Diabetoloji. 2017; 60 (8): 1502-1511.
2017 May 20 onlayn nəşr olundu. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1mücərrəd
Məqsədlər / fərziyyə
Pəhriz yağlarının aşınması insanlarda və kemiricilərdə piylənməyə səbəb olur. İnsanlarda və kemiricilərdə aparılan son tədqiqatlar, yağlara bağımlılığın, beyin mükafatlandırma sistemlərinin pozulması baxımından spirt, nikotin və narkotik maddələrə asılılıq ilə ortaq bir mexanizmi paylaşdığını göstərdi. Yüksək yağlı bir pəhrizin (HFD) striatumda siqnal verən dopamin D2 reseptorunu (D2R) aktivləşdirməsi, beyin mükafatlandırma sisteminin əsas tənzimləyicisi olduğu və hedonik həddindən artıq olmasına səbəb olduğu vurğulanmışdır. Daha əvvəl bildirmişdik ki, qəhvəyi düyüə məxsus bioaktiv tərkibli constit-oryzanol hipotalamik nəzarət vasitəsi ilə bir HFD-yə üstünlük verir. Buna görə siçanlarda γ-oryzanolun beyin mükafatlandırma sisteminin işini modulyasiya etmə ehtimalını araşdırdıq.
metodika
Bir HFD ilə qidalanan kişi C57BL / 6J siçanları γ-oryzanol ilə şifahi müalicə edildi və D2R siqnalında iştirak edən molekulların striatal səviyyəsi qiymətləndirildi. Γ-oryzanolun D2R təbliğatçısının DNT metilizasiyasına təsiri və pəhriz yağına üstünlük verilməsində sonrakı dəyişikliklər araşdırıldı. Bundan əlavə, DNK metiltransferazalarının (DNMTs) güclü bir inhibitoru olan 5-aza-2′-deoksisitidinin qidaya üstünlük verməsi, D2R siqnal və striatumdakı DNMTs səviyyələri təsiri araşdırıldı. Γ-oryzanolun DNMT-lərin fəaliyyətinə inhibitor təsirləri in vitro-da enzimatik olaraq qiymətləndirilmişdir.
Nəticələr
Bir HFD ilə qidalanan siçanlardan striatumda, D2R'nin qoruyucu bölgəsində DNT metilasyonunun artması ilə D2R'nin istehsalı azaldı. Γ-oryzanolun oral qəbulu DNMT-lərin ifadəsini və fəaliyyətini azaldı və bununla da striatumdakı D2R səviyyəsini bərpa etdi. DNMT-lərin 5-aza-2′-deoksisitidin tərəfindən farmakoloji inhibe edilməsi pəhriz yağına üstünlük verilməsini də yaxşılaşdırdı. Bu tapıntılara uyğundur, in vitro analizləri, γ-oryzanol DNMT-lərin fəaliyyətini maneə törətdiyini göstərdi.
Nəticələr / şərh
Siçanların striatumundakı D2R təbliğat bölgəsinin γ-oryzanol HFD-in DNT hipermetilizasiyasını yaxşılaşdırdığını göstərdik. Təcrübəli paradiqmamız γ-oryzanolu yeni bir epigenetik modulyator olmağın fərqli xüsusiyyəti ilə perspektivli bir antiobesity maddə kimi vurğulayır.
Elektron əlavə material
Bu yazının onlayn versiyası (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4), səlahiyyətli istifadəçilər üçün nəzərdən keçirilmiş, lakin redaktə olunmamış əlavə materialdan ibarətdir.
giriş
Şişman insanlarda həddindən artıq qidalanma, ən azı qismən alkoqol, nikotin və narkotik maddə asılılığı olan ümumi mexanizmləri bölüşür [1]. İştahın hipotalamik və hormonal tənzimlənməsi ilə yanaşı beyin mükafatlandırma sistemi, xüsusən dopamin reseptor siqnalları asılılıq və ya hedonik qidalanma davranışı ilə sıx əlaqəlidir.2]. Siçovullardakı əvvəlki bir tədqiqat, striatal dopamin D2 reseptorunun (D2R) lentivirusla əlaqəli qısa saç tırnağı ilə RNT-yə müdaxilə edən RNİ-yə sürətlə bağışlanmaya bənzər mükafat çatışmazlıqları və məcburi qidalar axtarması göstərdi.3]. D2R sıxlığının azaldığı üçün dorsal striatum, obez insanlarda və kemiricilərdə arıq nəzarət qrupları ilə müqayisədə qida mükafatına daha az reaksiya göstərir.3-5]. Bu anlayışa uyğun olaraq TaqIA alleli ANKK1 striatal D2R istehsalını azaldan gen lokusu (DRD1 / ankirin təkrarlanması və 2 olan kinaz sahəsini kodlaşdırma), insanlarda obez fenotip ilə əlaqələndirilir.6], bariatrik əməliyyatdan sonra kilo itkisinin təsiri yüksələn striatal D2R sıxlığı ilə əlaqələndirilir [7]. Bu məlumatlar, piylənmənin müalicəsi üçün yeni bir terapevtik hədəf olaraq striatal D2R-in əhəmiyyətini ciddi şəkildə ifadə edir. Bununla birlikdə, beyin mükafatlandırma sistemində hərəkətə gətirilən bəzi dərmanlar, ciddi psixiatrik problemlər də daxil olmaqla xeyli mənfi təsirlərə səbəb olmuş və nəticədə klinikalardan geri çəkilmişdir.8].
Epigenetik modifikasiyalar təkcə inkişaf və fərqləndirmə baxımından vacib deyil, həm də ətraf mühitdəki dəyişikliklər, o cümlədən pəhriz və həyat tərzi nəticəsində ortaya çıxdığına görə vacibdir [9]. DNT metilasyonu gen ifadəsinin sabitliyi üçün əsas epigenetik hadisədir.9]. Siçovullarda, yüksək yağlı bir diyetə (HFD) məruz qalan analara, nəsillərdəki mərkəzi mükafat sistemi içərisində DNT metilasyonunu dəyişdirərək, HFD'nin balalar tərəfindən həddən artıq istehlak edilməsinə səbəb olur.10]. Xüsusilə, DNT metiltransferazaları (DNMTs) həm qidalanma davranışının, həm də fiziki fəaliyyətinin tənzimlənməsində mühüm rol oynayır [10, 11], DNMT'lərin piylənmə-diabet sindromu müalicəsində ümidverici bir terapevtik hədəf ola biləcəyini irəli sürdü. Vacibdir ki, bəzi təbii qida mənbələri olan maddələr, o cümlədən kofein turşusu və epiqallokatechin DNMT inhibitorları kimi fəaliyyət göstərirlər [12, 13].
Bu yaxınlarda göstərdik ki, bioaktiv, qəhvəyi düyüə məxsus komponent fer-oryzanol, ferul turşusu esterinin və bir neçə fitosterolun qarışığı hipotalamik endoplazmatik retikulumun (ER) azalması ilə pəhriz yağına üstünlük verir.14]. Siçanlarda və dovşanlarda ağızdan idarə olunan γ-oryzanol bağırsaqdan sürətlə sorulur və əsasən beyinə paylanırdı.15, 16]. Bu tapıntıları bir araya gətirərək, mərkəzi sinir sisteminə təsir göstərən təbii qida məhsullarından istifadə, obezlikdə zəiflədilmiş qidalanma davranışına alternativ ola bilər. Bu çərçivədə, γ-oryzanolun beyin mükafatlandırma sistemindəki DNT metilasyon vəziyyətini dəyişdirməsi ilə nəticələnən fərziyyəni sınadıq və nəticədə siçanlarda bir HFD-yə üstünlük verildi.
metodika
Heyvanlar
Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japan) -dan alınan yeddi həftəlik bir kişi C57BL / 6J siçanları, 3 saat / 4 saatlıq bir işıq altında 24 ° C-də spesifik patogen olmayan şəraitdə (kafes başına 12-12) yerləşdirildi / qaranlıq dövr. Bir həftəlik uyğunlaşmadan sonra 8 həftəlik siçanlar çəki ilə uyğunlaşdırıldı və hər təcrübədən keçmək üçün iki və ya üç qrupa ayrıldı. Siçanların yeməyə və suya sərbəst girişi təmin edildi. Bütün heyvan təcrübələri Ryukyus Universitetinin Heyvan Təcrübəsi Etik Komitəsi tərəfindən təsdiqlənmişdir (nömrələr. 5352, 5718 və 5943).
Or-oryzanol və 5-aza-2′-deoksisitidin administrasiyası
HFD-yə üstünlük verilməsini qiymətləndirmək üçün γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Yaponiya) əvvəllər təsvir edildiyi kimi qida seçimi sınağı zamanı xNUMX həftəlik siçanlara idarə edildi [14, 17]. Digər təcrübələr üçün, 12079% γ-oryzanol ehtiva edən bir HFD (D0.4B; Tədqiqat Diyetləri, New Brunswick, NJ, ABŞ) qranullar şəklində istehsal edilmişdir. Pəhrizin komponentləri elektron əlavə material (ESM) Cədvəlində göstərilir 1. 12 həftəlik bəslənmədən sonra striatum və hipotalamusdan toxuma toplandı. Siçanların orta qida qəbulundan hesablanan γ-oryzanolun gündəlik qəbulu bədən çəkisi təxminən 320 μg / q idi. Γ-oryzanolun dozaları əvvəllər göstərildiyi kimi təyin edilmişdir [14]. 5-aza-2′-deoksisitidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABŞ), 0.25 həftə ərzində həftədə üç dəfə intraperitoneal olaraq enjekte edildi (bədən çəkisi 12 μg / g).18].
Pəhriz yağına üstünlük verilməsini təxmin etmək
Pəhriz yağı üçün üstünlükləri qiymətləndirmək üçün, qida testləri əvvəllər təsvir edildiyi kimi chow və HFD (D12450B və D12451; Araşdırma Diyetləri) arasında seçim təmin etdi [14]. Pəhrizin komponentləri ESM Cədvəlində göstərilir 1. Qısaca, siçanların chow və HFD-yə pulsuz girişinə icazə verildi. Chow və HFD qəbulu həftəlik ölçüldü və pəhriz yağına üstünlük dəyişikliyi üçün analiz edildi. HFD üstünlükləri aşağıdakı formula əsasən hesablanmışdır: HFD seçimi = [(HFD qəbulu / ümumi qida qəbulu) × 100].
DNT metilasyonu üçün bisülfit ardıcıllığı
DNeasy Qan və Toxuma Dəsti (QIAGEN, Tokyo, Yaponiya) istifadə edilərək DNA təmizlənmişdir. DNT məhlulu təzə hazırlanmış 3 mol / l NaOH ilə qarışdırıldı, 37 ° C-də 15 dəqiqə inkübe edildi və 5.3 mol / l üre, 1.7 mol / l natrium bisulfit və 4.9 mmol / l hidrokinona əlavə edildi. Məhlul, 15 saniyə ərzində 95 ° C-də 30 dövr denatürasyona və 50 dəqiqə ərzində 15 ° C-də inkubasiyaya məruz qaldı.19]. Bisülfitlə müalicə olunan DNT, MinElute PCR Təmizləmə Kitindən (QIAGEN) istifadə edərək təmizləndi və KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, ABŞ) və D2R-in təqdimatçı bölgəsinin CpG saytının ətrafındakı astarlardan istifadə edərək PCR ilə gücləndirildi. . Astar ardıcıllığı aşağıdakılar idi: irəli primer, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; tərs astar, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Sonra, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, ABŞ) istifadə edərək adapter ardıcıllığı əlavə edildi və təmizləndi. Daha sonra nümunələr istehsal edildi və istehsalçının protokoluna uyğun olaraq ardıcıllıqla ayrılması üçün GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Yaponiya) üzərinə yükləndi. Metilasyon səviyyəsi, bütün sitozinlərin qalıqlarında metilləşdirilmiş sitosinlərin faizi olaraq ifadə edildi.
DNMT fəaliyyətinin təhlili
DNMT enzimatik fəaliyyət təhlili, istehsalçının protokollarına əsasən bir EpiQuik DNA Methyltransferase Fəaliyyət / İnhibe Assay Dəsti (Epigentek Qrupu, Brooklyn, NY, ABŞ) və EPIgeneous Methyltransferase Assay dəsti (Cisbio Japan, Chiba, Yaponiya) istifadə edərək aparıldı.
Hər bir birləşmənin DNT metilasyonunda, meydana gəlməsində inhibitor fəaliyyətini qiymətləndirmək S-adenosil-l-homosistein (SAH) hər bir birləşmənin iştirakı ilə ölçülmüşdür (seçim müayinələri üçün 20 μmol / l), S-adenosil metionin (SAM; 10 μmol / l) və DNMT substrat (4 ng / μl) 37 ° C-də 90 dəqiqə. Michaelis-Menten kinetikasını qiymətləndirmək üçün DNMT1 (20 μmol / l) γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) və göstərilən poli dI-dC konsentrasiyasını 37 ° C-də 90 dəqiqə inkübe etdi. DNMT3a (100 μmol / l) və DNMT3b (100 μmol / l) γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) və göstərilən poli dG · dC konsentrasiyasını 37 ° C-də 120 dəqiqə inkübe etdilər. Təhlillər dördqat olaraq aparıldı. Çıxarılan protein (0.75 mg / ml) SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) və poli dG · dC (5 μg / ml) ilə 40 ° C-də 120 dəqiqə inkübe edildi və SAH meydana gəlməsi ölçülmüşdür.
Estrogenlə əlaqəli reseptorla əlaqəli fəaliyyət təhlili
Γ-oryzanolun estrogenlə əlaqəli reseptor-γ (ERRγ) üzərindəki potensial antaqonik fəaliyyəti, istehsalçı protokoluna görə İnsan Östrojenlə əlaqəli Reseptor Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir. Qısaca, aktiv ERRγ-ni ifadə edən qeyri-insan məməli reportyor hüceyrələri 24 saat ərzində üç qat olaraq hər birləşmənin göstərilən konsentrasiyasına məruz qaldı.
Western blotting
Bu əvvəlcədən təsvir olunduğu kimi edildi20] D2R (1: 500, dovşan), dopamin daşıyıcısı (DAT; 1: 500, dovşan), tirozin hidroksilaz (TH; 1: 1000, dovşan) (AB5084P, AB1591P və AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, ABŞ), 3α (STAT3α; 1: 1000, dovşan), DNMT1 (1: 1000, dovşan), DNMT3a (1: 1000, dovşan) (nömrələr 8768, 5032 və 3598; hüceyrə siqnalizasiya texnologiyası, Tokyo, Yaponiya), DNMT3b (1 μg / ml, dovşan), ERRγ (1: 1000, dovşan) və β-aktin (1: 10,000, siçan) (ab16049, ab128930 və ab6276; Abcam, Cambridge, MA, ABŞ).
Kəmiyyət real vaxt PCR
Gen ifadəsi əvvəllər təsvir olunduğu kimi araşdırıldı [14]. mRNA səviyyəsi normallaşdırıldı Rn18s (18S rRNA). Kəmiyyət real vaxt PCR analizləri üçün istifadə olunan astar dəstləri ESM Cədvəlində ümumiləşdirilmişdir 2.
Statistik təhlil
Məlumat orta ± SEM olaraq ifadə edilir. Mümkün olduğu təqdirdə birtərəfli ANOVA və təkrar tədbir ANOVA, sonra çoxsaylı müqayisə testləri (Bonferroni-Dunn metodu) istifadə edilmişdir. Tələbələr t test iki qrup arasındakı fərqləri təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir. Fərqlər əhəmiyyətli hesab edildi p <0.05.
Nəticələr
5-aza-dC tərəfindən DNMT-lərin farmakoloji inhibe edilməsi siçanlarda pəhriz yağına üstünlük verir
HFD ilə qidalanan siçanlarda, striatumdakı D2R'nin təbliğat bölgəsindəki DNT metilasyonu, bir chow pəhrizlə qidalanan siçanlarla müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır. (Şəkil .1a) .1a). Digər tərəfdən, D2R'nin qoruyucu bölgəsində hipotalamik DNT metilasyonu, bir chow pəhrizi altında striatumdakıdan daha yüksək idi (p <0.01) (Şek. (Şəkil.1a, 1a, f) və HFD tərəfindən dəyişdirilmədi (Şek.) (Şəkil .1f) .1f). HFD ilə qidalanan siçanlarda, striatumdakı D2R'nin təbliğatçı bölgəsindəki DNT metilasyonu, güclü DNMT inhibitoru olan 5-aza-dC ilə müalicə ilə normallaşdırıldı (Şek. (Şəkil .1a) .1a). Bunun əksinə olaraq, hipotalamusdakı D2R'ın təbliğat bölgəsindəki DNT metilasyonu 5-aza-dC ilə müalicə ilə əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmədi (Şek. (Şəkil .1f) .1f). 20 həftəlik HFD ilə qidalanan 12 həftəlik bir kişi siçanların striatumunda mRNA və D2R protein səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şek. (Şəkil.1b, 1b, k, l). Bunun əksinə olaraq dopamin D1 reseptorlarının səviyyəsi (D1R, tərəfindən kodlanmışdır Drd1), adenil siklazı və CAMP vasitəçi hüceyrədaxili siqnal üzərində D2R-lərə qarşı bir şəkildə hərəkət edənlər dəyişməz oldu (Şek. (Şəkil .1c) .1c). Bundan əlavə, mRNA və / və ya protein səviyyəsində TH və DAT kimi D2R siqnal ilə əlaqəli digər molekulların səviyyəsində dəyişiklik olmamışdır (Şek. (Şəkil.1d, 1d, e, k, m). Digər tərəfdən, hipotalamusda, o cümlədən D2R üçün də aydın dəyişikliklər müşahidə olunmadı (Şek. (Şəkil .1g-m) .1g – m). Qeyd edək ki, hipotalamusda D2R və TH protein səviyyəsi striatumdakılardan daha aşağı idi (Şek. (Şəkil.1l, 1l, m), ehtimal ki, hipotalamus ilə müqayisədə beyin mükafat sistemindəki dopamin reseptor siqnalının nisbi əhəmiyyətini əks etdirir.
D2R'nin təşviqat bölgəsindəki DNT metilasyonunun pəhriz yağına üstünlük verəcəyini dəyişdirmək üçün 5 aza-dC ilə müalicə olunan siçanların qidalanma davranışı təhlil edildi. Gözlənildiyi kimi, 5-aza-dC, HFD ilə qidalanan siçanların striatumunda D2R üçün mRNA və protein səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şek. (Şəkil.1b, 1b, k, l). Digər tərəfdən, səviyyələrə təsir göstərmədi Drd1, Th və Slc6a3 (DAT kodlaşdırma) striatumda və ya səviyyələrdə Drd2, Drd1, Th və Slc6a3 hipotalamusda (Şek. (Şəkil. 1c – e, 1c – e, g – m). Nəqliyyat vasitəsi ilə müalicə olunan siçanlar HFD-yə üstünlük verdikləri halda, 5-aza-dC ilə müalicə olunan siçanlarda HFD-yə üstünlük xeyli azaldı (vasitə ilə müalicə olunan siçanlar üçün dəyərlərin 88% -i) (Şek. (Şəkil .1n) .1n). Nəticə etibarı ilə, 5-aza-dC ilə müalicə bədən çəkisi artımını azaltdı (Şek. (Şek .11.)o).
or-oryzanol, HFD ilə qidalanan siçanların striatumundakı DNMT səviyyələrini azaldır
Daha əvvəl bildirdiyimiz kimi [14], γ-oryzanolun kişilərin siçanlara ağırlıq dərəcəsi ilə qəbulu bir HFD (nəqliyyat vasitəsi ilə müalicə olunan siçanların dəyərlərinin 93%) nisbətini əhəmiyyətli dərəcədə azaldı. (Şəkil .2a), 2a), bədən çəkisi artımının açıq şəkildə azalması ilə nəticələnir (Şek. (Şəkil .2b) .2b). Buna görə striatumdakı D2R-lərin epigenetik modulyasiyasına γ-oryzanolun potensial təsirini araşdırdıq.
Məməlilərdə üç əsas DNMT var - DNMT1, 3a və 3b. DNMT1 DNT metilasiyasını qorumaq üçün funksiyaları, DNMT3a və 3b de novo DNT metilasiyasını asanlaşdırmaqda rol oynayır [21]. Vivo-da oryzanolun DNMT-lərə təsirini öyrənmək üçün HFD ilə qidalanan siçanların beynindəki DNMT səviyyələrini qiymətləndirdik. Hər HFD ya striatumda, ya da hipotalamusda mRNA və DNMTs protein səviyyəsinə təsir göstərməsə də, γ-oryzanol ilə əlavələr striatumdakı DNMTs səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı, lakin hipotalamusda yox. (Şəkil. 2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Bu məlumatlar or-oryzanolun DNMT səviyyələrini striatuma xas bir şəkildə tənzimləməsi ehtimalını artırır. Bənzər bir şəkildə 5-aza-dC, striatumda DNMT3a və 3b səviyyələrində mRNA səviyyələrini əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (ESM Şek. 1a – d).
DNMT1-nin mRNA səviyyəsinin, ən azı qismən nüvə reseptoru ERRγ tərəfindən tənzimləndiyini göstərən əvvəlki bir araşdırma əsasında [22], γ-oryzanolun ERRγ fəaliyyətinə təsirini araşdırdıq. İnsan olmayan məməli hüceyrələrdə aktiv ERRγ-ni ifadə edən, ERRγ'nin güclü tərs agonisti olan 4-hidroksi tamoksifen, ERRγ fəaliyyətini əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb. Qeyd edək ki, γ-oryzanol ERRγ fəaliyyətini qismən azaldı (doğuşdan təxminən 40% azalma) (Şek. (Şəkil .3a) .3a). Əhəmiyyətli olan ERRγ, hipotalamusda deyil, striatumda yüksək ifadə edildi (Şek. (Şəkil. 3b – d) .3b – d). Striatum üçün vəziyyətin əksinə olaraq, or-oryzanol yalnız hipotalamusda DNMT1 protein səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şek. (Şəkil.2k, 2k, l). Bu nəticələr, ən azı qismən, DNMT3 səviyyəsinin müsbət tənzimləyicisi olan STAT1α tapdığımıza izah edilə bilər.23], hipotalamusda çox ifadə edildi, lakin striatumda deyildi (Şek. (Şek .33.)e-g).
Γ-oryzanolun DNMT-lərin in vivo fəaliyyətinə təsirini daha da qiymətləndirmək üçün, DNT metilasyonunun bir əlavə məhsulu olan SAH-nin və DNMT-lərin güclü inhibitoru olan HFD-ni bəsləyən or-oryzanol ilə müalicə olunan siçanlarda qiymətləndirilmişdir. Həm striatumda, həm də HFD ilə qidalanan və çow bəslənən siçanlar arasında SAH meydana gəlməsində ciddi dəyişikliklər baş vermədi (Şek. (Şəkil.2f, 2f, j). Diqqətəlayiqdir ki, γ-oryzanol striatumda SAH əmələ gəlməsini xeyli azaldı (Şek. (Şəkil .2f) 2f) lakin hipotalamusda deyil (Şek.) (Şəkil .2j), 2j), γ-oryzanolun HFD ilə qidalanan siçanlarda striatuma xas bir şəkildə DNMT-lərin fəaliyyətinin qarşısını ala biləcəyini təklif edir.
Vitamində DNMTs üçün γ-oryzanolun inhibitor xüsusiyyətləri barədə enzimatik analizlər
Daha sonra γ-oryzanolun DNMTs in vitro fəaliyyətinə təsirini qiymətləndirdik. DNMT-lərə qarşı γ-oryzanol, ferul turşusu, 5-aza-dC, haloperidol (bir nümayəndəsi D2R antaqonisti), quinpirol (bir nümayəndəsi D2R agonisti) və SAH-in inhibe potensialı qiymətləndirilmişdir. Müsbət bir nəzarət olaraq, SAH, DNMT-lərin fəaliyyətlərini dozadan asılı şəkildə möhkəmləndirdi (Şek.). (Şəkil. 4a – f) .4a – f). Gözlənildiyi kimi, haloperidol və quinpirole DNMT-lərin fəaliyyətinə heç bir təsir göstərməmişdir (ESM Şek. 2). Diqqətə çatdıraq ki, ol-oryzanol DNMT1 (IC) fəaliyyətini əhəmiyyətli dərəcədə maneə törətdi50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) və 3b (maksimum inhibisiya% 57) (Şəkil .4d-f) .4d – f). Bunun əksinə olaraq ul-oryzanolun metaboliti olan ferul turşusunun inhibitor fəaliyyəti γ-oryzanolun təsirindən xeyli aşağı idi (Şek. (Şek .44.)d – f).
DNMT-lərdə γ-oryzanolun inhibe xüsusiyyətlərini daha da araşdırdıq. SAH-nin meydana gəlməsi in-vitroda DNMT-lərdə in-inhiban fəaliyyətini qiymətləndirmək üçün ölçüldü. DNMT vasitəçiliyi ilə həyata keçirilən DNT metilasyonu zamanı SAH meydana gəlməsinə dair məlumatlar, Michael-Menten kinetikasının of-oryzanolun olması və olmaması üçün doymuş bir nümunə olduğunu göstərir. (Şəkil .4g – i) .4g – i). DNMT1 vasitəçiliyi ilə həyata keçirilən DNT metilasyonunda Eadie-Hofstee analizi γ-oryzanolun təsir göstərmədiyini göstərdi. V max SAH əmələ gəlməsi (vasitə, 597 pmol / dəq; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), γ-oryzanol isə göründüyü kimi K m (vasitə, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Şəkil .4j) .4j). Bu nəticələr, γ-oryzanolun DNMT1-ı ən azı qismən rəqabətli bir şəkildə inhibə etdiyini göstərir. Digər tərəfdən, DNMT3a- və 3b vasitəçiliyi ilə DNT metilasyonu üçün γ-oryzanol azaldı V max SAH (DNMT3a: vasitə, 85.3 pmol / dəq; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vasitə, 42.3 pmol / dəq; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / dəq, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) və buna bənzər şəkildə K m bu reaksiya üçün (DNMT3a: vasitə, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: vasitə, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (şək. (Şəkil.4k, 4k, l). Bu nəticələr, γ-oryzanolun DNMT3a və 3b ən azı qismən rəqabətsiz bir şəkildə inhibə etdiyini göstərir.
or-oryzanol HFD ilə qidalanan siçanların striatumunda D2R səviyyəsini artırır.
Daha sonra γ-oryzanolun DNMT-lərin bir inhibisiyası ilə striatal D2R tərkibinin artması ehtimalını sınadıq. HFD ilə qidalanan siçanlarda, γ-oryzanolun ağızdan tətbiqi, D2R-lərin təşviqat bölgəsində striatal DNT metilasyonunu əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı. (Şəkil .5a), 5a), halbuki hipotalamusda bunu etməmişdir (Şek.) (Şəkil .5f) .5f). Bu tapıntılara uyğun olaraq, D2R-in mRNA və protein səviyyəsi qarşılıqlı surətdə artmışdır (Şek. (Şəkil.5b, 5b, g, k, l). 5-aza-dC ilə müalicə haqqında məlumatlara bənzərdir (Şek. (Şəkil .1), 1), RNT və protein səviyyələrinə heç bir təsiri olmadı Drd1, Th və Slc6a3 (DAT) striatumda və səviyyələrə təsir etmir Drd1, Th və Slc6a3 hipotalamusda (Şek. (Şəkil. 5c – e, 5c – e, h – k, m).
Əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, D2R və DNMT1 səviyyələri ən azı qismən NF-viaB vasitəsilə ER stresi və iltihabla tənzimlənir.17, 24, 25]. Buna görə ER stresi ilə əlaqəli və iltihabla əlaqəli genlərin səviyyəsini araşdırdıq. Əvvəllər göstərildiyi kimi [26], HFD TNF-α kodlayan genlərin ifadəsini artırdı (Tnfa), monosit chemoattractant protein - 1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP homoloji protein (Doğramaq), ER lokallaşdırılmış DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) və X-qutu bağlayıcı zülal 1 (spliced form)Xbp1s) hipotalamusda, lakin striatumda deyil (Şek. (Şəkil.6) .6). Xüsusilə HFD'nin or-oryzanol ilə əlavə edilməsi artan ifadəni əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı Ccl2, Doğramaq, Dnajb9 və Xbp1s yalnız hipotalamusda, lakin striatumda deyil (Şek. (Şek .66.)).
Müzakirə
Bu araşdırmada əsas tapıntı, γ-oryzanolun siçanların striatumunda güclü DNMT inhibitoru kimi çıxış etməsi və bununla da ən azı qismən striatal D2R-in epigenetik modulyasiyası ilə HFD-yə üstünlük verilməsidir. HFD ilə qidalanan siçanlardan striatumda D2R səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə azaldı, halbuki D1R, TH və DAT səviyyələri dəyişmədi (Şek. (Şəkil. 1b – e, 1b – e, k – m). Bu məlumatlar striatal D2R-in disregulyasiyası, HFD-də olduqda, obez heyvanlarda HFD-nin hedonik həddən artıq istehlak edilməsinə səbəb olan qida mükafatının qəbul edilməsində mühüm rol oynayır.3]. Hazırkı tədqiqatda, HFD ilə qidalanan siçanların 5-aza-dC ilə müalicəsi striatal D2R səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şek. (Şəkil.1b, 1b, k, l) bəlkə də D2R'in təqdimat bölgəsində DNT metilasyon səviyyəsinin azalması ilə. (Şəkil .1a), 1a) və nəticədə pəhriz yağına üstünlük verildi (Şek.) (Şəkil .1n) .1n). Bu tapıntı, həmçinin bir HFD-də olduğu zaman striatal D2R-lərin qida mükafatını qavramasında mühüm rolunu dəstəkləyir.
In vitro analizimiz N-oryzanolun DNMTs-ə qarşı inhibitor fəaliyyətinin, yəqin ki, onun metabolit ferul turşusundan daha güclü olduğunu göstərdi (Şek. (Şəkil. 4d-f), 4d – f), DNMT-lərdə inhibe hərəkəti üçün or-oryzanolun tam quruluşunun vacibliyini ifadə edir. HFD ilə qidalanan siçanlarda apardığımız araşdırmalara görə oral-oryzanol beyinə tam bir quruluş olaraq çatır və striatumda DNMT-lərin səviyyələrini və fəaliyyətlərini azaldır, təbliğatçı bölgədə DNT metilasiyasının ardıcıl azalması ilə. Striatumdakı D2R. Bundan əlavə, in vitro tədqiqatlarımız göstərir ki, γ-oryzanol ERR-ə qarşı qismən antaqonist rolunu oynayır, bu da ilk növbədə DNMT1 istehsalına müsbət tənzimləyici rolunu oynayır.22], və nəticədə DNMT1 fəaliyyətini azaltdı (Şek. (Şəkil .3a) .3a). Qeyd edək ki, ERRγ siçanlarda hipotalamusda deyil, striatumda yüksək səviyyədə ifadə edilmişdir (Şek. (Şəkil .3b) .3b). Bu məlumatlar suggest-oryzanolun, ən azı qismən ERRR inhibe yolu ilə DNMT1-ın mRNA səviyyəsini azaltma potensialına sahib olduğunu göstərir. Striatumdan fərqli olaraq, γ-oryzanol HFD ilə qidalanan siçanlardan hipotalamusda D2R səviyyəsinə təsir göstərmədi (Şek. (Şəkil.5g, 5g, k, l).
Digər tərəfdən, γ-oryzanolun striatumda deyil, hipotalamusda DNMT1 səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını göstərdik (Şek. (Şəkil.2k, 2k, l). STAT3-nin malign T-lenfoma hüceyrələrində DNMT1 tərkibini artırdığı göstərilmişdir [23]. Qeyd edək ki, əvvəllər γ-oryzanolun HFD ilə qidalanan siçanlardan hipotalamusda leptinlə əlaqəli STAT3 fosforlanmasının əhəmiyyətli dərəcədə artdığını göstərdik14]. Həm də qeyd etmək lazımdır ki, STAT3α siçanlarda striatumda deyil, hipotalamusda əhəmiyyətli dərəcədə ifadə edilmişdir (Şek. (Şəkil. 3e-g) .3e-g). Bu məlumatlar bizi oth-oryzanolun hipotalamus və striatum arasındakı DNMT1 səviyyəsindəki təsirindəki fərqin ən azı qismən STAT3α və ERRγ bölgələrinə xas olan siçanların beynində təsbit edilə biləcəyini düşünməyə sövq edir ( Şek. (Şəkil .3b – g) .3b – g). Birlikdə, siçanlarda striatum və hipotalamus arasında ERRγ və STAT3α ifadələrinin qarşılıqlı bir nümunəsi var. Nəticələrimizə əsasən, ERRγ istehsalının bol olduğu striatumda, γ-oryzanolun ERRγ -nın mənfi tənzimləyicisi kimi DNMT1 ferment fəaliyyətini mRNA səviyyəsini azaldacağını düşünmək ağlabatan olar. Bunun əksinə olaraq, STAT3α istehsalının üstünlük təşkil etdiyi hipotalamusda γ-oryzanol DNMT1 səviyyəsini daha da artıra bilər.
Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma, HFD tərəfindən bəslənən striatal D2R siqnalının azalmasının qidalanma davranışını pozduğunu göstərdi.3], piylənmənin müalicəsi üçün striatal DNMTs inhibe edilməsinin potensial əhəmiyyətini təklif edir. Digər tərəfdən, əvvəlki bir araşdırma, spesifik hipotalamik nüvələrdə ifadə olunan melanokortin reseptoru 4 geninin DNT metilasiyasının vəziyyətinin agouti yaşıl sarı siçanlarda obezliyin transgenerativ formalarını modullaşdıra biləcəyini göstərdi.27]. Əlavə tədqiqatların əsas mexanizmləri izah etməsinə zəmanət verilsə də, bu tədqiqatlar HFD-yə yoluxmuş piylənmənin patofiziologiyasında toxuma, gen və ardıcıllığa aid DNT metilasyonunun əhəmiyyətini göstərir.
Bu yaxınlarda bildirdik ki, HFD siçanların pankreas adalarında D2R səviyyəsini artırdı [17, 24]. Çox güman ki, bu genişlənmə, ən azı qismən, NF-κB vasitəsilə ER stresi və iltihabı ilə vasitəçilik olunur, çünki D2R-in təşviqat bölgəsində bir neçə NF-κB-reaksiya verən elementlər var [17, 24]. Bundan əlavə, son bir araşdırma TNF-α və IL-1β HFD qidalandıran siçanlardan yağ toxumasında DNMT1 səviyyəsini və aktivliyini artırdığını göstərdi.25]. Əhəmiyyətli olan, bu araşdırma, HFD-nin striatumda deyil, hipotalamusda üstünlük verilən ER stressini və iltihabını göstərdiyini göstərdi (Şek. (Şəkil.6) .6). Təcrübəli paradiqmamızdakı toxuma, bölgə və sahəyə xas DNT metilasyonu və demetilasyonun dərin mexanizmləri əlavə araşdırma gözləməlidir.
Əvvəlki hesabatımızla birlikdə γ-oryzanol siçanlarda ER stressinin hipotalamik tənzimlənməsi ilə HFD-yə üstünlük verdiyini göstərir.14], γ-oryzanol həm qidalanma davranışının həm hedonik, həm də metabolik disregulyasiyanın yaxşılaşdırılmasının özünəməxsus xüsusiyyətini təmsil edir. Çünki hazırlanmış bəzi antiobesit dərmanlarının kritik mənfi təsirlərə səbəb olduğu bilinir.8], beyin mükafatlandırma sisteminə təbii bir qidaya əsaslanan bir yanaşma, piylənmə-diabet sindromunu etibarlı şəkildə müalicə etmək üçün gözlənilir [16]. Bu paradiqmada, γ-oryzanol, epigenetik modulyator olmağın fərqli bir mülkiyyəti olan vəd edən antiobesity namizədidir.
Təşəkkürlər
Əlyazmanı nəzərdən keçirdiyinə görə S. Okamotoya (Ryukyus Universiteti, Yaponiya) minnətdarıq. M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato və C. Noguchi (Ryukyus Universiteti, Yaponiya) katiblik yardımına görə təşəkkür edirik.
İxtisarlar
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoksisitidin |
| D1R | Dopamin D1 reseptoru |
| D2R | Dopamin D2 reseptoru |
| DAT | Dopamin daşıyıcısı |
| DNMT | DNT metiltransferaza |
| ER | Endoplazmik retikulum |
| Səhv düşmək | Estrogenlə əlaqəli reseptor |
| HFD | Yüksək yağlı pəhriz |
| SAH | S-Adenosyl-l-homosistein |
| SAM | S-Adenosil metionin |
| STAT3α | 3α siqnal ötürücü və transkripsiyanın aktivatoru |
| TH | Tirozin hidroksilaz |
Qeydlər
Məlumatın mövcudluğu
Mövcud araşdırma zamanı yaradılan və / və ya təhlil edilmiş məlumat bazaları müvafiq müəllifdən ağlabatan tələblər əsasında mövcuddur.
Maliyyələşdirmə
Bu iş qismən Yaponiyanın Elmin Təşviqi Cəmiyyətindən Qrant-in Yardımı (JSPS; KAKENHI Qrant Nömrələri 15K19520 və 24591338), Elm, Texnologiya və İnnovasiya Şurası (CSTI), Nazirlərarası Strateji İnnovasiya Təşviqi Proqramı tərəfindən dəstəkləndi (SIP) 'Gələcək nəsil kənd təsərrüfatı, meşə təsərrüfatı və balıqçılıq yaratmaq üçün texnologiyalar', Lotte Vəqfi, Yaponiya Tətbiqi Enzimologiya Vəqfi, Yeni Enerji və Sənaye Texnologiyalarının İnkişafı Təşkilatı (NEDO), Həyat Elmi Şəbəkəsinin Formalaşdırılması Layihəsi (Əczaçılıq sahəsi) ) (Okinawa prefekturası, Yaponiya) və Okinawa prefekturasının tibbi kümelenməsini təşviq etmə layihəsi, Okinawa prefekturasının qabaqcıl təbabətin təbliği üçün verdiyi qrantla birlikdə (Okinawa prefekturası, Yaponiya).
Maraq ikili
Müəlliflər bu əlyazma ilə əlaqəli maraq ikili olmadığını bəyan edirlər.
Töhfə ifadəsi
Tədqiqatı CK və HM tərtib etdi. CK və TK təcrübələr apardılar və məlumatları təhlil etdilər. TK, CS-O, CT, MT, MM və KA məlumatların şərhinə kömək etdi. Əlyazmanı CK və HM yazdı. Bütün müəlliflər məlumatların şərhinə öz töhfələrini verdilər. Bütün müəlliflər əlyazmanı yenidən nəzərdən keçirməyə qoşuldular və son variantını təsdiq etdilər. HM bu işin qarantıdır, bütün məlumatlara tam giriş əldə etdi və məlumatların bütövlüyü və məlumatların analizinin düzgünlüyü üçün tam məsuliyyət daşıyır.
Dəyişikliklər
Elektron əlavə material
Bu yazının onlayn versiyası (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4), səlahiyyətli istifadəçilər üçün nəzərdən keçirilmiş, lakin redaktə olunmamış əlavə materialdan ibarətdir.
References
;