mücərrəd
Nucleus accumbens (NAcc) dopaminozeptiv neyronlar üzərində dendritik spinlerin psixostimulyar təsir göstəricilərinin dəyişməsi uzunmüddətli addictive davranışlarla əlaqəli adaptiv nöronal cavab olaraq hipotez edilmişdir. NAcc əsasən ya dopamin D1 və ya D2 reseptorlarının yüksək səviyyələrini ifadə edən orta ölçülü spiny nöronların iki fərqli subpopulyasiyalarından ibarətdir. Bu işdə, NAcc'ta fərqli D1 və ya D2 reseptorları olan orta ölçülü spiny nöronlarda xroniki kokain müalicəsindən sonra dendritik bel yoğunluğunu təhlil etdik. Bu işlər DGNUMX və ya D1 reseptor promoteri (Drd2-EGFP və ya Drd1-EGFP) nəzarəti altında EGFP ifadə edən transgenik siçanlardan istifadə edilmişdir. 2 gün kokain müalicəsi və 28 gün çəkilməsindən sonra, Drd2-EGFP- və Drd1-EGFP pozitiv nöronlarda bel yoğunluğu artmışdır. Lakin, omurilik sıxlığının artması yalnız Drd2-EGFP-pozitiv nöronlarda narkotiklərin çəkilməsindən 1 gün ərzində saxlanılmışdır. Xüsusilə, 30 gündən dərman çəkilməsindən sonra Drn1-EGFP-və Drd2-EGFP-pozitiv neyronlarda, lakin 2 gündən sonra narkotiklərin çəkilməsindən sonra Drd1-EGFP-pozitiv nöronlarda ΔFosB ifadəsi də müşahidə olunmuşdur. Bu nəticələr kronik kokain müalicəsi sonrası müşahidə edilən artmış omurluq sıxlığının yalnız D30-reseptorları olan neyronlarda sabit olduğuna və ΔFosB ifadəinin D1-də dendritik spinlərin formalaşdırılması və / və ya saxlanılması ilə və D1 reseptor ehtiva edən nöronlarla bağlı olduğunu göstərir NAcc-da.
Mezolimbik dopaminerjik yol, nüvəli akumbensləri (NAcc), kükürdlü tüberkül, prefrontal korteks və amigdala (1), əsas nigra (pars compacta) nigrostriatal dopaminergik nöronlar isə dorsal striatuma (2). Psychostimulants NAcc'ta dopaminin sinaptik konsentrasiyalarını artırır: kokain, sinaptik yarıqdan dopaminin tutulmasını və amfetaminin sinir terminallerindən dopaminin salınmasını təşviq edərək3-5). Təkrarlanan, interaktiv psixostimulyantların tətbiqi, bu dərmanların kəskin stimullaşdırıcı təsirlərinə artan davranış reaksiyalarına (sensitizasiya) səbəb olur (6-8). Dəlillərin əksəriyyətini göstərir ki, ventral tegmental bölgədə adaptiv dəyişikliklər - NAcc dopaminergik sistemi narkotikə bağlı davranışa əsaslanan təcrübəyə asılı plastisitədə dəyişikliklər üçün əhəmiyyətlidir.
Dopamin ilə yanaşı, glutamat psixostimulyatorlara cavab olaraq davranışçı həssaslığın inkişafı üçün tələb olunur (9, 10). Ventral striatumda orta ölçülü spiny nöronlar (MSNs) dendritik spinlerin başlarına sinapsız olan prefrontal korteksdən qoruyucu glutamateriq proqnozlar alır. MSN də bel boyunlarına sinaps qoyan dopaminergik aksonlar üçün ən böyük hədəfdir (1, 11, 12). Buna görə də, MSN-də dendritik spinlər dopaminergik və glutamateriq ötürülmənin ilkin olaraq inteqrasiya olunduğu mobil bölməni təmsil edir.
Dopamin iki böyük reseptor subfamilyasına, D1 alt menyusuna (D1 və D5 alt tipləri) və D2 subfamilyasına (D2, D3 və D4 alt tiplərinə)13). Dorsal striatumda anatomik tədqiqatlar göstərir ki striatonigral MSNlər yüksək səviyyədə D1 reseptorları (maddə P və dynorphin ilə birlikdə), striatopallidal MSNlər əsasən D2 reseptorlarını (enkephalin ilə birlikdə) ifadə edir14-17). NAcc dən proqnozlar dorsal striatumdan daha mürəkkəbdir, NAcc'ın qabıq və əsas hissələri ventral pallidumun fərqli alt bölgələrinə və ventral tegmental sahəsi və əsasən nigra (18). D2 reseptorları və enkefalin ventral palliduma proqnozlarda yüksək ifadə edilərkən, D1 reseptorları və maddə P ventral pallid və ventral tegmental sahəyə proqnozlarda bərabər paylanmışdır (19). D1 və ya D2 reseptorları üçün selektiv olan agonistlərin və antagonistlərin tədqiqatları psixostimulyativ təsirlərə məruz qalan davranış dəyişiklikləri üçün həm D1, həm də D2 reseptorlarının tələb olunduğunu göstərdi20-25). Ancaq bu reseptorların rolu fərqli görünür. Məsələn, D1 reseptorlarının stimullaşdırılması kokain astarlanmasının və kokainlə əlaqəli ətraf mühitin istifadəsi ilə nəticələnən kokain axtarışını artırır, D2 reseptorlarının stimullaşdırılması isə kokainə səbəb olan bərpa işlərini asanlaşdırır (26-28).
Psikostimülan bağımlılığı ilə bağlı davranış anomaliyaları çox uzun ömürlüdür. Buna görə də, dopamin və glutamat tərəfindən tənzimlənən nöronlu dövrlərdə molekulyar və struktur səviyyəsində uzunmüddətli dərman vasitələrinə səbəb olan dəyişmələrin müəyyən edilməsinə böyük maraq var idi (29-32). Xüsusilə, kokain və ya amfetaminə uzun müddətli məruz qalma, NAcc-da dendritik dal nöqtələrinin və MSN-lərin sayının artmasına gətirib çıxardı33-35). Bu struktur dəyişiklikləri son narkotik dərhal sonra ≈ 1-3.5 ay qədər davam30, 35) və psikostimulyant təsirlərlə əlaqəli sinaptik plastisitədə uzunmüddətli dəyişikliklərin olmasını təklif etmişdir.
Bu işin məqsədi D1 və ya D2 reseptorlarını əks etdirən uyğunlaşdırılmış MSNlərin subpopulyasiyalarında dendritik spinlərin kokainlə bağlı struktur dəyişikliklərini araşdırmaq idi. Bu tədqiqatlarda biz D1 (Drd1-EGFP) və ya D2 (Drd2-EGFP) dopamin reseptor promoterinin (ya da DXNUMX-EGFP) nəzarətində EGFP ifadə edən bakterial süni xromosom (BAC) transgenik siçanlardan istifadə etdik36). Nəticələr göstərir ki, artan omurilik sıxlığı başlanğıcda D1 reseptoru olan MSN və D2 reseptorları olan MSNlərdən meydana gəlsə də, dəyişdirilmiş bel yoğunluğu D1 reseptor ehtiva edən nöronlarda sabitdir. Bundan başqa, ΔFosB transkripsiyası amilinin ifadəsindəki oxşar dəyişiklikləri tapırıq ki, ΔFosB D1-də dendritik spinlərin formalaşmasına və ya saxlanmasına və ya NAcc-da D2 reseptor tərkibli nöronlara cəlb oluna bilər.
Nəticələr
Drd1-EGFP və Drd2-EGFP BAC Transgenik Siçanlarında MSNlərin təhlili.
Drd1-EGFP və ya Drd2-EGFP BAC transgenik siçanlarında dorsal və ventral striatumdan olan MSN-lərin proqnoz nümunəsi GFP ifadəsinin təhlili36). Dorsal striatumun MSN-lərindəki GFP-nin diferensial ifadəsi ümumiyyətlə endogen D1 və ya D2 reseptorlarına uyğun gəlir (36). Bundan əlavə, Drd1-EGFP və ya Drd2-EGFP siçanlarında NAcc-da GFP-nin fərqli ifadəsini təhlil etdik (Əncir 1a və b). NAcc'ta nöronların ≈58% -i DrD1-EGFP siçanlarında GFP-i ifadə etdilər (baxmayaraq ki,Əncir 1a), NAcc'ta nöronların ≈ 48% -i DrD-2-EGFP siçanlarında GFP-ni ifadə etdiƏncir 1b). MSN'ler, NAcc'ta bütün nöronların 90-95%12, 37). D1 reseptorları yalnız MSN-də ifadə edilir və D2 reseptorları MSN-də və xolinergik internöronlarda ifadə edilir, bu da striatal nöronların 1-3%37). Bu faktorları nəzərə alaraq nəticələr göstərir ki, NAcc-da MSN-in ən azı ≈ 10-15% -i D1 və D2 qəbuledicilərini ifadə edə bilər.
Drd1-EGFP və Drd2-EGFP Siçanlarında Dendritik Spinlərin Təhlili.
Drd1-EGFP və Drd2-EGFP siçanlarında GFP ifadəsi nöronal hüceyrə orqanlarını ləkələmək üçün faydalıdır. Lakin, dendrit və dendritik spinlərdə olan GFP siqnalları anti-GFP antikorları ilə immundan sonra onların təhlili üçün çox zəif idi. Flüoresan boyalarının partikül vasitəçiliyi ilə ballistik çatdırılması son zamanlarda nöron populyasiyalarını sürətli və məhsuldar bir şəkildə təsvir etmək üçün istifadə edilmişdir (38). Bütün nöronlar bu üsulla istifadə edilə bilər və üsul Golgi-Cox boyama ilə müqayisə edilə bilir. NAcc'teki nöronların dendritik morfolojisini analiz etmek için, sabit akkumtal dilimleri, gen tabancası kullanılarak lipofilik floresans boya 1,1'-diotadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) ile etiketlendi. DiI-ləkəli bir MSN-in nümunəsi göstərilir Əncir 1c. İstifadə edilən şərtlərə əsasən, ümumiyyətlə etiketli neyronları digər etiketli nöronlardan heç bir üst-üstə düşməyən dendrit olmadan müşahidə etdik. Yüksək böyüdükdə, dendritik spinler də daxil olmaqla ətraflı dendritik morfologiya müşahidə oluna bilər (Əncir 1d).
Daha sonra toxum permeabilisiyası üçün az miqdarda bir deterjan konsentrasiyası istifadə etməklə mümkün olan Drd1-EGFP və ya Drd2-EGFP transgenik siçanlarında GFP üçün DiI etiketleme və immunohistokimiya birləşməsini istifadə etdik metodika). DiS lekesi və GFP ifadəsinin MSN-lərin hüceyrə orqanlarına diqqətlə müqayisə edilməsi nəticəsində biz Drd1-EGFP-də DiI- və GFP-müsbət və ya DiI-pozitiv və GFP-mənfi nöronları müəyyən edə bilərikƏncir 2a) və ya Drd2-EGFP (Əncir 2b) siçan. Aşağıdakı işlər üçün Drd1-EGFP və ya Drd2-EGFP siçanlarından yalnız DiI- və GFP-pozitiv nöronlarda dendritik morfologiyanı təhlil etdik.
Accumbal MSN-lərdə Drn1-EGFP və ya Drd2-EGFP-i ifadə edən Artıq Spin Yoğunluğunda Xroniki Kokain Müalicəsi nəticələri.
Drd1-EGFP və ya Drd2-EGFP siçan dörd dəfə ardıcıl həftə kokain (30 mg / kq) və ya salin ilə bir neçə dəfə enjekte edilmişdir (bax metodika). Sonuncu dərman müalicəsindən sonra iki gün (2WD) və ya 30 gün (30WD) yuxarıda təsvir edilən DiI etiketleme və immunohistokimya üçün beyinlər işlənmişdir. Əvvəlki bir işin, amphetamin ilə xroniki müalicənin NACC-də distal, lakin proksimal olmayan dendritlərdə artım olduğunu göstərdi35). Buna görə, analizimizi terminal bölgələr daxil olmaqla distal dendritlərə (ikinci və ya üçüncü dərəcəli filialları olanlar) məhdudlaşdırdıq. 2WD-də analiz edildikdə, Drd1-EGFP-pozitiv MSN-lərdə (128% -i salin qrupu) artmışdırƏncir 3a və c) və Drd2-EGFP-pozitiv nöronlarda (115% salin qrupu) daha az dərəcədə (Əncir 3 b və d). 30WD-dən sonra artmış bel möhkəmliyi Drd1-EGFP-pozitiv neyronlarda saxlanıldı (118% salin nəzarət) (Əncir 3 a və c), lakin Drd2-EGFP-pozitiv neyronlarda (Əncir 3 b və d).
Dendritik sümüklərin morfologiyası onların uzunluğu və baş belinin genişliyi baxımından dəyişir. Bu səbəbdən, 2WD-də kokaindən dörd məlumat (dırmaşan, göbələk, nazik və filopodiya) olan dendritik protrusionları təsvir etdik (məlumat göstərilməyib). Göbələk tipli sıxlığı (119.7 ± 4.0%, P <0.01) və nazik tikanlar (120.0 ± 3.4%, P Drd0.01-EGFP-pozitiv MSN-lərdə kokain müalicəsi ilə <1) artır, göbək sıxlığı isə (182.4 ± 21.6%, P <0.05) və göbələk tikanları (122.5 ± 5.0%, P Drd0.01-EGFP-pozitiv MSN-lərdə <2) artmışdır. Drd1-EGFP-pozitiv neyronlarda və ya Drd2-EGFP-pozitiv neyronlarda nazik onurğa sütunlarında ciddi artım olmamışdır.
Xroniki Kokain, NAcc'ta Drd1-EGFP- və ya Drd2-EGFP-Pozitif MSN'lerdeki ΔFosB İfadesini indükler.
ΔFosB Fos ailəsinin transkripsiya faktorlarının üzvüdür. Kokainin kəskin idarəsi NAcc'ta bir neçə Fos izoformunun sürətli və müvəqqəti induksiyasını yaradır, kokainə təkrar məruz qalma ΔFosB səviyyəsini artırır. Bundan başqa, ΔFosB ifadəsinin artması NAcc-də dərmana məruz qalmasının dayandırılmasından sonra həftələrə qədər davam edir və dərmanın dərhal aradan qaldırılmasından sonra da gen ifadəsinin uzunmüddətli tənzimlənməsi ilə məşğul olmağı təklif edir (29, 39, 40).
Kokain müalicəsinin ardından Drd1-EGFP ya da Drd2-EGFP siçanlarından NAcc'ta ΔFosB'nin indüksiyonunu incelemek üçün FosB ve GFP ifadesini cüt etiketleme (Əncir 4 və Cədvəl 1) Anti-FosB antikoru bütün FosB formalarını tanıyır, lakin artmış immünostainin ΔFosB (bkz. metodika müzakirə üçün). Şoranla müalicə edilən siçanlarda, Drd16-EGFP-pozitiv nöronların 1% və Drd15-EGFP-pozitiv nöronların 2% nisbətən zəif intensivliyi ilə FosB immunoreaktivliyini ifadə etdilər (Əncir 4 a və b və Cədvəl 1). 2WD tərəfindən təqib edilən təkrarlanan kokain müalicəsi, ΔFosB (GNPX-pozitiv nöronların 1% -i) ilə əlaqəli olan Drd55-EGFP pozitiv nöronların sayının əhəmiyyətli dərəcədə artmasına gətirib çıxardıƏncir 4c və Cədvəl 1). Drd2-EGFP-pozitiv nöronlarda (GNPX-pozitiv nöronların 25% -i) ΔFosB ifadəsində kiçik, lakin hələ də əhəmiyyətli artım aşkar edilmişdir (Əncir 4d və Cədvəl 1). Omuz sıxlığında dəyişikliklər olduğu kimi, ΔFosB'nin artan ifadəsi Drd1-EGFP-pozitiv nöronlarda (GNPX-pozitiv nöronların 46% -i), lakin Drd2-EGFP-pozitiv nöronlarda (GFP pozitiv nöronların 15% -i) 30WD (Əncir 4 e və f və Cədvəl 1). Qeyd edək ki, artan ΔFosB ifadəsi Əncir 4f Drd2-EGFP-mənfi nöronlarda mövcuddur.
Müzakirə
Dopaminergik nörotransmissiondə uzunmüddətli uyğunlaşma psixostimulyant preparatlarla əlaqəli asılılıqlı davranışlara əsaslanır. Xüsusilə, NAcc'teki MSN'lerin dendritik omurga sıxlığında psikostimülan neden olan artışlar, sinaptik bağlantının yeniden yapılandırılması30). NAcc əsasən, D1 və ya D2 dopamin reseptorlarının yüksək səviyyələrini ifadə edən MSN-lərin iki fərqli subpopulyasiyasından ibarətdir. Bu çalışmada, xroniki kokain müalicəsi sonrasında NAcc'ta fərqli D1 və ya D2 reseptörlü olan MSN'lerde bel yoğunluğunu analiz etdik. Alınan sonuçlar, artmış omurga sıxlığının başlangıçta D1 reseptör içeren MSN ve D2 reseptör içeren MSN'lerde meydana gelmesine rağmen, değişen omurga yoğunluğu sadece D1-reseptör içeren nöronlarda sabit kalmaktadır. Bundan başqa, biz D1 və D2 reseptoru olan MSN-lərdə transkripsiya faktorunun ΔFosB ifadəsindəki oxşar dəyişiklik nümunəsini tapırıq.
Bu işlər D1 və ya D2 reseptor promoterinin nəzarəti altında MSN-lərin xüsusi subpopulyasiyalarında GFP-i ifadə edən BAC transgenik siçanlardan istifadə etmişdir. Bundan başqa, biz DiFi istifadə nöronların ballistik etiket ilə GFP üçün immunohistokimya birləşdirən bir cüt etiketləmə metodu inkişaf etmişdir. Əvvəlki tədqiqatlar psixostimulyantların ürək sıxlığına təsirini təhlil etmək üçün Golgi-Cox metodundan istifadə etmişdir (34) və burada istifadə olunan DiI metodu kəmiyyətlə müqayisə edilə bilən nəticələr verdi. Biz Golgi boyama immunohistokimya ilə uyğun deyil, çünki ikili etiketləmə metodu inkişaf etdirdik. İmmünostainasiya adətən deterjanlarla toxuma permeabilisiyası tələb edir, adətən lipofil rənglərinin membrandan həll edilməsinə gətirib çıxaran prosesdir (38). Halbuki, mövcud tədqiqatlarda GFP immunostainqi toxuma permeabilisiyası üçün yüksək miqdarda deterjan konsentrasiyası tələb etməmişdir və lipofil rəngli boya etiketləri ilə birlikdə istifadə edilə bilər. Bizim ikili etiketləmə üsulu ümumiyyətlə dendritik spinlərdə struktur dəyişikliklərinin öyrənilməsi üçün faydalı olmalıdır, məsələn, GFP korteksdə neyronların xüsusi populyasiyalarında ifadə olunan BAC transgenik siçan xətlərinin təhlili üçün istifadə olunduqda36).
Hələ hələ bir qədər mübahisəli olsa da, D1 və D2 reseptorlarının əsasən anatomik olaraq birbaşa (striatonigral) və indirekt (striatopallidal) striatal proyeksiya nöronlarına ayrılmış olduğuna inanılır17, 41). Drd1-EGFP və Drd2-EGFP siçanlarında GFP-nin lokallaşdırılmasının ilkin xarakteristikası bu nəticəyə (36). Bundan əlavə, Drcc1-EGFP və Drd2-EGFP siçanlarından NAcc-da NAF-də olan GFP-pozitiv nöronların sayının analizi, ≈50% -i MSN-in yalnız D1 reseptorlarını ifadə etdiyini, ≈ 35-40% yalnız D2 reseptorlarını ifadə etdiyini, və ≈10-15% həm D1, həm də D2 reseptorlarını birləşdirir. Qarışıqlığın bu dəyəri, mRNA-ları (≈17% enkephalin və P maddəsinin coaxpressioni) və RT-PCR üsulları ilə tək striatal nöronların patch-kelepçe analizini birləşdirən dorsal striatumun tədqiqatları ilə bənzərdir42). Qeyd edək ki, mövcud tədqiqatlar D3, D4 və D5 reseptorlarının ifadəsi məsələsini həll etmir və onlar MSN-də yüksək səviyyəli D1 reseptorlarını əks etdirən D2 reseptorlarının ifadə səviyyəsinin aşağı səviyyədə olması məsələsini həll etmir.
Bir neçə əvvəlki tədqiqatlar psevdostimulyant səbəbli Fos ifadəsinin nöronal lokalizasiyası və D1 və D2 reseptorlarının rolu (43-45). Bu tədqiqatlar Fos və ΔFosB induksiyasının D1 reseptorlarının aktivləşdirilməsi vasitəsi olduğuna dair qənaətə gəldi. Fos ifadəsinin hücum lokalizasiyasına psixostimulyativ dərmanların tətbiq edildiyi ekoloji kontekstdən təsirlənir (46, 47). Məsələn, ev qəfəsində verilən amfetamin və ya kokain dərhal erkən genləri (Fos daxil olmaqla) D1 reseptorlarını coexpress edən P-pozitiv hüceyrələrdə üstünlük təşkil edir. Əksinə, bu dərmanlar yeni bir mühitdə tətbiq edildikdən sonra D1 və D2 reseptorları olan MSN-lərdə Fos ifadəsini yarada bilər. Bizim hazırladığımız tədqiqatlarda istifadə edilən protokol yeni bir mühitə məruz qaldıqda narkotik maddənin cütləşməsini ehtiva etməmişdir. Bununla belə, D2 reseptorunda olan MSN'lərdə ΔFosB ifadəsindən məsul olan bir növ kontekstə bağlı stresi istisna etmirik.
Bugünkü nəticələrin diqqətəlayiq bir xüsusiyyəti artmış omurluq sıxlığı və ΔFosB ifadəsinin paralel nümunəsidir. Artan omurilik sıxlığı və ΔFosB ifadəsi başlanğıcda MSN-də Drd1-EGFP və Drd2-EGFP ifadə edir. Lakin, bu dəyişikliklər yalnız D1 reseptorları olan neyronlarda sabit idi. D2 reseptor ehtiva edən nöronlarda artan omurum sıxlığının və ΔFosB ifadəinin müvəqqəti olaraq tapıldığının müşahidəsi üçün mümkün bir izah bu, həm də D1 və D2 dopamin reseptorlarını birləşdirən MSN-lərin kiçik bir hissəsində meydana gəldiyidir. Beləliklə, bu artımların keçid təbiəti D2 reseptor aktivasiyasının D1-bağımlı sinyal yolları üzərində antaqonistik təsirləri ilə əlaqələndirilə bilər (48). Göz damarlarının sıxlığı və ΔFosB ifadəsində dəyişikliklər D2 reseptoruna bağlı sinyal yollarının ΔFosB-nin sabitliyinə təsir göstərə biləcəyini əks etdirən reversibildir.
ΔFosB və bel yoğunluğunun ifadəsində paralel dəyişikliklərin olduğunu müşahidə edən ΔFosB, NAcc'teki D1 reseptor ehtiva edən nöronlarda dendritik spinlərin ilkin formalaşmasında və sonradan saxlanılmasında iştirak etdiyi fikri ilə uyğun gəlir. ΔFosB ifadəsi MSN'lərdə D1 / DARPP-32 / PP1-bağımlı sinyalizasiya yolu ilə idarə olunur (49). Bir neçə tədqiqat göstərir ki, ΔFosB psostimetrik təsirlərin ödüllendirici və lokomotor aktivləşdirən hərəkətlərində mühüm rol oynayır39), ehtimal ki, nörotransmiter reseptorlarını, sinyalizasiya zülallarını və nöronal morfologiyanın tənzimlənməsində iştirak edən zülalları ehtiva edən çoxlu genlərin ifadə edilməsinə təsir edərək50). Ancaq kronik kokainin meydana gətirdiyi omurgada meydana gələn xüsusi molekulyar mexanizmlər hələ bilinmir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, Cdk5 inhibitoru roscovitinin intraaccumbal infuziyası bel yoğunluğunda zəifləmiş kokain səbəbli artım (51). Bundan başqa, Cdk5 ΔFosB üçün aşağı bir hədəf genidir və kronik kokain müalicəsi ilə əlaqəli kompensativ adaptiv dəyişikliklərə (52). Buna görə də, Cdk5-asılı fosforilasyonda dəyişiklik kokain-induksiyalı omurun formalaşması və / və ya ürək sabitliyinə əsaslanan məqbul mexanizmdir. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55) və spinofilin (56) Cdk5 üçün substratlardır və hamısı omba morfogenezinin tənzimlənməsində iştirak edir (57-60). Bu və digər Cdk5 substratlarının daha spesifik olaraq daha xarakterizə edilməsi ümid edir ki, psixotimulantlar tərəfindən bel ürəklərinin formalaşmasında tənzimlənən mexanizmlərə işıq tutacaqdır.
metodika
Heyvanlar.
D1 və ya D2 dopamin reseptorlarının nəzarəti altında EGFP transgeni daşıyan siçanlar Gensat BAC transgen layihəsi (36). Bu işdə istifadə olunan transgenik siçanlar 4-5 həftəlik idi və İsveçrə-Webster fonunda idi. Siçanlar bir 12: 12-h işıqlı / qaranlıq dövrədə saxlanılır və 2-5 qruplarında yerləşdirilib və ərzaq və su mövcud ad libitum. Bütün heyvan protokolları Laboratoriya Heyvanlarının Qulluq və İstifadəsi üzrə Səhiyyə Milli İnstitutu ilə uyğunlaşdırılıb və Rockefeller Universitetinin Heyvan Qulluq və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edildi.
Dərman müalicəsi.
Xroniki kokain müalicəsi (gündəlik 30 mg / kq), həm də sıxlıqdan olan NAcc nüvəsi və kabuğunda MSN'lerin bel yoğunluğunda sağlam bir artım meydana gətirəcəyi bildirildi, lakin daha az doz (15 mg / kg) təkcə spin yoğunluğunu artırdı qabıq (61). Buna görə də NAcc'ın hər iki hissəsində struktur dəyişikliyini stimullaşdırmaq üçün daha yüksək dozada kokain istifadə etdik. Siçanlar 30 ardıcıl günlər üçün 5 mg / kq kokain-HCl (və ya salin) bir gündə bir injection (ip) aldılar, sonra 2 injection-free günlər və bu prosedur ardıcıl həftə 4 üçün təkrarlandı. Enjeksiyonlar ev qəfəsində aparıldı. 2WD və ya 30WD, siçan beyinləri DiI etiketleme və / və ya immunohistokimya üçün işlənmişdir.
Flüoresan Dye DiI ilə Ballistik Etiketleme.
Siçanlar 80 mq / kq natrium pentobarbital ilə anesteziyaya məruz qaldılar və 5 ml PBS ilə transcardial olaraq perfüze edildi, sonra PBS (40 ml / dəq) olan 4 ml 20% paraformaldehid ilə sürətli perfuziya izlədi. Braunlar tezdən kəllədən çıxarılmış və 4% paraformaldehiddə 10 dəq. Brain dilimləri (100 μm) ref şəklində təsvir edilən fluoressensial DiI (Molecular Probes) ballistik çatdırılması ilə etiketlənmişdir. 38. Birləşən DiI etiketleme-immunohistokimya üsulu, az miqdarda deterjan konsentrasiyası ilə hazırlanmışdır. DiI-etiketli bölmələr, 0.01 dəqiqə üçün PBS-də 100% Triton X-15 ilə permeabilize edilmişdir və 0.01% XnumX% Triton X-100 və 10% 1% normal keçi serumunun PBS-də 1 h üçün nonspesifik etiketləri minimuma endirmək üçün inkubasiya edilmişdir. 0.01% normal keçi serumu / 100% Triton X-2 və anti-GFP antikoru (Abcam, Cambridge, MA) ilə oda sıcaklığında 1 h üçün inkübe edilmiş, yıkanmış və 1,000: XNUMX dilimində FITC- konjuge orta antikor (Molekulyar Problar). Bölmələr mikroskop slaydlarına yerləşdirilib və montaj vasitəsi ilə örtülmüşdür. Balistik etiketləmə üsulu, dendritik ürək quruluşunun ətraflı analizinə icazə verildi və əldə edilən nəticələr, əvvəlki araşdırmalarla keyfiyyətcə və kəmiyyətlə müqayisə edilərək, sümük beyin dilimində Golgi-Cox emprenye üsulu34). Əvvəlki tədqiqatlardan fərqli olaraq, di-lekeli nöronlarda iki başlı hörümçək halları nadir hallarda müşahidə olunurdu. Bu fərq, sümük toxuması (sümük toxuması) və siçanın (bu işin) dəyişkənliyinə həssaslıq gətirə bilər.34).
İmmunohistokimya.
Heyvanlar yuxarıda göstərildiyi kimi boşaldılar və perfüze edildi. Xainum 4% paraformaldehiddə 4 ° C səviyyəsində bir gecədə qaldırıldı və saxlanıldı. Brains, cryoprotection üçün PBS həllində 30% sukroza köçürüldü. Coronal bölmələr (12 μm) bir dondurma mikrotomunda (Leica) kəsilmiş və immunohistokimya üçün işlənmişdir. Beyin bölmələri daha sonra 0.3-də 100% Triton X-15-də PBS-də 10 dəqiqə üçün permeabilize edilmiş və PBS-də iki dəfə durulanmışdır. 1-da 37 h normal keçi serumunda 1 h-da 4 ° C səviyyəsində 1% normal keçi serumunda xNUMX ° C'de bir gecədə 37 ° C'de birincil antikorlara məruz qaldı (PBS-də 48% normal keçi serumda seyreltildi), sonra PBS ilə durulandı və orta 1-da 500 ° C-də antikorlar. Aşağıdakı antikorlar istifadə edilmişdir: dovşan anti-pan-FosB (SC-488, XNUMX: XNUMX, Santa Cruz Biotexnologiya), siçan anti-NeuN (Chemicon), dovşan anti-GFP, FITC-konjuge anti-rabbit IgG və rodamin- Konjuge anti-mouse IgG (Molekulyar Problar). Üçlü etiketləmə (ΔFosB, NeuN və GFP) üçün beyin bölmələri əvvəlcə anti-pan FosB antikoru və anti-NeuN antikoru ilə immunostained edilmişdir və sonra ikincil antikorlar (rhodamine-konjuge anti-rabbit IgG və cyan-konjuge anti-mouse IgG ). Zenon etiketleme texnologiyası (Zenon Alexa Fluor XNUMX, Molecular Probes) istifadə edərək, GFP immunostaining üçün ikiqat örtülü beyin bölmələri də işlənmişdir. Anti-pan-FosB antikoru FosB-nin N-terminalına qaldırıldı və ΔFosB və tam uzunluqlu FosB (62). Xroniki kokain müalicəsindən sonra FosB və FosB ya da digər Fos ilə əlaqəli antigenlərin sabit olduğunu ifadə edən əvvəlki tədqiqatlara əsasən, immunoreaktivliyin uzunmüddətli artımı ΔFosB-nin sabit ifadəsini əks etdirir. Lakin, salin ilə müalicə edilən siçanlarda müşahidə edilən immunoreaktiv FosB siqnalının şəxsiyyəti bilinmir. Statistik analiz Cədvəl 1 Tələbə istifadə etdi t test.
Dendritik Spin Analizi.
NAcc'teki fərdi MSN'ler bir neçə kriterlere dayanan omurga analizleri üçün seçildi. (i) Müxtəlif hüceyrələrdən olan proseslərin qarışıq olmasını təmin etmək üçün başqa etiketli hüceyrələrlə minimal və ya üst-üstə düşməmişdi. (ii) Hüceyrələrin təhlili üçün istifadə edilməsi üçün ən azı üç əsas dendritin görünməsi lazım idi. (iii) Distal dendritlər (terminal dendritlər və ya terminal dendritə yaxın) müayinə edildi. NAcc-in nüvəsindəki və qabığındakı hər iki MSN-dən dendritlər analiz edildi. Seyrək iplikli MSN-ləri (tikanlı tip II) müşahidə etsək də, yalnız sıx iplikli MSN-ləri (tikanlı tip I) analiz etdik. Onurğa sıxlığını hesablamaq üçün dendritin uzunluğu (> 20 μm uzunluğunda) yağ daldırma lensi (× 510) ilə konfokal mikroskop (Zeiss LSM 40) istifadə edilərək izlənildi. Dendritlərin bütün görüntüləri fərqli çəkilmişdir z Dendritik spinlerin morfologiyasını araşdırmaq üçün (0.5-1 μm dərinliyi aralıklarla). Bütün ölçülər metamorf təsvir analiz proqramı (Universal Imaging, Downingtown, PA) ilə hazırlanmışdır. Statistik analiz Kolmogorov-Smirnov testindən istifadə etmişdir.
Dendritlərdən gələn protruslar refsdə təsvir olunduğu kimi uzunluqlarına əsasən dörd növə bölünmüşdür. 63 və 64. Kök çıxıntılar adlanan 1-ci sinif çıxıntıları uzunluğu <0.5 μm idi, onurğa başı böyük deyildi və boynu görünmürdü; sinif 2 və ya göbələk formalı tikanlar 0.5 ilə 1.25 μm arasında idi və qısa boyun və böyük onurğa başı ilə xarakterizə olunurdu; sinif 3 və ya nazik tikanlar, 1.25 ilə 3.0 μm arasında dəyişirdi və kiçik başları ilə uzanan bel boyunlarına sahib idi; sinif 4 və ya filopodial uzantılar, fərqlənən onurğa başı olmayan uzun filament çıxıntılar idi.
Minnətdarlıq
Bu iş ABŞ İctimai Səhiyyə Xidməti Grant DA10044 (PG və ACN) və Simons Fondu, Peter J. Sharp Fondu, Picower Fondu və FM Kirby Fondu tərəfindən dəstəklənmişdir.
İxtisarlar
- NAcc
- nüvə akumbens
- MSN
- orta ölçülü spiny neyron
- BAC
- bakterial süni xromosom
- Drd1
- dpamin qəbuledicisi D1 promoter idarə edir
- Drd2
- dpamin qəbuledicisi D2 promoter idarə edir
- DiI
- 1,1'-diotadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat
- 2WD
- Son narkotik müalicəsindən sonra 2 gün
- 30WD
- Son narkotik müalicəsindən sonra 30 gün.
References
;
