Orbitofrontal korteksdə DeltaFosB induksiyası kokain səbəb olduğu bilişsel disfunksiyanı susdurmasına baxmayaraq lokomotor həssaslaşmayı gücləndirir. (2009)

2. Metodlar

Bütün təcrübələr Laboratuvar Heyvanlarının Qulluq və İstifadəsi üzrə NIH Təlimatına uyğun olaraq həyata keçirilib və UT Southwestern-in Təşkilati Heyvan Təminatı və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edildi.

2.5. MRNA kantifikasiyası

Sıçanlar, AAV-GFP və ya AAV-ΔFosB-in intra-OFC inyeksiyalarını qəbul etdilər, sonra 21 iki dəfə günəbaxan və ya kokain enjeksiyonları ilə davranış təcrübələri üçün izah edildi. Heyvanlar son salin və ya kokain enjeksiyasından sonra 24 h istifadə edildi. Siçovulların kəskinləşməsi ilə öldürüldü. Beyinlər sürətlə çıxarılıb və NAc-ın ikiqat 1 mm qalın 12 gauge punches əldə edildi və dərhal donduruldu və -80 ° C RNT izolyasiya qədər saxlanılır. Bu bölgədə müvəffəqiyyətlə viral mediatlı gen köçürməsini təsdiqləyən DNA mikroarraylı ilə təhlil etmək üçün OFC-dən də zərbələr çıxarılıb (bax (Winstanley et al., 2007) daha ətraflı nəticələr üçün). RNA, istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq RNA Stat-60 reaktifi (Teltest, Houston, TX) istifadə edərək NAc nümunələrindən çıxarılıb. DNT-nin çirkləndirilməsi DNase müalicəsi (DNA-Free, kataloq # 1906, Ambion, Austin TX) ilə çıxarıldı. Rütubətli RNA cDNA-ya (Superscript First Strand Sintezi, Kataloq # 12371-019, Invitrogen) tərs-transkripsiya edilmişdir. Maraqların genləri üçün Transkriptlər Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96-yaxşı termocyclerdə real-time qPCR (SYBR Green, Applied Biosystems, Foster City, CA) istifadə etməklə ölçülmüşdür. Bütün primerler Operon tərəfindən xüsusi sintez edilmişdir (Huntsville, AL; Cədvəl 1 ardıcıllıq üçün) və təcrübələrdən əvvəl doğrusal və spesifiklik üçün təsdiq edilmişdir. Bütün PCR məlumatları aşağıdakı formulata əsasən kokain müalicəsi ilə dəyişdirilməyən qlikeraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) səviyyəsinə normallaşdırılmışdır: ΔC_t =C_t(maraq geni) - C_t (GAPDH). Kokain qəbul edən AAV-ΔFosB və AAV-GFP siçovulların və kronik salinanı alan AAV-ΔFosB siçovulların hər ikisi üçün düzəliş edilmiş ifadə səviyyələri aşağıda göstərilənləri nəzərə almışdır (AAV-GFP qrupu kronik salin): ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (nəzarət qrupu). Sahədə tövsiyə edilən təcrübəyə uyğun olaraq (Livak və Schmittgen, 2001), nəzarətlərə nisbətən ifadə səviyyələri aşağıdakı ifadələrlə hesablanır: 2^-DΔCt.

  

Cədvəl 1

Gerçək vaxtlı PCR vasitəsilə cDNA səviyyələrini kəmiyyətləndirmək üçün primerlərin sırası.

3. Nəticələr

1 sınağı

Xroniki kokain idarəsi ΔFosB tərəfindən mimicked olan kəskin kokainin hiperlokomotor təsirlərinə həssaslıq yaradır

Gözlənildiyi kimi, kronik kokain pozuntusundan sonra nəzarət heyvanlarında güclü lokomotor həssaslaşma müşahidə olunmuş, kokainlə müalicə olunan heyvanlar kəskin kokain probleminə cavab olaraq artmış hiperaktivliyi göstərmişdir (Şəkil 1A, xroniki müalicə: F_1,34 = 4.325, p<0.045). DFosB antaqonisti rolunu oynayan JunD-un dominant bir mənfi mutantı olan ΔJunD-i çox ifadə edən heyvanlar (Zachariou et al., 2006), OFC-də nəzarət heyvanlarından fərqlənənŞəkil 1C, GFP vs ΔJunD, qrup: F_{1, 56} = 1.509, NS). Bununla yanaşı, təkrarlanan şoran iltihabı qəbul edən OFC-də ΔFosB-in ifraz etdiyi heyvanlar "əvvəlcədən həssaslaşmışdır": onlar kronik kokainlə müalicə olunan qarşılıqlı tərəfdarların həssas cavabından fərqlənməyən kəskin kokainə güclü bir lokomotor cavab göstərdilərŞəkil 1B, GFP vs ΔFosB cərrahiyyə × xroniki müalicə: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; OnlyFosB yalnız: xroniki müalicə: F_1,22 = 0.664, NS). ΔFosB heyvanları lokomotor qutulara yerləşdirilən ilk 15 min daxilində bir qədər hiperaktiv idi (GFP vs ΔFosB, cərrahiyyə: F_1,56 = 4.229, p <0.04), lakin lokomotor aktivlik səviyyələri, kokain tətbiqindən 15 dəqiqə əvvəl edilən əməliyyatlarla (əməliyyat: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Əncir 1

Kokain üçün lokomotor həssaslaşdırma. Kəskin kokain kokainlə salinlə qarşılıqlı müalicə edilən nəzarət heyvanlarında (panel A) lokomotor fəaliyyətdə daha çox artım meydana gətirdi. Heyvanları aşkara çıxaran ΔFosB (panel B) təkrarlanan salin verənlərdə (daha çox ...)

5CSRT zamanı kokain verildiyi zaman, eyni heyvanlar, erkən motor hərəkətlərinin qarşısını almaq üçün nisbətən daha güclü bir qabiliyyət göstərdilər, bu hiperaktiviya ambulator lokomozaya xüsusi olaraq görünür, yəni tipik olaraq lokomotor həssaslaşdırma tədqiqatlarında qeyd olunan hərəkət növüdür. Stimulant dərmanlara cavab olaraq inkişaf etmiş bir fəaliyyət bir anksiyogen profil əks etdirə bilər, baxmayaraq ki, ΔFosB'nin intra-OFC aşın ifadəsi yüksək artı labirent və ya açıq sahə testi (göstərilməmiş məlumatlar) istifadə edərək ölçülmüş kimi narahatlığı artırmaz. Heyvanlar, həmçinin, İP müalicəsinə yaxşı alışdılar və salin enjeksiyonları onların bilişsel performansını dəyişdirmədilər (Winstanley et al., 2007), buna görə də bu motor effekti bir IP inyeksiyasına ümumi cavabla bağlı ola bilməz. Xülasə olaraq, bu nəticələr göstərir ki, FDA-nın AİF-də indeksasiyası kokainə qarşı həssaslaşmış lokomotorların cavablandırılması üçün kifayətdir (lakin zəruri deyil), baxmayaraq ki, eyni regionda ΔFosB kokainin motivasiya və dürtüselliyə təsirinə tolerantlıq yaradırWinstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

NAc-da FosB mRNA səviyyələri xroniki narkotik müalicəsi ilə dəyişdirilməyib (Şəkil 2A, dərman: F_1,14 = 1.179, ns) və ya OFC-də ΔFosB ifadəsi (cərrahiyyə: F_{1, 14} = 0.235, ns). Əvvəlki hesabatlara əsasən, ΔFosB səviyyələri kokainlə müalicə olunan heyvanlarda əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (Chen et al., 1997); Şəkil 2B, dərman: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Maraqlıdır ki, şoranla müalicə olunmuş heyvanların NAc-sındakı ΔFosB mRNA miqdarı, bu transkripsiya faktorunun OFC-də çox ifadə olunduğu heyvanlarda daha az idi (dərman: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Bununla birlikdə, bir dərman × cərrahiyyə qarşılıqlı təsirinin olmaması, xroniki kokain müalicəsinin həm AAV-GFP, həm də AAV-ΔFosB ilə müalicə olunan qruplarda eyni təsiri göstərdiyini və ΔFosB səviyyələrini oxşar dərəcədə nisbi olaraq artırdığını göstərir (dərman × əməliyyatı: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Əncir 2

OFC-də ya GFP və ya ΔFosB-dən artıq heyvanların NAc-da mRNA-da dəyişikliklər və ya salin və ya kokainlə xroniki olaraq müalicə olunur. Verilərdə ifadə dəyərlərinin bir nisbəti kimi ifadəsində linear qat dəyişiklikləri göstərilir. Göstərilən məlumatlar (daha çox ...)

4. Müzakirə

Burada biz ≥FosB'nin, OFC həssaslaşmış sıçanlarda kronik kokain tətbiqinin hərəkətlərinə uyğundur, kokainin lokomotor stimulant hərəkətlərinə çox ifadə etdiyini göstərir. Daha əvvəl göstərmişdik ki, eyni heyvanların 5CSRT və gecikmə-diskontlaşdırma paradiqmalarına təsirləri kəskin kokaindən daha az təsirlənmişdir və təkrarlanan kokain pozuntularına bənzər bir tolerantlıq təsiri müşahidə olunur. Beləliklə, eyni heyvanlarda, həmin eyni beyin bölgəsində fəaliyyət göstərən eyni molekul, ΔFosB vasitəsilə vasitəçiliyi ilə eyni heyvanlarda kokainin müxtəlif hərəkətlərinə həssaslıq və tolerantlıq müşahidə edilə bilər. Hər iki hadisənin eyni zamanda bir ciyokokortik lokusda kokain hərəkətlərindən birini təqlid etməklə birləşdirilə bilməsi faktiki olaraq kortik bölgələrin xroniki narkotik qəbulunun sekelində əhəmiyyətini vurğulayır. Bundan əlavə, bu məlumatlar tolerantlıq və həssaslığın yaranmasına səbəb olan narkotik maddələrin reaksiyasına qarşı görünən iki ziddiyyətli, lakin çox yaxından əlaqəli aspektləri əks etdirdiyini göstərir.

NAc-da artan ΔFosB ifadəsinin lokomotor həssaslaşmanın inkişafında kritik şəkildə iştirak etdiyini nəzərə alsaq, ONC-də ΔFosB-nin aşkara çıxarılması heyvanların NAc-də ΔFosB səviyyəsini artıraraq heyvanları kokainə həssaslaşdıracağını göstərirdi. Buna baxmayaraq, tərs nəticə tapıldı: NAc-da ΔFosB səviyyələri OFC-də ΔFosB üzərində ifraz edən heyvanlarda əhəmiyyətli dərəcədə aşağıdır. NAc ΔFosB-də bu azalmanın davranış nəticələri, ΔFosB-nin bu bölgədə ΔJunD-nin çoxdan ifadə edilməsi yolu ilə hərəkətlərini maneə törətmək kimi şərh etmək çətindir, çünki siçanlarda çoxlu kokain effekti azalır (Peakman et al., 2003). Bu müşahidələr və dopamin sisteminə istinad edilənlər arasında müəyyən paralellər mövcuddur. Məsələn, NAc-dəki partial dopamin tükənməsi bu bölgədə dopamin agonistlərinin tətbiqini yönəldən hiperaktivliyə səbəb ola bilər (Bachtell və digərləri, 2005; Costall və digərləri, 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Eyni şəkildə, ΔFosB'nin kortikal səviyyəsinin artmasının subkortikal ifadəni azalda bilməsi faktoru, prefrontal dopaminerjik ötürülmənin artımının striatal dopamin səviyyələrində qarşılıqlı azalma ilə müşayiət edildiyini yaxşı müəyyənləşdirmişdir (Deutch et al., 1990; Mitchell və Gratton, 1992). Daxili hücresel sinyalizasiya molekulları üçün belə bir geribildirim mexanizmi işə yaramadıqda hazırda qeyri-müəyyəndir, lakin gen transkripsiyasının dəyişməsi nəticəsində müəyyən nöronal şəbəkələrin ümumi fəaliyyətində dəyişiklikləri əks etdirə bilər. Məsələn, OFC-də ΔFosB artan lokal inhibitor fəaliyyətin yüksəlməsinə gətirib çıxarır, çünki GABA səviyyəsinin artması_A reseptor, mGluR5 reseptoru və mikroorray analizi ilə aşkar edilən maddə PWinstanley et al., 2007). OFC fəaliyyətində bu dəyişiklik daha sonra digər beyin sahələrində fəaliyyətə təsir göstərə bilər və bu da ΔFosB ifadəsində lokal dəyişikliyə səbəb ola bilər. ΔFosB səviyyəsinin dopamin aktivliyindəki nisbi dəyişiklikləri əks etdirməməsi daha da istintaqa zəmanət verən bir məsələdir.

Xroniki kokain müalicəsi sonrasında bütün heyvanlar NAc-da ΔFosB mRNA səviyyələrində əhəmiyyətli bir artım göstərdilər, artan protein səviyyəsinin əvvəlki hesabatlarınaChen et al., 1997; Hope və digərləri, 1992; Nye və digərləri, 1995). Bununla yanaşı, yaxın bir hesabat ΔFosB mRNA səviyyəsinin xronik amfetamin müalicəsindən sonra artıq xNUMX h səviyyəsinin artmamasına baxmayaraq, son inyeksiyadan (24 h)Alibhai et al., 2007). Bu uyğunsuzluq, istifadə edilən psistostimulyant dərman (kokain vs amfetamin) fərqindən qaynaqlanır, lakin kokainin daha qısa yarım ömrünü nəzərə alsaq, gen ifadəsinə təsirləri amfetamindən daha sürətli normalləşəcəkdir, əksinə əksinə deyil. Bu fərqli nəticələr üçün daha məqbul bir səbəb, 21 gün üçün bir yüksək doz enjeksiyasına nisbətən 7 gün üçün gündəlik olaraq iki dəfə orta dozalı dərman ilə cari tədqiqatın heyvanlara cəlb edilməsidirAlibhai et al., 2007). Müalicənin daha uzadılmış rejimi burada müşahidə olunan daha dəqiq dəyişikliklərə səbəb ola bilərdi.

Kronik kokain sonrası NAc daxilində müşahidə olunan gen ifadəsində meydana çıxan dəyişikliklər daha əvvəl bildirilən bulgularla ümumi razılığa gəlsə də, təsirlərin böyüklüyü bu araşdırmada daha kiçikdir. Bunun bir potensial səbəbi heyvanların son kokain enjeksiyasından sonra yalnız 24 h qurbanı olub, araşdırmaların əksəriyyəti isə son narkotik dərmandan iki həftə sonra toxumadan istifadə etmişdir. Lokomotor həssaslaşmanın gedişatını tədqiq edən tədqiqatlar göstərir ki, bu sonrakı nöqtədə həm davranış, həm də gen / protein ifadəsində daha çox dəyişikliklər müşahidə edilir. Dopamin D üçün mRNA'da bir az artım olduğunu bildiririk₂ NAc-da reseptor, ümumi konsensus, D.₂ və ya D₁ reseptor lokomotor həssaslaşmanın inkişafından sonra daimi olaraq dəyişdirilmir, baxmayaraq ki, həm də D-də artım və azalma olur₂ reseptor sayı, həssaslaşdırma rejiminin bitməsindən bir qədər qısa müddətdə bildirilmişdir (bax.Pierce və Kalivas, 1997) müzakirə üçün). GluR1 və GluR2 mRNA'nın bu erkən dövrdə kronik kokain müalicəsi sonrasında dəyişməz olduğuna dair müşahidələrimiz əvvəlki hesabata uyğun olaraq (Fitzgerald və digərləri, 1996), baxmayaraq ki, GluR1 mRNA'sında artım xroniki psixostimulyasiya müalicəsinin kəsilməsindən sonra sonrakı zaman nöqtələrində aşkar edilmişdir (baxmayaraq ki,Churchill və digərləri, 1999).

Lakin kokainlə xroniki olaraq müalicə edilən heyvanların NAc-də PSD95 mRNA-nın kiçik bir artımını müşahidə etdik. PSD95 iskele molekuludur və həyəcanlı sinapsların postsinaptik sıxlığı içərisində olan əsas zülallardan biridir. Sinapsda bir neçə glutamat reseptorunu və əlaqəli siqnal zülallarını bağlayır və PSD95 ifadəsində artımın sinaptik aktivliyin artmasına və sinapslarda glutamat reseptorlarının artımının və stabilləşməsinin artmasına səbəb olurVan Zundert və digərləri, 2004). Lokomotor həssaslaşmanın inkişafında PSD95 üçün bir rol əvvəlcədən təklif edilmişdir (Yao və digərləri, 2004).

Arc ifadəsində artımlar sinaptik fəaliyyətin artması ilə əlaqədardır. Lakin, NAc-da Arc ifadəində artım müşahidə olunduğunda, amfetaminlə enjeksiyondan sonra 50 minKlebaur et al., 2002), məlumatlar göstərir ki, kokainin xroniki idarəsi NAc-da davamlı artım göstərmir, baxmayaraq ki, antidepresant preparatlarla xroniki dozadan sonra 24 hLarsen və digərləri, 2007) və amfetamin (Ujike və digərləri, 2002). Kəskin kokain və amfetamin idarəsindən sonra NAc-da CREB fosforiliyində artım müşahidə olunur (Kano et al., 1995; Konradi və digərləri, 1994; Self et al., 1998), lakin bəlkə də təəccüblü deyil ki, kronik kokain tətbiqindən sonra CREB mRNA-nın artması müşahidə edilməmişdir. CREB yolundan siqnalın dərman preparatının başlanğıc mərhələlərində daha vacib olduğu düşünülür, çünki ΔFosB kimi transkripsiyaya səbəb olan amillər bağımlılığı irəlilədikcə hakim olur (McClung və Nestler, 2003). CREB kokainin mükafatlandırıcı təsiri ilə əlaqələndirilmişdir (baxmayaraq ki,Carlezon və digərləri, 1998), CREB ekspresyonunun artan lokomotor həssaslaşmasına təsir edən heç bir məlumat yoxdur, baxmayaraq ki, CREB endojen dominant mənfi antagonistində, indüklədilən cAMP erkən repressor protein və ya ICER-də viral vasitəçilik artımlar amfetaminin kəskin bir enjeksiyonundanYaşıl et al., 2006).

Xülasə, baxdığımız dərmana bağlı dəyişikliklərin əksəriyyəti ədəbiyyatdan gələn proqnozlarla uyğun olsa da, NAc daxilində gen ifadəsində heç bir dəyişiklik tapa bilməmişik, çünki narkotik maddələri nəzərə alınmış narkotik maddələrdə müşahidə olunan kokainə həssaslaşmış lokomotor reaksiyanı izah edə bilərik intra-OFC AAV-ΔFosB ilə birlikdə. Bu, OFC-də ΔFosB artımının NAc vasitəsilə motor həssaslaşmasına təsir göstərməməsi ehtimalını artırır, baxmayaraq ki, burada tədqiq olunmayan digər bir çox gen ehtimala cəlb edilə bilər. Maddi prefrontal korteksin (mPFC) modulyasiyası striatal fəaliyyəti dəyişə bilər və bununla da psevdostimulyantlara davranışçı həssaslaşmaya kömək edirSteketee, 2003; Steketee və Walsh, 2005), həm də OFC kimi daha çox ventral prefrontal bölgələrin rolu haqqında daha az məlumat verilir. NAc OFC-dən bəzi proqnozlar alır (Berendse və digərləri, 1992). Bununla yanaşı, daha yeni və ətraflı bir iş birbaşa OFC-NAc proqnozlarını çox təsbit etdi: NAc qabığının ən lateral hissəsinin səliqəli etiketlənməsi, OFC'nin lateral və ventrolateral bölgələrinə anteroqrada izləyicinin enjeksiyasından sonra və ən ventral OFC bölgə NAc nüvəsinə minimal proqnozlar göndərir (Schilman et al., 2008). Mərkəzi kaudat-putamen daha sıx innervasyonu qəbul edir. Bu anatomik sübutların işığında, PCR reaksiyalarımızda təhlil edilən NAc toxumasının əksəriyyəti OFC tərəfindən innervasiya edilməyəcəkdi, gen ifadəsində hər hansı bir dəyişikliyin uğurla təsbit ediləcəyinə şansını azaldılardı.

OFC, mPFC, basolateral amigdala (BLA), caudate putamen və subtilamic nucleus (STN) kimi NAc ilə sıx bağlı olan bölgələrə ağır bir layihə edir. OFC-nin dəyişiklikləri NAc-nın bu sahələrdə təsiri ilə dolayı yolla hərəkət edə biləcəyini açıq sualdır. BLA-da fəaliyyətin OFC pozğunluqlarından sonra dəyişdiyini və bu, OFC zədələnməsinin səbəb olduğu geriqalma öyrənmə çatışmazlığına əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərdiyini göstərmişdir (Stalnaker və digərləri, 2007), ancaq NAc kimi sahələrdə hər hansı bir təsirə məruz qalmayacaq. Diqqəti OFC-yə daha sıx bağlı olan və mühərrik nəzarəti ilə bağlı olan digər sahələrə diqqət yetirmək daha məhsuldar ola bilər. STN xüsusilə perspektivli bir hədəfdir, çünki STN və OFC pozğunluqları təkamül və Pavlovyen öyrənilməsinə oxşar təsirlər yaradırBaunez və Robbins, 1997; Chudasama və digərləri, 2003; Uslaner və Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), lakin psikostimulyant səbəb olan lokomotor həssaslaşdırma bu bölgədə c-Fos ifadəsinin artması ilə əlaqədardır (Uslaner və digərləri, 2003). OFC-nin gen ekspozisiyasında dərmana bağlı dəyişikliklərin STN kimi aşağı istiqamətli bölgələrin işləməsinə necə təsir etdiyini araşdırmaq üçün hazırlanmış gələcək təcrübələr təmin edilir. OFC həmçinin ventral tegmental sahəyə kiçik bir proyeksiya göndərir (Geisler və digərləri, 2007), lokomotor həssaslaşmanın inkişafında tənqidi şəkildə iştirak edən bir bölgədir. Bu səbəbdən, OFC-də ΔFosB-nin artıq ifrazı bu yolla lokomotor həssaslaşmaya təsir göstərə bilər.

Kognitif funksiya və lokomotor həssaslaşdırmada dərmanla bağlı dəyişikliklər arasındakı əlaqənin dəqiq təbiəti hələ də açıq deyil və biz indiyə qədər OFC-ə yönəldik. Bu tapıntılar nəzərə alınmaqla, digər beyin bölgələrində lokomotor həssaslaşmanın inkişafı ilə əlaqəli gen ifadəsində dəyişikliklərin əksinə kokainə bilişsel cavab verməyə təsir göstərə bilər. Bağımlılık verici dərmanların tətbiq olunmasından sonra kortikal və subkortikal sahələr arasında qarşılıqlı əlaqəni tədqiq edən təcrübələr, asılı dövlətin necə yaradılıb saxlanıldığına və bu prosesdə həssaslaşdırma və tolerantlıq ilə oynadığı interaktiv rollara yeni bir işıq gətirə bilər.

References