Cdk5 Fosforli Dopamin D2 Receptor və Downstream Sinyalleri Attenuates (2013)

Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y və digərləri. (2013) Cdk5 Dopamin D2 Reseptorunu Fosforə Aldırır və Downstream Sinyalini Attırır. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Redaktor: James Porter, Şimali Dakota Universiteti, Amerika Birləşmiş Ştatları

Alınan: May 20, 2013; Qəbul edildi: Noyabr 14, 2013; Tarix: Dekabr 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Bu şərtlərə görə paylanmış açıq bir məqalədir Creative Commons Attribution Lisenziyası, hər hansı bir mühitdə məhdudiyyətsiz istifadəyə, yayılmağa və reprodüksiyaya icazə verən, orijinal müəllif və mənbə verilmişdir.

Maliyyələşdirmə: Koreya hökumətindən (MSİP) qrantlar (NRF-2012R1A2A2A01012923 və NRF-2012R1A4A1028200) və Koreya NRF (2012K2A1A2033117) və Koreya Brain Araşdırma İnstitutu (KBRI) tərəfindən idarə olunan beynəlxalq əməkdaşlıq proqramı çərçivəsində dəstəklənmişdir. MSIP-in əsas tədqiqat proqramı (2031-415). SKP 2004 və 2006 Milli Şizofreniya və Depressiya Araşdırmaları üzrə Milli Alliance (NARSAD) Gənc İstedadlar Mükafatının alıcısı idi. Fondun tədqiqi, məlumatların toplanması və təhlili, nəşr olunması və ya əlyazma hazırlığı barədə qərar qəbul edilməsində rol oynamışdır.

Rəqabət maraqları: Müəlliflər heç bir rəqabət mənsubu olmadığını bəyan etdi.

giriş

Dopamin siqnalları motorun koordinasiyası, əhval nəzarət və mükafat mexanizmləri daxil olmaqla müxtəlif beyin funksiyalarına cəlb olunur [1]. onurğalı dopamin siqnal əsas komponenti SN (seçilmiş dopamin reseptorları alt ifadə və ventral tegmental sahəsi (VTA) və maddə nigra əsasən dopamin daxil almaq striatal orta tikanlı neurons (MSNs) tərəfindən sərf edilir) [2]. Dopamin reseptorları 7 transmembran domainləri olan G proteinlə əlaqəli reseptorlardır (GPCR) və iki alt tipdən ibarətdir, D1 kimi və D2 kimi reseptorlar, dopamin siqnallarında qarşılıqlı hərəkətlərə vasitəçilik edən [1]. Məsələn, dopamin D1 kimi reseptorlar (D1, D5) G vasitəsilə adenilil siklaza aktivləşdirir_αs və cAMP-nin hüceyrə səviyyəsini artırır, lakin dopamin D2-reseptorları (D2, D3, D4) G vasitəsilə adenilil siklazı inhibe edir_α cAMP-nin hüceyrə səviyyəsini azaldır [1], [3].

Dopamin reseptorları arasında D2 reseptoru (DRD2) şizofreniya və narkomaniya daxil olmaqla bir çox əsas psixiatrik xəstəliklərin patofizyolojisinə aiddir [4]belə ki, bir çox antipsikotik dərmanlar ən azı qismən DRD2 hədəf alırlar. DRD2 fəaliyyətinin heyvan modellərində sui-istifadənin dərman vasitələrinin davranış nəticələrinə yaxşı təsir göstərdiyi də bilinir [5]. Antidepresanlar və əhval stabilizatoru effektliyi də DRD2-in hüceyrə səthində ifadə edilməsində və ya PKA, ERK və GSK3 vasitəçiliyi ilə aşağıda yerləşən intraselluler siqnalların dəyişməsi ilə əlaqədardır [1], [4], [6]. Beyində DRD2 üçün bu kritik rollara baxmayaraq, DRD2 xüsusiyyətlərinə heterojenlik və komplekslik gətirən ətraflı tənzimləyici mexanizmlər tamamilə başa düşülməmişdir.

Birləşən dəlil xətləri göstərir ki, DRD2 fəaliyyətinin dəqiq tənzimləməsində bir çox posttranslasyonal dəyişikliklər iştirak edir. DRD2'ün geniş glikozilasyonu erkən foto-afinite etiketleme işlərində aşkar edilmişdir [7], DRD2 içərisində disülfid bağının formalaşması da ligand bağlanması üçün əhəmiyyətli bir dəyişiklik olaraq təyin edildi [8]. Bundan başqa, DRD2-in fosforilyasiya sahələri əvvəlcə müəyyən edilmişdir vitro radioizotoplarla sınaqdan keçirilməsi, müxtəlif kinazlarla vasitələnən müxtəlif tənzimləmə yolları üçün marşrutların verilməsi [9]. Həqiqətən, protein kinaz C (PKC), intrasellüler kalsiyumun DRD2 vasitəsi ilə səfərbər olunmasını tənzimləyir və DRD2-in sitoskeletal proteinlərlə qarşılıqlı təsirini modullaşdırır [10]. GPCR kinaz 2 (GRK2) tərəfindən fosforlaşması DRD2-in agonistlə bağlı rezensitləşdirmə nümunələrini tənzimləyir [11].

Cyclin-asılı kinaz 5 (Cdk5), əsas aktivatörlerin beyin-spesifik ifadəsi sayəsində imtiyazlı fəaliyyətə malik olan prolin yönümlü serin / treonin kinazdır. p35 və p39 [12]. Cdk5, nöronal miqrasiya və akson rəhbərliyi daxil olmaqla müxtəlif neyronal proseslərdə iştirak edir və Cdk5 və p35 null siçanlarda kortik qatlamada qüsurları göstərir [13]. Son zamanlarda, WAVE1 və ephexinin Cdk5 tərəfindən fosforlaşması dendritik omurun morfogenezini tənzimləyir [14]. Bundan əlavə, Cdk5 həmçinin NMDA reseptorunun, NR2B və NR2A-vasitə ilə işlənmiş NMDA axınlarının səth ifadə səviyyələrini tənzimləyir [15], [16]. Qeyd edək ki, bir çox sübut ədəd Cdk5 və dopamin sistemi arasında intim əlaqələr yaradır. Cdk5, stabilliyini tənzimləyən tirozin hidroksilaza (TH) fosforədir və beləliklə, dopaminergik homeostazı saxlayır [17]. postsinaptik neurons, zaman dopamin və tsiklik-AMP tənzimlənən phosphoprotein-75kD (DARPP-32) Cdk32 ilə fosforüzvi, bu PKA fəaliyyəti mane və beləliklə dopamin DRD5 vasitəçiliyi PKA siqnal kışkırtmak bilər T1 qalıq [18]. Maraqlıdır ki, dopamin reseptorlarının dolayı bir agonisti olan kokain, siçovullarda kronik olaraq tətbiq edildikdə, orta ayaq nöronlarında Cdk5-in mRNA və protein səviyyələri artır [19]. Cdk5, kollektiv olaraq, uyuşturucuya bağlı sinaptik uyğunlaşmalarda iştirak edir. Bu çalışmada DRD2 və Cdk5 funksiyalarının qarşılıqlı təsiri göstərir ki, bu da dpamin siqnallarında Cdk5 rolunu daha da genişləndirir.

Material və metodlar

Antikor

Anti-dovşan serumları, DRD321 üçüncü intrasellüler loopun (D321i2) fosfo-serin 2 (pS3) olan peptidlərə qarşı qaldırıldı. Fosfo-peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), affinity təmizlənməsi üçün peptid-konjuge sütun (20401, PIERCE) üçün istifadə edilmişdir. Anti-pS321 antikoru istehsalçının göstərişindən sonra bir affinity təmizlənməsi sistemi ilə zənginləşdirilmişdir. Purified fosfo antikoru 0.1% sodyum azid və 0.1% jelatinlə PBS-də saxlanılır. Cdk5 / p249-in Western blotting və immunosytochemistry for anti-mouse anti-Cdk35 antikoru (sc-820) və anti-rabbit anti-p5 antikoru (sc-35) istifadə edilmişdir. DRD9996-GFP'nin immunoprecipitation və Western blotting üçün anti-mouse anti-GFP antikoru (sc-2) istifadə edilmişdir. Anti-rabbit anti-FLAG antikoru (sc-807), anti-rabbit anti-HA antikoru (sc-805), anti-fare anti-GST antikoru (sc-138) və anti-mouse anti-GAPDH antikoru (sc- 32293) Santa Cruz Biotexnologiyalarından satın alındı.

Heyvanlar

P35 knockout siçanı, Yaponiyada RIKEN Brain Elm İnstitutunda doktor Katsuhiko Mikoshiba tərəfindən verilən bir hədiyyə idi və əsas nöron mədəniyyəti üçün istifadə edildi. Genotipləmə üçün primer dəstləri əvvəllər təsvir edilən 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC və 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT idi [20]. Beynin lizat hazırlığı üçün ICR siçanları və Sprague Dawley sıçanları istifadə edilmişdir. Bütün heyvan prosedurları Pohang Elm və Texnologiya İnstitutu Heyvan Qulluğu və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edildi.

Plazmid qurur

İnsan DRD2 bir EGFP-N1 plasmid vektor uzun Isoform və DRD2 bir pFLAG-CMV-212 plasmid vektor (uzun Isoform DRD373 üçün unikal 29 əlavə amin turşusu qalıqları, o cümlədən 2-2 amin turşusu qalıqları) üçüncü hüceyrədaxili loop istifadə edilmişdir. İnsan Cdk5 pCMV-HA plazmid vektoruna yerləşdirildi və insan p35 pcDNA 3.1 plazmid vektoruna yerləşdirildi. İnsan Cdk5 immunocytochemistry üçün ikili ifadə tikintinin (Cdk35 / p3.1) etmək üçün bir pcDNA 5 vektor insan p35, reseptor beynəlmiləlçiliyin təhlil [ilə birlikdə sitomeqalovirus (CMV) Promoter altında ilişdi³⁵S] -GTP_γS bağlanma təhlili, radioligand bağlanma testi və cAMP enzim immunoassay.

Vitro Kinaz təhlili

IP ilə əlaqəli vitro kinaz analizi aşağıdakı kimi aparıldı. 3 ml lysed ki, bir bütün siçan beyin lizisi bufer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0) 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) bir Dounce homogenizer bir 20 vuruş almaq üçün homogenized beyin Lysates erythrocytes . Lizatlar 30 dəq üçün buz üzərində inkubasiya olunmuş, sonikləşdirilmiş və 16,000-da santrifüj edilmiş g 10 dəq. Süpernatanlar aktiv Cdk35 / p5 kompleksi əldə etmək üçün anti-rabbit anti-p35 antikoru ilə immunoprecipitated idi. Cdk5 / p35 kompleks və təmizlənmiş GST füzyon proteini adenosin 5'-triposfat, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) və kinaz tamponunda (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) 1 h üçün oda temperaturunda [18], [21]. Purified Cdk5 / p25 kompleksi (14-516, Millipore) həmçinin vitro yuxarıda təsvir edilən kinaz testi. 2 × nümunə yükləmə tamponu reaksiya qarışığına əlavə edildi və 100 ° C'de qaynadıldı. Nümunələr SDS-PAGE-ə tabe edilmişdir və qurudulmuş jel autoradioqrafiya ilə qiymətləndirilmişdir.

Liquid Chromatography (LC) -Mass Spektrometriyası (MS) / MS Təhlili

Rekombinant GST-D2i3 proteinləri IP ilə əlaqəli LC-MS / MS tərəfindən təhlil edilmişdir vitro kinaz testi. X. Tandem (versiya Dec-01-2008) istifadə edərək LC-MS / MS məlumatlarının peptid identifikasiyası aparıldı. Hər bir RAW məlumat faylı əvvəlcə trans-proteomik boru kəməri (TPP; versiya 4.3) istifadə edərək mzXML-ə çevrilmişdir. Dönüştürülmüş mzXML-lərdə MS / MS taramaları X-Tandem istifadə edərək GST-D2010i07 sıra daxil olmaqla UniProt siçan protein zonası bazası verilənlər bazasına (2_3 versiyası) qarşı axtarışa məruz qaldı. Tolerantlıq 3 Da-yə prekursor ionları və 2 Da parçalı ionlar üçün təyin edilmişdir. Tripsin üçün ferment spesifikliyi istifadə edilmişdir. Dəyişən modifikasiya variantları sistein carbamidomethylation (57.021 Da) üçün istifadə edilmişdir, metionin oksidləşmə (15.995 Da) asparagindən hidroliz (0.987 Da) və Serine of phosphorylation (79.966 Da).

İmmunoprecipitation

ELB lizis tamponunda hüceyrə lizatlarında immunopresipitasiya aparıldı. Anti-GFP antikoru, lizatlara əlavə edildi və 3 h üçün 4 ° C-də inkubasiya edildi. İmmünokomplekslər protein A-agarozu ilə təmizlənmişdir. Çöküntülər 30 ° C'de 37 dəq üçün SDS nümunə yükləmə tamponu ilə kuluçkalanmış və SDS-PAGE və Western blotlara məruz qalmışdır.

GST Pull-down Assay

10 μg saflaşdırılmış GST və GST-D2i3 1.5 ° C'de 4 h üçün siçovul beyin lizatı ilə inkubasiya edilmişdir. 30 μL glutatyon (GSH) -xızdıran Sepharose 4B boncukları (17-0756-01, GE Healthcare) lizis tamponu ilə balanslaşdırılmış və əlavə 1 h üçün inkubasiya edilmişdir. Boncuklar 2,000 × da santrifüqasiya ilə toplandıg 4 dəfə lizis tamponu ilə yuyulur [22], [23]. Çöküntülər anti-Cdk5 və anti-p35 antikorları istifadə edərək Western blotting tərəfindən təhlil edilmişdir.

İmmünositokimya

Ləkələr üzərində kültürlənmiş HEK 293 hüceyrələri və striatal neyronlar fosfat tamponlu salin (PBS) ilə bir dəfə yuyulurdu və 4 min üçün soyuq 30% paraformaldehid / PBS daldırma ilə sabitləşdirildi. İbtidai antikor bloklama həllində (2% at serumu və PBS-də 1% Triton X-100) seyreltildi. İkinci bir antikor kimi Alexafluor-647-konjuge anti-siçan antikoru (A20990, Invitrogen) və Alexafluor-568-konjuge anti-dovşan antikoru (A11011, Invitrogen) istifadə edilmişdir. Hoechst nüvənin boyanması üçün istifadə edilmişdir. Şəkillər konfokal mikroskopiya (Olympus, FluoView-1000) tərəfindən əldə edilmişdir.

Reseptorun Daxililəşdirilməsi Təyinatı

Transfeksiyadan sonra 24 h, hüceyrələr 1 μM quinpirol (Q102, Sigma) ilə 30 dəqiqə və 90 dəq. 37 mL soyuq PBS-də hüceyrələr yenidən dayandırıldı və hər reaksiya üçün 2 μL aliquots istifadə edildi. Aşağıdakı konsentrasiyalarda 200 h üçün otaq temperaturunda dərman müalicələri aparılmışdır; 3 nM [³H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpirid (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobik [³H] -spiperon ümumi ifadə edilmiş reseptorları etiketləmək üçün istifadə edilmişdir və hidrofilik sulpirid membranoz reseptorla bağlı [³H] -spiperon siqnalları. Membranla əlaqəli reseptor siqnalları, ümumi ifadə edilən reseptor dəyərlərindən hüceyrə reseptor dəyərlərini çıxararaq hesablanmışdır. Hücrelər bir GF / B (Millipore) süzgəcində süzüldü və yuyucu tampon ilə 3 dəfə yuyuldu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrlər qurudulmuş və qalıq radioaktivlik maye sintillator sayğacları ilə ölçüldü [24].

Hüceyrə Membranına Hazırlıq

Transfeksiyondan sonra 100 mm mədəniyyət qablarında konflikt hüceyrələri buzlu soyuq PBS ilə yuyulur və 1 mL HME tamponunda (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Homojenleşmiş lizatlar 500 dəqiqə üçün xNUMXx ilə santrifüj edilmiş və üstəgəlilər sonradan 15 dəqiqə üçün 36,000 × g ilə santrifüj edilmişdir. HME tamponunda yenidən dayandırılmış pelletlər testlər üçün istifadə edilmişdir.

[³⁵S] -GTP_γS Binding Təlimi

Hücre membran fraksiyaları test tamponunda 1 μM quinpirol (Q102, Sigma) ilə əvvəlcədən inkubasiya edilmişdir (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA və 0.01 mM GSYH) 10 dəq. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) 3 μL-də 30 nM-nin yekun konsentrasiyasına əlavə edilmiş və daha sonra 90 dəqiqə üçün inkubasiya olunmuşdur. 170 μL buzlu bufer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, və 0.1 mM GTP) reaksiya dayandırmaq üçün əlavə edildi. Membranlar bir GF / B filtresinde (Millipore) süzüldü və yuma tamponu (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) ilə 100 dəfə yuyuldu. Süzgəclər qurudulmuş və radioaktivlik sintilasyon sayacından istifadə edilmişdir [25], [26].

Radioligand bağlanma təhlili

Hazırlanan hüceyrə membranları 0.01 nM ilə inkubasiya edilmişdir [³(565 mM HEPES (pH 102), 30 mM MgCl (HNUMX, Sigma)) üçün 25 min üçün H] -piperon (NET-7.5, PerkinElmer) və quinpirol (Q1.5, Sigma)₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranlar bir GF / B filtresinde (Millipore) süzüldü və yuma tamponu (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) ilə 100 dəfə yuyuldu. Reaksiya GF / C filtrlər vasitəsilə sürətli filtrasiya ilə sona çatdı. Qalıq radioaktivlik bir maye sintillation counter istifadə edərək ölçüldü [27]-[29].

cAMP Enzim Immunoassay

Transfekte edilmiş HEK 293 hüceyrələri 10 h üçün 6520 μM rolipram (R1, Sigma) ilə əvvəlcədən işlənmiş və 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) və 102 dəqiqə üçün quinpirolun artan konsentrasiyaları (Q30, Sigma) ilə müalicə olunmuşdur. İbtidai kültürlü striatal nöronlar, 10 h üçün 1 μM rolipram ilə müalicə olundu, sonra 1 h üçün 1 μM dopamin [22]. Hücre lizatları 0.1 M HCl ilə hazırlanmış və cAMP səviyyəsi cAMP enzim immunoassay dəsti (Sapphire Bioscience) tərəfindən istehsalçının göstərişindən sonra aşkar edilmişdir.

İbtidai Cultured Striatal Neyron

Striatal sahə sümük embrion beynindən (E15) təcrid olunmuşdur. 11095% tripsin (T0.25-4549, Sigma) və 100% DNase I ehtiva edən minimal əsas mühitdə (0.1, Invitrogen) 6 ° C-də dississiya olunmuş toxuma ayrıldı. Hücrelər örtük vasitələrində (37 M HEPES (pH 0.01) və 7.4% (həcm / həcm) at serumu (10-16050, GIBCO) olan MEM-də yenidən suspened edilmişdir. Nöronlar 122 gün üçün kültür edilmişdir vitro (DIV 7) CEMP enzim immunoassays tətbiq olunmadan B27 əlavə (17504-044, Invitrogen) ilə MEM.

Nəticələr

DRD5 üçüncü intrasellüloz döngəsində Cdk321 fosforli sirkə serum 2 vitro

Yeni Cdk5 substratlarını müəyyən etmək üçün Cdk5 tanıma konsensusları sırası olaraq (S / T) PX (K / H / R) [30] və DRD2'i namizəd substrat olaraq təyin etdi. Serin 321 daxil olmaqla konsensus ardıcıllığı DRD2 üçüncü intraselüler döngədə yerləşdirilib (D2i3), müxtəlif tənzimləyici mexanizmlər aiddir [3], [10], [11]. Ardıcıllıq təkamülçülərdə DRD2-da təkamül yolu ilə saxlanılır və qalıqların funksional əhəmiyyətini (Şəkil 1A).

Download:   

• PPT

  PowerPoint slaydı

• PNG

  böyük şəkil (2.08MB)

• TIFF

  orijinal şəkil (4.36MB)

Şəkil 1. Cdk5, DRD321 üçüncü hüceyrə döngəsindəki serin 2 fosforini açır in vitro.

(A) müxtəlif növlərdən (gölgeli) DRD2-in mühafizə olunan bölgələrini göstərən amin turşu dizisi hizalaması. Potensial Cdk5 fosforilyasiya sahəsi bir ulduzla göstərilir. (B) IP bağlıdır vitro rekombinant GST-D2i3 və GST-D2i3 mutant proteinləri ilə kinaz təhlili. Kinaz reaksiyaları üçün anti-p5 immunoprecipitation tərəfindən siçan beyin ekstraktı zənginləşdirilmiş Cdk35 / p35 kompleksi istifadə edilmişdir. Fosforlanmış zülalların autoradioqrafı həmin jelin Coomassie parlaq mavi boyanması ilə birlikdə göstərilir. Arrowhead, GST-D2i3s uyğun olan radioaktiv siqnalları göstərir və açıq ox p35-dən radioaktiv siqnalları göstərir. (C) D2i3 fosforli peptid fragmentinin MS / MS spektri. Theoretical parçalanma nümunələri spektrinin altında göstərilir. Bütün fragment ionları arasında təsbit edilən y- və b-ionları spektrdə ifadə edilir. Y₆ və y₇ ionları serin 321-in fosforiliyasını güclü göstərir. (D) In vitro GST-D5i25 və GST-D2i3 mutant proteinləri istifadə edərək saflaşdırılmış Cdk2 / GST-p3 kompleksi ilə kinaz təhlili. Fosforlanmış zülallar, Coomassie parlaq mavi boyama ilə birlikdə autoradiograph ilə göstərildi. Arrowhead radioaktiv siqnal müvafiq GST-D2i3 göstərir və açıq ok başlığı GST-p25-dən radioaktiv siqnalları göstərir.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

D5i2-ni fosforilatmaq üçün Cdk3-ın həcmini qiymətləndirmək üçün biz IP-əlaqəli vitro substrat kimi təmizlənmiş rekombinant GST-D5i35 (amin turşusu qalıqları 35-2) proteinləri ilə p3 immunoprecipitation tərəfindən siçan beyin lizatından zəngin olan aktiv Cdk212 / p373 kompleksi istifadə edərək kinaz testləri. Biz təmizlənmiş GST-D2i3 və GST-D2i3 S297A proteinlərində fosforilasyon siqnallarını müşahidə etdik, lakin siqnal GST-D2i3 S321A (Şəkil 1B). GST-D321i2-də serin 3-in fosforilyasiyasını daha doğrulamak üçün, IP-bağlı nümunələrin LC-MS / MS analizi vitro LTQ XL kütlə spektrometriyası istifadə edərək kinaz testləri. Ardıcıl olaraq, fosfo-serin 321 peptidlərin kütləsinə uyğun olan fosfo-peptidlər bərpa edilmişdir (Şəkil 1C). LC-MS / MS analizi zamanı məlumatlara asılı əldə edilməsi nümunədə zəngin zülalları aşkar etməyə çalışır. [31], bu məlumatlar serin 321 qalıqlarının D5i2 regionunda Cdk3-in dominant fosforilyasiya sahəsidir. Cdk321 tərəfindən GST-D2i3-də serin 5-in birbaşa fosforiliyini sübut etmək üçün, vitro saflaşdırılmış rekombinant GST-D5i25 proteinləri ilə təmizlənmiş Cdk2 / GST-p3 kompleksi istifadə edərək kinaz təhlili aparılmışdır. GST-D2i3-də GST-D2i3 S321AŞəkil 1D). Birlikdə aparılan bu nəticələr, D2i3 S321 qalınlığının Cdk5-vasitə ilə əlaqəli fosforiliyə üçün üstünlük təşkil etdiyini göstərir.

Cdk5 Hüceyrədə DRD321 Üçüncü İntasküler Döngədə Serin 2 Fosforatları

Serin 321-in fosforiliyasını müəyyən etmək üçün biz fosfor-serin 321 (pS321) üçün xüsusi antikoru qaldırdıq. IP-bağlı nümunələr vitro kinaz analizi anti-pS321 antikorundan istifadə edərək Western blotinqi ilə təhlil edilmişdir. Blots kinaz reaksiyasında fərqli bir qrup göstərdi ki, bu da GST-D2i3 (Şəkil 2A). DRD321-də serin 2-də Cdk5-də serin 293-də hüceyrələrdə potensial fosforilliyini yoxlamaq üçün HA-Cdk2 və ya p2 ilə DRD321-GFP və DRD5 S35A-GFP ifadə edən HEK 321 hüceyrələrindən anti-GFP immunoprecipitates anti-GFP istifadə edərək Western blotting tərəfindən analiz edilmişdir və anti-pS2 antikorları. DRD2'ün aşırı glikozilasyonundan dolayı bilinen anti-GFP antikoru tarafından karakteristik bulaşmış band sinyalleri DRD321-GFP'nin varlığında gözlenir ve anti-pS2 antikoru, yalnız Cdk5 / p35 co ifadesi ile benzer DRDXNUMX sinyalleri algılarŞəkil 2B) [7]. Serin 321'in Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) və D2i3 mutant forması (FLAG-D2i3 S321A) tərəfindən fosforiliyasını daha doğrulamak üçün yaradılmışdır. HEK 2 hüceyrələrində HA-Cdk3 və p2 ilə ifadə olunan və ya ifadə edilməyən FLAG-D3i321 və FLAG-D5i35 S293A SDS-jel hərəkətlilik dəyişməsi təhlili ilə təhlil edilmişdir. FLAG-D5i2 üçün əhəmiyyətli bir Cdk3-asılı hərəkətlilik dəyişikliyi müşahidə edildi, lakin FLAG-D2i3 S321A (Şəkil 2C). Ayrıca SerxNUMX'ta agonist stimulasyonla DRD2'un fosforilasyon səviyyəsini qiymətləndirdik. DRD321-GFP və Cdk293 / p2 komplekslərini ifadə edən HEK 5 hüceyrələri quinpirol ilə stimullaşdırıldı və anti-GFP və anti-pS35 antikorları istifadə edərək, Western lekotizasiya ilə hücum lizatlarından anti-GFP immunoprecipitates analiz edildi. SerxNUMX-da DRD321-in Cdk5-mediatlı fosforilasiyasının GRK- və PKC vasitəçiliyi olan fosforilasyonlardan fərqli olan agonist stimulatordan təsirlənmədiyini təsbit etdik (Şəkil 2D) [32], [33]. Birlikdə bu nəticələr göstərir ki Cdk5 hüceyrə mühitində DRD321 serin 2 qalıqını fosforilə bilər.

Download:   

• PPT

  PowerPoint slaydı

• PNG

  böyük şəkil (1.92MB)

• TIFF

  orijinal şəkil (3.5MB)

Şəkil 2. Cdk5 hüceyrələrdə DRD321 üçüncü hüceyrə döngəsindəki serin 2-ni fosforə verir.

Serin 5-in Cdk321-mediated fosforilasyonu anti-pS321 antikoru istifadə edərək təhlil edilmişdir. (A) IP-bağlı nümunələr vitro GST-D2i3 proteinlərindən istifadə edərək kinaz analizi göstərilmiş antikorlarla Western blotting (WB) tərəfindən təhlil edilmişdir. Arrowheads GST-D2i3s-i göstərir. (B) DRD2-GFP və DRD2 S321A-GFP HEK 5 hüceyrələrində HA-Cdk35 və p293 və ya olmadan ifadə edildi. Anti-GFP immunoprecipitates anti-GFP və anti-pS321 antikorları istifadə edərək Western blotting tərəfindən təhlil edilmişdir. Mötərizədə DRD2 siqnallarını göstərir və açıq ok başlığı anti-GFP immunoprecipitateslərdən nonspesifik siqnalları göstərir. '% input' bir IP reaksiya üçün ümumi lizatın həcmi. Zəif endogen Cdk5 siqnalları ulduzlarla göstərilmişdir. (C) Jel ​​hərəkətliliyinin dəyişməsi təhlili. Göstərilən kimi transfekte edilmiş HEK 293 hüceyrələri Western blotting tərəfindən təhlil edilmişdir. Transfekte edilmiş HEK 293 hüceyrələri quinpirol ilə müalicə edildi və anti-GFP immunoprecipitates anti-GFP və anti-pS321 antikorları ilə Western bloting tərəfindən təhlil edildi. Openheadhead anti-GFP immunoprecipitates dən nonspesifik siqnalları göstərir.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Kompleksi və DRD2 fiziki cəhətdən bağlıdır

Cdk5 / p35 kompleksi ilə DRD2 arasındakı potensial fiziki qarşılıqlılığı araşdırdıq, çünki bir çox Cdk5 substratının Cdk5 / p35 kompleksi ilə fiziki olaraq əlaqəli olduğu bilinir [23], [34], [35]. Birincisi, GST-nin açılan sınaqları həyata keçirildi. Purified rekombinant GST-D2i3 protein siçovul beyin lizatı ilə inkubasiya edilmiş və Western blotting üçün GST açılan precipitates analiz edilmişdir. Göstərildiyi kimi Şəkil 3A, DRD5 və Cdk35 / p2 kompleksi arasında fiziki qarşılıqlı təsir göstərən, aşağı çəkən çöküntülərdə endojen Cdk5 və p35 müəyyən edilmişdirŞəkil 3A). Bundan başqa, DRD5-GFP və Cdk35 / p293 (ifadə edən HEK 2 hüceyrə lizatları) anti-GFP immunoprecipitateslərində HA-Cdk5 və p35 aşkar edilmişdirŞəkil 3B). Bundan əlavə, immunositokimyəvi analizlər etdik və DRD2-GFP, HA-Cdk5 və p35 HEK 293 hüceyrələrinin membran bölgəsində əhəmiyyətli ko-lokalizasiya siqnallarını göstərdiyini müşahidə etdikŞəkil 3C, yuxarı panellər). Nöronal kontekstdə DRD2 və Cdk5 / p35-ın birgə lokalizasiyası tədqiq edilmişdir. DRD2-GFP ardıcıl olaraq, DRD5 və Cdk35 / p7 (həmçinin DRD2 / p5) arasında funksional əlaqələri dəstəkləyən, cultured striatal neyronlarda (DIV35) endojen CdkXNUMX və pXNUMX ilə əhəmiyyətli ko-lokalizasiya göstərmişdirŞəkil 3C, alt panelləri). Nəticələr DRD2 və Cdk5 / p35 bir kompleks təşkil edə biləcəyini və beləliklə, DRD2'un Cdk5'un fizioloji bir substratı olduğu anlayışını dəstəklədiyini göstərir.

Download:   

• PPT

  PowerPoint slaydı

• PNG

  böyük şəkil (3.91MB)

• TIFF

  orijinal şəkil (5.35MB)

Şəkil 3. Cdk5 / p35 DRD2 ilə kompleks qura bilər.

(A) Siçovul beyin ekstraktı ilə təmizlənmiş rekombinant GST-D2i3 proteinindən istifadə edərək GST pull-down təhlili. GST açılan çöküntüləri Western blotting analizlərinə məruz qaldı. 'Boncuk' GST proteinləri olmadan açılır çöküntüləri göstərir. (B) DRD2 və Cdk5 / p35 kompleksinin immunoprecipitasiyası. Transfeksiyalı hüceyrələrdən alınan lizatlardan Anti-GFP IP Western blotting analizlərinə məruz qaldı. Mötərizədə DRD2 siqnallarını göstərir və açıq ok başlığı anti-GFP immunoprecipitateslərdən nonspesifik siqnalları göstərir. Girdilər üçün daha çox işıqlı bir blot da sağda göstərilir. (C) DRD2 və Cdk5 / p35-in immunositokimyəvi analizləri. DRD293-GFP və Cdk2 / p5 ifraz edən HEK 35 hüceyrələri anti-Cdk5 və anti-p35 antikorları (Üst panellər) ilə boyandı. DRD2-GFP, kültürlü striatal nöronlarda tək-tək ifadə edildi və anti-Cdk5 və anti-p35 antikorları (Alt panellər) ilə boyandı. Hoechst nüvənin boyanması üçün istifadə edilmişdir. Ölçək barı 5 μm'dir. Bütün şəkillər konfokal mikroskopiya (Olympus, FluoView-1000) istifadə edilmişdir.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5-in Cdk2 vasitəçiliyi ilə fosforlaşması reseptor aktivliyini azaldır

Fosforiliyin GPQ-ların kritik xüsusiyyətlərini G-protein coupling, reseptor daxiliizasiya, hüceyrə lokalizasiyası və modülatör zülalları ilə birləşməsi kimi modullaşdırdığı bildirilmişdir [9], [11], [24]. AGönülçüyə bağlı reseptorun daxililəşdirilməsi siqnal ötürücüsünün kritik tənzimləmə prosesidir. DRD5 daxiliizasiya Cdk2-mediated modulation tədqiq. DRD293-GFP və DRD2 S2A-GFP'yi ifadə edən Hek 321 hüceyrələri Cdk5 / p35 ilə və ya olmadan, 1 μM quinpirol ilə agonist-stimullaşdırılmış DRD2 daxiliizasiyasınıŞəkil 4A). [³H] -spiperon sinyalleri xNUMX min quinpirol müalicəsində əhəmiyyətli dərəcədə azaldılmış və 2 dəqiqədə bərpa olunmuşdur. Maraqlıdır ki, [³DRD2-GFP və Cdk5 / p35 eksprese edən hüceyrələrin H] -spiperon siqnalları da 30 min quinpirol müalicəsində azaldılmış, lakin 90 minŞəkil 4A, ikinci bölmə). Digər tərəfdən, [³DRD2 S321A-GFP hüceyrələri ifadə edən H] -spiperon siqnalları 30 dəqiqədə azaldılmış və Cdk90 / p5 ilə birgə ifadədən asılı olmayaraq 35 dəqiqədə bərpa edilmişdir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, daxililəşdirilmiş DRD2 uzunmüddətli agonist stimullaşdırılması ilə plazma membrana geri çevrilir [11]. TDRD5'in Cdk2 aracılı fosforilasyonu, agonistle ilişkili DRD2 içselleştirilmesini takiben resenzitizasyon süreçlerine katılmaktadır.

Download:   

• PPT

  PowerPoint slaydı

• PNG

  böyük şəkil (387KB)

• TIFF

  orijinal şəkil (1.31MB)

Şəkil 4. Cdk5-mediatlı fosforilyasiya DRD2 səthinin ifadəsini və aşağı siqnalizasiyasını azaldır.

(A) DRD2,³H] -spiperon bağlanma təhlili. Transfekte edilmiş HEK293 hüceyrələri göstərilən vaxt üçün 1 μM quinpirol ilə stimullaşdırılıb və 3 nM [³3 saat ərzində H] -spiperon müalicəsi. Radioaktivlik ölçülmüş və yerüstü siqnallar hesablanmışdır. Xəta çubuqları orta ± SE-ni təmsil edir (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Dunnett post hoc testi ilə birtərəfli ANOVA: bütün sütunları idarəetmə sütunu ilə müqayisə edin). (B) [³⁵S] -GTP_γS bağlanma təhlili. Hücre membranları göstərildiyi kimi transfekte edilmiş hüceyrələrdən hazırlanmışdır. Membran preparatları 1 μM quinpirol və 3 nM [³⁵S] -GTP_γ90 dəqiqə S. Xəta çubuqları orta ± SE-ni təmsil edir (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Bonferroni post hoc testi ilə birtərəfli ANOVA: bütün cüt sütunları müqayisə edin). (C) Quinpirole ilə rəqabət edən [³H] -spiperon bağlanma təhlili. Transfeksiyalı hüceyrələrdən olan məmə preparatları 0.01 nM ilə inkubasiya edilmişdir [³H] -spiperon və 30 dəqiqə ərzində kinpirolun artan konsentrasiyası. Qeyri-xətti reqressiya GraphPad tərəfindən əldə edilmişdir. Xəta çubuqları orta ± SE (n = 3) göstərir. (D) transfekte edilmiş HEK 293 hüceyrələrində cAMP fermenti immunoassayları. Transfekte edilmiş hüceyrələr 10 saat ərzində 1 µM rolipram ilə əvvəlcədən müalicə olundu və daha sonra 0.1 µM forskolin və 30 dəqiqə ərzində kinpirolun artan konsentrasiyası ilə birlikdə müalicə olundu. Qeyri-xətti reqressiya GraphPad tərəfindən əldə edilmişdir. Xəta çubuqları orta ± SE (n = 4; ** p <0.01; iki quyruqlu) təmsil edir t- tövsiyələr). (E) Çöl tipli və p35 nekroz embriyoslarından (DIV 7) kültürlü striatal nöronlar 10 h üçün 1 μM rolipram ilə işlənmiş və 1 h üçün 1 μM dopaminin ardından. Hata barları ortalama ± SE (n = 4; **p<0.01; iki quyruqlu t- tövsiyələr).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Bundan əlavə, Cdk2-mediatlı fosforilasyonla əlaqəli DRD5-ə agonist-stimullaşdırılmış G protein coupling potensial dəyişikliyi qiymətləndirdik [³⁵S] -GTP_γS bağlanma təhlili [25], [26]. DRD2-GFP və Cdk2 / p321 olmadan və ya olmayan DRD5 S35A-GFP HEK 293 hüceyrələrində ifadə edildi. Membranlar 1 μM quinpirol ilə hazırlanmış və stimullaşdırılmışdır və daha da icazə verilmişdir [³⁵S] -GTP_γS birləşməsi. DRD2-GFP və Cdk5 / p35 hüceyrə membranlarını ifadə edənlər əhəmiyyətli dərəcədə pozulmuşdur [³⁵S] -GTP_γBütün digər hüceyrə membranları ilə müqayisədə S bağlanması (Şəkil 4B). Bu nəticələr Cdk5-mediatlı fosforiliyenin DRD2-da agonist-stimullaşdırılmış G protein bağlanmasının aşağı səviyyədə tənzimləndiyini göstərir.

Bundan əlavə, quinpirol-rəqib [³H] -spiperon bağlanma təhlilləri Cdk2-mediatlı fosforilyasiya ilə DRD5-də agonist-yaxınlığında potensial dəyişiklikləri araşdırmaq üçün aparılıb. Müsabiqənin [³H] -spiperon xinpirolun artan konsentrasiyalarının müalicə edilməsindən membran preparatına müalicəsi ilə ölçüldü. Quinpirol və [³H] -spiperon DRD2-GFP və DRD2 S321A-GFP də oxşar logK_i (DRD9.789-GFP üçün 2; -9.691, DRD2 S321A-GFP üçün), DRD2 üçün ligandın yaxınlığının DRD5-də Cdk2-vasitə ilə əlaqəli fosforilasyondan əhəmiyyətli dərəcədə təsirlənmədiyini bildirirŞəkil 4C).

Cdk5-vasitəçiliyi Fosforilyasiya Down-DRD2-cAMP siqnalizasiya yolunu tənzimləyir

Daha sonra, Cdk2 tərəfindən DRD5 modifikasiyasının aşağıya doğru sinyalizasiya yollarını təsir etdiyini araşdırdıq. CAMP enzim immunoassayından istifadə edərək, DRD2-GFP və DRD2 S2A-GFP ifadə edən hüceyrələrdə adenilil siklaza görə forksolin stimullu cAMP istehsalının DRD321-vasitə ilə inhibe edilməsini izləyirik. DRD2-ifadə edən hüceyrələr doza bağlı şəkildə quinpirole cavab olaraq cAMP səviyyələrinin azaldığını göstərir. Qeyd edək ki, Cdk5 / p35-in birgə ifadəsi cAMP formasiyasının maksimal inhibisyonunuŞəkil 4D, sol panel). Digər tərəfdən, DRD2 S321A-GFP eksperiment edən hüceyrələrdə cAMP formasiyaları, Cdk5 / p35 (Şəkil 4D, sağ panel). Bu nəticələr DRD5'in Cdk2 vasitəçiliyi ilə fosforlaşmasının DRD2'in inhibitor fəaliyyətinin aşağı cAMP sinyallaşma yolunda azaldığını göstərir. Daha fiziologiyaya uyğun bir vəziyyətdə hadisələri daha da təsdiqləmək üçün, əsas Cdk35 aktivatoru olan p5-də çatışmazlıq olan nokta embriyoslarından birincil kültürlü nöronlardan istifadə etdik. Birincil kültürlü striatal nöronlar 1 μM dopamin ilə müalicə olunmuş və cAMP enzim immunoassayla analiz edilmişdir. P35 knockout siçanlarından gələn neyronlar dopamin ilə stimullaşdırıldığında vahşi tip nöronlarla müqayisədə azalmış cAMP səviyyələrini nümayiş etdirdi (Şəkil 4E). TBirlikdə aken, DRD5'ün Cdk2 aracılı fosforilasyonunun DRD2 tarafından uygulanan cAMP yolunda inhibitör tonunda bir azalmaya yol açtığını düşündük.

Müzakirə

DRD2-nu yeni bir Cdk5 substratı olaraq təyin etdik. Fosforilasyon DRD2 səthinin aşağı səviyyədə tənzimlənməsinə səbəb olur və DRD2-in reseptorun daxililəşməsindən sonra belə DRD2 G_i-Couping və aşağı cAMP yolunun. Fosforilasyon qalıqları S321 həm DRD2-də, həm də uzun izoformlarda mövcud olduğundan, bu işdə təklif olunan mexanizm DRD2 vasitəsi ilə işlənmiş sinyalizmə ümumi rejim ola bilər.

Orta damar nöronlarında DRD2 yalnız böyük bir dopamin qəbuledici alt növü olaraq qəbul edilməmişdir, həm də ekoloji xəbərdarlıqlara cavab verən mövcudluqdakı dəyişikliklərə həssaslıqla tanınmışdır. DRD2-in agonistlə bağlı desensitizasiyası və reensitizasiyası geniş şəkildə tədqiq edilmişdir [11], [24]. Xüsusilə, bir sıra tədqiqatlar göstərir ki, striatal sinapsda dopaminin ekstrasellüler səviyyəsini yüksəldən kokain və amfetamin kimi xroniki psixostimulyar təsirlərin təsirləri DRD2 postsinaptik olaraq dinamik dəyişikliklərlə müşayiət olunur [36]. Həqiqətən, kronik kokain istifadəçilərinin striatal bölgədə DRD2 səviyyələrini azaltdığı bilinir və nucleus accumbens (NAcc) içindəki DRD2 mövcudluğu, siçan və primatlarda narkotik maddə axtarma və gücləndirici davranışlar ilə mənfi bir əlaqə göstərir [37]-[39]. Bu tapıntılar DRD2 funksionallığının xroniki narkotik riskin də daxil olduğu müxtəlif xəbərdarlıqlara cavab olaraq adaptiv və ya kompensasiya tənzimlənməsinə çox həssas olduğunu göstərir. Bizim nəticələr göstərir ki, DRX321 üçüncü hüceyrə döngüsündəki S2 qalıqları Cdk5 tərəfindən fosforlana bilər və DRD2-in cAMP yolunda inhibitor təsirinin azalmasına səbəb olur. Bu qarşılıqlı əlaqə DRD5 səthinin mövcudluğunun dinamik təbiətinə zidd ola biləcək dopamineşektiv neyronlarda Cdk2 ilə əlaqəli yeni bir tənzimləmə mexanizmini təklif edir.

Qeyd etmək lazımdır ki, Cdk5 neyronal mühitdə adaptiv dəyişikliklərin vasitəçiliyində əsas komponentdir. Məsələn, limbik dövranın nöronlarında dendritik spinlerin struktur və funksional dəyişiklikləri təkrarlanan psixostimulyar təsirlərin nəticələrindən biridir [40]. Bu dəyişikliklər cAMP reaksiyası elementli bağlayıcı protein (CREB) və ΔFosB, transkripsiya faktorları daxil olmaqla müxtəlif molekulyar dəyişikliklərlə müşayiət olunur, bu da kronik kokain tətbiqinə [41], [42]. Vacibdir ki, Cdk5 ΔFosB hədəfidir [19], PSD-95, p21-aktivləşdirilmiş kinaz (PAK), β-catenin və spinofilin kimi dendritik spin dinamikasında iştirak edən bir çox mühüm komponent Cdk5 substratları [43]-[46]. Cdk5 aktivliyinin genetik və ya farmakoloji manipulyasiyaları dendritik omurum morfologiyasını və kokainə davranış reaksiyalarının dəyişməsini təmin edərək, mezolimbik dopamin sxemlərinin molekulyar və morfoloji dəyişikliklərində Cdk5 üçün kritik rolları nəzərdə tutur [47], [48]. DRD2'un Cdk5-in yeni bir hədəfi olduğunu göstərən nəticələr, sonradan Cdk5-nin ΔFosB vasitəsi ilə up-tənzimlənməsi nəticəsində DRD2-in fosforilyasiyasına səbəb ola bilər, çünki dopamin sisteminin adaptiv dəyişikliklərinə əlavə məlumat verir. . Bundan əlavə DRD2, cAMP və MAP kinaz yollarının tənzimlənməsi və aşağıda transkripsiya hadisələri daxil olmaqla çoxsaylı mobil prosesləri təsirli olduğu bilinir [42], [49]. Beləliklə, bu tədqiqatdakı tapıntılar Cdk2 tərəfindən DRD5-nun birbaşa tənzimlənməsini əks etdirmir, həm də dopamin sisteminin xroniki narkotikə məruz qalmasına adaptiv reaksiyalara dair yeni bir fikir verir.

Müəllif iştirakları

JJ YUP DH SKP. Denemeler gerçekleştirildi: JJ YUP DKK YK. Məlumatları təhlil: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Tərkibli reagentlər / materiallar / analiz vasitələri: YHS. Qəzet yazdı: JJ SKP.