Cytlin-asılı kinaz 5-in artması kokainlə əlaqəli dopamin siqnalının (2005) zəifləməsinə gətirib çıxarır.

mücərrəd

Kokain, striatumda sinaptik dopamin səviyyələrini artırır və dopamin D1 reseptorundan nüvəyə qədər ilkin siqnal yayan intraselüler yolları aktivləşdirərək dopaminoceptive neyronlarda gen ifadəsini dəyişir1). Kokainə xroniki məruz qalma bir neçə transkripsiya faktoru düzəldir, kokain bağımlılığında nöronal adaptasiyaların altında yatan düşünülmüş gen ifadəsində uzun müddətli dəyişikliklərə səbəb olur (2). Belə bir transkripsiya faktoru kimi təsbit olunmuş ΔFosB,3), heyvanların kokaine olan davranışlara qarşı məsuliyyətini artırdığı göstərilir (4, 5). Buna görə, ΔFosB induksiyası ilə tənzimlənən hədəf genlərin müəyyən edilməsinin kokain asılılığının altında olan molekulyar mexanizmin daha geniş anlayışına kömək etməsi gözlənilir. Son zamanlarda, kokainli heyvanların xroniki müalicəsi, ΔFosB (indikatoru) vasitəsilə striatumda siklinə bağlı kinaz 5 (Cdk5) və onun aktivator p35 ifadəsini yuxarı tənzimləyir6, 7).

Cdk5 serin / treonin kinazların Cdk ailəsinin üzvüdür. Hüceyrə dövrü inkişafının əsas tənzimləyiciləri olan digər Cdkslərdən fərqli olaraq, Cdk5 əsasən postmitotik neyronlarda substratların fosforlaşmasına iştirak edir (8). Cdk5 fəaliyyətinin nöronal spesifikliyinə əsasən postmitotik neyronlarda ifadə edilən p35 və ya p39,8). Beyin inkişafında Cdk5-in əsas rolu ilə yanaşı (9, 10), ipostnatal beyində dopaminergik ötürülmədə də iştirak etmişdir11, 12). Cdk5 fəaliyyətinin inhibisyonu, stitatumda artan dopamin sindromunda Cdk5'in presinaptik funksiyasını ifadə edən dopamin sərbəst tənzimləyici (11). Bundan əlavə, Cdk5 DARPP-32-ni cAMP-asılı kinaza (PKA) bir inhibitoruna çevirən Thr-32-də Dopamine- və cAMP-tənzimlənən fosfoproteinin, Thr-75-də molekulyar kütləsi 32 kDa (DARPP-XNUMX) fosforilatlayan postsinaptik dopamin siqnalının effektivliyini modullaşdırır. (12).

Bu müşahidələr göstərir ki, Cdk5 və p35 kokainin kronik məruz qalması və dolayısı ilə kokain asılılığından sonra dopamin siqnalının uzun müddət aktivləşdirilməsinin aşağı tənzimləyiciləridir. Striatal dopamin siqnallarına Cdk5 rolunu daha da yaxınlaşdırmaq üçün, CX5 və ya p35'in p35 promoterinin nəzarəti altında xüsusi neyronlarda olduqca geniş yayılmış iki transgenik siçan xətti yaradılıb. Bizim tapıntılar Cdk5 aktivliyinin p35 proteininin yüksək səviyyələri ilə deyil, Cdk5 proteininin deyil, p35 protein səviyyəsinin Cdk5 aktivliyi üçün dərəcəsi məhdudlaşdığını göstərir. Biz burada təmin edirik vivo ilə p5 aşırı ekspresyonu nəticəsində Cdk35 aktivliyinin artdığına dair sübut, PKA və ekstraselüler siqnal tənzimlənən kinaz (ERK) cascades inhibisyonu vasitəsilə nüvəyə kokainlə əlaqəli dopamin siqnallarının zəifləməsinə gətirib çıxarır.

Material və metodlar

Antikorlar. Cdk5 (C-8) və p35 (C-19) poliklonal antikorları Santa Cruz Biotexnologiyasından alınmışdır. ERK kinaz (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 və cAMP-cavab element-bağlayıcı proteinə (CREB) fosforiliyaya asılı və müstəqil antikorlar Cell Signaling Technology-dən (Beverly, MA) əldə edildi. Fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), ümumi DARPP-32 (12) və c-fos (14) təsvir edilmişdir. Aktinga qarşı bir antikor Sigma'dan alındı.

Eksperimental Heyvanlar. Daha əvvəl siçan p35 genini klonladıq Cdk5r1, p35 proteinini kodlayan və genomik strukturunu xarakterizə edən15). P35 (Tgp35) nöronal overspression ilə transgenik siçan yaratmaq üçün, 6-kb EcoRI-Eco1.2-kb promoter bölgəsini ehtiva edən RI fragmanı pGEM9Z (-) plazmidinə alt klonlanmış və SV45-dən əldə edilmiş bir 40-bp tag KpnMən poli (A⁺) siqnal (Əncir 1A). Etiketdə bir var SPEHeyvanların genotipləşməsi üçün mən site. 6-kb fragmanı plazmiddən çıxarılmış və təmizlənmiş, transjenik siçanların yaranması üçün transgenin pronukulyar enjeksiyası aparılmışdır. 1.2-kb p35 promoterinin tənzimləmə nəzarəti altında transqenin ifadə profilini araşdırmaq vivo ilə, ikiqat transgenik siçan (Tgp35; p35 - / -), Tgp35 siçanının endogen bir p35-boş fonunda bərpa edildiyi iki addımlı yetiştirme strategiyasından istifadə edərək daha da yaradılıb. Bu işdə istifadə olunan digər siçan modelləri p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- və Cdk5 (TgCdk5) (nömrəli overspression ilə transgenik bir siçan daxildir)9, 16, 17). Bu siçanların genotipləri, quyruq biopsiyalarından izole edilmiş genomik DNT üzərində Cənubi blot analizi və ya PCR yerinə yetirməklə təyin edilmişdir. Siçanlar 12-h işıqlı / 12-h qaranlıq dövrü altında yerləşdirilib. Bütün qayğılar Milli Sağlamlıq İnstitutunun laboratoriya və eksperimental heyvanların qorunması və istifadəsi üzrə təlimatlarına uyğun olaraq verilmişdir.

  

Fig. 1.

P35 promoteri (Tgp35) tərəfindən yönəldilən p35-in nöronal overspresiyası ilə transjenik siçanın yaranması. (A) Transgen quruluşu vahşi tipli və hədəflənmiş p35 allellərinin şematik strukturları ilə göstərilir. Qırmızı çubuqlar genotipləşdirmə üçün istifadə edilən probu göstərir. ...

Cənubi Blot Təhlili. Kuyruk biopsiyalarından çıxarılan genomik DNT ilə həzm edildi EcoRI və SPEI, bir 0.9% agaroz jel elektroforez və bir neylon membran köçürülür. Membran təsadüfi astarlı hibritləşdirildi ³²Bir gecədə 42 ° C'de P-etiketli prob. P485 knockout (p35 - / -) və Tgp35 siçanlarının genotipləşməsi üçün 35-bp probu aşağıdakı primerlər vasitəsilə PCR tərəfindən yaradılıb: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'və 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Hibridləşdirilmiş membran 2 sx / xNUMX% SDS-də 0.1 santimetrdə 42 dəqiqə iki dəfə və 10 × SSC / 0.1% SDS-də 0.1 ° C-də 65 dəqiqə iki dəfə yuyulurdu və x-ray filminə məruz qaldı.

Dərman müalicəsi. Kokain (Sigma) steril şoranla ləğv edildi. Heyvanlar 15 aylıq dövrdə kokainlə (3 mg / kq) ya da bərabər həcmli salin ilə ip-enjekte edildi və injectiondan sonra fərqli vaxt nöqtələrində (15, 30, 60 və 120 min) dekapitasiya ilə öldürüldü. Brains sürətlə çıxarılır və soyuq PBS-də soyudulur. Striata daha sonra dağılmış və Şimali və ya Western blot analizinə məruz qalmışdır. İmmünohistokimyasal analiz üçün striatal bölmələr 2 siçanlarından injectiondan sonra əldə edilmişdir.

Şimali Blot Təhlili. Total RNA, TRIzol reaktifi (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) ilə striata çıxarılmış və təsvir olunduğu kimi Northern blot analizinə məruz qalıb (18). C-fos mRNA'sının aşkar edilməsi üçün, təsvir olunduğu kimi, sümük c-fos cDNA'nın bir 189-bp fragmanı bir prob kimi istifadə edilmişdir19). C-fos mRNA səviyyələri nih image software, Version 1.62 ilə bir şəkil analiz sistemi istifadə edərək xüsusi bandın optik sıxlığını ölçməklə ölçülmüşdür.

Western Blot Təhlili. Striatal toxumalar 1% SDS ilə sonicated və 10 dəqiqə üçün qaynadılmışdır. Hər bir nümunədə protein konsentrasiyası BCA protein testi (Pierce) tərəfindən müəyyən edilmişdir. Nitroselüloz membrana köçürülməzdən əvvəl bərabər miqdarda proteinlər SDS / PAGE ilə ayrıldı. Membranlar 1% skim südü və 5% Tween 0.05 olan 20 × PBS-də bloklandılar və 4 ° C'de bir gecədə əsas antikorlar ilə inkubasiya edildi. Peroksidaz konjuge anti-siçan və ya dovşan IgG (Sigma) ilə inkubasiya 60 dəqiqə üçün oda temperaturunda aparıldı. Yüksək səviyyəli chemiluminescence (Pierce) tərəfindən bir siqnal aşkar edilmişdir və bantların optik sıxlığı yuxarıda təsvir edildiyi kimi ölçülmüşdür.

Cdk5 kinaz təhlili. Striatal lizatlar 50 mM Tris HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenilmetilsülfonil fluorid / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml leupeptin / fosfataz inhibitorları (fosfataz inhibitor qarışıqları I və II, Sigma). Lizatların anti-Cdk5 (C-8) və ya anti-p35 (C-19) antikorları ilə immunopresipitasiya edilmişdir. Cdk5 immunoprecipitates 300 ° C'de 300 μl lizatın (5 μg proteinə bərabər olan) anti-Cdk3 antikoru (4 μg) ilə inkubasiya yolu ilə hazırlanaraq 25 μl Protein A-agaroz boncuklar (50 3 ° C'de 4 h üçün, liziz tamponunda çirkab su; Santa Cruz Biotexnologiyası). P35 immunoprecipitatların hazırlanması üçün, 500 μl lizatı (1 mq proteinə müvafiq olaraq) yuxarıda təsvir edildiyi kimi anti-p35 antikoru (3 μg) ilə inkubasiya edilmişdir. İmmünoprecipitatlar iki dəfə lysis tamponu ilə və iki dəfə 50 mM Tris HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl-dən ibarət kinaz tamponu ilə iki dəfə yuyulurdu₂/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, kinaz tamponun 60 μl'sinde yeniden salıverildi. Kinaza aktivliyi substrat olaraq histon H1 istifadə edərək ölçüldü18).

İmmunohistokimya. Siçanlar Averin (250 mg / kq, Fluka) iynə enjeksiyonları ilə anesteziyaya məruz qaldılar və 0.1 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.4 ilə transcardially perfused, sonra Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), qeyri-çapraz bağlama fiksatoru ilə izlədi. Dissected beyinlər eyni fiksatorda gecə-gündüz 37 ° C-də sabitlənmişdir. Beyin, parafin içərisinə yerləşdirilib, 5-μm qalın koronal bölmələrə bölündü və subamin olaraq diaminobenzidin ilə avidin-biotin-peroksidaz kompleksi texnikası (Vektor Laboratoriyaları) istifadə edərək immunohistokimyaya məruz qaldı. Bölmələr 4 ° C'de gecə-gündüz qarşı bir yaxınlıqla təmizlənmiş poliklonal antikorla inkubasiya edilmişdir. Boyanma spesifikliyi əsas antikorun pozulması ilə qiymətləndirilmişdir.

Nəticələr

P35-ın neyronal overspresyonu ilə transgenik siçanların yaranması. P35-ın artmış neyronal ifrazına nail olmaq üçün istifadə olunan transgen, 6-kb promoterini və p35-ın bütün kodlama sırasını ehtiva edən klonlanmış siçan p1.2 geninin 35-kb fragmentiniƏncir 1 A). Siçanların genotipləri, p35 - / - və Tgp35 siçanlarını yabanı tipli siçanlardan ayırmaq üçün nəzərdə tutulmuş bir probu istifadə edərək, Southern blot analizi ilə müəyyən edilmişdirƏncir 1 A və B). 1.2-kb p35 promoterinin nəzarəti altında transqen ifadəsini yoxlamaq üçün biz pxNUMX ifadəsinin yalnız transqendən ötürülməsinə səbəb olan ikili transgenik siçan (Tgp35; p35 - / -) yaradılıb. TGP35-də p35 ifadəsi, p35 - / - siçan yalnız beyindəƏncir 1C), məkan ifadə naxışının yabanı tipli siçanlaraƏncir 1D). P35-in olmaması serebral korteks və siçanların hipokampusunda anormal qatlama quruluşuna səbəb olub10). Lakin, Tgp35; p35 - / - siçanlar p35 - / beyin fenotipininƏncir 1E). Bu məlumatlar göstərir ki, 1.2-kb p35 promoteri transgenin ifadəsini birbaşa oxşar profil ilə p35-in endojen p35 genindən idarə edir.

P35 Protein səviyyəsi Cdk5 Aktivliyinin up-tənzimlənməsi üçün dərəcəsi məhdudlaşdırır. P35 - / -, p5 +/-, yabanı tipli, Tgp35, Cdk35 +/- və TgCdk35 siçanlarından 5 aylıq striatal çıxarışlarda p5 və Cdk3 kodlayan genlərin gen dozada təsirlərini araşdırdıq. P35 və Cdk5 protein səviyyələri müvafiq olaraq gen dozaları ilə əlaqəli olaraqƏncir 2 A və B). Tgp35 siçanları p1.6 protein səviyyəsindəki çınqıl tipli siçanlarla müqayisədə ≈35 qat artım göstərdi, Cdk5 protein səviyyəsi isə p35 proteininin müxtəlif səviyyələrindən təsirlənməmişdi. TgCdk5 siçanlar, Cdk1.9 protein səviyyəsindəki çınqıl tipli siçanlarla müqayisədə ≈5 qat artım göstərdi, p35 protein səviyyələri Cdk5 proteininin müxtəlif səviyyələrindən təsirlənməmişdi. Müxtəlif miqdarda p35 proteininin Cdk5 aktivliyinə təsirlərini araşdırmaq üçün Cdk5 anti-Cdk5 antikoru olan striatal ekstraktlardan immunoprecipitasiya edilmiş və kinaz aktivliyi ölçüldü. Eyni şəkildə, müxtəlif miqdarda Cdk5 proteininin kinaz aktivliyinə təsirlərini araşdırmaq üçün, p35 anti-p35 antikoru olan striatal ekstraktlardan immunopresipitasiya edildi və kinaz aktivliyi ölçüldü. Cdk5 fəaliyyəti p35 protein səviyyəsinə yaxşı nisbətdə, lakin Cdk5 protein səviyyəsinəƏncir 2 C və D). Bu nəticələr göstərir ki, p35 protein miqdarı Cdk5 fəaliyyəti üçün dərəcəsi məhdudlaşdıran bir faktordur. Buna görə də, artan Cdk35 fəaliyyətinin striatal dopamin siqnallarına təsirlərini araşdırmaq üçün Tgp5 siçanlarından istifadə etdik.

  

Fig. 2.

Cdk5 fəaliyyətinin yuxarı tənzimlənməsi p35 protein səviyyəsi ilə dərəcəsi məhduddur. (AP35 və Cdk5 protein səviyyələrini sırasıyla p35 və Cdk5 genlərinin gen dozaları ilə əlaqələndirən Western blots. (BP35 və ya Cdk5 proteinlərinin nisbi səviyyəsi ...

Thr-32-də DARPP-34-in kokainlə törədildiyi fosforilyasiya Tgp35 siçanında zərifdir. DARPP-32 funksiyası bir çox yerlərdə onun fosforilyasiya vəziyyətinə bağlıdır (20). Thr-32-də PKA fosforli DARPP-34, Cdk5 isə Thr-32-da DARPP-75 fosforlu olur. Beləliklə, DARPP-32-in striatal ekstraktlarında yabanı tipli və Tgp35 siçanlarından fosforilyasiya vəziyyətini araşdırdıq. Fosfo-Thr-75 DARPP-32 səviyyəsində Tgp35 farelerindəƏncir 3A; 1.6 ± 0.2-yabanı tipli siçanların dəyərindən yuxarı). Sonradan artan Cdk5 fəaliyyətinin striatal dopamin siqnallarına təsirlərini qiymətləndirdik. Thr-35-də DARPP-32-in fosforilyasiya vəziyyətini təhlil edərək Tgp34 siçanlarında kokainlə bağlı PKA aktivliyini müayinə etdik. Fosfo-Thr-34 DARPP-32 səviyyəsində kokain enjeksiyonundan sonra yabanı tipli siçanlarda 15 dəqiqə artmışdır (Əncir 3B; 1.8 ± 0.2 səviyyəsindən yuxarı səviyyədə). Lakin, DKPP-34-in Thr-32 fosforiliyinə kokainin təsiri Tgp35 siçanlarında zərif olmuşdu (bazal səviyyədən yuxarı 1.2 ± 0.3 qat). Bu nəticələr Cdk5 aktivliyinin artırılması, ehtimal ki, Thr-32-də DARPP-75 fosforilasyonu vasitəsilə kokainlə əlaqəli PKA aktivliyinin zəiflədildiyini göstərir (6, 12). Presinaptik Cdk5 aktivliyinin artmasının dopamin susuzluğunun azaldılmasına gətirib çıxarması da mümkündür və bu da kokainin təsirinin azaldılmasına təsir göstərə bilər. Xüsusilə, bir tək kokain enjeksiyonu, p35 və Cdk5 proteinlərinin səviyyələrinə və kinaz aktivliyinə təsir göstərməmişdir (Əncir 3 C və D). Bu, kokainə xroniki məruz qalmağın p35 və Cdk5 (6).

  

Fig. 3.

Cdk5 fəaliyyətinin yuxarı tənzimlənməsi fosfo-Thr-75 DARPP-32 səviyyəsini artırır və kokainə səbəb olan PKA aktivləşdirməsini azaldır. (A) Tgp32 siçanlarından striatal ekstraktlarda Thr-75-də (P-D32 Thr-75) DARPP-35-in fosforiliyasını artdıran immunoblot. Daxildir ...

Cdk5 fəaliyyətinin up-tənzimlənməsi ERK1 / 2-nun kokainə səbəb olan aktivliyini azaldır. Son sübutlar göstərir ki, striatumda dopamin qəbuledicisinin aktivləşdirilməsi digər ERK yolunu da daxil olmaqla,21, 22), kokainə davranışla reaksiya verməsində əhəmiyyətli rol oynayan23). Buna görə Cdk5 fəaliyyətinin ERK yolunun kokainlə bağlı təsirini təsir edə biləcəyini araşdırdıq. ERK yolunun aktivləşdirilməsi Ser-1 və Ser-2 (bazal səviyyədən yuxarı 217 ± 221 qat) və ERK1.5-də MEK0.2 / 1-in fosforiliyinin artması ilə ortaya çıxdığı kimi, yabanı tipli siçanlardan striatal ekstraktlarda kokain enjeksiyasından sonra müşahidə olundu Thr-2 və Tyr-202-də (ERK204 fosforilasiyası: bazal səviyyədə yuxarıda 2 ± 1.5 qat) 0.2Əncir 4 A və B). Lakin, MEK1 / 2 (bazal səviyyədən yuxarıda 1.2 ± 0.2 qat) və ERK1 / 2 (ERK2 fosforilasyon: 1.2 ± 0.2-bazal səviyyədən yuxarı) aktivləşməsi Tgp35 siçanlarında zəiflədiƏncir 4 A və B). Bundan əlavə, fosfo-ERK1 / 2 bazal səviyyələri Tgp35 siçanlarında aşağı olduqda (yabani tipli siçanların dəyərindən xNUMX ± 0.8-kat), bu tendensiya isə statistik olaraq əhəmiyyətli deyildir. Bu son nəticə Thr-0.2-də MEK5-in Cdk1 -ə bağlı fosforiliyinə aid edilə bilər, nəticədə katalitik aktivliyin azalması (24). Bu ehtimalları qiymətləndirmək üçün Thr-1-də MEK286-in fosforilyasiya vəziyyətini araşdırdıq və TGP286 siçanlarından striatal ekstraktlarda yüksək səviyyədə fosfo-Thr-1 MEK35 olduğunu təsbit etdikƏncir 4C; 1.3 ± 0.1-yabanı tipli siçanların dəyərindən yuxarı). Bundan başqa, Thr-1-də MEK286-in fosforilyasiya vəziyyəti tək bir kokain enjeksiyonu ilə dəyişdirilməmişdir, Cdk5 aktivliyinin müalicədən təsirlənməməsiƏncir 3D).

  

Fig. 4.

MEK5 / 1-in Cdk2 vasitəsi ilə inhibisyonu ERK1 / 2-nun kokainlə bağlı aktivasiyasını azaldır. Striatal çıxarışlar yabanı tipli (WT) və Tgp35 siçanlarından 15 dəqiqə hazırlanmış və ya kokain və ya salin enjeksiyasından sonra immunoblotinqə məruz qalmışdır ...

Dopamin siqnalının nüvəyə yayılması artan Cdk5 aktivliyi ilə zəiflədilir. PKA və ERK ilə əlaqəli çoxlu siqnal cazqalarının kokainlə əlaqəli aktivləşdirilməsi Ser-133-də fosforiliyin vasitəsilə nüvədə CREB transkripsiyası amilinin sonrakı aktivasiyasına gətirib çıxarır22, 25). PKA və ERK aktivasiya cascades üzərində Cdk5 vasitəçiliyi təsirlərinin CREB fosforilyasiyasına nüvədə uyğunlaşa biləcəyini araşdırmaq üçün, Wild-type və Tgp133 siçanlarından striatal ekstraktlarda Ser-35-də CREB-in fosforilyasiya vəziyyətini araşdırdıq. Fosfor-CREB bazal səviyyədə Tgp35 farelerində (yabani tipli siçanların xNUMX ± 0.7-qatına) aşağı düşdü ()Əncir 5). Kokain inyeksiyasına cavab olaraq, yabanı tipli siçanların striatumunda (bazal səviyyədən yuxarı 1.5 ± 0.1 qat) fosfor-CREB səviyyəsi artırılmışdır, lakin kokainə bu cavab Tgp35 siçanlarında zərif olmuşdu (1.2 ± 0.1- bazal səviyyədən yuxarı qat) (Əncir 5).

  

Fig. 5.

Cdk5-in fəaliyyətinin yuxarı tənzimlənməsi Serin-133-də ya salin və ya kokain inyeksiya ilə siçanlarda CREB-nin fosforiliyasını azaldıb. Striatal çıxarışlar yabanı tipli (WT) və Tgp35 siçanlarından 30 min iltihabdan sonra hazırlanmış və immunoblotinqə məruz qalmışdır ...

Ser-133-dakı CREB-in fosforilasiyası c-fos gen (o cümlədən) müəyyən genlərin təşviqat bölməsində cAMP cavab elementi vasitəsilə transkripsiya fəaliyyətini artırır26). Buna görə də, kokain enjeksiyonundan sonra yabanı tipli və Tgp35 siçanlarının striatumunda c-fosun induksiyasını tədqiq etdik. Yabani tipli siçanlarda c-fos mRNA səviyyəsi kokain enjeksiyonundan sonra 1.8 min (0.2 ± 30 səviyyəsindən bazal səviyyədən yuxarı) qədər yüksəldi və daha sonra injectiondan sonra 120 dəqiqə bazal səviyyəyə qayıtdı (Əncir 6 A və B). Lakin, c-fos mRNA səviyyələri Tgp30 siçanlarında ≈ 35% aşağı enjeksiyondan 30 dəqiqəyə qədər yabanı tipli siçanlardan daha aşağı idi (Əncir 6 A və B). Tgp35 siçanlarında c-fosun daha az indüksiyası immunohistokimya tərəfindən daha da təsdiqlənmişdir (Əncir 6 C-F). Kokain idarəsi striatumun dorsomedial-dorsosentral hissələrində və zəif olaraq lateral hissələrdə, yabanı tipli və Tgp35 siçanlarında, c-fos immunoreaktivliyini artırdı. Lakin, c-fos-immunopozitiv hüceyrələr sayında kokainlə bağlı artım xüsusən Tgp35 siçanlarının striatində zəiflədilər (Əncir 6G). Birlikdə bu nəticələr nüvə üçün striatal dopamin siqnalının kokain vasitəsi ilə artmasının Tgp35 siçanlarında artması, Cdk5 aktivliyinin artması ehtimalı ilə nəticələndiyini göstərmişdir.

  

Fig. 6.

Cdk5 fəaliyyətinin yuxarı tənzimlənməsi striatal c-fos ifadəsinin azalmasına və kokain tətbiqindən sonra onun daha az induksiyasına gətirib çıxarır. (A) Kokain enjeksiyonundan sonra yabanı tipli (WT) və Tgp35 (Tg) siçanlarda c-fos induksiyasının vaxtını göstərir. ...

Müzakirə

Cdk5 və onun aktivatoru p35 kokainə xroniki məruz qalma ilə tənzimlənən hədəf genləri kimi təsbit edilmişdir (6). Burada Cdk5-in daha çox tənzimlənməsi deyil, p35 up-tənzimlənməsi nəticəsində Cdk5 aktivliyinin artması, striatal neyronlarda kokainlə əlaqəli dopamin siqnallarının azalmasına gətirib çıxarır. Striatal dopamin siqnallarında Cdk5 ya da p35-in yuxarı tənzimlənən ifadəsinin nəticələri, iki transgenik siçan xətləri, TgCdk5 və Tgp35 siçanlarının təhlili aparılmışdır. Cdk5 aktivliyinin p35 proteininin artım səviyyəsinə mütənasib olaraq tənzimləndiyini, lakin Cdk5 proteininin artan səviyyəsindən təsirlənmədiyini təsbit etdik. Əvvəlki hesabatımızda həmçinin Cdk5 immunoprecipitates (Cdk5 immunoprecipitates istifadə edərək ölçüldü zaman TgCdk5 siçan beyin CdkXNUMX fəaliyyəti vahid tipli siçan beyin daha aşağı olduğunu göstərmişdir17), cdk5 oversekspresyonunun p5 səviyyəsinin artırılmaması halında monomer Cdk35 səviyyəsində artım göstərməsini təklif edir. Bu nəticələr p35 protein səviyyəsinin Cdk5 fəaliyyəti üçün dərəcəsi məhdudlaşdıran bir faktordur.

Tgp35 fareler, CREA fosforilasyonunun və c-fos'un kokainin kəskin şəkildə enjeksiyonundan sonra daha az bir induksiya nümayiş etdirərək, kokainə qarşı striatal cavabın artması Cdk5 aktivliyi ilə inhibe edildi. Tgp35 siçanlarında kokainlə əlaqəli dopamin siqnallarının zəifləməsi DARPP-5, PKA və ERK-nı əhatə edən çoxlu siqnal cascades Cdk32 vasitəsi ilə inhibisyonu ilə əldə edilmişdir. Kokain idarəsi Thr-32-də yabanı tipli siçanlarda DARPP-34-in PKA fosforiliyini artırdı, bu cavab isə Tgp35 siçanlarında zəiflədi. Thr-32-də DARPP-34-in PKA fosforiliyi protein-fosfataz 1 (PP1) aktivliyinin inhibe edildiyi göstərilmişdir, CRE-nin 133 seriyasının deposforiliyasından məsul olan ferment27). Beləliklə, PP1 fəaliyyəti Tgp32 siçanlarının DARPP-1 / PP35 yolu ilə antaqonizə edilməyəcəkdir.

ERK1 / 2-nun kokainlə əlaqəli aktivasiyası da Tgp35 siçanlarında zəiflədi. Cdk5-in ERK1 / 2-in kokainlə əlaqəli aktivləşdirilməsini maneə törədə bilən bir neçə fərqli mexanizm var. Birincisi, Thr-5-də DARPP-32-in Cdk75-asılı fosforilasyonu PKA'yı maneə törədirdi və ERK1 / 2 aktivasiyası üçün tələb olunan hər hansı bir PKA vasitəsi ilə MEK1 / 2 aktivliyini sonradan inhibə etməyə gətirib çıxardı. Son zamanlardakı bir araşdırma, MR aktivləşdirmənin dolayı tənzimlənməsi ilə yanaşı striatal zənginləşdirilmiş fosfataz, tirosin və tirozin tənzimlənməsini əhatə edən bir çox yollarla ERK32 / 34-in kokain vasitəsi ilə aktivləşdirilməsi üçün Thr-1-də DARPP-2-in fosforiliyasını tələb edirdi birbaşa ERK1 / 2-da fəaliyyət göstərən fosfataz28). Bu ehtimalın dəstəklənməsi Txp1 siçanlarında Ser-2 və Ser-217-də MEK221 / 35-nun kokainlə bağlı fosforiliyasını ləğv etdiyindən tapılır. Başqa bir ehtimal yol MX5-in Thr-1-də Cdk286 -ə bağlı fosforilasyonu vasitəsilə həyata keçirilir ki, bu da katalitik aktivliyinin azalmasına və ERK1 / 2 aktivliyinin24).

Striatumda Cdk5 aktivliyinin qadağan edilməsinin heyvanlarda kronik kokain müalicəsinin davranış təsirlərini gücləndirməsi göstərilmişdir (6). Cdk5-in fəaliyyətinin yuxarı tənzimlənməsi təkrar kokain tətbiqinin təsirinə qarşı mübarizə üçün nöronal uyğunlaşmaya kömək edə biləcəyi hipotezi ilə uyğun gəlir (6) aşkar etdik ki, DARPP-5 və MEK32-in Cdk1-mediatlı fosforlaşması ERK1 / 2-in kokainlə əlaqəli aktivləşdirilməsinin azalmasına gətirib çıxardı və nəticədə striatumda CREB fosforilyasiya və c-fosun daha az indüksiyasına səbəb oldu. Bizim tapıntılar p5 up-tənzimləməsinin nəticəsində Cdk35 artımının kronik xroniki pozğunluqdan sonra striatumda gen ifadəsini dəyişə biləcəyi ideyasını dəstəkləyir. Bu, CREB və c-fos kimi transkripsiya faktlarının fəaliyyətində dəyişikliklər nəticəsində baş verə bilər. Beləliklə, Cdk5 aktivatoru p35, Cdk5 fəaliyyətinə dərəcəsi məhdudlaşdıran təsirlər səbəbiylə, kokain asılılığının altında yatan nöron funksiyasında uzunmüddətli dəyişikliklərə kömək edə bilər.

Minnətdarlıq

Qeydlər

References