (David Kopf Instruments، Tujunga، CA) لحقن الفيروسات ، تم استخدام إبرة حقنة قياس 31 لبث ثنائي ميكرولتر من الفيروس في NAc بزاوية 2 درجة (AP +0 ؛ ML ± 1.7 ؛ DV 1.3) بمعدل 4.5 ميكرولتر / دقيقة. تُركت الإبرة في مكانها لمدة 0.1 دقائق بعد الحقن قبل سحبها ببطء. تتكون قنية الألياف الضوئية للزرع من حلقة من الزركونيا (قطرها 10 مم وطولها 1.25 مم) وطرف مسطح من الألياف الضوئية (قطرها 4.5 ميكرومتر). تم إجراء غرس قنية الألياف الضوئية في NAc لإضاءة D200-MSNs مباشرة بعد حقن الفيروسات. كانت إحداثيات غرس قنية الألياف الضوئية بزاوية 2 درجة (AP +0 ؛ ML ± 1.7 ؛ DV −1.35) لاستهداف NAc. للمساعدة في تثبيت الألياف الضوئية ، تم تثبيت اثنين من البراغي في الجمجمة في الجزء الخلفي من موقع زرع قنية الألياف الضوئية. لإصلاح قنية الألياف الضوئية على الجمجمة ، تم تطبيق C & B Superbond (Sun Medical) على سطح الجمجمة حول قاعدة القنية. بمجرد أن تصلب C & B Superbond ، تم إطلاق القنية من الحامل وطبق الأسمنت السني (Poly-F ، Dentsply) حول القنية والمسامير. لإغلاق الشق حول موقع إدخال القنية ، تم استخدام لاصق الأنسجة Vetbond (4.2 M ، 3). بعد الزرع ، أعطيت الفئران حقنة تحت الجلد من المضادات الحيوية (إنروفلوكساسين ، 7003449 مجم / كجم ، ف 5 ساعة) وتسكين (كاربروفين ، 12 مجم / كجم ، ف 5 ساعة) لمدة 24 أيام متتالية.

في الجسم الحي ضوئي

تم توصيل سلك التصحيح 200 tom بالجزء الخارجي من الألياف البصرية المزروعة بشكل مزمن باستخدام كم. تم ربط الألياف الضوئية من خلال محول FC / PC إلى ديود ليزر أزرق (473 nm و MBL-III 473-150 mW) ، وتم توليد نبضات ضوئية من خلال محفز (BNC 575). من أجل التحفيز الضوئي لعصبونات ChR2-expressing ، كان نموذج التنبيه هو تردد 20 Hz ومدة نبض 5 و 2-5 mW من الطاقة الضوئية. تم قياس الطاقة الضوئية المنبعثة من سلك التصحيح باستخدام عداد الطاقة (PM100D) مع مستشعر الإضاءة S121C.

التحليل السلوكي

أجريت التجارب السلوكية مع فئران D2-Cre الذكور عند عمر 11 – 13 ، باستثناء الفئران التي خضعت للتحليل الكهربية التي كانت في عمر 5-6. تم حقن فئران D2-Cre والفئران الضابطة بالفيروسات ذات السن المتطابقة بالفيروس وتم إسكانها بشكل فردي وسمحت بالتأقلم مع القفص حتى الاختبار السلوكي. لكل تلاعب ، تم نقل الفئران إلى الغرفة التجريبية 60 دقيقة قبل بداية التجربة للسماح بالتعاطي والحد من التوتر (سطوع الغرفة التجريبية كان 70 لوكس). تم تنظيف كل جهاز تجريبي باستخدام إيثانول 70٪ بين التجارب لإزالة أي إشارات محتملة للرائحة.

توعية الكوكايين

لبدء تحسيس الكوكايين ، تم تعاطي الفئران لحقن المياه المالحة (IP) للأيام المتتالية 3 ثم حقنها بالمحلول الملحي أو الكوكايين (15 mg kg-1، ip) للأيام المتتالية 5. تم حقن الفئران داخل الصفاق (ip) مع إما هيدروكلوريد الكوكايين (جونسون ماتني ، ادنبره ، المملكة المتحدة) الذائبة في المياه المالحة (0.9 ٪ كلوريد الصوديوم) أو المالحة بإبرة 30 G. مباشرة بعد كل حقن ، تم اختبار الفئران للنشاط الحركي الأفقي في غرفة المجال المفتوح ل 30 دقيقة. لقياس تأثير photostimulation على بدء والتعبير عن التحسيس (الشكل (الشكلâ € <â € <â € <5)، 5) ، أعطيت الفئران الإضاءة الزرقاء الخفيفة ثنائية من خلال حبال التصحيح الألياف الضوئية المزدوجة على NAc لمدة أربع فترات 3 دقيقة خلال جلسات 30 دقيقة في أقفاص المنزل. تمت إزالة الحبال التصحيح من قنية الألياف البصرية الموجودة على جمجمة الماوس وأعطيت الفئران على الأقل راحة 10 دقيقة. ثم تم حقن الفئران إما مع الكوكايين أو المالحة (كوك 1d-coc 5d). بعد البدء في التوعية ، تم سحب الكوكايين لمدة أيام 14 دون أي حقن من المياه المالحة. خلال فترة الانسحاب هذه ، لم يتم تطبيق أي تحفيز ضوئي. ثم تم تحديد التعبير عن الحساسية السلوكية للكوكايين عن طريق حقن جرعة التحدي من المخدرات (10 mg kg-1، IP) بعد photostimulation من NAc كما هو موضح في الشكل Figure5A.5A. لقياس تأثير التحفيز الضوئي خلال فترة انسحاب الكوكايين (الشكل (Figure6)، 6) ، تعرضت الفئران لنفس البروتوكول للتوعية كما هو موضح أعلاه (الشكل Figure5) 5) ما عدا أعطيت photostimulation. بعد البدء في توعية الكوكايين ، تم تطبيق عملية التحفيز الضوئي على NAc يوميًا لـ 1 h خلال فترة السحب الإجمالية لأيام 14. بعد أيام 14 من الانسحاب ، تم حقن جميع مجموعات الفئران بجرعة التحدي من الكوكايين ، (10 mg kg-1).

الشكل 1 

انتقائية photostimulation من الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في المتكئة نواة. (ا) تعبير انتقائي من ChR2 في الخلايا العصبية NX D2R عن طريق تسليم ناقلات الفيروسات الفيروسية AAV-DIO-ChR2-EYFP. أشرطة النطاق: رقم الخلفية ، 1 ملم: insert ، 200 µm. (B) صور متحد البؤر ...
الشكل 2 

Photostimulation من D2RCre-MSNs محركات الدوائر المثبطة المحلية. (ا) صورة متحد البؤر لشريحة NAc حية ، تظهر عصبونًا مليئًا بصبغة لا يعبر عن ChR2 وخلية مجاورة (رأس سهم) تعبر عن ChR2 ويمكن تحريكها ضوئيًا. (B) التوجيهية ...
الشكل 3 

خصائص خلايا NAc. (ا) اثنين من الفوتون مضان صورة من الخلايا العصبية مليئة اليكسا 594. (A1) يظهر الخلايا العصبية من مجموعة ChR2 + / AP ، في حين (A3) يظهر عصبونًا من مجموعة ChR2− / IPSC. (A2) و (A4) هي صور عالية التكبير من ...
الشكل 4 

تأثيرات التنشيط الوصفي داخل الجسم لـ D2-MSNs في NAc على النشاط الحركي الأساسي. (A) عرض Sagittal من فئران D2 كريه حقن في NAc مع AAV-DIO-ChR2-EYFP تليها زرع ثنائية من قنية الألياف البصرية. 473 نانومتر الضوء الأزرق التحفيز ...
الشكل 5 

آثار تفعيل D2-MSN أثناء التحسيس إلى الكوكايين. (ا) مخطط تجريبي لتحفيز الصور من D2-MSNs أثناء البدء والتعبير عن التوعية بالكوكايين. تم تسليم إضاءة زرقاء خفيفة (2 ~ 5 mW و 5 ms و 20 Hz) لأربعة ...
الشكل 6 

آثار تفعيل D2-MSN أثناء الانسحاب إلى التعرض المتكرر للكوكايين. (ا) مخطط تجريبي لتحفيز الصور من D2-MSNs أثناء الانسحاب إلى الكوكايين. تم تسليم إضاءة زرقاء خفيفة (2 ~ 5 mW و 5 ms و 20 Hz) لمدة ثمانية فترات 3-min ...

المناعي وميكروفون الليزر مبائر

للتخاد المناعي ، تم تخدير الفئران مع Zoletil (Virbac ، 1.6 ميكرولتر / ز ، intraperitoneally) و 0.05 µl / g Rompun (باير) و perfused مع التعقيم مرشح 0.1 M PBS تليها التثبيت باستخدام 4 ٪ بارافورمالدهيد / برنامج تلفزيوني الحل (سيغما). ثم تمت إزالة الدماغ وبعد ذلك ثابتة ل 4 ح مع مثبت الجليد الباردة على النحو الوارد أعلاه. ثم تم تجفيف العقول في 30٪ سكروز / 0.1 M PBS لأيام 2. تم تجميد العقول ثم تم إعداد 40-µm - أقسام سميكة التاجي على التوالي على ناظم البرد (لايكا CM 1900 ، ألمانيا). تم حظر الأقسام (40 µm) لـ 1 h في 0.1 M PBS التي تحتوي على 5٪ من مصل الماعز العادي و 0.2٪ Triton X-100 وحضنت مع الأرانب polyclonal anti-D2R (1: 500، Millipore، AB5084P) عند 4 ° C خلال الليل. بعد الغسل باستخدام PBS يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 ، تم تحضين العينات في RT لـ 1 h مع Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG (1: 500؛ Molecular Probes، Eugene، OR، USA) and 0.2 µl / ml 4، 6-diamidino-2-phenyl-indole HCl (DAPI؛ Sigma، St. Louis، MO، USA) in PBS contains 1٪ normal goat serum and 0.2٪ Triton X-100. كتحكم سلبي ، تم تحضين العينات بـ DAPI والجسم المضاد الثانوي فقط. تم فحص الأقسام على نظام C1 Plan Apo × 40 / 1.4 المسح بالليزر المتحد البؤري (LSM 700 ، زايس ، برلين ، ألمانيا).

الفيزيولوجيا الكهربية والتحفيز الضوئي في النواة المتكئة الشرائح

تم استخدام الفئران للتجارب بعد 4 أسابيع من حقن الفيروس ، لتحقيق التعبير الأمثل عن ChR2-EYFP. ثم تم تخدير الفئران وقطع رأسها لإعداد شرائح الدماغ الحادة. تمت إزالة الدماغ بسرعة ووضعها على الفور في محلول قطع الجليد الباردة التي تحتوي (في mM) 250 Sucrose ، 26 NaHCO3، 10 D-Glucose، 3 Myo-inositol، 2.5 KCl، 2 Na-pyruvate، 1.25 NaH2PO4، 0.5 حامض الأسكوربيك ، 1 Kynurenic حامض و 7 MgCl2 التي فُقشت بـ 95٪ O2/ 5٪ CO2 (الرقم الهيدروجيني = 7.4). تم تحضير شرائح الدماغ التاجية (250 thickm thick) المحتوية على NAc باستخدام vibratome (Leica VT 1200 S) وتم تحضينها بعد ذلك في السائل النخاعي المصطنع بالغاز (ACSF) المحتوي (في mM): 11 D-glucose، 125 NaCl، 25 NaHCO3، 1.25 نا2PO4و 2.5 KCl و 1.25 MgCl2 و 2.5 CaCl2 في 34 ° س لـ 1 h قبل التسجيل. ثم تم نقل شرائح إلى غرفة تسجيل الغمر فيها O2- حل ACSF المشبع تم امتصاصه بشكل مستمر. تم تصور الخلايا في NAc و VTA باستخدام مجهر 2-photon (Olympus FV1000 MPE ، طوكيو ، اليابان) مجهزة عدسة 25X للغطس بالماء وبصريات DIC الأشعة تحت الحمراء. تم الحصول على تسجيلات المشبك كاملة الخلية من خلايا NAc مع مكبر للصوت Multiclamp 700B و Digidata 1440A digitizer (Molecular Devices، LLC). تم أخذ عينات من البيانات باستخدام برنامج pCLAMP 10.2 وتم تحليلها باستخدام برنامج Clampfit 10.2 (Molecular Devices، LLC). تم ملء أقطاب التصحيح ذات المقاومة بين 3-5 M with مع محلول داخلي يحتوي على (بالسيكل): 130 K-gluconate و 2 NaCl و 2 MgCl2و 20 HEPES و 4 Na2ATP ، 0.4 Na3GTP و 0.5 EGTA و 10 Na2- فوسفوكرياتين ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 باستخدام 1 N KOH. تم تطبيق Bicuculline (10 ميكرومتر) على شريحة الدماغ لمنع مستقبلات GABA في مجموعة فرعية من التجارب.

تم تحفيز خلايا NAc التي تعبر عن ChR2-EYFP بواسطة مصدر ضوء LED (460 ± 27 nm و UHP-Mic-LED-460 و Prizmatix). تمت تصفية الضوء الأزرق من LED بشكل أكبر وتوهينه بواسطة مرشح الفلتر المزوّد بمرشح الإثارة (470 – 495 nm) ؛ ومضات ضوء (مدة X X X X، 10 xW / mm2تم تسليمها إلى شريحة الدماغ عبر عدسة 25X الموضوعية على ترددات 5 – 40 Hz. في مجموعة فرعية من التجارب ، تم قياس المتجهات الضوئية في خلايا تعبير ChR2 استجابة لمضات ضوء مدة 2 s.

التحليل الإحصائي

يتم تقديم البيانات كوسيلة and sem وقد تم تحليلها مع الطالب ثنائي الطرف tاختبار ، أو مع تحليل اتجاهين من التباين تليها Bonferroni اللاحق اختبار. ا P- تعتبر القيمة <0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

انتقائية photostimulation من الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في المتكئة نواة

ولتحديد دور NAc D2R-MSNs في السلوكيات المسببة للكوكايين ، استخدمنا نهج optogenetic لتحفيز الخلايا العصبية NAc D2R. للتحكم بشكل انتقائي في نشاط D2R-MSNs في NAc عن طريق الضوء ، تم تحقن الترميز الفيروسي AAV-DIO-ChR2-EYFP بشكل تجسيمي في NAc من فئران D2R-CR BG المعدلة وراثيا. بعد أسابيع من الحقن الفيروسي 4 ، لوحظ تعبير قوي من ChR2-EYFP في NAc (الشكل (Figure1A) .1A). تم تأكيد خصوصية تعبير ChR2 في D2R-MSNs بواسطة التحليل البؤري المناعي: التعبير عن YFP-tagged ChR2 تم تأليفه مع D2R في NAc (الشكل (Figure1B)، 1B) ، مما يدل على أن تم التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية D2R-expressing في NAC.

على الرغم من استخدام هذا النهج في دراسات أخرى (على سبيل المثال ، Lobo وآخرون ، 2010) ، ستختلف تفاصيل إجراءات حقن الفيروس من مختبر إلى آخر ، مما يجعل من المهم توثيق التحكم في optogenetic تحت ظروفنا التجريبية المحددة. قمنا بتقييم التعبير الوظيفي لـ ChR2 بجعل تسجيلات المشبك على شكل خلية كاملة من MSN في شرائح NAc. تم تحديد الـ MSNs بواسطة: (1) إمكانات غشاء مستقر (hypertigulated) مستقر نسبيا (RMP) ، عادة أكثر سلبية من −80 mV؛ (2) نمط منتظم من إطلاق AP للرد على النبضات الحالية المطبقة ؛ (3) زمن انتقال طويل لإطلاق نقطة الوصول الأولى خلال نبضة التيار ؛ (4) غياب "تبلد" الجهد الكهربي أثناء فرط الاستقطاب الذي يحدث بسبب تيار كاتيون مفعل مفرط بالتنشيط المفرط (Ih)؛ و (5) حجم صغير نسبيا من أجسامهم الخلوية (تشانغ وكيتاي ، 1985. أودونيل وغريس ، 1993. لو موين وبلوخ ، 1996. Taverna et al.، 2008). تم تطبيق الضوء الأزرق (470 nm) على مجال العرض بالكامل (0.78 ملم2) في حين أن الجهد الكهربي للضغط على الـ MSN عند إمكانية الإمساك بـ −69 mV. بعض MSNs أعربت ChR2 ، واضح كما مضان YFP في somata (الأسهم في أرقام 1C1، C3). عرضت هذه الخلايا العصبية ضوابط كبيرة ، مع مؤثرات ضوء أكثر إشراقا استقطاب أكبر photocurrents (الشكل (Figure1D) .1D). العلاقة بين السعة الضوئية الضوئية وشدة الضوء (الشكل (Figure1E) 1E) كان حساسية الضوء نصف القصوى من 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 وسعة الذروة القصوى لـ 1.16 ± 0.16 nA (يعني ± sem ، n = 4).

تحت ظروف المشابك الحالية ، قامت MSNs التي تعبر عن ChR2 بإطلاق APs بشكل موثوق به استجابة لقطارات نبضات الضوء (مدة 10 مللي ؛ الشكل Figure1F) .1F). تحت هذه الظروف ، شدة الضوء أكبر من 0.1 mW / mm2 كانت كافية لاستحضار APs (الشكل (Figure1G، 1G, n = 5). تم استحضار الـ APs بشكل موثوق في ترددات photostimulation حتى 20 Hz ، بينما في 40 Hz تم جمع الاستجابات التي يسببها الضوء لإحداث استقطاب مستدام أقل فعالية في استحضار APs (الأرقام 1F، G).

Photostimulation من D2R-MSNs محركات الدوائر المثبطة المحلية

وللتحقق من عواقب نشاط D2R-MSNs على الدوائر المحلية في NAc ، فإننا نحقق photostimulated MSN presynaptic معبرًا عن ChR2 أثناء قياس الاستجابات بعد المشبكية في ملفات MSN السالبة ChR2 (الشكل (Figure2A) .2A). العصبون هو مبين في الشكل Figure2A2A لا يعبر عن ChR2 ، كما هو مبين من عدم وجود مضان EYFP فضلا عن عدم وجود المتوازية القصيرة الكمون مثل تلك المبينة في الشكل Figure1D.1D. ومع ذلك ، عندما تم عقد MSNs بوستسينابتيك كإمكانات ل mVXXVXX ، فإن فترة الوميض 69 ms تومض تيارات خارجية بعد زمن انتقال من 10 ± 9.0 ms (الشكل (Figure2B، 2B, n = 15). لتحديد طبيعة هذه الاستجابات ، تفاوتت إمكانات الغشاء بعد المشبكي بين −99 mV إلى −39 mV ، بينما تم تطبيق فلاش خفيف (الشكل (Figure2C) .2C). تختلف الردود التي تحفزها الضوء مع إمكانات الغشاء (الشكل (Figure2D، 2D, n = 6) وعكست قطبيتها في −81 ± 3.4 mV. بالنظر إلى أن إمكانات توازن أيونات الكلوريد هي −80 mV في ظل ظروفنا الأيونية ، فإن التيارات الناتجة عن الضوء يمكن أن تكون نتيجة لتدفق الكلوريد بوساطة GABA بعد المشبكيA مستقبلات. لاختبار هذا الاحتمال ، GABAA تمت إضافة bicuculline (10 µM) لمضاد المستقبل إلى الحل الخارجي. هذا الدواء منعت تماما الردود التي يسببها الضوء (الشكل (Figure2B)، 2B) ، مما يؤكد أن الاستجابات المستحثة للضوء كانت تيارات ما بعد المشبكية المثبطة للاحتكاك (IPSCs).

استنادًا إلى ردودهم على التحفيز الضوئي ، يمكن تصنيف الـ MSNs التي سجلناها في واحدة من مجموعات 4: (1) التي تعبر عن كمية كافية من ChR2 لإطلاق الـ APs استجابة للتحلل الضوئي (ChR2 + / AP) ، والتي تم وصفها أعلاه ؛ (2) الخلايا التي تعبر عن كمية صغيرة من ChR2 ، والتي تفترض الاستقطاب الفرعي دون رد فعل استجابة للضوء (ChR2 + / No AP) ؛ (3) الخلايا الصامتة التي ليس لها تعبير عن ChR2 ولكنها استقبلت IPSCs التي يسببها الضوء من الـ Msenss المشبكية التي تعبر عن ChR2 (ChR2− / IPSC) ؛ و (4) الخلايا السلبية ChR2 التي لم تعرض IPSCs استجابة للتحفيز الضوئي لـ MSN الأخرى (ChR2− / No IPSC). يتم عرض النسبة النسبية للخلايا في كل من هذه الفئات في الشكل Figure2E2E (n = 53). وعموما ، أعرب ما يقرب من نصف الخلايا (45.3 ٪) ChR2 (مجموع المجموعات (1) و (2)). أي من MSNs التي سجلناها عرضت كل من الضوئية و IPSCs ردا على photostimulation ؛ يشير هذا إلى أن MSNs موجبة D2R لا تعصب أعضاء آخرين من هذه الخلية نفس السكان داخل NAc.

يشير هذا التصنيف للردود على الضوء إلى أن photostimulation من ChR2 + / لا خلايا AP (مجموعة 2) وخلايا ChR2− / No IPSC (مجموعة 4) لن تولد أي إشارات كهربائية يمكن أن تسهم في نشاط الدارة. وهكذا ، لتحديد تأثيرات التحفيز الضوئي على وظيفة الدائرة ، قمنا بتمييز خصائص ChR2 + / AP MSNs (مجموعة 1) ، والتي ستقوم بتوليد APs عند تحريك NAc ، وخلايا ChR2− / IPSC (مجموعة 3) ، والتي هي postynaptic إلى ChR2 + / APS MSN لأنها تتلقى IPSCs التي يسببها الضوء. تم تحديد كل من الخلايا ChR2 + / AP و ChR2− / IPSC في NAc على أنها الخلايا العصبية الشوكية (الشكل (Figure3A) .3A). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في الخصائص المورفولوجية أو الكهربية للخلايا العصبية في هاتين المجموعتين. على سبيل المثال ، كانت somata من الخلايا العصبية في هاتين المجموعتين متشابهة في الحجم (الشكل (Figure3B) .3B). بالإضافة إلى ذلك ، فإن RMPs الخاصة بهم (−83.0 ± 1.7 vs. −85.0 ± 1.8 mV؛ mean ± sem؛ n = 10 ، الشكل Figure3C) 3C) ومقاومات الإدخال (113 ± 15 مقابل 133 ± 13 MΩ ، n = 6 ، الشكل Figure3D) 3D) كما لم تكن مختلفة (p > 0.05 للطالب ثنائي الذيل tالاختبار) في حين أن أنماط إطلاق AP الخاصة بهم ردا على نبضات الحالية (الأرقام 3E، F) كانت أيضا مماثلة (p > 0.05 للطالب ثنائي الذيل t-اختبار، n = 6). باختصار ، ينشط التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs في NAc الدوائر المثبطة المحلية مع الخلايا العصبية بعد المشبكية التي تشبه إلى حد كبير D2R-MSNs ولكنها لا تعبر عن D2R.

تحفيز Optogenetic من NAc D2R-MSNs في التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين

بعد ذلك قمنا بفحص النتائج السلوكية لـ في الجسم الحي photostimulation من NAc D2R-MSNs. لأن التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs في المخطط الظهري يقلل من النشاط الحركي (Kravitz et al.، 2010) ، بدأنا من خلال تحديد تأثيرات تفعيل المتكثف D2R-MSN على النشاط الحركي الأساسي. لهذا الغرض ، تم حقن الفئران D2R-Cre بفيروس DIO-AAV-ChR2-EYFP ثنائيا في NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). ومن ثم تم تحريك D2R-MSNs مع الضوء الأزرق (473 nm ، ومدة نبض 5 ، 20 Hz) التي تم تسليمها إلى NAc عبر ليف ضوئي. تم تطبيق Photostimuli خلال أربع فترات مدة 3-min داخل جلسة دقيقة 50 عندما تم الاحتفاظ الفئران في غرفة تسجيل نشاط حركي (الشكل (Figure4A) .4A). في موازاة ذلك ، كما تم حقن فئران مكافحة non-Cre WT مع الفيروس وتلقى إضاءة زرقاء مماثلة. D2-Cre (+) عرضت الفئران NAc-ChR2 على مستوى مماثل أو مرتفع قليلاً من النشاط الحركي الأساسي بالمقارنة مع السيطرة D2R-Cre (-) NAc-ChR2 الفئران (أرقام 4B، C). تسبب تحفيز ضوئي لـ D2R-MSNs في D2-Cre (+) NAc-ChR2 في انخفاض كبير في النشاط الحركي الذي تعافى بعد توقف التحفيز الضوئي (الشكل (Figure4B) .4B). لم يلاحظ أي آثار من هذا القبيل في السيطرة D2R-Cre (-) NAc-ChR2 الفئران (أرقام 4B، C) ، مشيرا إلى أن آثار التحفيز الضوئي ناتجة عن تفعيل ChR2 ، بدلا من التأثيرات غير المحددة المحتملة مثل تسخين أنسجة المخ. لذلك ، أشارت بياناتنا إلى أن التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs في NAc أدى إلى انخفاض في النشاط الحركي.

أثبتت هذه النتائج قدرتنا على التحكم في نشاط D2R-MSNs داخل NAc في الجسم الحي. استخدمنا بعد ذلك هذه القدرة لفحص تأثير نشاط D2R-MSN على التحسس السلوكي للإدمان المتكرر للكوكايين. يشير التحسس السلوكي إلى العملية التي تسمح بالتعرض الأولي لمضادات نفسية ، مثل الكوكايين ، لتعزيز قدرة التعرض للعقار لاحقا لتحفيز النشاط الحركي. يمكن فصل هذه العملية إلى مراحل البدء والتعبير: يشرح البدء الأحداث العصبية المباشرة التي تحفز التوعية السلوكية (فاندرشورين وكاليفاز ، 2000. سيم وآخرون ، 2013) ، بينما يُعرف التعبير بأنه شكل طويل الأمد من اللدونة السلوكية التي تستمر بعد سحب الأدوية (فاندرشورين وكاليفاز ، 2000. سيم وآخرون ، 2013). لذلك قمنا بفحص التوعية السلوكية الناتجة عن الكوكايين أثناء حقن الكوكايين المتكرر داخل البايريتون ، أثناء استخدام optogenetics للتحكم في نشاط D2R-MSN في NAc خلال كل مرحلة من هذه المراحل.

بعد التعود على حقن المياه المالحة خلال أيام 3 ، تم حقن الفئران مع الكوكايين (15 ملغ / كغ) في أيام 5 متتالية وسجلت الردود الحركية ل 30 دقيقة بعد كل حقنة (الشكل (Figure5A) .5A). تم تسليم Photostimuli خلال جلسات 30 دقيقة قبل حقن الكوكايين ، تتخلل فترات دقيقة 3 للإضاءة مع فترات دقيقة 5 حيث تم إطفاء الضوء (الشكل (Figure5A) .5A). بالنظر إلى أن photostimulation من D2R-MSNs في NAc يقلل النشاط الحركي الأساسي (الشكل (Figure4)، 4) ، تم تسليم photostimuli على الفور قبل إدارة الكوكايين لتجنب احتمال التدخل مع الاستجابات السلوكية لحقن الكوكايين.

أظهر كلا الفئران D2-Cre (-) NAc-ChR2 والفئران D2-CR (+) NAc-ChR2 زيادة ملحوظة في النشاط الحركي استجابة لحقن الكوكايين المتكرر (الشكل (Figure5B)، 5B) ، مما يدل على بدء التوعية. لا يبدو Photostimulation من D2R-MSNs في NAc تؤثر على بدء التحسس السلوكي ، وذلك لأن التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين كان مماثلا في الفئران D2-CR (+) NAc-ChR2 والتحكم D2-Cre (-) NAc-ChR2 الفئران.

بعد تحريض التوعية السلوكية بتكرار مثل هذه الحقن من الكوكايين (15 mg / kg) لأيام 5 ، تم سحب الدواء لأيام 14 وتم فحص درجة التعبير عن التحسس من خلال تحدي الفئران بجرعة أقل من الكوكايين (10 mg /كلغ). التعبير عن التوعية هو شكل طويل الأمد من اللدونة السلوكية التي تستمر بعد سحب الأدوية (Steketee و Kalivas ، 2011. سيم وآخرون ، 2013). لدراسة دور D2R-MSNs في التعبير عن التوعية ، تم تحفيز NAc مباشرة قبل إعطاء الكوكايين (الشكل (Figure5A) 5A) وتم قياس التحسس كمقدار النشاط الحركي الناجم عن حقن الكوكايين.

في كلتا المجموعتين المضبوطة سابقا من الكوكايين - الفئران D2-Cre (-) NAc-ChR2 (D2-Cre (-) :: coc-coc) و D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) - حدث تعبير قاطع للتوعية (الشكل (Figure5C) .5C). كان المسار الزمني لتغيرات الحركة المحفزة للكوكايين متشابها أيضا بين المجموعتين (الشكل (Figure5C)، 5C) ، مع عدم وجود فرق كبير لوحظ بين مجموعتين. مجتمعة ، تشير هاتان التجربتان إلى أن تنشيط D2R-MSNs في NAc لا يؤثر على بدء أو التعبير عن التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين.

Photostimulation من NAc D2R-MSNs أثناء سحب المخدرات

الإجهاد المزمن أثناء سحب الأدوية بعد التعرض المتكرر للكوكايين يؤدي إلى توظيف انتقائي لآلية التكيف المعتمدة على D2R التي تتحكم في الزيادة المحرضة على الإجهاد في سلوكيات البحث عن الكوكايين والانتكاس بالترافق مع التغيرات في اللدونة المشبكية في NAc (Sim et al.، 2013). ويشير هذا إلى أن الآليات التي تعمل عن طريق سحب الأدوية تختلف عن تلك المشاركة في التوعية بتهريب المخدرات. ولذلك قمنا بعد ذلك بفحص ما إذا كان التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs في NAc أثناء انسحاب الكوكايين يؤثر على التعبير عن التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين.

بعد تحريض التوعية السلوكية عن طريق الحقن المتكرر للكوكايين على النحو الوارد أعلاه ، تم تقسيم D2-Cre (-) و D2-CR (+) إلى مجموعتين في فترة سحب 14: تم إخضاع مجموعة واحدة للتحفيز اليومي للضوء الأزرق. NAc لـ 1 h (3 min × 8 times) ، بينما لم تكن المجموعة الأخرى (الشكل (Figure6A) .6A). لم يؤثر التثبيط المتكرر لـ D2R-MSNs في NAc أثناء انسحاب الكوكايين على التعبير عن الحساسية في D2-Cre (-) :: coc-coc mice (الشكل (Figure6B) .6B). في المقابل ، في D2-Cre (+) :: coc-coc mice ، توهين التعبير عن التحسس بشكل ملحوظ عن طريق التحفيز المتكرر أثناء سحب الدواء (الشكل (Figure6B)، 6B) ، على الرغم من أن الدورة الزمنية للتحفيز الناجم عن الكوكايين من الحركة لم تتأثر (الشكل (Figure6C) .6C). وهكذا ، فإن تقليل تأثير D2R-MSNs من NAc أثناء سحب الدواء قلل من التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين (تفاعل الكوكايين التحفيز الضوئي) F(1,18) = 11.08، P = 0.0037 ، الشكل Figure6B) .6B). تشير هذه البيانات إلى أن تفعيل D2R-NAc MSN خلال فترة الانسحاب من المخدرات يؤثر على سلوكيات التماس الكوكايين والانتكاس.

مناقشة

تشير أدلة كبيرة إلى أن التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين يرتبط بالنقل المعزّز للدوباميني في نظام ميزوكورتوليمبيك الذي يتألف من المنطقة السطحية البطنية وقشرة الفص الجبهي ونواة المتكئة (NAc). على وجه الخصوص ، تتميز مرحلة التعبير عن الحساسية السلوكية باستجابة مفرطة للأدوية بعد التوقف عن تناول الدواء ، والذي يرتبط بمجموعة من آليات التكيف (Kalivas and Duffy ، 1990. روبنسون وبيريدج ، 1993. كاليفاس وآخرون ، 1998) التي يمكن أن تسهم في شغف المخدرات القهري (Robinson and Berridge ، 1993. كاليفاس وآخرون ، 1998. Steketee و Kalivas ، 2011). وقد اقترح أن التغيرات التي يسببها الكوكايين في اللدونة الجزيئية والخلوية والسلوكية داخل NAc ، بالاشتراك مع تشوير مستقبلات DA في الـ MSN ، يمكنها تنظيم السلوكيات المسببة للمخدرات (Lobo et al.، 2010. شميت و بيرس ، 2010. فيرغسون وآخرون ، 2011. باسكولي وآخرون ، 2011. بوكليش وآخرون ، 2013. غورتر وآخرون ، 2013).

وقد كشفت الدراسات الحديثة التي تستخدم الفئران المهندسة جينيا والتي تعبر بشكل مشروط عن إعادة تكوين الرحم الكريبي عن أدوار ل D1R-MSNs أو D2R-MSNs في سلوكيات تعاطي الكوكايين. التنشيط الضوئي لـ D1R-MSNs من NAc بعد أيام 6 من تعاطي الكوكايين المتكرر يزيد من النشاط الحركي ، في حين أن تنشيط D2R-MSNs ليس له أي تأثير (Lobo et al.، 2010). تشير هذه البيانات إلى أن التعرض المتكرر للكوكايين يعزز إنتاج D1R-MSNs من NAc. تثبيط D1R-expressing MSN مع توكسين الكزاز (Hikida et al.، 2010يقلل من تفضيل المكان الموصى به للكوكايين (CPP) ، في حين لم تلاحظ أي تغييرات في الكوكايين CPP بعد إلغاء الإرسال المتشابك في D2R-MSNs (Hikida et al.، 2010). التنشيط الضوئي لـ D1R-MSNs في المخطط الظهري يحفز التعزيز المستمر ، في حين يحفز تحفيز مستقبلات D2-expressing neurons العقاب العابر (Kravitz et al.، 2012). كما أفادت دراسة حديثة بأن تثبيط D2R-MSNs من خلال نهج كيميائي يعزز الدوافع للحصول على الكوكايين ، في حين أن التنشيط الوراثي لـ D2R-MSNs يثبط الإعطاء الذاتي للكوكايين (Bock et al.، 2013). من ناحية أخرى ، Bocklisch وآخرون. (2013) ذكرت أن D1R-MSNs من مشروع NAc إلى VTA ، وتحديدًا إلى الخلايا العصبية GABAergic ضمن VTA ، في حين D2R-MSNs لا تقدم مباشرة إلى VTA. تعني هذه الدائرة أن تفعيل optogenetic من D1R-MSNs يزيل الخلايا العصبية DA ، والتي في النهاية تعزز السلوكيات المسببة للكوكايين المستحثة (Bocklisch et al.، 2013).

على الرغم من التنظيم البسيط على ما يبدو لهذين المجموعتين من MSN ، فإن حقيقة أن MSNs تتلقى مدخلات متعددة ولها نواتج مختلفة من / إلى مناطق الدماغ الأخرى ، بالإضافة إلى تشكيل دوائر محلية بين MSN و فئات أخرى من interneurons ، الناتج الناتج من D1R- يمكن أن تسفر MSNs و D2R-MSN عن عواقب جزيئية وخلوية وسلوكية معقدة ومختلفة.

في السابق ، تبين أن D2R يساهم في التعديلات المشبكية التي يحدثها خلال سحب الأدوية ، مما يؤدي إلى تقوية الانتكاس إلى السعي إلى الكوكايين ، دون التأثير على اكتساب الدواء الأولي أو البحث عن المخدرات (Sim et al.، 2013). تشير بياناتنا الحالية إلى أن التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs في NAc يؤدي إلى انخفاض النشاط الحركي الأساسي. لوبو وآخرون. (2010) لم يلاحظ أي تغيير في الحركة عندما تم تنشيط إما النوع الفرعي من MSN ، ولكنهم فحصوا فقط نشاط الحركي الكلي بدلًا من فحص الاستجابات الفورية للنشاط الحركي الأساسي إلى التحفيز الضوئي. كرافيتز وآخرون. (2010) وجدت أيضا أن تفعيل optogenetic من D2R-MSNs في الظهارية المخطط أيضا يقلل النشاط الحركي. وهكذا ، فإن بياناتنا هي الأولى التي تثبت أن النشاط الحركي الأساسي يتم تثبيطه عن طريق التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs من NAc والأول لفحص مسار الدورة الزمنية للنشاط الحركي الأساسي خلال التحفيز الضوئي لهذه الخلايا العصبية.

في هذه الدراسة ، لاحظنا أن تفعيل optogenetic من D2R-MSNs في NAc لم يؤثر على بدء أو التعبير عن التوعية السلوكية. ومع ذلك ، قللت عملية التحفيز الضوئي لـ D2R-MSN خلال فترة سحب الدواء من التعبير عن التوعية التي يسببها الكوكايين. لذلك ، تشير بياناتنا إلى أن D2R-MSNs تقوم بتوظيف بعض الإشارات على وجه التحديد خلال فترة الانسحاب التي تستمر في تغيير التعبير الجيني أو أشكال أخرى من الإشارات وبالتالي تحدث تغيرات في اللدونة المشبكية ، مما يؤدي إلى تغيرات في التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين. لا تعرف الطريقة التي تستخدم بها هذه الشبكات تكييفات محددة من النوع الخلوي يمكن أن تنتج نتائجها المختلفة في السلوكيات المتعلقة بالإدمان. غورتر وآخرون. (2013) اقترح أن ΔFosB في NAc يحلل بشكل تفاضلي الخصائص المشبكية والسلوكيات ذات الصلة بالمكافأة في نمط من النوع الخلوي ودون الإقليمي. مؤخرا ، شاندرا وآخرون. (2013) أفاد أن تكرار ChR2 التنشيط من D1R-MSNs ولكن ليس D2R-MSNs تسبب في تنظيم أسفل الجين Tiam1 ، وهو بروتين يشارك في إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الأكتين ، على غرار آثار الكوكايين. لذلك ، لفهم الآليات التي تسفر عن تأثيرات دائمة للسلوكيات التي يسببها الدواء ، سيكون من المهم تحديد الحث الانتقائي للخلايا للأحداث الجزيئية في هذه الـ MSNs التي تتحكم في التكيف التشابكي بالتعرض المتكرر للعقاقير.

بالاشتراك مع التعرض المتكرر للعقاقير ، تم اقتراح الانسحاب للعب دور مهم لأن بعض التغييرات تظهر فقط بعد عدة أسابيع من التعرض النهائي للكوكايين. هذا يشير إلى أن الامتناع عن ممارسة الجنس هو وسيط هام في تطوير اللدونة (Robinson and Berridge ، 2003. بودرو وولف ، 2005. بودرو وآخرون ، 2007. كورنيش وآخرون ، 2007). تثير هذه الملاحظات إمكانية أن يكون الانسحاب نفسه محفزًا للتغييرات في NAc التي تخضع لتحكم تشوير D2R. تظهر نتائجنا أن تفعيل D2R-MSNs في NAc أثناء سحب الدواء يؤثر على التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين يوفر دعما قويا لهذه الفكرة.

وقد تبين من قبل أن التعرض المتكرر للإجهاد أثناء سحب المخدرات يمنع التعبير عن التوعية السلوكية الناجمة عن تعاطي الكوكايين وكذلك سلوكيات التماس الكوكايين والانتكاس في فئران D2R KO (Sim et al.، 2013). لذلك من المثير للاهتمام أن التحفيز الضوئي لـ D2R-MSNs أثناء سحب الأدوية يضعف التعبير عن التوعية. يتم تغيير اللدونة المشبكية التي يسببها الإجهاد في المشابك الجلوتامينية في NAc of D2R KO mice (Sim et al.، 2013). على الرغم من أنه لم يُعرف بعد ما إذا كان التحفيز الضوئي لـ D2R MSNs أو الإجهاد المزمن خلال فترة الانسحاب يؤدي إلى تغييرات مشابهة في اللدونة المشبكية ، تدعم نتائجنا الحالية فرضية أن D2R-MSNs من NAc تلعب دورًا رئيسيًا في اللدونة الناتجة عن الانسحاب وقد تساهم في الانتكاس بعد التوقف عن تعاطي المخدرات. وستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لمعرفة الدوائر العصبية الوظيفية التي تشارك فيها D2R MSNs أثناء سحب الدواء وتحليل ومقارنات عواقب D2R-MSNs photostimulation والإجهاد المزمن على اللدونة متشابك في هذه الدائرة معينة.

قد يكون دور محتمل آخر لـ D2R-expressing MSNs هو منع إخراج D1R-MSNs من NAc. تشير الأبحاث السابقة إلى أنه على الرغم من قيام MSS بإنتاج محاوير طويلة إلى أهداف بعيدة ، يحدث تداخل كبير بين ضمانات المحوار والأشجار المتغصنة للخلايا العصبية الإسقاط المجاورة (Grofová ، 1975. بريستون وآخرون ، 1980. ويلسون وجروفز ، 1980). قد يشير ذلك إلى إمكانية الاتصال المحلي المتشابك المحلي لـ MSN داخل NAc. سجلت التسجيلات داخل الخلايا من أزواج من الخلايا العصبية الإسقاط شوكية اتصالات مثبطة وظيفية بين MSN في الفئران striatum (Czubayko و Plenz ، 2002. Tunstall وآخرون ، 2002. كووس وآخرون ، 2004. غوستافسون وآخرون ، 2006). وقد أفيد أيضا أن المشابك التي شكلتها المحاور الجانبية المتكررة من MSNs في المخطط ليست عشوائية ، D2R-MSNs إجراء اتصالات متشابكة مع D2R-MSNs الأخرى ومع D1R-MSNs ، في حين أن D1R-MSNs تكاد تكاد تشكل اتصالات متشابكة مع غيرها D1R-MSNs (Taverna et al.، 2008). على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن الترابط GABAergic عن طريق الضمانات axonal المحلية المتكررة بين تراكمات MSN أيضا (تريز و آخرون ، 2004) ، لا يزال من غير الواضح بعد ما إذا كانت D2R-MSNs تشكل بشكل عشوائي الدوائر المصغرة المحلية أو أنها تسهم في الدوائر المصغرة في NA مع اتصال تفضيلي كما تفعل في المخطط. تشير بياناتنا إلى أن D2R-MSNs في NAc معبرًا عن ChR2 يجرون اتصالات متشابكة مع MSN المتجاورة التي تعبر عن D1R ، وأن D2R-MSNs يجرون اتصالاً مثبطًا لـ D1-MSNs لتعديل الترويج لسلوك الإدمان D1R.

في الختام ، أظهرنا أن تفعيل optogenetic من NAc D2R-MSNs يغير اللدونة الناجم عن الانسحاب التي تحدث أثناء إدمان الكوكايين. وبالنظر إلى أن نشاط التشوير المعتمد على D2R خلال فترة الانسحاب يبدو منظمًا رئيسيًا للتعبير عن التوعية السلوكية الناجمة عن الكوكايين ، فإننا نقترح أن D2R-MSN هي وسيط هام للتكيف طويل الأمد للبحث عن المخدرات والانتكاس. يجب أن يوفر تحديد الركائز الجزيئية للتشوير المعتمد على D2R ، مع تحديد دارة معينة من NAc D2R-MSNs المستخدمة في ظل التعرض المتكرر للعقاقير ، أهدافًا جديدة للتدخل العلاجي في انتكاس الدواء.

بيان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب مصالح محتمل.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي من خلال برنامج أبحاث الدماغ (إلى Ja-Hyun Baik و Grant No. 2013M3C7A1056101) و Bio and Medical Technology برنامج التنمية (إلى Ja-Hyun Baik ؛ Grant No. 2013M3A9D5072550) وبرنامج المعهد العالمي (WCI) التابع لمؤسسة البحوث الوطنية في كوريا (NRF) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (إلى George J. Augustine ؛ WCI 2009-003) ، بالإضافة إلى منحة جامعة كوريا (إلى Ja-Hyun Baik) ومنحة CRP من مؤسسة الأبحاث الوطنية بسنغافورة (إلى George J. Augustine).

مراجع حسابات

  1. Baik JH (2013). إشارات الدوبامين في السلوكيات ذات الصلة بالمكافأة. أمامي. الدوائر العصبية 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  2. Baik JH، Picetti R.، Saiardi A.، Thiriet G.، Dierich A.، Depaulis A.، et al. (1995). اختلال الحركي الشبيه بمرض باركنسوني في الفئران التي تفتقر إلى مستقبلات الدوبامين D2. Nature 377 و 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [مجلات] [الصليب المرجع]
  3. Berridge KC (2007). الجدل الدائر حول دور الدوبامين في المكافأة: قضية التحفيز. Psychopharmacology (Berl) 191 و 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [مجلات] [الصليب المرجع]
  4. Bock R.، Shin JH، Kaplan AR، Dobi A.، Markey E.، Kramer PF، et al. (2013). يعزز تعزيز المسار غير المباشر المتراكم المرونة لاستخدام الكوكايين القهري. نات. Neurosci. 16 و 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  5. Bocklisch C.، Pascoli V.، Wong JC، House DR، Yvon C.، de Roo M.، et al. (2013). الكوكايين يعزل الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تقوية انتقال GABA في المنطقة الجزئية البطنية. العلوم 341 و 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [مجلات] [الصليب المرجع]
  6. Boudreau AC، Reimers JM، Milovanovic M.، Wolf ME (2007). خلية مستقبلات AMPA الخلية في النواة المتكئة الفئران زيادة خلال الانسحاب الكوكايين ولكن استيعاب بعد تحدي الكوكايين بالاشتراك مع تغيير التغير في كينازات البروتين منشط mitogen. J. نيوروسكي. 27 و 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  7. Boudreau AC، Wolf ME (2005). يرتبط التحسس السلوكي للكوكايين بزيادة تعبير مستقبلات AMPA في النواة المتكئة. J. نيوروسكي. 25 و 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [مجلات] [الصليب المرجع]
  8. Chandra R.، Lenz JD، Gancarz AM، Chaudhury D.، Schroeder GL، Han MH، et al. (2013). تثبيط Optogenetic من D1R التي تحتوي على الخلايا العصبية المتكئة نواة يغير تنظيم بوساطة الكوكايين من Tiam1. أمامي. مول. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  9. Chang HT، Kitai ST (1985). إسقاط الخلايا العصبية في النواة المتكئة: دراسة وصفية داخل الخلايا. الدماغ الدقة. 347 و 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [مجلات] [الصليب المرجع]
  10. Chausmer AL، Elmer GI، Rubinstein M.، Low MJ، Grandy DK، Katz JL (2002). النشاط الحركي الناجم عن الكوكايين وتعاطي الكوكايين في فئران مستقبلات الدوبامين D2. Psychopharmacology (Berl) 163 و 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [مجلات] [الصليب المرجع]
  11. Chevalier G.، Deniau JM (1990). إزالة التثبيط كعملية أساسية في التعبير عن وظائف المخطط. اتجاهات neurosci. 13 و 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [مجلات] [الصليب المرجع]
  12. Czubayko U.، Plenz D. (2002). انتقال متشابك سريع بين الخلايا العصبية الإسقاط المخطط شوكي. بروك. NATL. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 99 و 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  13. Ferguson SM، Eskenazi D.، Ishikawa M.، Wanat MJ، Phillips PE، Dong Y.، et al. (2011). تثبيط الخلايا العصبية العابرة يكشف الأدوار المتعارضة من المسارات المباشرة وغير المباشرة في التوعية. نات. Neurosci. 14 و 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  14. Goto Y.، Grace AA (2005). التعديل الدوباميني للحمض القشري والقشوي للنواة المتكئة في السلوك الموجه نحو الهدف. نات. Neurosci. 8 و 805 – 812 10.1038 / nn1471 [مجلات] [الصليب المرجع]
  15. Grofová I. (1975). تحديد الخلايا العصبية المخطط والبلدي الإسقاط إلى المادة السوداء. دراسة تجريبية عن طريق نقل محور عصبي إلى الوراء من الفجل البيروكسيديز الفجل. الدماغ الدقة. 91 و 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [مجلات] [الصليب المرجع]
  16. Grueter BA، Robison AJ، Neve RL، Nestler EJ، Malenka RC (2013). ΔFosB ينظم بشكل تفاضلي النواة المتكئة وظيفة المسار المباشرة وغير المباشرة. بروك. NATL. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 110 و 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  17. Gustafson N.، Gireesh-Dharmaraj E.، Czubayko U.، Blackwell KT، Plenz D. (2006). تحليل الجهد والمقياس الحالي المشبك من ردود الفعل والانتقال متشابك feedfortic في microcircuit مخطط في المختبر. J. نيوروفيزيول. 95 و 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [مجلات] [الصليب المرجع]
  18. Hikida T.، Kimura K.، Wada N.، Funabiki K.، Nakanishi S. (2010). أدوار متميزة لانتقال متشابك في مسارات مخطط مباشر وغير مباشر لمكافأة السلوك والمجاز. Neuron 66 و 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [مجلات] [الصليب المرجع]
  19. Kalivas PW، Duffy P. (1990). تأثير علاج الكوكايين الحاد واليومي على الدوبامين خارج الخلية في النواة المتكئة. Synapse 5 و 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [مجلات] [الصليب المرجع]
  20. Kalivas PW، Pierce RC، Cornish J.، Sorg BA (1998). دور للتوعية في الرغبة والانتكاس في إدمان الكوكايين. J. Psychopharmacol. 12 و 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [مجلات] [الصليب المرجع]
  21. Koos T.، Tepper JM، Wilson CJ (2004). مقارنة بين IPSCs التي أثارتها الخلايا العصبية شوكية وسريعة في neostriatum. J. نيوروسكي. 24 و 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [مجلات] [الصليب المرجع]
  22. Kourrich S.، Rothwell PE، Klug JR، Thomas MJ (2007). تتحكم تجربة الكوكايين في اللدونة المشبكية ثنائية الاتجاه في النواة المتكئة. J. نيوروسكي. 27 و 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [مجلات] [الصليب المرجع]
  23. Kravitz AV، Freeze BS، Parker PR، Kay K.، Thwin MT، Deisseroth K.، et al. (2010). تنظيم السلوكيات parkinsonian السيارات عن طريق التحكم optogenetic من الدوائر القاعدية القاعدية. Nature 466 و 622 – 626 10.1038 / nature09159 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  24. Kravitz AV، Tye LD، Kreitzer AC (2012). أدوار متميزة عن الخلايا العصبية المخطط مباشرة وغير المباشرة في التعزيز. نات. Neurosci. 15 و 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  25. Kreitzer AC، Malenka RC (2008). اللدونة الشتوية ووظيفة الدائرة القاعدية القاعدية. Nature 60 و 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  26. Le Moine C.، Bloch B. (1996). التعبير عن مستقبلات الدوبامين D3 في الخلايا العصبية الببتيدية من النواة المتكئة: مقارنة مع مستقبلات الدوبامين D1 و D2. Neuroscience 73، 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [مجلات] [الصليب المرجع]
  27. Lobo MK، Covington HE، 3rd، Chaudhury D.، Friedman AK، Sun H.، Damez-Werno D.، et al. (2010). نوع خلية محددة للخسارة من اشارات BDNF يحاكي التحكم optogenetic من مكافأة الكوكايين. العلوم 330 و 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  28. Lobo MK، Nestler EJ (2011). قانون الموازنة المخطط في إدمان المخدرات: أدوار متميزة للخلايا العصبية الشوكية المتوسطة المباشرة وغير المباشرة. أمامي. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  29. Lüscher C.، Malenka RC (2011). اللدونة متشابك المخدرات أثار في الإدمان: من التغييرات الجزيئية لإعادة تصميم الدوائر. Neuron 69 و 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  30. O'Donnell P.، Grace AA (1993). الخصائص الفيزيولوجية والمورفولوجية للخلايا العصبية المتجانسة وعلبة الصدفة المسجلة في المختبر. Synapse 13 و 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [مجلات] [الصليب المرجع]
  31. Pascoli V.، Turiault M.، Lüscher C. (2011). إنعكاس تعاطي المشابك المتشبعة بالكوكايين يستدعي السلوك التكيفي الناجم عن تعاطي المخدرات. Nature 481 و 71 – 75 10.1038 / nature10709 [مجلات] [الصليب المرجع]
  32. Preston RJ، Bishop GA، Kitai ST (1980). متوسطة الإسقاط العصبي الشوكي من نيوسترياتوم الفئران: دراسة البيروكسيديز الفجل بين الخلايا. الدماغ الدقة. 183 و 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [مجلات] [الصليب المرجع]
  33. Robinson TE، Berridge KC (1993). أساس العصبية من شغف المخدرات: نظرية التحفيز-الحافز من الإدمان. الدماغ الدقة. الدماغ الدقة. Rev. 18 و 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [مجلات] [الصليب المرجع]
  34. Robinson TE، Berridge KC (2003). إدمان. أنو. القس Psychol. 54 و 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [مجلات] [الصليب المرجع]
  35. Schmidt HD، Pierce RC (2010). عمليات التحديث العصبي الناجم عن الكوكايين في انتقال الغلوتامات: أهداف علاجية محتملة للشغف والإدمان. آن. نيويورك أكاد. الخيال العلمي. 1187 و 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [مجلات] [الصليب المرجع]
  36. Sesack SR، Grace AA (2010). شبكة مكافأة العقد القشرية - كوركو: دوائر كهربائية دقيقة. Neuropsychopharmacology 35، 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  37. Sim HR، Choi TY، Lee HJ، Kang EY، Yoon S.، Han PL، et al. (2013). دور مستقبلات الدوبامين D2 في اللدونة السلوكيات المسببة للإجهاد الناجم عن الإجهاد. نات. COMMUN. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [مجلات] [الصليب المرجع]
  38. Smith RJ، Lobo MK، Spencer S.، Kalivas PW (2013). إن تكيفات الكوكايين المستحثة في D1 و D2 تكشف عن الخلايا العصبية الإسقاطية (وهو انقسام ليس بالضرورة مرادفا للمسارات المباشرة وغير المباشرة). داء. أوبان. Neurobiol. 23 و 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  39. Steketee JD، Kalivas PW (2011). الإدمان على المخدرات: التوعية السلوكية والانتكاس إلى سلوك البحث عن المخدرات. Pharmacol. Rev. 63 و 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  40. Taverna S.، Ilijic E.، Surmeier DJ (2008). تتعطل الاتصالات الجانبية المتكررة من الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة النسيجية في نماذج من مرض باركنسون. J. نيوروسكي. 28 و 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  41. Taverna S.، van Dongen YC، Groenewegen HJ، Pennartz CM (2004). الأدلة الفسيولوجية المباشرة للارتباط المشبكي بين الخلايا العصبية الشوكية متوسطة الحجم في النواة الفئران المتكئة في الموقع. J. نيوروفيزيول. 91 و 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [مجلات] [الصليب المرجع]
  42. Thomas MJ، Kalivas PW، Shaham Y. (2008). المرونة العصبية في نظام الدوبامين mesolimbic وإدمان الكوكايين. ر. جي فارماكول. 154 و 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [بك المادة الحرة] [مجلات] [الصليب المرجع]
  43. Tunstall MJ، Oorschot DE، Kean A.، Wickens JR (2002). التفاعلات المثبطة بين الخلايا العصبية الإسقاط الشوكية في المخطط الفئران. J. نيوروفيزيول. 88 و 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [مجلات] [الصليب المرجع]
  44. Vanderschuren LJ، Kalivas PW (2000). تعديلات على انتقال الدوبامين والجلوتاميت في التحريض والتعبير عن التحسس السلوكي: مراجعة نقدية للدراسات قبل السريرية. علم الادوية النفسية (Berl) 151، 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [مجلات] [الصليب المرجع]
  45. ويلسون CJ ، غروف PM (1980). بنية دقيقة وربط متشابك من الخلايا العصبية الشوكية المشتركة للفئران حديثي الولادة: دراسة تستخدم الحقن داخل الخلايا من البيروكسيديز الفجل. J. شركات. Neurol. 194 و 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [مجلات] [الصليب المرجع]