(İNSAN) Xroniki kokainə qarşı davranış və struktur cavablar Nucleus Accumbens Shell (2013) içərisində ΔFosB və Kalsium / Calmodulin-Dependent Protein Kinaz II iştirak edən Feedforward Döngü tələb

Transkripsiya faktoru ΔFosB və beyin zənginləşdirilmiş kalsium / calmodulin qarışıq protein kinaz II (CaMKIIa) kokain və ya digər psixostimulyant narkotik istismarına xroniki məruz qalması nəticəsində nüvəli akumbenslərdə (NAc) endirilirlər ki, burada iki protein də həssas dərman cavablarına vasitəçilik edir . NAF-də AMPA glutamat reseptor ifadəsi və funksiyasını tənzimləyən ΔFosB və CaMKIIα, NAc orta spiny nöronlarda (MSN) dendritik omurma formalaşması və kokainə lokomotor sensitizasiya edilməsinə baxmayaraq, bu molekulların arasında birbaşa əlaqə yoxdur. Burada ΔFosB'nin CaMKIIα tərəfindən protein-stabilləşdirici SerxNUMX-də fosforilatlı olduğunu və CaMKII'nin kakainin vasitəçiliyi ilə ΔFosB yığması üçün zəruri NAc.

Əksinə, biz ΔFosB'nin in vivo CaMKIIα gen ifadəsinin kokain induksiyası üçün lazımlı və lazımlı olduğunu göstəririk, D üçün seçici təsir₁NAc kabuk alt bölməsində MSN növü.

Bundan başqa, NAc MSN'lərdə dendritik spinlerin induksiyası və NAF'nin ΔFosB ekspresyonu sonrasında kokainə artan davranışla cavab verməsi həm CaMKII asılıdır.

Əhəmiyyətli dərəcədə, biz NAc ildə ΔFosB və CaMKII ilk dəfə indüksiya nümayiş etdiririk insan kokain asılısıgələcək terapevtik müdaxilə üçün mümkün olan hədəfləri təklif edir. Bu məlumatlar ΔFosB və CaMKII'nin xroniki kokainə cavab olaraq beynin mükafat dövriyyəsini tənzimləyən əsas mexanizm kimi bir hüceyrə tipli və beyin bölgəsinə xüsusi müsbət feedforward loop ilə məşğul olduğunu təsbit edir.

giriş

Artan sübutlar gen ifadəsində dəyişikliklərin narkotik maddələrdən asılılıq mexanizmlərinəRobison və Nestler, 2011). Bu dəyişikliklərin bir mühüm vasitəçisi ΔFosB, Fos ailə transkripsiyası faktorudur (Nestler, 2008). Fəlakətin hər hansı bir dərmanının kronik administrasiyası, mükafat davranışları üçün vacib olan limbik bir bölgə olan nucleus accumbens (NAc) 'də uzun müddət davam edən ΔFosB birikimini yaradır. SÜç induksiya D1 dopamin reseptorlarını ifadə edən NAc orta spiny nöron (MSN) sinifinə xüsusi olaraq görünür. Bu D1 tipli NAc MSN-lərdə ΔFosB-nin endiriləcəyi aşırı ekspresyonu kokain və morfinə lokomotor və mükafatlandırıcı cavabları artırır (Kelz və digərləri, 1999; Zachariou et al., 2006), artan kokain özünü idarə etmək (Colby və digərləri, 2003). Bundan başqa, ΔFosB transkripsiyası fəaliyyətinin genetik və ya viral blokadası bu dərmanlarınZachariou et al., 2006), bu ΔFosB'nin davamlı indüksiyonunun NAc-da kronik dərman administrasiyası tərəfindən gətirilən davamlı dəyişikliklərin kritik vasitəçisidir.

ΔFosB'nin qeyri-adi sabitliyi (bütün digər Fos ailə zülallarına nisbətən) həm də tam uzunluğunda FosB-də mövcud olan degron sahələrinin kəsilməsinə görə molekulun daxili xüsusiyyətidirCarle və ark., 2007) və tənzimlənmiş bir prosesdir. ΔFosB fosforilatlıdır vitro və vivo ilə Ser27-də bu reaksiya daha sonra ΔFosB, ~ 10-qat, hüceyrə mədəniyyətində və NAc-da sabitləşir. vivo ilə (Ulery-Reynolds və digərləri, 2009). SerxNUMX-ΔFosB'nin kazein kinaz-27 üçün substrat olduğu göstərilmiş olmasına baxmayaraq vitro (Ulery et al., 2006), onun mexanizmi vivo ilə fosforlaşma hələ də bilinmir.

Kalsium / calmodulin-asılı protein kinaz II (CaMKII) α və β izoformları dodekamerik homo- və hetero-holoenzimlər təşkil edən yüksək səviyyəli serin / treonin kinazdır vivo iləvə nöroplastisiyanın bir çox formaları üçün vacibdir (Lisman və al., 2002; Colbran və Brown, 2004). CaMKIIα, NAc qabığında kronik amfetamin (Loweth və s., 2010NAc qabığında CaMKII fəaliyyətinin farmakoloji blokadası amfetaminə davranışçı həssaslığı azaldır (Loweth və s., 2008) və kokain (Pierce və ark., 1998), bu NAc subregionunda CaMKIIα-nin viral aşırı ekspresyonu amputaminin lokomotor həssaslaşması və özünü idarə etməsini artırır (Loweth və s., 2010). CaMKIIα, AMPA glutamat reseptor alt birimlerinin modulyasiyası vasitəsilə mükafat davranışlarına təsir göstərə bilər (Pierce və ark., 1998CaMKIIα fəaliyyəti AMPA reseptor funksiyası və sinoptik-bir neçə formada nöroplastisiyanınMalinow və Malenka, 2002).

Bu ədəbiyyat ΔFosB və CaMKII arasında bir neçə paralelliyi nümayiş etdirir: hər ikisi də istifadənin çoxlu davranış təsirləri üçün zəruri və kifayətdir, həm də müxtəlif neyronal hüceyrələrdəki dendritik dayanıqları düzəldir vivo ilə (Jourdain və digərləri, 2003; Maze və ark., 2010) və hər ikisi AMPA reseptorlarının modullaşdırılması vasitəsilə onların davranış təsirlərindən ən azı birini tətbiq edirlər (Kelz və digərləri, 1999; Malinow və Malenka, 2002; Vialou və digərləri, 2010). Bu parallellərə baxmayaraq, ΔFosB və CaMKII arasında heç bir funksional əlaqə yoxdur. Burada ΔFosB və CaMKII arasında qarşılıqlı tənzimləməni qururuq və iki proteinin kokain tərəfindən əmələ gələn NAc kabuğunda D1 tipli MSN xüsusi feed-forward döngəsini təşkil etdiyini göstərir və bir sıra kokain reaksiyalarını tənzimləyir vivo ilə.

Get:

Material və metodlar

1-in eksperimenti: NAc Shell və Core kokain müalicəsindən sonra iTRAQ proteomik təhlili (Şəkil 1A)

Yetkinlər (8 həftə) kişi siçovulları yeddi gün ərzində gündə bir dəfə 20 mg / kq kokain və ya salin vasitə İP tətbiq edilmişdir. Sonuncu enjeksiyondan sonra 24 saat, NAc qabığı və nüvəsi mikrodissed edilmişdir (Şəkil 1A) və dondurulmuş flaş. iTRAQ təhlilləri daha əvvəl təsvir edildiRoss və digərləri, 2004; Davalos et al., 2010).

Şəkil 1

CaCKII-nin kokain tərəfindən NAc-də Shell xüsusi induksiyası

2-in eksperimenti: kokain müalicəsindən sonra natrium və qatılıqda zülalın miqdarının müəyyənləşdirilməsiŞəkil 1B-D)

Yetkin (8 həftə) kişi siçovulları lokomotor qeyd kameralarına yeddi gün ərzində gündə bir dəfə 10 mg / kq kokain və ya salin vasitə İP verildi. Daha əvvəl kokainlə ("xroniki" olaraq adlandırılan) və salin ilə müalicə olunanların bir hissəsini ("acute") və tənəffüs yollarına qarşı lokomotor reaksiyalara cavab verən heyvanlara birdəfəlik kokain (5 mg / kg IP) enjeksiyasına cavab verildi tək qalan kronik salin ilə müalicə edilən heyvanlarda ("salin" adlanır) qeyd edildi. Lokomotor aktivlik təhlilləri izah edildiHiroi et al., 1997). Qısaca, 18 "24" PAS açıq yerlikli qeydiyyatdan qutularında (San Diego Instruments) 30 min üçün yerləşdirilən böyüklər üçün kişi siçovulların birinə əlavə bir 30 min üçün bir IP inyeksiyası verilmiş və bir sıra 5 mg / kq kokainin vahid IP inyeksiyası və 30 dəqiqə üçün izlənilir.

24 hr, bu son inyeksiyadan sonra, anesteziyanın nöronal protein səviyyələrinə və fosfor vəziyyətlərinə təsirlərini aradan qaldırmaq üçün siçovulların anesteziya olmadan dekapitasiya edilmişdir. Brains 1.2 mm matrisində (Braintree Scientific) birbaşa dilimlənmiş və hədəf toxuma NAc nüvəsi üçün bir 14 gauge punch istifadə edərək, proteaz (Roche) və fosfataz (Sigma Aldrich) inhibitorları olan fosfat tamponlu salin tərkibində qaldırılmış və qalan bir 12 gauge punch NAc qabığı üçün toxuma (bax Şəkil 1Aquru buzda dərhal dondurulmuşdur. 10 mM Tris bazası, 150 mM sodyum klorid, 1 mM EDTA, 0.1% sodyum dodesil sulfat, 1% Triton X-100, 1% sodyum deoksikolat, pH 7.4, proteaz və fosfataz inhibitorları ilə yüngül sonikasiya ilə homogenləşdirilmiş nümunələr yuxarıda olduğu kimi. Laemmli tamponunun əlavə edilməsindən sonra, proteinlər 4-15% polyacrylamaide gradient jelləri (Criterion System, BioRad) ayrılmış və istehsalçı protokollarına əsasən Odyssey sistemi (Li-Cor) istifadə edərək Western lekeletmə aparılmışdır.

3-in eksperimenti: Kokainin çəkilməsindən sonra natrium və qatılıqda zülalın miqdarıŞəkil 1E)

Yetkinlər (8 həftə) kişi siçovulları yeddi gün ərzində gündə bir dəfə 10 mg / kq kokain və ya salin vasitə İP tətbiq edilmişdir. Son inyeksiyadan 14 gün sonra salin ilə müalicə olunan heyvanlara bir şoran salınması verildi ("salin" adlanır), kokainlə müalicə edilən heyvanlara isə bir salin enjeksiyonu (14 gün çıxarılması və ya "14d WD" adlanır) və ya bir kokain çağırış üçün "14d WD Chal" adlandırıldı). Son bir injectiondan sonra bir saat sonra heyvanlar dekapitasiya edildi və Western blotting də olduğu kimi həyata keçirildi 2 sınağı.

4-in eksperimenti: Kokainin özünü idarə etməsindən sonra, Rat NAc Core və Shell-də zülalın miqdarıŞəkil 2A-C)

Sıçanlar doqquz gün üçün sabit bir nisbətdə 0.5 proqramı çərçivəsində bir saatlıq sessiyalarda 1 mg / kg / kokain infüzyonunu öz-özünə tətbiq etməyə hazır idi. Dokuz bazal seansdan sonra siçovulların son iki sessiyada kokain alınması ilə balanslaşdırılmış iki qrupa bölünmüşdür. Bir qrup siçovulların bir saatlıq kokain (0.5 mg / kq / infuziya) özünü idarə etməsinə bir saat seansda (qısa müddətdə, ŞA) icazə verilirdi, digər qrup isə altı saatlıq siqnallarda özünü idarə edən kokain (uzun müddətli, LgA ) on günə qədər (artım sessiyaları).

Beyin seqmentləri immunohistokimya üçün işlənmişdirPerrotti və digərləri, 2004). Braunlar narkotikə son dərəcə məruz qaldıqdan sonra 18-24 saatdan sonra perfüze edildi və nəticədə bütün qalan immunoreaktivlik ΔFosB əks etdirən hər hansı bir qalsa tam uzunluqlu FosB proteininin parçalanmasına gətirib çıxardı. Bu deqradasiya, ΔFosB (məlumatlar göstərilməyib) tanımır ki, tam uzunluğu FosB C terminus qarşı yönəldilmiş bir antikor ilə əhəmiyyətli bir boyama göstərən Western blotting tərəfindən təsdiq edilmişdir. 35 μm bölmələrə bölündükdən sonra, ΔFosB immunopozitiv hüceyrələrin sayı hər bir sıçanın NAc yolu ilə iki hissədə kor edilmiş müşahidəçi tərəfindən ölçülmüş və hər bir heyvan üçün regiona görə 40 × sahələri üzrə ortalama dəyərlər hesablanmışdır. Hər bir heyvan statistik analiz üçün fərdi müşahidə hesab edilmişdir. Paxinos və Watson (Paxinos və Watson, 2007).

CaMKIIα immünoreaktivliyinin kantifikasiyası təsvir edilən kimi bir Licor sistemi iləCovington və digərləri, 2009). CaMKII və GAPDH-in inteqrasiya olunmuş intensivliyi Odyssey proqram təminatı ilə müəyyən edilmişdir. Nəticələr mm başına intensiv intensivlik dəyərləri kimi təqdim olunur² və vasitələrlə təqdim olunur.n = Qrup başına 4-10). GAPDH üçün dəyərlər dilim qalınlığı və şərtləri üçün CaMKII intensivliyinin normallaşdırılması üçün istinad kimi istifadə edilmişdir.

Şəkil 2

Self-administering siçovulların və insan kokain asılılarının NAc qabığında CaMKII-nin tədqiqi

5-in eksperimenti: kokain-asılı insanlarda kantifikasiya zülal səviyyələri (Şəkil 2D)

Qaydası

Postmortem insan beyninin toxumaları Quebec İntihar Brain Bankından əldə edildi (Douglas Ruh Sağlamlığı Universiteti İnstitutu, Montreal, Quebec, Kanada). Dokuların qorunması, əsasən,Quirion və digərləri, 1987). Qısaca, bir dəfə çıxarılmışdır, beyin bir Styrofoam qutusuna yaş buz üzərində yerləşdirilir və Kvebek İntihar Brain Bankı təsislərinə qaçdı. Hemispheres dərhal beyin ortasında, beyin kök və serebellum bir sagittal cut ilə ayrılır. Qan damarları, pineal bez, koroid pleksusu, yarım beyin sümüyü və yarım beyin kökləri adətən sol yarımkürədən ayrılır və sonra donmadan əvvəl 1 sm qalınlığında koronal olaraq kəsilir. İkinci yarım serebellum dondurmadan əvvəl sagittal olaraq 1cm-qalın dilim kəsilir. 2-metilbütan-40 ° C-də ~ 60 saniyədə toxumalar dondurulmuşdur. Bütün dondurulmuş toxumalar uzun müddətli saxlama üçün -80 ° C-də plastik torbalarda ayrı saxlanılır. Xüsusi beyin bölgələri ətraf mühitin temperatürünü nəzarət etmək üçün quru buz ilə paslanmayan polad bir plitə üzərində dondurulmuş koronal dilimlərdən sökülür. Western Blotting, açıqlandığı kimi icra edildi 2 sınağı.

Cohort

Kohort, 37-3 il arasında yaşa qədər dəyişən 15 kişi və 66 qadın elementlərdən ibarət idi. Bütün subyektlər birdən-birə uzun ömürlü dövlət və uzun müddət tibbi xəstəlik olmadan birdən ölmüşdü. Hər halda, ölüm səbəbi Quebec Coroner ofisi tərəfindən müəyyən edilmişdir və ölüm zamanı dərman və qeyri-qanuni maddə istifadəsi haqqında məlumat əldə etmək üçün doku nümunələri ilə toksikoloji ekranı aparılmışdır. Mövzu qrupu, kokain asılılığına görə SCID-I meyarlarına cavab verən 20 şəxslərdən ibarət idi. Nəzarət qrupu, kokain asılılığından və heç bir əhəmiyyətli psixiatrik diaqnozu olmayan 20 subyektlərindən ibarət idi. Bütün mövzular birdən beyin toxumasına heç bir təsiri olmayan səbəblərdən öldü. Qruplar orta yaş dövrü, soyuducu gecikmə və pH ilə uyğunlaşdırıldı. Bütün fənlər üçün psixoloji otopsiyalar daha əvvəl təsvir edilən kimi həyata keçirilmişdir (Dumais və digərləri, 2005), psixiatrik və tibbi tarix, həmçinin digər müvafiq klinik və sosyodemografik məlumatlar haqqında ətraflı məlumat əldə etmək imkanı verir. Qısaca, təlim keçmiş bir müsahibə icra etdi DSM-IV üçün strukturlaşdırılmış Klinik mübahisə Psixiatrik Bozukluklar (SCID-I) ölənlərin bir və ya daha çox informantı ilə. Klinisyenler qrupu konsensus psixiatrik diaqnoz əldə etmək üçün SCID-I qiymətləndirmələrini, hal bildirişlərini, koroner qeydlərini və tibbi qeydləri nəzərdən keçirdi.

6 eksperimenti: Rat NAc üçün kromatin immunoprecipitation (Şəkil 3A-C)

Yetkinlər (8 həftə) kişi siçovulları yeddi gün ərzində gündə bir dəfə 10 mg / kq kokain və ya salin vasitə İP tətbiq edilmişdir. Sonuncu enjeksiyondan sonra 24 hr, NAc qabığı və nüvəsi mikrodissected edilmişdir. Kromatin immunopresipitasiyası (CHIP) 14 ümumi qruplarında (98 heyvanları ümumi, 7 kokain hovuzları, 7 salin hovuzları) hər qrupda yeddi siçovun qabığının və ya nüvəsinin ikiqat NAc yumrularını birləşdirdi. Toxucular xromatin sonication tərəfindən kəsmə qədər qədər-xNUMX ° C-də çapraz bağlı, yuyulur və saxlanılır. Kesilmiş kromatin əvvəllər maqnetik boncuklara (Dynabeads M-80, Invitrogen) bağlanmış antikorlar ilə inkubasiya edilmişdir. Qeyri-immün IgG nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Geri qarşılıqlı keçid və DNT təmizlənməsindən sonra qPCR CaMKIIα promoter DNT səviyyələrini ölçmək üçün istifadə edilmişdir. Əvvəllər transkripsiyaya başlama sahəsinə (Əvvəlki: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Ters: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA) əvvəl 280 bp olan bir AP-1 konsensus ardıcıllığı olan bölgəni gücləndirmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.

Şəkil 3

CaMKIIa hüceyrə növü və bölgəyə xüsusi ΔFosB induksiyası vivo ilə

7-in eksperimenti: CaMKII transkriptinin və hüceyrə tipli xüsusi ΔFosB oversexpresiyası ilə Protein ifadəsinin ölçülməsi (Şəkil 3D)

Kişi bitransgen siçanlardan əldə edilmişdir NSE-tTA (xətt A) × TetOp-ΔfosB (line 11) və NSE-tTA (line B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (xətt 11) fareler (Chen et al., 1998; Kelz və digərləri, 1999; Werme və ark., 2002; Zachariou et al., 2006) 100 μg / ml doksisiklin üzərində hazırlanarkən ΔFosB ifadəsini basdırmaq üçün hazırlanmış və qaldırılmışdır. Littermates sütun bölünmüş bölündü: yarısı doksisiklin üzərində qaldı və yarısı suya keçdi və heyvanlar 8-dən 11 həftə sonra ΔFosB-nin transkripsiya təsirləri maksimal olduqda (Kelz və digərləri, 1999; McClung və Nestler, 2003). Transkripsiyalı analizlər üçün siçanlar sürətlə kəsilmiş və beyinlər çıxarılmış və buz üzərində yerləşdirilmişdir. NAc-ın ayrılması 14-gauge iynə vuruşu ilə aparılmış və RNT-nin çıxarılmasına qədər quru buzda tez dondurulmuşdur. RNT izolyasiyası, qPCR və məlumat təhlili daha əvvəl təsvir edilənLaPlant və digərləri, 2009). Qısaca RNA TriZol reaktifi (Invitrogen) ilə təcrid olundu, daha sonra Qiagen-dən RNAeasy mikro dəsti ilə təmizləndi və Agilent'in Bioanalyzer ilə keyfiyyətinə nəzarət etdi. Ters transkripsiya iScript (BioRad) istifadə edərək həyata keçirildi. QPCR aşağıdakı dövrü parametrləri ilə tətbiq olunan Biosystems 7900HT RT PCR sistemi ilə həyata keçirildi: 10-da 95 ° C; 40 dəq. 95 ° C 1 dəqiqə, 60 ° C üçün 30 ° C, 72 ° C üçün 30 saniyə; vahid PCR məhsullarının təsdiqlənməsi üçün ayrışma əyriləri yaratmaq üçün 95 ° C dərəcəsi ilə isitmə dərəcəsi. ΔFosB ve CaMKIIα proteinlerinin immunohistokimyasal analizleri, anlatıldığı şekilde gerçekleştirildi 4 sınağı.

8-in eksperimenti: Intra-NAc D1 və D2 Dopamin qəbuledici antagonistlərinin kokain mediatlı zülal dəyişikliklərinə təsiriİncir 3H)

Yetkin (8 həftə) kişi siçovulları 10 mg / kq kokain və ya salin vasitəsi ("vasitə" qrupu) yeddi gündə gündə bir dəfə İP tətbiq edilmişdir. Hər bir kokain enjeksiyasına qədər 30 min əvvəl sıçanlar IP ya D1 reseptor antagonisti SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" qrupu) ya da D2 reseptor antagonisti etiklopridi (0.5 mg / kg, "D2 Ant" qrupu) , ya da şoran nəzarət inyeksiya ("kokain" qrupu). 24 hr son enjeksiyondan sonra, heyvanlar dekapitasiya edildi və zülalların Western blotting 2 sınağı.

9-in eksperimenti: AAV-vasitə ilə ΔFosB oversexpressionin Protein ifadəinə təsiri (Şəkil 4 A-C)

AAV-GFP (yaşıl floresan protein) və ya AAV-GFP-ΔFosB (ya da AAV-GFP-ΔFosB)Maze və ark., 2010). 33 ölçülü iynələr (Hamilton) 0.5 μl təmizlənmiş yüksək titer virusun bir 5 dəqiqə müddətində iki dəfə ikiqat şəkildə infuziya edildiyi, sonra isə əlavə 5 min infuziya sonrası istirahət dövrü üçün istifadə olunmuşdur. Bütün məsafələr Bregma ilə müqayisədə ölçülür: 10 ° açısı, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. Əməliyyatdan 14 gün sonra, ΔFosB overexpresyonunun davranış təsirlərini qiymətləndirmək üçün heyvanlara lokomotor monitorinq otaqlarında 10 mg / kq kokainin vahid IP inyeksiyası verildi. 24 saat sonra bu son injection, siçovulların başına decapitated edilmişdir 2 sınağıvə toxuma mikrodisseksiyası GFP pozitiv NAc toxumasını əldə etmək üçün floresan mikroskopik rəhbərlik altında həyata keçirildi. Western blotting sonra həyata keçirildi 2 sınağı.

Şəkil 4

ΔFosB NAc qabığında kokainlə əlaqəli D1 reseptoruna bağlı CaMKIIα induksiyası üçün zəruri və kifayətdir

10-in eksperimenti: AAV-mediatlaşdırılmış ΔJunD oversexpression-in kokain-asılı Protein ifadəinə təsiri (Şəkil 4 D-F)

AAV-GFP'nin və ya AAV-GFP-ΔJunD'nin stereotaksik enjeksiyonu 8 sınağı. 14 gün sonra əməliyyat zamanı heyvanlar gündə bir dəfə 10 mg / kq kokain və ya salin vasitənin IP-lokomotor qeyd kameralarında tətbiq edildi. Bir kokain (5 mg / kq IP) və ya salin bir tək injection üçün locomotor reaksiya qeyd edildi. 24 saat sonra bu son injection, siçovulların decapitated edilmişdir, toxuma toplanmış və Western blots kimi 9 sınağı.

Experiment 11: Vitro Protein Kinaz Təlimi (Şəkil 5A-D)

Recombinant CaMKIIα və ΔFosB həşərat hüceyrələrindən təmizlənmişdir (Brickey və digərləri, 1990; Jorissen və digərləri, 2007) və protein kinaz təhliliColbran, 1993), daha əvvəl açıqlandığı kimi. Qısaca, CaMKII, ΔFosB, 2.5 mM Ca, 1 μM (və ya göstərilən konsentrasiyası) ilə buz üzərində preincubated edilmişdir²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 μM calmodulin və 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilasyon 200 μM ATP əlavə və ya [γ-³²P] ATP və oda temperaturunda 10 dəqiqə davam etməsinə icazə verildi (Şəkil 5A & B) və ya buz haqqında 2 minŞəkil 5C & D). Məhsullar Western Blotting tərəfindən həll edildi (Şəkil 5A & B) və ya autoradiogram və sintilasyon hesablanması ilə (Şəkil B-D).

Şəkil 5

ΔFosB CaMKIIa üçün güclü substratdır

12 təcrübəsi: Ser27 ΔFosB Fosforilasyonu (Şəkil 5E)

In vitro Kinaz testləri hər birinə görə həyata keçirilmişdir 11 sınağı, zülallar SDS-PAGE ilə ayrıldı və ΔFosB-ə uyğun olan bantlar kəsildi və tandem kütlə spektrometrisinə məruz qaldı. Bütün panellərdə müvafiq ion fraqmentlərinin m / z tapşırıqları ion piklərinin üstündə etiketlənir. Bütün parçalı ionlar kosmik məhdudiyyətlərə görə etiketlənmir. Ümumiyyətlə, parçanın ion etiketləri üçün mətn, birbaşa təsdiq edildikdə və ya fosforilyasiya sahələrinin mövcudluğuna dair sübutlar əlavə edildikdə, istisna olmaqla, qara rənglərlə işlənmişdir. Omurğa parçalanma məhsulları üçün sübutlar, fosforopeptidin birbaşa amin turşu məktubu təsvirləri ilə qırmızı ilə göstərilən fosforiliya qalıqlarının aşkar edilmiş sahəsi ilə ardıcıllıqla hazırlanmasında təqdim olunur. Gözlənilən parçalı ionların ədədi təsviri də b və y ionları kimi peptid sekansında qeyd olunur. M / z oxunun aşağı zəiflikli parçalı ionlarını göstərmək üçün böyümə faktorları hər bir kütlə spektrinin yuxarı hissəsində qeyd olunur. H panelində göstərilən fragment ionları Ser27 fosforli izoformun varlığını təsdiqləyir, lakin Ser28, Ser31, Ser34 və Thr37 saytlarında digər fosforli izoformların qarışığı içərisindədir. Pa5, pa5-P, pb5 və pb5-P ionlarının mövcudluğu Ser27 qalıqlarının fosforiliyini təsdiq edir.

13-in eksperimenti: SerxNUMX fosforiliyasiyasının kəmiyyətlənməsi (İncir 5F)

Standart peptidlər Ser27 ΔFosB-nin fosfonun və qeyri-fosfonun formasını mimikləşdirməklə hazırlanmışdır. Sintez və təmizlənmədən sonra hər bir "ağır" iddiotipik peptid bir 50 / 50 asetonitril / su tamponunda eritildi və sintetik peptid fond həlli üzərində mütləq konsentrasiyası müəyyən etmək üçün amino asit analizi üçün göndərildi. Hər bir "ağır" peptid daha sonra MS / MS parçalanması və iki-dörd MRM keçişi üçün ən yaxşı toqquşma enerjisini müəyyən etmək üçün birbaşa 4000 QTRAP kütlə spektrometresinə (MS) daxil edilmişdir. Daha sonra, peptid ayrılmasını təmin etmək üçün səliqəli "ağır" peptidlər 4000 QTRAP üzərində LCMS-ə məruz qaldı. Qurğu üçqat quadrupole rejimində işləmişdir, Q1 xüsusi öncü m / z dəyərinə (Q1 scanning deyil) və Q3 bu peptidin xüsusi bir hissəsinə uyğun xüsusi m / z dəyərinə təyin olunmuşdur. MRM rejimində, təkrar reaksiyalar seriyası (əvvəlcədən / parçalı ion keçidləri, toqquşma enerjisinin maraq fraqmenti ionlarının intensivliyini optimallaşdırmaq üçün tənzimləndiyi) ardıcıl olaraq ölçüldü və dövr (tipik olaraq 1-2 san) HPLC ayrılmasının bütün vaxtı. MRM keçişləri mövcud peptidlərin MS / MS spektrlərindən müəyyən edilmişdir. Daha sonra yüksək intensivlikli parçalı ionlara cavab verən peptid başına iki keçid seçilib və avtomatlaşdırma proqramı ilə MRM keçişlərinin siqnal gücünü maksimuma çatdırmaq üçün optimallaşdırılan toqquşma enerjisi. Daha sonra, standart peptidlər və CaMKII ya da nəzarətə məruz qalan ΔFosB nümunələrindən meydana gələn zirvələr reaksiya zamanı hər bir peptid şəklinin mütləq bolluğunu müəyyən etmək üçün müqayisə edildi. LC-MRM məlumatlarına dair məlumatlar AB Multiquant 1.1 proqramı ilə həyata keçirilir.

14-in eksperimenti: CaMKII-də aşındırıcı siçanlarda ΔFosB-nin indeksasiyasıŞəkil 5G & H)

T286D CaMKII-ni aşırdıran transgenik siçanlar (Mayford və ark., 1996; Kourrich və digərləri, 2012) və yabanı tipli littermates, transgen ifadəsini təmin etmək üçün doksisiklin olmadığı təqdirdə qaldırıldı. Yetkin siçanlar 20 gün ərzində gündə bir dəfə 14 mg / kq kokain və ya şorafi IP verildi. 24 saat sonra son injection, heyvanlar decapitated və immunohistochemistry və ΔFosB ifadə quantifikasiyası 4 sınağı.

15-in eksperimenti: HSV-mediated ΔFosB Aşqarlaşdırma və CaMKII inhibisyonunun NAc Dendritik SpinesŞəkil 6A-E)

Yetkin kişi siçanları (8 həftə) HSc-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, və ya HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Bu konstruktlarda CaMKII fəaliyyətinin peptid əsaslı inhibitoru olan AC3I, GFP-nin C-terminalına birləşdirilir. GFPAC3I aşağıdakı prensipler ilə bir şablon kimi pMM400-vektorunu istifadə edərək, PCR ilə klonlandı: GFP-AC3I-F: 3 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 5' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (clampBspEIstop). Nəticədə çıxan PCR məhsulu NXI və BspEI saytlarını istifadə edərək p3 + və p1005 + -D FosB vektorlarına yerləşdirildi. Quruluş sıralama ilə təsdiqləndi. Stereotaksik koordinatlar: 1005 ° açısı, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = -1.5 mm (Barrot et al., 4.4). Perfüzyon və beyin bölmələrinə görə 4 sınağı.

Spin analizi, açıqlandığı kimi icra edilmişdir (Christoffel və digərləri, 2011). Qısaca, soma'dan dendritik seqmentlər 50-150 μm uzaqdan GFP ifadə edən HSV-yoluxmuş hüceyrələrdən təsadüfi seçilmişdir. Şəkilləri raybord alqoritm ilə NeuronStudio istifadə edərək morfoloji analiz üçün konfokal LSM 710 (Carl Zeiss) üzərində əldə edilmişdir. NeuronStudio, aşağıda göstərilən dəyərlərə əsasən yivləri nazik, göbələk və ya üfüqi olaraq təsnif edir: (1) aspekt nisbəti, (2) başdan boyun nisbəti və (3) baş diametri. Boyunlu dişlər ya nazik, ya da göbələk kimi təsnif edilə bilər və əhəmiyyətli bir boyunsuz olanlar ürəkli olaraq təsnif edilir. Boyunlu dişlər baş diametrinə əsasən nazik və ya göbələk kimi etiketlənir.

Şəkil 6

CaMKII fəaliyyətinin blokadası NAc-da ΔFosB-nin morfoloji və davranış təsirlərini maneə törədir

16 təcrübəsi: HSV-mediatlı ΔFosB Aşırma və CaMKII inhibisyonunun kokain reaksiyalarına təsiri (İncir 6F)

Yetkin kişi siçanlarına görə viruslara qarşı enjekte edilmişdir 15 sınağı, və bir 5 mg / kg kokain enjeksiyasına qarşı lokomotor reaksiyalar ölçüldü 9 sınağı. Lokomotor məlumatları, kokain enjeksiyonundan sonra 30 dəqiqə ərzində ümumi kirişlər kimi ifadə edilir.

Əlavə məlumat

Heyvanlar üçün yaşayış yerləri

Kişi Sprague Dawley sıçanları (250-275 g, Charles River Laboratories) cüt-evdə idi. Səkkiz həftəlik C57BL / 6J kişi siçanları (The Jackson Laboratory) qəfil başına maksimum beş heyvanın yerləşdiyi qrup idi. Bütün heyvanlar 1 hr yüngül / qaranlıq dövrəyə (23: 25 AM-da işıqlar) yemək imkanı verən ≥ 12 həftə əvvəl sınaqdan manipulyasiya etmədən və iqlimə nəzarət edilən odalarda (7-00 ° C) və su ad libitum. Eksperimental Sinirbilim Dərnəyi və Sinay dağında təşkilati heyvan qayğı və istifadəsi komitəsi (IACUC) qaydalarına uyğun olaraq aparılmışdır.

Narkotiklərlə

Narkotiklərlə müalicə olundu və kokain (siçanlar üçün 5 ml başına 20-10 ml, 1 ml başına 23390 ml, NIDA) və SCH 0.5 ya da etikloprid hidroklorid (1 ml başına 100 / kg, Tocris) daxil olmaqla steril salin, . Stereotaksik cərrahiyyə üçün, siçan steril salin ilə ketamin (xNUMX mg / kq) və xylazine (10 mg / kq) (Henry Schein) bir "kokteyli" ilə anesteziya edilmişdir.

Antikor

CaMKIIα (cəmi): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (ümumi): 5G4, 1: 250 sinyalleri

ΔFosB fosfo-Ser27: Fosfosolutions, 1: 500

GluA1 (ümumi): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistik təhlil

Bütün statistik analizlər Prizma 6 proqram paketindən (GraphPad) istifadə edilmişdir. Şagirdlərin t-testləri bütün cüt-müqayisələr (t dəyərinin verildiyi nəticələrlə göstərilmişdir) üçün istifadə olunmuşdur və bütün bir neçə müqayisə üçün bir istiqamətdə ANOVA istifadə edilmişdir (F dəyərinin verildiyi nəticə bölməsində göstərilmişdir).

Get:

Nəticələr

Xroniki kokain NAc Shell-də CaMKII-ni yaradır

Bir çox tədqiqat göstərir ki, NAc qabığının və nüvəsindəki MSNlər sui-istifadəyə qarşı narkotiklərə xroniki təsir göstərən müxtəlif biokimyəvi və fizioloji reaksiyalara malikdirlər (Kourrich və Tomas, 2009; Loweth və s., 2010) və iki alt bölmənin narkotik maddələr axtaran davranışlarını fərqli olaraq tənzimləməsi (Ito və digərləri, 2004). NAc qabığının protein tərkibinə kokainin diferensial təsirlərini müəyyən etmək vs nüvəsi, Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) və tandem kütlə spektroskopiyası (MS / MS) istifadə etdik. Yetkin kişi sıçanları 20 gündə gündəlik kokain (7 mg / kq) və ya salin ilə İP-ə yoluxmuşlar; Sonuncu enjeksiyondan sonra 24 saat, NAc qabığı və nüvəsi mikrodissed edilmişdir (Şəkil 1A) və dondurulmuş flaş. Bu nümunələrdəki zülallar daha sonra iTRAQ istifadə edərək ölçülmüşdür. Bütün dörd CaMKII izoformu kokain müalicəsindən sonra, NAc kabuğuna xüsusi olan yadına nisbətən ifadə edilən böyük artımları nümayiş etdirdi. Daha əvvəl digər sistemlərdə müxtəlif CaMKII substratlarla əlaqəli olan PP1 katalitik və tənzimləyici alt birləşmələr və PP2A daxil olmaqla bir neçə protein fosfataz (Colbran, 2004), oxşar bir nümunə təqib etdi. Bu tapıntılar CaMKII siqnal yolunun NAc-da kokainlə xüsusi bir qaydada tənzimləndiyi yeni, qərəzsiz sübutlar təqdim etmişdir.

Bu təsiri daha kəmiyyətlə təsdiqləmək üçün biz siçovulların yuxarıda olduğu kimi kokain (müxtəlif dozalarda) və ya bir kokainə (5 mg / kq) və ya salin problem dozasına salin və ölçülmüş lokomotor reaksiya ilə müalicə etdik. 10 mg / kq kokainə təkrar məruz qalma lokomotor həssaslaşmanın tipik nümunəsi ilə nəticələndi (Şəkil 1B). Bu dozaj rejimi ilə aparılan tədqiqatlar göstərir ki, təkrarlanan kokain CaMKIIa'yı seçilmiş şəkildə NAc qabığında 24 hr-də kokainin son injectionundan sonraŞəkil 1C və D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Bundan əlavə, AMPA reseptorunun GluA831 subunitinin SerxNUMX kanonik CaMKII substratının fosforillənməsi CaCKIIa Thr1 autofosforilasyonun güclü olmasına baxmayaraq, NAc qabığında və əsas deyil (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28) yalnız qabıqda indüksiyaya doğru əhəmiyyətli tendensiya (Şəkil 1D). Bir sıra digər glutamat reseptorları təsirlənməmişdi. CaMKII'nin bu tədbirlərindən fərqli olaraq, eyni toxuma nümunələri NAc-in hər iki qabığında ΔFosB'nin (p = 0.0260, F = 4.189, df = 29) və əsas (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) (Şəkil 1C və D), əvvəlki tapıntılara (Perrotti və digərləri, 2008).

AMPA reseptorlarının kokain tənzimləməsinin bir neçə əvvəlki tədqiqatları xronik kokaindən çəkilmədən ~ 14 gün sonra heyvanları təhlil etmişdir (bax. Bax), bu zaman nöqtəsində bu biyokimyəvi analizləri təkrarladıq. Kokainin son injectionundan 14 gün sonra, ΔFosB NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22) səviyyəsində qaldıqda, nə CaMKII nə də GluA1 SerxNUMX-in fosforiliyi artmamışdırŞəkil 1E). Ancaq 1 hr bir 10 mg / kq dozada kokain dozasından sonra ümumi CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) və GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilasyon həm də ilkin xroniki kokain pozuntusundan sonra aşkar olunmuş dərəcəyə oxşar dərəcədə yüksəldilmişdir (Şəkil 1E). Bu məlumatlar, NAc kabuk nöronlarının, CaMKII gen təşviqçisinin birbaşa astarlanması yolu ilə uzun müddət davam edən CaMKII induksiyası üçün asılıdır (bax. Müzakirə bax). Bununla yanaşı, ΔFosB induksiyası CaMKII induksiyasından daha qalıcıdır ki, müzakirədə əks olunduğu kimi, CaMKII-nin tənzimlənməsində "əyləc" edən kromatin-bazlı və ya başqa üsullarla əlavə mexanizmlərin mövcudluğunu nəzərdə tutur.

Bu müşahidələri daha da gücləndirmək üçün biz kokain özünü idarəetmə modellərini tədqiq etmişik. Yetkin kişi siçovullarına kokainə qısa və ya uzun müddətli istifadə imkanı verilmişdir; gözlənildiyi kimi (Ahmed və Koob, 1998), yalnız uzun müddətli şərtlər dərmanın özünü idarə etməsinə səbəb olmuşduŞəkil 2A). ΔFosB uzun müddətə daha çox istifadəyə verildi vs həm də NAc qabığında (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) və əsasda (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17) kokainə qısa daxil olmaq. Əksinə, CaMKIIα NAc kabuğunda yalnız kokaindən uzun bir müddətəŞəkil 2B və C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Orta gündəlik kokain alışını qısa əlçatan heyvanlar (~ 12 mg / kq IV), uzun müddətli heyvanlar (~ 70 mg / kg IV) və eksperimental idarə heyvanlar (10 mg / kq) arasında müqayisə etmək maraqlıdır və Niyə sonuncu ΔFosB və CaMKII-nin möhkəm induksiyasını təmin edərsə, qısa giriş olmadıqlarını soruş. Bu uyğunsuzluq ehtimal ki, peak kokain səviyyələrində fərqliliklər səbəbindən (təcrübəli administrasiya kokain bir çox bolluq IP olaraq verilir, özünü idarə edən kokain çoxlu IV dozalarda verilir) ya da dərmana məruz qalmanın uzunluğundan fərqlənir (eksperiment üçün 7 gün) administrasiya, özünü idarə etmək üçün 19 gün).

Kokain hərəkətində ΔFosB və CaMKII ilə bağlı böyük ədəbiyyata baxmayaraq, insan kokain istifadəçilərində bu zülalların tədqiqi yoxdur. Burada kokainə qarışıq insanlarda NAc-da artımın ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) və CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32)Şəkil 2D, Cədvəl 1). Bu məlumatlar göstərir ki, Kemoterapist NAc-də kokainlə ΔFosB və CaMKII induksiyasını sınağı, insan kokain bağımlılığına klinik olaraq aiddir.

Cədvəl 1

İnsan kokain bağımlılarından və uyğunlaşdırılmış nəzarət qruplarından nümunələrin xarakterizə edilməsi

ΔFosB CaCKII Transkripsiyasını NAc Shell-in D1-tipli MSN-lərində seçici olaraq tənzimləyir

CaMKII və ΔFosB həm kemirgendə NAc-da kokain ilə düzəldilmişdir ki, bizi ΔFosB CaMKII geninin transkripsiyasını tənzimləməyini müəyyənləşdirməyə gətirib çıxardı. Daha əvvəl CaMKIIα'yı ΔFosB üçün mümkün bir hədəf olaraq, NAc-nin qeyri-obyektiv mikroarray analizindəMcClung və Nestler, 2003), lakin bu araşdırma bu işdə daha doğrusu təsdiqlənməmişdir. Əvvəlcə ΔFosB, böyüklər kişi sıçanlarının NAc-da CaMKIIα gen stimulatoruna bərkidiyini və bu cədvəlin kronik kokain tətbiqi ilə, qabığındakı (daha çox) kəmiyyətin artdığını aşkar etmək üçün quantitative ChIP (kChIP-ChIP kantitatif PCR) p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), lakin əsas, subregion (Şəkil 3A). CaMKIIα promoterinə ΔFosB bağlamasında bu subregiona aid xüsusi mexanizmləri daha yaxşı başa düşmək üçün biz bu genomik bölgədə histon modifikasiyalarının vəziyyətini xarakterizə etmək üçün qChIP istifadə etdik. Əvvəllər edilən tədqiqatlarda total mouse NAc (CaMKIIα promoterində H3 asetilinin kokain indüksiyası göstərilmişdirWang et al., 2010). Əksinə, biz kokain CaCKIIα promoterində NAc nüvəsində selektiv olaraq H3 asetiliyini azaldığını gördük (Şəkil 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), ΔFosB bağlanmasının kənarında subregiona xas olan kromatin dəyişiklikləri ilə uyğun olaraq, qabıqda heç bir dəyişiklik yoxdur. Repressiv nişan üçün qChIP, dimethylated H3 lizin 9 (H3K9me2), hem kabuk ve çekirdek alt bölgelerdeki azalma eğilimlerini ortaya çıxardı (Şəkil 3C).

ΔFosB CaMKIIα transkripsiyasını tənzimləyirmi? vivo ilə, xüsusilə D1-da ΔFosB'yi aşağı yönəldici təsir göstərən iki bitransgen siçan xəttindən istifadə etdik vs D2 tipli MSNlər içməli su içərisində doksisiklin administrasiyası tərəfindən nəzarət edilən şəkildəChen et al., 1998; Kelz və digərləri, 1999; Werme və ark., 2002). Yalnız D1 tipli MSN-lərdə ΔFosB-dən az olan böyüklərdəki siçanlarda D0.0337 tipli MSN-lərdə əsasən ΔFosB-dən çox olan siçanlarda görülən bir təsir NAc-da CaMKIIa mRNA səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (p = 1.996; t = 13; df = 2)Şəkil 3D). D1 tipli MSN'lərdə ΔFosB ifadəsi ilə CaMKIIα mRNA'sında artım CaCKIIa proteininin hər iki NAc qabığında (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) və əsasda (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Figs 3E və F). Bu məlumatlar göstərir ki, ΔFosB hər iki subregionda da D1 tipli MSN'lərdə CaMKIIα gen ifadəsini idarə edə bilir. Şəkil 3B CaMKIIα promoterində kokainlə əlaqəli kromatin dəyişmələri (məsələn, azaldılmış asetiliya) ΔFosB kokaindən sonra əsas subregionda CaMKII-ni dəyişməkdən çəkindirir.

Transgenik siçan məlumatlarımız CaMKII gen ekspresyonunun ΔFosB induksiyasının NAc-dakı D1 tipli MSN-lər üçün spesifik olduğunu göstərdiyindən, daha sonra CaMKII-nin kokainə bağlı tənzimlənməsinin D1 dopamin reseptorunun aktivləşdirilməsini tələb edib etmədiyini araşdırmağa çalışdıq. Yetkin kişi siçovullarına əvvəlki kimi xroniki kokain və ya fizioloji maddə tətbiq edildi, lakin hər enjeksiyondan 30 dəqiqə əvvəl, kokain qrupundakı siçovullara salin, D1 antagonisti SCH 23390 (0.5 mg / kg) və ya D2 reseptor antaqonisti etikloprid tətbiq edildi. (0.5 mq / kq). Son kokain enjeksiyasından 24 saat sonra heyvanlar analiz edildi. Western blotting, D1 deyil, D2 antagonistinin əvvəllər bildirildiyi kimi ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18) içindəki kokain vasitəçiliyi artımını tamamilə blokladığını ortaya çıxardı (Nye və digərləri, 1995), həmçinin CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G və H). Bu məlumatlar kokainin NAc kabuğunun D1 tipli MSN-lərində CaMKII gen ekspresyonunda ΔFosB vasitəsi ilə artım göstərdiyini fərz edir. Bu beyin bölgəsində CaMKII ifadəinə bu hüceyrə tipli kokain təsirini birbaşa göstərmək üçün gələcək işlərdə vacib olardı.

ΔFosB həm də NAc Shell-də CaMKII-nin kokain indüksiyası üçün zəruri və kifayətdir

Bitransjenik siçanların istifadəsini tamamlamaq üçün biz əczaçılıq vasitələrində kök hüceyrələrinin köçürülməsi vasitəsi ilə CaMKIIα'nın kokain indüksiyasına vasitəçilik etməkdə ΔFosB rolunu öyrəndik. Adeno ilə əlaqəli viral (AAV) hissəcikləri ikitərəfli olaraq yalnız ΔFosB plus GFP və ya GFP-ni ovsunxpress etmək üçün yetkin kişi siçovullarının NAc qabığına (şüşə seçmə hədəflənə bilər) daxil etdik. Heyvanlara sonra 10 mg / kq kokainin tək bir IP inyüksiyası verildi. ΔFosB / GFP'yi aşırı eksprese eden hayvanlar tek başına GFP'yi aşırı hayvanlara kıyasla artan lokomotor tepki gösterdi (Şəkil 4A). 24 hr bir kokain enjeksiyonundan sonra, GFP pozitiv NAc toxuması bu heyvanlardan fluoresan işıq mənbəyi altında diseksiyonla çıxarıldı. Bu toxumanın Western blotinqi (Şəkil 4B və C) güclü ΔFosB aşırı ekspresyonu və kronik kokain tətbiqi ilə görülən indüksiyaya bənzər GFP heyvanları ilə müqayisədə ümumi CaMKIIa proteinində əhəmiyyətli artım (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30) aşkar etmişdir. Bundan əlavə, CaMKIIa Thr286-də (enzim aktivləşdirmə göstəricisi) CaMKIIa autofosforilasyon CaMKII substratının fosforiliyəsi, GluA0.0330-dən SerxNUMX (p = 2.243; t = 28; df = 831), yenidən kronik kokain hərəkətlərini təqlid edir (Şəkil 1C və D). TAken birlikdə, bu məlumatlar NAc qabığında ΔFosB ifadəsinin kokainə lokomotor həssaslaşması və CaMKII induksiyasına və subregiona aktivləşdirilməsinə yetərli olduğunu sübut edir.

NAc kabuğunda CaMKIIα'nın kokainlə vasitələndirilmiş indüksiyonun üçün ΔFosB'nin də lazım olduğunu müəyyən etmək üçün oxşar bir yanaşma istifadə etdik. AAV, ΔFosB transkripsiya aktivasiyasının mənfi tənzimləyicisi olan ΔJunD adlı kəsilmiş JunD proteininiWinstanley et al., 2007) yalnız GFP və ya GFP. İki həftə sonra transgen ifadəsi maksimal olduqda, heyvanlara 10 gündə gündəlik kokain (7 mg / kq) və ya salin verildi və son kronik inyeksiyadan (5 mg / kq) 24 saat sonra lokomotor reaksiyalar üçün test edildi (Şəkil 4D). ΔJunD oversexpression kokainə lokomotor həssaslığını maneə törətdi və NAc qabığında CaMKIIα induksiyasını və aktivləşdirilməsini maneə törətdi (Şəkil 4E və F; p = 0.0437; F = 2.997; ümumi df = 38), bu subregionda CaMKIIa'nın kokainlə vasitələnmiş indüksiyasına görə ΔFosB transkripsiyası fəaliyyətinin lazım olduğunu ifadə edir. Maraqlıdır ki, ΔJunD ΔFosB səviyyəsini ΔFosB səviyyəsinin aşağı salınması və kokainlə müalicə olunan şərtlər (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35) səviyyəsində azaldığını, ΔFosB'nin öz ifadə səviyyələri üçün AP-1 aktivliyinə bağlı olma ehtimalı artırdığını aşkar etdik.

SerxNUMX-də CaMKII fosforli ΔFosB

Istifadə vitro Protein kinaz testləri, təmizlənmiş ΔFosB'nin CaMKIIa üçün sağlam substrat olduğunu təyin etdik. Onun incubasiyası₆CaMKIIa və ATP ilə DFOSB ΔFosB elektroforetik hərəkətlilikdəŞəkil 5A); bir neçə müxtəlif bantlar fosforilyasiyanın bir neçə yerini təklif etdilər. Oxşar vitro kinaz analizləri [γ-³²P] ATP köçürülmüş ΔFosB bantlarına radiolabeled fosfatın daxil edilməsini göstərdi (Şəkil 5B), proteinin birbaşa fosforilyasiyasını nümayiş etdirir. Əvvəllər xarakterizə edilən SerxNUMX-ə ΔFosB-yə fosforaya xüsusi bir antikor çıxardıq (Ulery et al., 2006). Bu antikor Ser27-fosforilatlı ΔFosB (məlumat göstərilməyib) olan beyin ekstraktlarına qarşı bir siqnal vermir, baxmayaraq ki, SerxNUMX fosforilasyonunu vitro CaMKII istifadə edərək kinaz təhlili (Şəkil 5B). ΔFosB'nin CaMKII fosforilatsiyasining kinetik tahlillari uning kinaz uchun kuchli substrat (Şəkil 5C), müəyyən bir K ilə_M 5.7 ± 2.0μM və K_CAT 2.3 ± 0.3min^-1. Bu nəticələr çox yaxşı xüsusiyyətlərlə müqayisə edilə bilər vivo ilə CaMKII substratları (Colbran və Brown, 2004). Bundan əlavə CaMKII'nin ΔFosB fosforilatını 2.27 ± 0.07 mol / mol (Şəkil 5D), onun içərisində CaMKII fosforiliyinin ən az üç yerinin olduğunu ifadə edir₆-DFosB protein ilə razılaşdırmaq Şəkil 5A.

Fərdi fosforilyasiya sahələrini araşdırmaq üçün nümunələrin MS analizlərini bizdən istifadə etdik vitro kinaz testləri. Şəkil 5E əvvəlcədən xarakterizə edilən Ser27-də və bir sıra əlavə sahələrdə ΔFosB fosforilyasiyasını nümayiş etdirir (data göstərilməyib). Ser27-un əvvəlki funksional xarakteristikasını nəzərə alaraq, SerxNUMX-in fosfo- və qeyri-fosfo vəziyyətlərini təqlid edən etiketli sintetik peptidlər meydana gətirərək, bu sahəyə diqqət göstərdik, daha sonra bu peptidlərin bilinən miqdarlarını ΔFosB-in MRM analizlərində standartlar kimi əvvəl və sonra istifadə etdilər vitro CaMKII tərəfindən fosforlaşma. Sonrakı kəmiyyətləmə (İncir 5F) SerxNUMX'in CaMKII üçün güclü substrat olduğunu təsdiqləyir. Bu nəticələr göstərir ki, ΔFosB daxilində bir çox fosforlaşmış qalıqlar arasında SerxNUMX CaMKII üçün xüsusilə effektiv substratdır.

CaMKII, NAc Shell-də ΔFosB-nin kokain yığılmasına vasitəçilik edir

CaMKII ΔFosB fosforilə bilər vitro onun sabitliyini kəskin şəkildə artırdığı bir sayt vitro və vivo ilə (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds və digərləri, 2009), CaMKII fəaliyyətinin NAc-da ΔFosB səviyyələrini idarə etdiyini müəyyən etdik vivo ilə. Bu suala cavab vermək üçün ilk növbədə, bir çox beyin bölgələrində CaCKIIa (T286D) kalsium-müstəqil mutantını aşan bir siçan xəttini NAcMayford və ark., 1996; Kourrich və digərləri, 2012). 20 gün ərzində gündə bir dəfə 14 mg / kq kokain və ya salin ilə yaşla əlaqəli yetkin kişi mutantı və yabanı tipli çöpçəkənləri enjeksiyadan bir gün sonra heyvanları təhlil etdik. ΔFosB bazal səviyyələri NAc qabığında mutant heyvanlarda artmışdır (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), lakin əsas (Fig 5G və H). Şaşırtıcı bir şekilde, ΔFosB'nin kokain bağımlı indüksiyonu her iki kabuk ve çekirdekte mutant hayvanlarda engellenmiş, ki CaMKII, NAc qabığında birbaşa FOSB stabilitesini düzenleyebilmesine baxmayaraq, hem NAc alt bölgelerinde kokain aktifleştirilmiş yollarda ΔFosB'nin yuxarı akışına yatabilir .

CaMKII Faaliyeti ΔFosB-vasitəçiliyi struktur və Davranışçı Plastisitə üçün tələb olunur

NAc MSN-larda dendritik spinlərin kokain indeksasiyası bu beyin bölgəsində ən yaxşı qurulmuş dərman vasitələrinə uyğundur və bu cür induksiya dərmana qarşı həssas davranış reaksiyaları ilə əlaqələndirilirRobinson və Kolb, 2004; Russo və digərləri, 2010) və D1 tipli MSNlər üçün seçici olmağı bildirmişdir (Lee və digərləri, 2006). Son vaxtlarda NAc-da dendritik spinlərin kokain indüksiyası ΔFosB və onun aşağı axın transkripsiyası proqramınaMaze və ark., 2010). CaMKII-nin dendritik omba morfologiyasına və digər beyin bölgələrində və eksperimental sistemlərdə indüksiyaya cəlb olunması ilə əlaqədar geniş bir ədəbiyyat varJourdain və digərləri, 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), NAc MSN onurğa formasındakı rolu araşdırılmamışdır. Buna görə CaMKII aktivliyinin CaMKII aktivliyini inhibe edən QFP ilə əlaqələndirilmiş CaMKII inhibitör peptidi AC3I HSV vasitəsi ilə aşırı ekspresyonu istifadə edərək, MSN dendritik spinlərin ΔFosB vasitəsi ilə ötürülməsi üçün CaMKII fəaliyyətinin tələb olunduğunu müəyyən etdik. vivo ilə (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Yetkin siçanların NAc qabığındakı ΔFosB-nin viral həddindən artıq ekspressionu MSN dendritik bel sıxlığında əhəmiyyətli bir artıma səbəb oldu (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Şəkil 6A və B) daha əvvəl bildirildiyi kimi (Maze və ark., 2010) və bu artım əsasən ince (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) və püskürmə (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59)Şəkil 6C-E). Daha yetkin, göbələk şəklində yivlərdə heç bir təsir görülməmişdir. Bununla birlikdə, GFP-AC3I birgə işlədildikdə, spinlərin ΔFosB induksiyası tamamilə ləğv edildi (Şəkil 6A-ENAc kabuğunda dendritik spinlərin ΔFosB induksiyası üçün CaMKII fəaliyyətinin tələb olunduğunu bildirir.

Bundan sonra CaMKII fəaliyyətinin ΔFosB-nin kokainə qarşı davranış həssaslığına təsiri üçün lazım olduğunu müəyyən etmək üçün eyni viral vasitələrdən istifadə etdik. NAc qabığına viral inqilabdan sonra 72 saatdan sonra heyvanlara 5 mg / kq kokainin birdəfəlik enjeksiyonu verilmiş və onların lokomotor fəaliyyəti qeyd olunmuşdur. Əvvəllər olduğu kimi daha uzadılmış AAV ilə ΔFosB (Şəkil 4A), ΔFosB'nin HSV-mediated aşırı ekspresyonu kokainə lokomotor həssaslığı artırdı (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; İncir 6F). Dendritik spinlerin induksiyasında olduğu kimi, GFP-AC3I ilə birlikdə CaMKII fəaliyyətinin maneə törədilməsi kokain həssaslığında ΔFosB vasitəçiliyi artımını tamamilə maneə törətmiş və CaMKII fəaliyyətinin kokain davranış təsirlərində ΔFosB-induced dəyişiklikləri üçün lazım olduğunu göstərmişdir.

Get:

Müzakirə

Bu tədqiqat kokain NAc qabiliyyətində olan CaCKIIa geninin transkripsiyasını NAc kabuğunda selektivləşdirən NAc-də ΔFosB'yi indükləyən yeni bir feed-forward mexanizmini təsvir edir. CaMKIIα sonradan daha çox ΔFosB yığılmasına və daha da CaMKIIα induksiyasına gətirib çıxaran ΔFosB'yi fosforələşdirir və stabilləşdirir (İncir 6G). Kokainə xroniki məruz qalma zamanı iki zülalın birgə yüksələn səviyyəsi daha sonra dərmana həssas davranış reaksiyaları üçün mühüm yollarla kömək edir. Bu, həm də ΔFosB və CaMKII'nin kokainə artan davranış reaksiyaları üçün əvvəlcədən nümayiş olunduğuna görə xüsusilə cəlbedici bir hipotezdir (Pierce və ark., 1998; Peakman et al., 2003) və biz NAc qabığında ΔFosB üçün bu tapıntıyı xüsusilə viral yanaşma (İncir 4 və Və66).

D1 tipli MSN-lərdə transgenik ΔFosB aşırı ekspresyonu həm CaMKII induksiyasını, həm də kokain-naip heyvanların NAc qabığında və nüvəsindəki kokain kontekstində, həm subregondalarda meydana gələn endojen ΔFosB yığılması, həm də NAc qabığında CaMKII'nin indüksiyasını idarə edir . Bu fərq bizim bitransgenik modelimizdə əmələ gələn ΔFosB-nin daha yüksək səviyyələrinə aid ola bilər, lakin bu da kokainin qabığındakı CaMKIIα promoterini fərqli olaraq dəyişdirə bilməsi qabiliyyətini əks etdirə bilər vs əsas MSN-lər, ya da keçmişdə ΔFosB bağlamasını təşviq etsinlər və ya ikinci subregionda istisna etsinlər. Əslində, yalnız NAc nüvəsindəki CaMKIIα gen stimulatorunda histonların kokain vasitəçiliyi ilə deasetiliyini aşkar edən ÇİP məlumatlarımız bir kromatin mexanizminin mümkün tutulmasını dəstəkləyir. Bu hipotezə uyğun olaraq, D1 tipli MSN'lərdə ΔFosB aşırı ekspresyonu CaCKIIα indeksini NAc nüvəsində kokain olmaması (İncir 3F), kronik kokain pozulmasında bu induksiyanı maneə törətmiş CaMKIIα promoterinin aktiv dəyişiklikləri olduğunu düşünür. CaMKII təşəbbüskarındakı kromatin landşaftının tənzimlənməsi CaMKII-nin kronik kokain çıxaran siçovulların NAc qabığında problemli dozada kokain səbəbindən səbəb olduğunu açıqlaya bilər (Şəkil 1E), lakin narkotik maddələri olmayan heyvanlar (Şəkil 1D). Bu, ΔFosB epigenetik bir "gen priming" təsiri göstərə bilər (Robison və Nestler, 2011) və beləliklə kokainin özleminin inkübasyonunun bir molekulyar mexanizmi ola bilər (Pickens və s., 2011). Lakin, bu kromatin dəyişməsinin səbəbi özlemin inkübasyonuna bağlı olması üçün zaman keçdikcə artırılmalıdır. Bu vəziyyətin olub-olmadığını müəyyən etmək maraqlıdır və digər genlərin kokainlə ΔFosB-asılı, subregiona xüsusi tənzimləməsinin olub olmadığını öyrənmək maraqlıdır. Qeyd etdiyimiz feed-forward loopun CaMKII və ya ΔFosB-nin sonsuz bir yığılmasına gətirib çıxarmayacağını qeyd etmək vacibdirŞəkil 1E); Bunun üçün məsul olan molekulyar "əyləc" nin ortaya çıxması gələcək işlərin əhəmiyyətli bir məqsədi.

Bir neçə eksperimental sistemdə və beyin bölgələrində ΔFosB və CaMKII'nin tanınmış funksiyaları bir çox səviyyədə birləşir (İncir 6F). Hər iki molekul dendritik ürək böyüməsi ilə sıx bağlıdır: CaMKII, aktin sitoskeletonuOkamoto et al., 2009), bel əsas ölçüsünü tənzimləyir (Matsuzaki və digərləri, 2004) və hipokampal organotipik dilim mədəniyyətlərində filopodiya və sinaps sayı sayəsində plastisiyaya səbəb olan artımlar üçün zəruri və kifayətdirJourdain və digərləri, 2003), wtəpə ΔFosB NAc MSN-də kokainlə əlaqəli dendritik bel ürəyi üçün lazımlı və lazımlıdırMaze və ark., 2010). Bundan əlavə, həm molekullar AMPA glutamat reseptorlarının tənzimlənməsi ilə bağlıdır. CaMKII, AMPA reseptor alt birimlerinin ümumi səviyyələrini tənzimləmir, amma AMPA reseptorlarının sinapslara yerləşdirilməsini sürətləndirir və mədəniyyətdə hipokampal piramidal nöronlarda SerxNUMX-də GluA1-ni fosforilatlayaraq AMPA kanalı keçiriciliyini artırır və vivo ilə (baxıldığında (Malinow və Malenka, 2002; Colbran və Brown, 2004)). GluA1-in sinapsına bu cür artan qaçaqmalçılığı da kronik kokain fəaliyyətinə təsir göstərmişdir (Boudreau və Wolf, 2005). Bundan əlavə, NAc-də AMPA reseptorlarının aktivləşdirilməsinə dair davranış reaksiyaları CaMKIIa-nın aşırı ekspresyonu ilə D1 dopamin reseptoruna asılı olaraq artır (Singer və digərləri, 2010). ΔFosB-nin uzun müddətli D1-ə xüsusi ekspresyonu NAc-da GluA2 transkripsiyaya səbəb olurKelz və digərləri, 1999), bu da qısa müddətli ΔFosB ov ekspresyonu və qısa müddətli kokainin ifşa edilməsini göstərməklə, GluA1 vasitəsi ilə araşdıran AMPA reaksiyalarını azaldır və bu alt birliyə təsir göstərmir (Əncir 1). Buna baxmayaraq yaxın illərdə ΔFosB overexpresyonunun NAX-da D1 tipli MSN-lərdə AMPA cavablarını azaldırGrueter et al., 2013). Bu məlumatlar kokainə vaxtında asılı bir sıra nörodejmentlər yarada bilən müvəqqəti fərqli mexanizmlər təklif edir ki, bu da hələ başa düşülməmiş addiction inkişafının müxtəlif aspektlərinə əsaslanır. Davamlı səviyyədə, CaMKII və ΔFosB kokainə lokomotor həssaslaşdırma üçün tələb olunur (yuxarıda bax) və hər ikisi kemiricilərdə davamlı kokain özünü idarə etmək üçün tələb olunurColby və digərləri, 2003; Wang et al., 2010), bu iki zülal qısa və uzun müddətli davranış uyğunlaşması üçün vacibdir, buna baxmayaraq qismən fərqli əsas mexanizmlər vasitəsilə narkotik təsirinə məruz qalır. Şübhəsiz ki, ΔFosB və CaMKII sinaqtik hadisələri davranış dəyişikliyinə birbaşa birləşdirmək üçün daha çox işə ehtiyac duyulmasına baxmayaraq, NAc sinaptik funksiyasındakı dəyişikliklər nəticəsində bu cür kompleks davranış adaptasiyalarını tənzimləyir.

CaMKII holoenzyme eyni zamanda müxtəlif sinaps-əlaqəli proteinlərləRobison və digərləri, 2005) postsinaptik sıxlığa (PSD) yönəldilməsini tənzimləyən düşünülmüş, sinaptik plastisitə üçün əhəmiyyətli olan bir fenomen. Xüsusilə, CaMKII-nin NMDA tipli glutamat reseptorunun GluN2B alt birliyi ilə qarşılıqlı təsiri həm sinaptik plastisitə və öyrənmə (Halt et al., 2012). AC3İ peptidi CaMKII'nin avtomatik tənzimləyici domainini təqlid edir və beləliklə ferment katalitik fəaliyyətini maneə törədəcək, bu da bir çox protein-protein qarşılıqlı təsirini (Strack və digərləri, 2000; Robison və digərləri, 2005). Beləliklə, burada bildirilmiş HSV-GFP-AC3I-nin davranış və morfoloji təsiri CaMKII hədəf proteinlərinin azaldılmış fosforlaşması, CaMKII hədəfindəki dəyişikliklər və ya sinamalarda CaMKII-nin təklif etdiyi struktur rolunun dəyişməsi ilə baş verə bilər (Lisman və al., 2002).

Təklif olunan ΔFosB-CaMKII loopunun NAc qabığına məhdudlaşdırılması xüsusilə qeyd olunur ki, son işdə kokain tətbiqinə cavab olaraq NAc qabığı və nüvəsi arasında bir neçə fizioloji fərqlilik göstərilmişdir, bu da bizim obyektiv iTRAQ (Table S1) . NAc qabığında olan MSNlər həftə ərzində davam edən kronik kokaindən sonra tutma qabiliyyətində depressiya göstərirlər, eyni heyvanlardan gələn əsas MSNlər 1 həftə ərzində bazal səviyyələrə qayıdırlar ki, atəş gücündən müvəqqəti (3-2 gün) artım göstərirlər (Kourrich və Tomas, 2009). Bundan əlavə, çoxsaylı sinaptik zülallar NAc qabığında fərqli şəkildə tənzimlənir vs Xroniki kokainə məruz qalan heyvanların özü, GluA2 (Knackstedt və digərləri, 2010). Xroniki amfetamin CaMKIIα-ni xüsusilə NAc qabığındaLoweth və s., 2010), kokainlə bənzər bir təsiri tapdığımız təəccüblü deyil. Lakin, ΔFosB həm NAc qabığında həm də kronik kokain (Perrotti və digərləri, 2008) və biz Kabardakı CaMKIIα induksiyasını ΔFosB-bağımlı olduğunu göstərdiyimizdən bu günə qədər tapıntılar CaMKIIα'nın qabığındakı selektiv indüksiyasından məsul olan bu iki subregions arasında CaMKIIα promoterində fərqli transkripsiya mexanizmləri üçün yeni sübutlar təmin edir.

D1- və D2 tipli NAc MSN-lər arasında fərqlərin məhdudlaşdırılmasına yönəldilmiş son işlər çoxdur. Həm D1, həm də D2 reseptorları kokainin mükafatlandırıcı təsirlərinə baxmayaraq iştirak edirlər (Öz, 2010), son iş D1 tipli MSN-lərin optogenetik aktivliyinin kokainə davranış reaksiyalarını artırdığını göstərir, D2 tipli MSN aktivləşdirmə isə əks təsir göstərir (Lobo et al., 2010). Bu nəticələrə uyğun olaraq, D1-reseptorun knockout siçanları kokain özünü idarə etmə (Caine və ark., 2007), D2 knockouts isə deyil (Caine və ark., 2002). NAX-da doğrudan D1 agonist idarəsi bərpa paradiqmalarında kokain axtarış davranışını tetiklerÖz, 2010). Maraqlıdır ki, bu təsirin NAc qabığında CaMKII fəaliyyətində D1-reseptorlara nisbətən artım tələb olunur, lakin əsas deyil (Anderson və digərləri, 2008), burada təklif olunan D1- və kabuka xüsusi ΔFosB-CaMKII loopu ilə yaxşı nəticələr verən bir nəticə.

Daha əvvəl bildirdik ki, ΔFosB-də SerxNUMX kalium kinaz-27 (fosforilatlaşdırılmış)Ulery et al., 2006), lakin burada biz CaMKII'nin bu və digər sahələrdə daha böyük kinetiği və stokiometriyası ilə ΔFosB-ni fosforə edəcəyini təsbit etdik və yuxarıda göstərilən M_r ΔFosB (Şəkil 5A) kokain təsiri ilə vivo ilə (Nestler, 2008). Biz artıq bilirik ki, SerxNUMX fosforilyasiyası ΔFosB sabitliyini və transkripsiyası aktivliyini (Ulery et al., 2006; Ulery və Nestler, 2007; Ulery-Reynolds və digərləri, 2009). Gələcək işlər indi bu işlə göstərilən ΔFosB fosforilasyonun yeni yerlərinin müəyyənləşdirilməsi və funksional nəticələrinə yönəldiləcəkdir.

Burada təsvir edilən qidalanma forması, təkrarlanan kokain tətbiqi, NAc-da irəliləyici anormalliklər çıxaran yeni bir mexanizm təmin edir. Beləliklə, bu biyokimyəvi yol, asılılıq pozğunluqlarına gələcək müalicə müdaxiləsi üçün əhəmiyyətli bir hədəf təmin edə bilər. CaMKII hər yerdə olduğu və bir çox bazal nöronal və davranış funksiyaları üçün tələb olunduğu üçün CaMKII inhibitorlarının birbaşa istifadəsi bir asılılıq müalicəsi olaraq qaldırıldı. Bizim məlumatlar göstərir ki, CaMKII indüksiyasiyasının fərdi bir hüceyrə tipinə və beyin mükafat dövriyyəsinin subregionuna həssas olan daha məqsədəuyğun hədəf sistemi sistemli CaMKII inhibisyonunun ağırlaşmalarından qaçınmaq üçün terapevtik bir hədəf təmin edə bilər.

Get:

Təşəkkürlər

Bu iş Narkotiklərlə Toxunma üzrə Milli İnstitutun (EJN), NIDA-Yale Proteomics Mərkəzinin DA018343 (AJR və EJN) və Hartwell Fondu (AJR) tərəfindən dəstəkləndi. Müəlliflər, təmizlənmiş CaMKIIa'nın səxavətli hədiyyə üçün təmizlənmiş ΔFosB və Roger Colbran'ın səxavətli hədiyyəsi üçün Gabby Rundenkoya təşəkkür edir.

Get:

References

1. Ahmed SH, Koob GF. Orta həddindən artıq həddindən artıq dərman qəbuluna keçid: hedonik set nöqtəsində dəyişiklik. Elm. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: kokain axtarışında acumbens dopamin və glutamat sistemlərini birləşdirən biyokimyəvi körpü. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Kokainə qarşı davranış həssaslığı, nüvə adacıklarında artan AMPA reseptor səthinin ifası ilə əlaqələndirilir. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Baculovirus ifadə sistemini istifadə edərək Ca2 + / calmodulin-bağlı protein kinaz II-nin alfa-alt birliyinin ifadəsi və xarakterizə edilməsi. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. D2 reseptor mutant siçan və yeni D2 reseptorları ilə tədqiqatlar: Cain SB, Nəcus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. antagonistlər. J Neurosci. 2; 2002: 22-2977. [PubMed]
6. DPamin D1 reseptorunun sökülməsindəki siçanlarda kokainin özünü idarə etməməsi Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. FosB-in sabitləşməsi üçün Proteazome-bağımlı və müstəqil mexanizmlər: FosB degron domainlərinin müəyyən edilməsi və DeltaFosB sabitliyinə təsirləri. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Beyində induksiyalı, hədəf gen ifadəsi olan transgenik heyvanlar. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. İkappaB kinaz seksual stress və sinaptik və davranışçı plastisitənin sosial məğlubiyyətini tənzimləyir. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
10. Colbran RJ. Bazik otofosforilasyonla Ca2 + / calmodulin-bağımlı protein kinase II inaktivasiyası. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Protein fosfatazlar və kalsium / calmodulin-bağlı protein kinaz II-bağlı sinaptik plastisitə. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalsium / calmodulin-asılı protein kinaz II və sinaptik plastisitə. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. DeltaFosB'nin striatal hüceyrə tipli xüsusi ov ekspresyonu kokain üçün təşviq artırır. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Histon deasetilaz inhibitorlarının antidepresan hərəkətləri. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin Mİ, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Caveolin-1-tənzimlənən zülalların kəmiyyət protomiqi: endirsel hüceyrələrdə polimeraz i və transkripsiyaya salınma faktoru / CAVIN-1 in xarakterizə edilməsi. Mol Celi Proteomikası. 2010; 9: 2109-2124. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Major depressiyada intiharın tamamlanması üçün risk faktorları: Dəyişən və təcavüzkar davranışlarda iddiada nəzarət işi kişilər. Am J Psixiatriya. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB, nüvə adapterlərinin birbaşa və indirekt yolak funksiyasını fərqli olaraq modullaşdırır. Proc Natl Acad Sci ABŞ. 2013 mətbuatda. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. GluN2B'ye CaMKII bağlanması yaddaş konsolidasiyası zamanı vacibdir. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB mutant siçanları: Fos ilə əlaqəli zülalların xroniki kokain induksiyasının itirilməsi və kokainin psixomotor və faydalı təsirlərinə qarşı həssaslığın artması. Proc Natl Acad Sci ABŞ A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Nüvə akumbens nüvəsi və qabığı ilə kokain axtarış davranışına fərqli nəzarət. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. DeltaFosB transkripsiyon faktorunun dimerizasiyası və DNT-bağlama xüsusiyyətləri. Biokimya. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsium / calmodulin-asılı protein kinaz II, fəaliyyətə bağlı filopodiya artımı və omurilik meydana gəlməsinə qatqı təmin edir. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Beşte deltaFosB transkripsiyon faktorunun ifadəsi kokain həssaslığını nəzarət edir. Təbiət. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Dorsal Striatal Orta Spin Neyronlarda CaMKII'nin Genetik Qadağanı İşlevsel Eksototerik Sinapsləri Azaldır və Daxili Həssaslığı artırır. PLoS One. 2012; 7: e45323. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Kokainin özünü idarə etməsindən sonra söndürmə təhsili kokainin axtarılmasını maneə törətmək üçün glutamaterjik plastisitə səbəb olur. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Oxşar neyronlar, əks adaptasiyalar: psixostimulyantlıq təcrübəsi fərqli olaraq şüa qarşı akumbens nüvəsində atəş xüsusiyyətlərini dəyişdirir. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Striatal alphaCaMKII'nin AMPAR-Müstəqil Təsiri Kokain mükafatının həssaslığını artırır. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Qadın farelerdeki ovarian hormon vasitəçiliyində stress həssaslığında bağırsaq nüvə amilinin rolu. Biol Psixiatriya. 2009; 65: 874-880. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
29. D1 və D2 dopamin retseptorları içərisində nüvə akumbensində orta kəllə neyronları olan kokain-dendritik orqanik formasiyanın meydana gəlməsi ilə Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Proc Natl Acad Sci ABŞ A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Sinematik və davranış yaddaşında CaMKII funksiyasının molekulyar əsasları. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. BDNF siqnalının hüceyrə tipli xüsusi itkisi kokain mükafatının optogenetik nəzarətini təqlid edir. Elm. 2010; 330: 385-390. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. CaMKII-nin nüvəli akumbens qabığında qadağan edilməsi həssaslaşmış sıçanlarda amfetamin əmələgəlməsini azaldır. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Nucleus accumbens shell in alfa-Ca2 + / calmodulin-asılı protein kinazının amfetaminə davranışa cavab verir. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA reseptorlarının qaçaqmalçılığı və sinaptik plastisitə. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Tək dendritik spinlərdə uzunmüddətli potensialın struktur əsasları. Təbiət. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. CaMKII transgeninin tənzimlənən ifadəsi vasitəsilə yaddaşın formalaşmasının idarə edilməsi. Elm. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Xəzər Universitetinin rektoru Yaqub Eyvazovun sözlərinə görə, bu gündən etibarən, Nestler EJ. Kokain ilə bağlı plastisitədə histon metiltransferaza G3a'nın əsas rolu. Elm. 9; 2010: 327-213. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. CREB və DeltaFosB tərəfindən gen ifadə və kokain mükafatının tənzimlənməsi. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Baxış-icmal. Bağımlılığın transkripsiyon mexanizmləri: DeltaFosB rolu. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Striatum və nüvəsiz acumbensdə kokain tərəfindən xroniki FOS ilə əlaqəli antigen induksiyasının tənzimlənməsində farmakoloji tədqiqatlar. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Dendritik spinlerin struktur plastifikasiyasında CaMKII və F-aktinin rolları: sinaptik etiketin potensial molekulyar şəxsiyyəti? Fizyoloji (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB, nüvənin içindəki akumbenslərdə qidalandırılmış instrumental davranış və motivasiyanı tənzimləyir. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Stereotaksik koordinatlarda olan siçovul beyin. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Akademik Mətbuat / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Fond JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. C-Jun'un transgenik siçanlarda dominant mənfi mutantının beyin bölgəsinə spesifik ifadəsi kokainə qarşı həssaslığı azaldır. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergent CaMK və RacGEF siqnalları dendritik strukturu və funksiyasını idarə edir. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Xroniki stressdən sonra mükafatla əlaqəli beyin strukturlarında deltaFosB induksiyası. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB-nun istifadəsi ilə narkotik maddələri ilə beynin induksiyası. Sinapse. 2008; 62: 358-369. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Şaham Y. Dərman istəklərinin inkubasiya nörobiyolojisi. Trends Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalsiumun vasitəçiliyi olan ikinci peyğəmbərlər, davranış həssaslığının kokainə ifadə edilməsini modullaşdırırlar. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. İnsan beyin reseptoru autoradiografi, bütün yarımkürə bölmələrindən istifadə edir: toxuma artefaktlarını minimuma endirən ümumi bir metoddur. Sinapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. İstifadəsi olan narkotik maddələrə məruz qalma ilə əlaqəli struktur plastisitə. Neurofarmakologiya. 2004; 47 (Əlavə 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Bağımlılığın transkripsiyonel və epigenetik mexanizmləri. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Kalsium / calmodulin-asılı Protein kinaz II-nin postsinaptik sıxlıq zülalları olan NR2B, densin-180 və alfa-aktinin-2 ilə multivilli qarşılıqlı təsirləri. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. H.C., X. P., Pillay S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, F. Jacobson A, H. Y., Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Pappin DJ. Saccharomyces cerevisiae-də amin reaktiv izobarik etiketleme reaktivləri istifadə edərək, multipleksli protein miqdarı. Mol Celi Proteomikası. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Bağımlı sinaps: çekirdek akumbensində sinaptik və struktur plastikləşmə mexanizmləri. Trends Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
56. Self DW. Dopamin reseptorları. Neve KA, redaktoru. New York: Humana Press; 2010. 479-524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Nüvə akumbens qabığında alfa-kalsiyum / calmodulin-asılı protein kainazının keçici viral vasitəçiliyi ilə aşırı ekspresyonu alfa-amino-3-hidroksil-5-nin uzunmüddətli funksional upregozmasına gətirib çıxarır -metil-4-izoksazol-propionat reseptorları: dopamin tipi-1 reseptoru və protein kinaz A asılılığı. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. N-metil-D-aspartat reseptorunun NR2B alt biriminə hədəf olan kalsium / calmodulin-asılı protein kinaz II mexanizmi və tənzimlənməsi. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. DeltaFosB-nin fosforlaşması onun in vivo sabitliyinə vasitəçilik edir. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. SerxNUMX fosforilasiyası ilə DeltaFosB transkripsiyalı fəaliyyətinin tənzimlənməsi. Eur J Neurosci. 27; 2007: 25-224. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. DeltaFosB sabitliyini fosforilyasiya ilə tənzimləmə. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. Beyin mükafat sxemlərində DeltaFosB stress və antidepresan cavablara qarşı davamlılığı təmin edir. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Kronik kokainlə bağlı H3 asetilasyonu və CaMKIIalphanın çekirdek akumbensində transkripsiya aktivləşdirilməsi narkotik maddənin gücləndirilməsi üçün motivasiya üçün vacibdir. Nöropsikofarmakologiya. 2010; 35: 913-928. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Bren S. Delta FosB təkər qaçışını tənzimləyir. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Orbitofrontal korteksdə DeltaFosB induksiyası kokain səbəbindəki kognitif disfunksiyaya tolerantlıq yaradır. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. DeltaFosB üçün morfin hərəkətində nüvəli akumbens üçün mühüm rol. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Ş.H., Vişnivetskaya TA, Atkinson J.B., Gurevich VV, Salama G, H.M.G., Wu Y, Yang Y, Grueter CE, NiG, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Calmodulin kinaz II inhibisyonu struktur ürək xəstəliyindən qorunur. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]