Şərhlər: İki molekulyar şalter, davranışdan asılılıq da daxil olmaqla, bütün bağımlılıklarda görkəmli rol oynayır. Birincisi, DeltaFosB adlanır, digəri isə CREB, bu məqalənin mövzusudur.
20 il bundan əvvəl elm adamları bir sıra istifadəsinə qarşı cavab verən bir transkripsiya faktoru üzərində əyləşiblər. Onların işi müalicəyə gətirib çıxaracaq?
Kerry Grens tərəfindən
Pennsylvania Universitetinin aspirantı Stephen Mague, siçan qəfəsləri yüklənmiş bir arabanı böyük bir dolabın ölçüsündə bir otağa keçirir. Otaq, yalnız qırmızı işıqla yandırılan və kiçik iş skamyaları və asılan qara pərdələrlə dolu bir fotoqrafiya inkişaf edən laboratoriyaya bənzəyir. Dəhlizdə bir televiziya ekranında videokameranın otaq içərisindən bir sıra pleksiqlas qutularına baxaraq görünüşü göstərilir.
Lateks əlcəkli əl bir-bir ekranda görünməyə başlayır və hər qutuda qəhvəyi bir siçan çəkir. Heyvanlar küncləri araşdırmaq üçün gəzirlər; kameranın ortasında bir neçə fasilə və özlərini enerjili bir şəkildə bəyin. Mague, heyvanları bir dərmanı kameranın bir tərəfi ilə digər tərəfi ilə əlaqələndirmək üçün şərtləndirir, məsələn, möhkəm divarlar əvəzinə zolaqlı divarları olan bir dərmanı. Otaqlara kokain kimi bir dərman əlavə etmək işi olduqca asanlaşdırır. Aspirant Jess Cleck deyir ki, dərmana yalnız bir dəfə məruz qalmaq bunu edəcək: "Bir dəfə siçan əvvəllər kokain aldığı tərəfdə 13 dəqiqə 30 saniyə oturdu."
Zamanla, həm heyvanlarda, həm də insanlarda dərmana məruz qalma, dərman götürüldükdə asılılığa, həsrətə və çəkilməyə səbəb olur. Narahatlıq və depressiya daha çox yayılır və dərman ilkin motivasiya mənbəyinə çevrildiyi üçün bütün digər mükafat mənbələri cəlbediciliyini itirir. Asılılığı olan insanlarda fizioloji dəyişikliklər diqqət çəkir. Dallasdakı Texas Universitetinin Southwestern Medical Center-də Eric Nestler, "Bir dərmana az və ya çox həssas olmaları deyil, fərqli insanlar olduqları" deyir. "Sinir hüceyrələrinin təbiətini dərindən dəyişdirirsiniz."
Uzun müddət davam edən asılılıqdan aşağı spiral çoxsaylı nörobiyoloji uyğunlaşmaları ehtiva edir: sinapslarda uzunmüddətli depressiya, nörodejenerasiya və gen ifadəsində daimi dəyişikliklər. Bununla belə, hər ikisi bir-birinə uyğundur, çünki hər birinin özünə məxsus olanları vardır. Məsələn, amfetamin və kokain kimi stimulantlar nüvəli akumbenslərdə nöronal dallı artırır, morfin isə əks təsir göstərir.
Dərmanın beyinə təsirinin klassik təsviri mükafat sistemində, xüsusən ventral tegmental nahiyədən (VTA) nüvə hüceyrələrinə ventral proyeksiya edən neyronlara əsaslanır. Bu neyronlar dopamin salırlar və alkoqol və sui-istifadə maddələri onları birbaşa və ya dolayı yolla həyəcanlandırır. Dopamin akumbens nüvəsinə çatdırıldıqda zövqü artırır.
Narahatlıq, zaman keçdikcə bu sistem aşınmağa və tolerantlığı inkişaf etdirməyə başlayanda başlayır. Eyni miqdarda dərman daha kiçik dopamin reaksiyalarına səbəb olur, VTA nöronları büzüşə bilər, sinaptik əlaqələr çürüyür, reseptorların sıxlığı dəyişir və bəzi genlərin ifadəsi, xüsusən narahatlıq və depressiya ilə əlaqəli olur. Bu, Kaliforniya ştatının La Jolla şəhərindəki Salk İnstitutundakı George Koob'a görə, bir bağımlısının yalnız aludə olmağın pis hisslərini yaxşılaşdırmaq üçün bir dərman istifadə etməyə davam etdiyi zaman “bağımlılığın qaranlıq tərəfi” dir.
Nague, Pennsylvania Universitetindəki Mague'nin baş müstəntiqi Julie Blendy və başqaları, beyində transkripsiyal olaraq nələr baş verdiyini dəqiqləşdirmək üçün dərmanlara və aludəçiliyə müşayiət olunan saysız-hesabsız molekulyar dəyişiklikləri süzürlər. Təxminən iyirmi ildir ki, asılılıq tədqiqatçıları bir transkripsiya faktorunun fəaliyyətinə baxırlar: cAMP-reaksiya-elementi bağlayan protein (CREB). Bu zülal, kokain, morfin, alkoqol, amfetamin və nikotin daxil olmaqla müxtəlif istismar dərmanlarına cavab verir. Lakin bütün bu vaxta baxmayaraq Nestler deyir: “CREB hədəfini müəyyənləşdirmək üçün indi buzdağının ucundayıq”. Yenə də bu dəyişikliklərin qarşısını almaq və ya düzəltmək üçün yollar tapacağına ümid edirlər.
Blendy, ilk CREB çatışmazlığı olan siçanların doğulduğunu dəqiq xatırlayır. "15 yaşındalar," deyə gülərək deyir, "Qızımı [iyun ayında] dünyaya gətirdim və iki həftə sonra ilk mutant dünyaya gəldi." O vaxt Blendy, Heidelberqdəki Alman Xərçəng Tədqiqat Mərkəzindəki Gunther Schutzun laboratoriyasında bir postdoc idi və nakavt texnologiyasında çox həvəs vardı. Digər qruplar siçanları istifadə etmək üçün qışqırdılar.
Bununla birlikdə Schutz qrupu siçanları xarakterizə etməyə başladığı zaman dayanmağa başladı. "Tamamilə nokaut etmədiyimizi anladıq" deyir Blendy. Mütant heyvanlarda CREB geninin alternativ birləşmə formaları var idi, lakin bunun təsadüfi bir qəza olduğu ortaya çıxdı. CREB nakavt heyvanları perinatal dövrdə sağ qalmaz. Yalnız az miqdarda CREB-nin olması, bu mutantların yetkinlik yaşına qədər yaşamasına imkan verdi, bu da tədqiqatçıların öyrənmə, yaddaş, əhval-ruhiyyə pozğunluqları və asılılıq da daxil olmaqla bir sıra nevroloji aspektlərdə CREB-in rolunu araşdırmasına imkan verəcək funksional dəyişikliklərlə.
Bu zamana qədər 90-cı illərin ortalarında transkripsiya faktoru artıq asılılıq tədqiqatının hədəfi idi. 1970-ci illərdə beyin sapının mavimsi görünüşlü, beyin sapının beynin çoxsaylı hissələrinə çatdıran lokus ceruleus adenilil siklaz fermenti ilə başladı. Adenilil siklaz cAMP sintez edir və bu da öz növbəsində CREB-ni aktivləşdirir. Nobel mükafatı laureatı Marshall Nirenberg və həmkarları, morfinə qarşı “hüceyrə tolerantlığının” lokus ceruleus neyronlarında dəlillər təqdim etdilər. Adenilil siklazanın aktivliyi morfinə məruz qaldıqdan sonra azaldığını, dərmanın bir gündən çox hüceyrələrdə inkubasiya edilməsinə buraxıldığını, adenilil siklaz aktivliyinin sıçrayış etdiyini göstərdilər.1 Dərman çıxarıldıqda fermentin aktivliyi artdı müəlliflər asılılıqdan hüceyrə çıxışı kimi şərh edirlər: “Bu fenomeni heyvanlarda abstinensiya sindromuna bənzətmək olar.”
"Sinir hüceyrələrinin təbiətini dərindən dəyişdirirsiniz." -Eric Nestler
On ildən çox vaxt keçdikdən sonra, 1990-cı illərin əvvəllərində Nestler, sonra Yale Universitetində və qrupu nəticələri vivo şəkildə təkrarladı və adenil siklazdan CREB-nin aktivləşdirilməsinə qədər iki addım aşağıya doğru hərəkət etdi. Morfinin bir dozasının CREB-nin (CREB aktivasiyasının bir göstəricisi) fosforilasiyasını pozduğunu göstərdilər, lakin dərmanla daha uzun müddət təmasda olduqdan sonra aktivlik normallaşdı. Locus ceruleus afyun sistemi üçün yalnız bir nümunə sistemidir, amma digər neyronlar buna cavab verirmi? ” Ventral tegmental bölgədən dopaminerjik giriş alan və beynin mükafatlandırma sistemində iştirak edən bir qrup nöron nüvəsinə çevrildi. Orada Nestler oxşar nəticələr tapdı: Morfinin xroniki istifadəsi CREB aktivliyini artırır.
Schtz laboratoriyasında CREB çatışmazlığı olan siçanlar, CREB-nin asılılıq prosesində lazım olub olmadığını ölçmək üçün bir fürsət təqdim etdi. O vaxt Paris Universitetində olan Rafael Maldonado ilə, Blendy 1996-cı ildə mutant siçanlarının normal heyvanların nümayiş etdirdiyi morfinin çəkilmə əlamətləri olmadığını göstərdi.3 “Tərifə görə, asılılıq dərman xaric edildikdə geri çəkilmə sindromunun olması deməkdir. , ”Blendy deyir. "Sual budur ki, heyvanlar heç əvvəlcə narkotikdən asılı deyildimi?" Blendy, CREB-nin asılılığı başlatmaqda əhəmiyyətli olduğu qənaətinə gəldi. Ancaq belə bir sadə izah həqiqət olmaq üçün çox yaxşı idi.
Hal-hazırda Belmontdakı Harvard McLean Xəstəxanasında psixiatriya üzrə dosent olan Bill Carlezon, 1990-cı illərin ortalarında Nestler laboratoriyasında nüvə akumbensində kokain öyrənən bir postdok idi. O dövrdə CREB-ni birbaşa hədəf almağın yaxşı bir yolu yox idi, buna görə Nestler qrupu, endogen CREB ilə rəqabət edən və fəaliyyətini əngəlləyən mutant bir CREB forması olan bir virus vektoru inkişaf etdirdi. Mutant heyvanlara kokain verildikdə, dərmana üstünlük verdiklərini, CREB heyvanlarda həddindən artıq ifadə edildikdə isə ondan nifrət etdiklərini göstərdilər.4
Blendy, 1997-ci ildə CREB çatışmazlığı olan siçan xətti ilə Pennsylvania Universitetinə köçdükdən sonra oxşar nəticələr tapdı. Bu heyvanlara az dozada kokain verildikdə (onları duzlu sudan vəhşi tipli heyvanlarla ayırd edə bilməyəcək qədər kiçik dozalarda) heyvanlar kokain qəbul etdikləri qutunun tərəfi üçün güclü bir yer seçimi göstərdilər.5 “CREB çatışmazlığı olan heyvanlar kokain mükafatında bir artım göstərin ”dedi Blendy.
Blendy'nin məlumatları Nestler və Carlezonun nəticələri ilə uyğun gəlsə də, morfinlə əlaqəli nəticələrə uyğun gəlməyən tapıntılar idi. CREB çatışmazlığı heyvanları kokainlə daha çox maraqlandırsa da, morfinlə əks hərəkət etdi. Blendy, uyğunsuzluğun hər bir dərmanın işlədiyi fərqli beyin bölgələri ilə əlaqəli olduğundan şübhələnir. Bütün sui-istifadə dərmanları nüvə akumbenslərində artan dopaminlə nəticələnsə də, fərqli mexanizmlər vasitəsi ilə hərəkət edirlər: Kokain, nüvə akumbensindəki dopamin daşıyıcılarını bloklayır, morfin isə ventral tegmental bölgədəki dopamin hüceyrələrini disinhibitə edir.
Narkomaniya ilə əlaqəli molekulyar dəyişikliklərin mürəkkəbliyi bununla bitmir. Alkol və nikotin CREB-də kokain və morfindən fərqli olaraq təsir göstərir. Üstəlik, başqa bir transkripsiya faktoru, DFosB, davranışa əks təsirləri olsa da, CREB-ə bənzər şəkildə tənzimlənmişdir.6
Dərmanlara qarşı DFOSB reaksiyası, xüsusilə uzunmüddətli dəyişikliklərlə əlaqədar, CREB kimi bağımlılığa çox əhəmiyyətli ola bilər. Nestlerin sözlərinə görə, CREB əsasən narkotikdən mənfi rəy verir və DFosB narkotiklərin mükəmməl təsirlərini artırır.
"DFosB bir çox cəhətdən CREB-in əksinə olaraq görülə bilər" dedi Nestler. Ancaq heyrətləndirici bir mürəkkəbliklə hər iki transkripsiya faktoru eyni hüceyrədə tənzimlənə bilər. "Bəzi hüceyrələr CREB aktivasiyasını göstərir, bəziləri DFosB əmələ gətirir və bəziləri üst-üstə düşür" Nestler izah edir. "İşlənilməsi lazım olan çox mürəkkəb bir prosesdir."
Bilikdəki bu boşluqlara baxmayaraq, 1990-cı illərədək elm adamları, CREB-nin sui-istifadə narkotiklərinin təsirlərini tənzimləməkdə əhəmiyyətli olduğuna əmin oldular. Bununla yanaşı, bunun beynin bütün bölgələrindəki bütün dərmanlar üçün bir ölçülü bir marker olmadığını, bir müalicə qalsın, başa düşdülər. “CREB heç vaxt terapevtik hədəf olmayacaq. Bu, çox vacibdir, hər yerdə var ”deyə Blendy deyir.
Axın tərəfə dönməyə qərar verdi. Onun qrupu, ilkin təsirlənmədən asılılığa qədər çəkilməyə qədər olan narkotik asılılığı prosesi zamanı bir sıra CREB hədəf genlərinin ifadəsini izləyir. "Ümid budur ki, cavabdeh olduğu hədəf [genlərin] bir hissəsi ideal olacaqdır."
Bu fazalar vasitəsilə diferensial ekspresiyada ən dramatik nəticələr göstərən aşağı istiqamətli hədəf genlərdən biri kortikotropini azad edən amildir (CRF, ayrıca kortikotrofin salma hormonu, CRH). CRF, stres reaksiyalarının vasitəçiliyində vacibdir, eyni zamanda Koobun asılılığın qaranlıq tərəfində də iştirak edir. "Tapdığımız şey," deyir Koob, və bu xüsusilə alkoqol və opiatlarla nikotinlə əlaqəlidir və bəlkə də kokain üçün bir az daha azdır - heyvanlar çox dərman qəbul etdikdə, CRF sistemi məşğul olur və həddindən artıq dərmana kömək edir. - götürmək. ”
Milli Alkoqol Bağımlılığı və Alkoqolizm İnstitutunun klinik direktoru Markus Heilig, CRF sisteminin tənzimlənməsinin qalıcı olduğunu söyləyir. "Son bir ildir gəmiricilərə mıxlanmış bir sıra sənədlər, əgər uzun müddət alkoqoldan asılılığınız və sərxoşluq və geri çəkilmə dövrləriniz varsa, endogen [CRF] sistemində olduqca uzunmüddətli dəyişikliklərə səbəb olacaq" Heilig deyir.
Koob, son zamanlarda alkoqoldan asılı olan heyvanların, CRF1 reseptoruna antaqonist verildikdə, geri çəkilmə zamanı daha az içdiklərini göstərdi. 7 “Bir [CRF1 reseptor antagonisti] geri çəkilmək üçün əla bir dərman ola biləcəyini söylədi” dedi. Ancaq insanlarda istifadə üçün təhlükəsiz bir antaqonist tapmaq çətin oldu. Bir ilaç, NBI 30775 üzərində aparılan klinik sınaqlar, bir neçə il əvvəl iki xəstədə qaraciyər ferment səviyyəsinin yüksəlməsindən sonra dayandırılmışdı.8 Koob və Heilig, başqaları arasında, asılılığı müalicə etmək üçün təhlükəsiz istifadə edilə bilən bir CRF1 reseptor antagonistini tapmaq üçün çalışırlar.
Bu ilin mart ayında Heilig, alkoqoldan asılı sıçanlarda proqressiv nəticələr yayaraq, narkotik maddə stresə məruz qaldıqda asılı heyvanları spirt axtararaq dayandırdığını göstərdi. 9 Bir CRF1 reseptor antagonisti bir dərmana çevrilə bilərsə, Koob deyir ki, ən çox ehtimal edilən tətbiq kəskin çıxarılması zamanı olardı.
“CREB heç vaxt terapevtik hədəf olmayacaq. Çox vacibdir, hər yerdə yayılmışdır. ”- Julie Blendy
Blendy's Penn laboratoriyasından təxminən 300 mil şimalda, Harvardın McLean Xəstəxanasında bənzər bir geyimli, əlcəkli və qənimət qazanan bir alim bir dəhlizdə heyvan arabasını təkərlər. Bunlar Carlezonun eksperimental siçovullarıdır, hər biri antenna bənzər elektrodla cərrahi şəkildə başının üstünə monte edilmişdir. Elektrod, beynin mükafat mərkəzinə kvadrat dalğalı elektrik cərəyanının impulsları şəklində xoş bir stimulyasiya verir. Carlezonun ofisində həzz verən axını almaq üçün bir siçanın ardı-arası kəsilmədən fırlandığı bir video oynayır. “Yəqin ki, indiyə qədər olan ən yaxşı şey kimi hiss olunur. Heyvanlar bunu dərman, qida, seks - hər şeyə görə seçəcəklər ”deyir.
Carlezon, müəyyən bir nöqtədə cari mükafatın azaldığı bir frekansın altına enəndə sükan çarxını döndərməyi dayandırır. Heyvanlar kokaindən çəkildikdə, çalışmağa hazır olduqları minimum cərəyan miqdarı - “mükafat həddi” artır. 10 “Stimulyasiya geri çəkilmə müddətində o qədər də faydalı olmadığı üçün siçanlar onları əldə etmək üçün daha yüksək tezlik tələb edirlər [stimul üçün] işləmək. ” Carlezonun nəticəsi: "Daha çox dinorfin hazırladıqlarını düşünürük."
Dynorphin, k-opioid reseptorlarında əmələ gələn və CREB-nin bir aşağı hədəf genidir olan endojen bir opioiddir. Carlezon göstərir ki, CREB və ya dynorphin funksiyası nüvə adapterlərində yüksəlmişdə, kokain daha az mükafatlandırır və bəzən hətta ehtiyatlıdır. Lakin k-reseptorları bloklandıqda, təsiri uzaqlaşır. 4 Carlezon indi kokain çıxarılması ilə qarşılaşan siçovullara k-opioid reseptor antagonistləri verərək və bu dərmanların mükafat eşiklərini sabit saxlaya bilmədiklərini ölçərək sınaqdan keçirir. Antagonistlər işləyərsə, Carlezon deyir ki, narkotik maddənin çəkilməsinin əlamətlərini müalicə etmək üçün namizəd ola bilərlər.
Koob və Brendan Walker, həmçinin Scripps-də etanoldan asılı olan siçovullarda k-opioid reseptor antaqonisti nor-binaltorphimine istifadə etdilər və daha az içdiklərini aşkar etdilər. Asılı olmayan heyvanlarda içmə davranışı dəyişməyib. Walker, dinorfin-k-opioid sisteminin asılılığın "qaranlıq tərəfi" ilə əlaqəli olduğu fikrini dəstəklədiyini söyləyir11. "Ümumiyyətlə," Walker deyir, "bu hipotezdir; heyvanlar asılı olduqda və alkoqoldan kənarlaşdırdığınız zaman, artan mənfi təsir onları daha çox alkoqol almaq istəməsinə səbəb olur. Belə görünür ki, bu sistemi blok edə bilsək, analın həddindən artıq alkoqol istehlakının qarşısını ala bilərik. ”
Pensilvaniya Universitetinin psixiatriya sədrinin müavini və Bağımlılığa Araşdırmalar Mərkəzinin direktoru Charles O'Brien, dinorfin və CRF1 reseptorları antaqonistləri ilə bağlı araşdırmaların ümidverici göründüyünü, ancaq asılılığı həqiqətən müalicə etmək üçün hədəfin beynin yaddaş mərkəzi olması lazım olduğunu söylədi. , CREB-i əhatə edə bilər və ya daxil ola bilməz.
O'Brien "Asılılıq məcburi bir narkotik axtarma davranışıdır" deyir. “Alkoqol, kokain və ya eroinin özü tərəfindən istehsal olunan dəyişikliklər deyil. Dərman bitdikdən sonra istək yaradan, narkotik axtaran və nüks edən bir öyrənmə, bir yaddaş izi var. ” Nestler bu xatirələrin ömür boyu olduğunu söyləyir. “Uşaq vaxtı isti sobaya toxunduq və heç vaxt isti soba ilə sınaqdan keçməyə dəyməyəcəyini xatırladıq. Dərman xatirələri bu xatirələr qədər güclü ola bilər. ”
Bağımlılığın öyrənilməsinin CREB-ni əhatə edib-etməməsi qeyri-müəyyəndir. Buna baxmayaraq, Nestler, çəkilmə simptomlarını azaltmaq üçün CREB-in hədəf genlərini manipulyasiya etmənin, xatirələri təsir edə biləcək bilişsel-davranışçı terapiya kimi digər bağımlılıq müalicələrinə kömək edə biləcəyini söyləyir. "Mənim fikrimcə, bu [potensial dərmanları] insan subyektlərinə nə qədər tez daxil etsəniz, bir o qədər yaxşıdır" deyir O'Brien. "Heyvan modelləri yolu göstərə bilər, amma gec-tez onları insanlara qovuşdurmalısan."
References
1. SK Sharma et al., "Adenilat siklazın ikili tənzimlənməsi, narkotik asılılığı və tolerantlığı hesaba alır", Proc Nat Acad Sci, 72: 3092-6, 1975. [PUBMED]
2. X. Guitart və digərləri, "Siçovul lokus ceruleus içərisində kəskin və xroniki morfin ilə siklik AMP reaksiya elementini birləşdirən protein (CREB) fosforilasyonunun tənzimlənməsi", J Neurochem, 58: 1168-71, 1992. [PUBMED]
3. R. Maldonado et al., "CREB kodlayan gendəki bir mutasiya ilə siçanlardakı morfin abstinensiyasının azaldılması", Science, 273: 657-9, 1996. [PUBMED]
4. WA Carlezon, Jr. et al., "CREB tərəfindən kokain mükafatının tənzimlənməsi", Science, 282: 2272-5, 1998. [PUBMED]
5. CL Walters, JA Blendy, “İstifadədən istifadə olunan dərmanların müsbət və mənfi gücləndirici xüsusiyyətlərindəki zülalı bağlayan cAMP cavab elementi üçün fərqli tələblər”, J Neurosci, 21: 9438-44, 2001. [PUBMED]
6. EJ Nestler, "Asılılıq üçün ortaq bir molekulyar yol varmı?" Nat Neurosci, 8: 1445-9, 2005. [PUBMED]
7. CK Funk və digərləri, "Kortikotropini sərbəst buraxan faktor 1 antaqonistləri etanoldan asılı olan siçovullarda etanolun öz-özünə verilməsini seçici şəkildə azaldır", Biol Psych, 61: 78-86, 2007. [PUBMED]
8. C. Chen, DE Grigoriadis, “NBI 30775 (R121919), kortikotropin salma faktoru (CRF) tip-1 reseptorunun anksiyete və depresyon müalicəsi üçün ağızdan aktiv antagonisti,” Drug Dev Res, 65: 216- 26, 2005. [PUBMED]
9. DR Gehlert et al., “3- (4-Kloro-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il) -8- (1-etilpropil) -2,6-dimetil-imidazo [1,2 -b] piridazin: yeni beyin nüfuz edən, ağızdan alınan, kortikotropin salma faktoru reseptoru 1 antagonisti, alkoqolizmin heyvan modellərində effektivliyi, ”J Neurosci, 27: 2718-26, 2007. [PUBMED]
10. I. Goussakov et al., "Kokainin çıxarılması zamanı lateral amigdalada LTP," Eur J Neurosci, 23: 239-50, 2006. [PUBMED]
11. Walker BM və Koob GF, "Etanoldan asılılıqda opioid sistemlərin motivasion rolunun farmakoloji dəlili", Nöropsikofarmakoloji, 2 May 2007-ci il internet nəşri. [PUBMED]
Daha çox oxu: Asılılıq gətirən tədqiqatlar - Alim - Həyat Elmləri Dergisi http://www.the-scientist.com/article/display/53236/#ixzz17vJl152n
;