Ön Psixiatriya. 2018; 9: 81.
2018 Mar 12 onlayn nəşr olundu. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Parkı,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* və Yeun-Jun Chung1,2,3,*
mücərrəd
Fon
İnternet və onlayn oyunların asılılıqdan istifadəsi internet oyun bozukluğu (IGD) adlandırılan potensial psixiatrik bir xəstəlikdir. Müəyyən psixiatrik pozğunluqları olan xəstələrin qan və beyin toxumalarında dəyişmiş microRNA (miRNA) ifadə profilləri bildirilmiş və biyomarkerlər kimi təklif edilmişdir. Bununla belə, IGD-də qan miRNA profilləri barədə heç bir məlumat yoxdur.
metodika
IGD bağlı miRNA'ları keşfetmek üçün, TaqMan Low Density miRNA Array'ı kullanan 51 nümunelerinin (25 IGD ve 26 kontrolleri) miRNA ekspresyon profillerini analiz etdik. Doğrulama üçün, 36 müstəqil nümunələrlə (20 IGD və 16 nəzarətləri) kəmiyyət ters transkriptiya PCR həyata keçirilmişdir.
Nəticələr
Kəşf və müstəqil qiymətləndirmə vasitəsi ilə üç ədəd miRNA aşkar edilərkən (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) IGD qrupunda əhəmiyyətli ölçüdə aşağı salındı. Bütün üç miRNA dəyişiklikləri olan fərdlər IGD-nin heç bir dəyişiklik etməməsi ilə müqayisədə daha yüksək riskə malik idi [odds nisbəti (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11] və ORs dəyişmiş miRNA sayı ilə asılı olaraq doz artırdı. Üç miRNA-nın proqnozlaşdırılan hədəf genləri neyron yollarla əlaqəli idi. Biz üç qısamüddətli hədəf geninin proteinlərinin qərbli blotlarla araşdırıldığını və GABRB2 və DPYSL2 ifadələrinin IGD qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olduğunu təsdiqləyirik.
Nəticə
Biz hs-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p və hsa-miR-652-3p ifadələrinin IGD xəstələrində aşağı səviyyədə tənzimləndiyini müşahidə etdik. Bizim nəticələri IGD'nin patofizyolojisini anlamaq üçün faydalı olacaq.
giriş
İnternet və İnternet əsaslı oyunların asılılıqdan istifadəsi geniş internetə çıxış infrastrukturuna malik olan ölkələrdə sosial fenomen deyil, lakin İnternet oyun bozukluğu (IGD) (potensial psixiatrik pozğunluq)1-3). Epidemioloji məlumatlara görə, erkən yaşlarda IGD-nin yayılma dərəcələri 0.8-dan 26.7% -ə qədər olan ölkələr arasında dəyişir (4). Xüsusən, tədqiqatlar Cənubi Koreya, Çin, Tayvan, Hong Kong və Sinqapur kimi bir çox Asiya ölkələrində ergenlərdə 10%4). IGD, idrak, psixo-sosial münasibətlər və gündəlik həyatda dəyərsizləşmə ilə əlaqələndirilir; məsələn, akademik və ya peşə performansının azaldılması (4-7). IGD İndi Psixi Bozuklukların Teşhis ve İstatistiksel El Kitabının (DSM-V) beşinci versiyasının III Bölümünde (Əlavə araşdırma şərtləri)8). Lakin klinik-sosial əhəmiyyətinə baxmayaraq, IGD'nin arxasında molekulyar genetik mexanizm barədə çox az məlumat var.
Son iri miqyaslı əkiz tədqiqatlar IGD (9, 10). Vink et al. Hollandiyada 5,247 monozigot və dizigotik ergen əkizləri ilə kompulsiv internet istifadə fərdi fərqləri araşdırdı və 48% fərqlərin genetik amillərlə izah etdiyini bildirdi (9). Li və al. 825 cütlüyünün Çinli əkiz əkizlərini müşahidə etdiyini və genetik faktorların fərqlərin 58-66%10). Buna görə, nörotransmission, idrak və dopamin reseptoru D2 geni kimi diqqəti cəlb edən genlərin polimorfizmləri (DRD2), katekolamin-O-metiltransferaza gen (COMT), serotonin nəql edən gen (5HTTLPR) və kolinergik reseptor nikotinik alfa 4 gen (CHRNA4) İnternet bağımlılığı ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqəli olduğu bildirilmişdir (11-13). Son zamanlar, Kim və digərləri. Növbəti nəsil sıralama təhlili ilə nörotransmitterlərin istehsalı, hərəkət və metabolizması ilə əlaqəli 100 namizəd genindən daha çox ekranlaşdırılmış variantlar və rs2229910 NTRK3 gen IGD ilə əlaqəli14).
Genetik faktorlara əlavə olaraq, neurobevratsevar fenotiplərin mikroorqanizmlər (miRNA) (o cümlədən, qeyri-kodlayıcı RNT-lər) ilə epigenetik olaraq nəzarət edildiyi15, 16). miRNA'lar mRNA-ların azaldılması və protein xəstəliklərinin müxtəlif xəstəliklər prosesində kritik rol oynayaraq protein kodlayıcı genlərin ifadə edilməsini mənfi tənzimləyən kiçik stranded RNA molekullarını (uzunluğu təxminən 20-23 nükleotidlər)17). Dəlillərin xarakteristikaları göstərir ki, miRNA-lar insan mərkəzi sinir sistemində (CNS) çoxdur və CNS sisteminin inkişafında və olgunlaşmasında iştirak edən hədəf genlərin ifadə səviyyələrini dəqiq tənzimləmək üçün hərəkət edirlər (15). Həqiqətən, son dövrlərdə edilən araşdırmalar, miRNA ekspresyon profillerinin psixiatrik bozuklukları olan hastaların beyin dokusunda değiştirildiğini ortaya koydu ve bunların ifade profilleri psikiyatrik bozukluklar üçün biyomarker15, 16, 18). Məsələn, postmortem analizi vasitəsilə, Lopez et al. metabotropik glutamat reseptoru-1202 geninin ifadə edilməsini tənzimləyən miR-4 ifadəsi və antidepressantın reaksiyasını proqnozlaşdırdığını bildirən depressiya pozuqluğu olan xəstələrin prefrontal korteks toxumalarında19). Biomarker taraması baxımından, bu yanaşma dəqiq bir məhdudiyyətə malikdir, çünki ekranlaşdırma üçün CNS toxumasının biopsiyası mümkün deyildir. MiRNA'lar qan (plazma ya da serum) ilə aşkar edildiyindən, miRNA'ların nöropsikiyatrik xəstəliklərdə qeyri-invaziv biyomarker kimi müəyyən bir üstünlüyü var. Lakin, bu günə qədər IGD-də miRNA profillərinin dövriyyəsi ilə bağlı heç bir iş görülməmişdir. Gəzən miRNA ekspresyon profillerinin daha yaxşı başa düşülməsi IGD inkişaf mexanizmini aydınlaşdırmağa və klinik tərcüməni asanlaşdırmağa kömək edə bilər.
Bu çalışmada IGD ile ilişkili miRNA markerlerini IGD ve kontrol qrupları arasında farklı şekilde ifade edilmiş plazma miRNA'lar gözlemleyerek ve biyolojik etkilerini araştırdık.
Material və metodlar
Tədqiqat mövzusu
DSM-V İGD hesabı istifadə edərək, 3,166 yeniyetmələr (yaşlı 12-18 il) ilə tanış oldum. Bunlar arasında, 251 (168 kişilər və 83 qadınlar) DSM-V meyarlarına görə IGD diaqnozu qoyuldu (8). 91 fərdlərin ümumi sayı (49 IGDs və 42 nəzarətləri) bu iş üçün məlumatlı razılığa malikdir. Onların arasında dörd şəxs istisna meyarlarına uyğun olaraq çıxarıldı. Son olaraq, bu iş üçün 87 fərdlər (45 IGD mövzusu və 42 sağlam nəzarət fərdləri) alındı. Bunlar arasında, 51 iştirakçıları (25 IGD xəstələri və 26 nəzarətləri) 2014-dan 2016-a qədər olan kəşf kimi qəbul edildi. Digər 36 iştirakçıları (20 IGD xəstələri və 16 nəzarətləri) 2016-dən müstəqil qiymətləndirmə kimi qəbul edildi. Bütün iştirakçılar Seul St Mary Hospital (Seul, Cənubi Koreya) və Seul Milli Universiteti Boramae Xəstəxanasından (Seul, Cənubi Koreya) qeydiyyatdan keçmiş Koreyalı şəxslər idi. Bütün iştirakçılar Koreya Kiddie Affektiv Bozuklukları və Şizofreni (K-SADS-PL) (C-SADS-PL) üçün cədvəl əsasında psixiatr tərəfindən strukturlaşdırılmış bir müsahibə keçirdi20). Bütün iştirakçılar Uşaqlar üçün Koreya-Wechsler Kəşfiyyat Ölçeğinin Block Design və Vocabulary alt tapşırıqlarını tamamladılar, 4 edition (K-WISC-IV) (21). Impulsivlik Barratt Impulsiveness Scale (BIS) tərəfindən qiymətləndirilmişdir (22). Behavioral Inhibitasiya Sistemi (BINS) və Davranış Aktivləşdirmə Sistemi (BAS) tərəzi şəxsiyyət ölçüsünü23). Bırakma meyarlar keçmiş və ya cari əsas tibbi iğtişaşlar (məsələn, şəkərli diabet), nevroloji bozukluğu (məsələn, zəbt iğtişaşlar, baş zədə), psixiatrik pozuqluqlar (məsələn, əsas depresif bozukluk, anksiyete bozukluğu), Zəka geriliyi, və ya hər hansı maddə asılılığı daxil (məsələn, , tütün, sirr, spirt). Tədqiqat subyektlərinin ümumi xüsusiyyətləri Cədvəldə öz əksini tapmışdır Table1.1. Bu iş, Katolik Universitetinin Koreya Tibb Kollecinin (MC16SISI0120) İnstitusional İnceleme Şurası tərəfindən təsdiqləndi. Bütün iştirakçılar və onların valideynləri yazılı razılığa gəldilər.
Cədvəl 1
Tədqiqat subyektlərinin ümumi xüsusiyyətləri.
| Kəşf | Qiymətləndirmə | Kombinə | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nəzarət | IGD | P-value | Nəzarət | IGD | P-value | Nəzarət | IGD | P-value | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Yaş (il) | |||||||||
| Median (min-max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Həftəlik İnternet oyun saatları (h) | |||||||||
| Median (min-max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
| Aylıq həcmli gəlir (milyon KRW) | |||||||||
| Median (min-max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Təhsil (il) | |||||||||
| Median (min-max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: blok dizaynı | |||||||||
| Median (min-max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: sözcük | |||||||||
| Median (min-max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Median (min-max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Median (min-max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Median (min-max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| BINS | |||||||||
| Median (min-max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, İnternet oyun pozuqluğu xəstələri; KS, Koreya İnternet Bağımlılığı Proneness Ölçeği; BIS, Barratt Dürtüsellik Ölçeği; BAS, Davranışa Aktivləşdirmə Sistemi; BİNS, Davranış Qadağanlığı Sistemi; KRW, Koreya Won.
aP <0.05 (Mann-Whitney-Wilcoxon testi).
TaqMan Düşük Yoğunluk miRNA Array (TLDA) Deneyleri
Hər bir iştirakçıdan periferik qan toplanmış və qan hüceyrəsinin lizisini minimuma endirmək üçün 4 h-də laboratoriyaya köçürülmüşdür. Nümunə, 3,000 rpm'de, oda temperaturu üçün 10 dəqiqə üçün santrifüj edilmişdir. Sonra, qan hüceyrələrini çirkləndirmədən supernatant (plazma qat) toplandı. Sirkulyasiya miRNA'ları istehsalçı təlimatına əsasən TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) istifadə edərək çıxarılıb. Qısaca, 50 μL plazma nümunəsi və ABN tamponunun 100 μL qarışıq idi. Hedefe özgü anti-miRNA manyetik boncukları ile hibridizasyondan sonra, sınırlı dolaşan miRNA'lar, 100 μL elüsyon tamponu ile boncuklardan uzaklaştırıldı. (; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Birləşmiş Ştatları İnsan Panel A) istehsalçının təlimatları uyğun olaraq kəşf mərhələdə 381 miRNAs TaqMan Mirna ABC Arıtma Kit istifadə 51 plazma nümunələri (25 IGDs və 26 nəzarət) və araşdırıldı. MegaplexPreAmp Primers Human Pool A və TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək, miRNA ekspresyon analizi üçün cDNA miqdarını artırmaq üçün Megaplex tərs transkripsiyası və pre-amplification reaksiyaları edildi. TLDA paneli v2.0 (Thermo Fisher Scientific), miRNA'ların ifadəsini qiymətləndirmək üçün ViiA7 real vaxtlı PCR sistemi (Thermo Fisher Scientific) üzərində işləmişdir. Ham data, hər miRNA üçün Ct dəyərlərini təyin etmək üçün ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək işlənmişdir.
TLDA üçün məlumat təhlili
Əvvəlcə hər bir miRNA-nın eşik dövrlərini (Ct dəyəri) ölçdük. Ct dəyəri> 35 olan miRNA'lar aşkarlanmayan hesab edildi və sonrakı analizlərdən kənarlaşdırıldı. Bütün Ct dəyərləri insan plazmasında dövriyyədə olan ən stabil ifadə olunan miRNA-lardan biri olan miR-374b (ΔCt dəyəri) Ct dəyərinə normallaşdırıldı (24). Sözün bir log2 qat-dəyişmə nisbəti (ΔΔCt dəyəri) nəzarət nümunələrinin orta dəyərlərindən istifadə edərək, Biokondraktordan HTqPCR paketində kalibratör25). Hər bir miRNA hədəfinin nisbi miqdarı (RQ) 2 kimi müəyyən edilmişdir-DDCt. İki qrup arasında ifadə fərqi hipotetik test üçün, biz istifadə edərək, təcrübələrdə partiyaların effektləri kimi heterojenlikləri ələ almaq üçün surrogate dəyişən analizini (SVA) tətbiq etdik. sva Biokondüktördə paket (26). miRNAs ilə a P-dəyəri <0.05 iki qrup arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli hesab edildi.
Genə Zənginləşdirmə Təhlili Analizi
Gen seti zənginləşdirmə təhlili üçün ToppGene Suite-də ToppFun27) əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş Gene Ontoloji (GO) (28) şərtləri, yolu və xəstəlik şərtləri. Bu yanaşma üçün biz 1,230 proqnozlaşdırılan hədəf genlərinin namizəd miRNA'larını istifadə etdik. KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP, və MSigDB görə ToppGene yollarına görə proqnozlaşdırılan hədəf genlərin əhəmiyyətli yollarını tapmaq üçün yol təhlili istifadə edilmişdir. Funferik zənginləşdirmə şərtlərinin əhəmiyyəti Bonferroni-tənzimlənməsinə əsaslanaraq müəyyən edilmişdir P-value.
Kəmiyyət Ters Transkripsiyası PCR (qRT-PCR) Doğrulama və Çoğaltma
Mir-10b-15p, #5; Mir 000390b-26p, # differentially kəşf mərhələsində ifadə edildi 5 miRNAs doğrulamak üçün, qRT-PCR TaqMan MicroRNA Assay (Mir-000407b-29p, #3 istifadə edərək həyata keçirilib 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; miR-483 -5p, #002338 və miR-652-3p, #002352) və istehsalçı protokoluna əsasən ViiA7 sistemi (Life Technologies). ümumi RNT on nanograms TaqMan probe ilə real-time PCR ardından TaqMan MicroRNA Reverse Transkripsiya Kit (#4366596, Life Technologies) istifadə edərək Mirna xüsusi astar ilə ilk sahil cDNA çevrildi. Hər bir miRNA'nın RQ 2 olaraq təyin edilmişdir-DCtburada ΔCt sözügedən nümunə üçün eşik dövründəki fərqdir, endogen miRNA (miR-374b-5p, #001319) ilə normalləşir. Bütün PCR reaksiyaları üçqat olaraq həyata keçirilmiş və onların Ct dəyərləri ortada olmuşdur. Hər bir miRNA'nın bir sıra log2 qat-dəyişmə nisbəti (ΔΔCt) array-based təhlili ilə eyni şəkildə hesablanmışdır. MiRNA'ların ifadə səviyyələrində fərqləri iki qrupda eşiklə test etmək üçün qeyri-parametrik olmayan Mann-Whitney-Wilcoxon testi aparıldı P0.05 dəyər.
Western Blot Təhlili
Hər bir serum nümunəsi ilk olaraq yuxarıdakı 14 yüksək zəngin proteinlərdən (albümin, immunoglobulin G, immunoglobulin A, serotransferrin, haptoglobin, alfa-1 antitripsin, fibrinogen, alfa-2 macroglobulin, alfa-1 acid glycoprotein, immunoglobulin M, apolipoprotein AI , A-II apolipoprotein, MARS-3 sütun istifadə edərək,) C14 və transthyretin tamamlamaq (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, qərb blot təhlili əvvəl Santa Clara, CA, ABŞ). MARS-14 sütunundan əldə edilən məhdud olmayan fraksiya bir Amicon Ultracel-3 santrifüj filtri (3 kDa kəsmə) istifadə edərək konsentrasiya olundu və sonra protein konsentrasiyası bicinchoninic acid üsulu ilə müəyyən edildi. eyni miqdarda nəzarət və IGD serum nümunələri bir 10-30% Mini-protean TGX dəmir gel (Bio-Rad, CA, Amerika Birləşmiş Ştatları) üzrə ayrılmış və bir polyvinylidene difluoride membran köçürülüb (4 olan mkq 20 üçün). Next, membran 190 min otaq temperaturunda 25% -i qeyri-yağ quru süd ilə TBS-T (7.5 mM NaCl, 0.05 mM Tris-HCl, pH 20 və 5% Tween 30) ildə bağlanıb. (2, Novus Biologicals Littleton, CO, Amerika Birləşmiş Ştatları 1), GABRB500 (2: 1, Abcam, Cambridge, MA, Amerika Birləşmiş Ştatları) və CNR1000 (1: 1, Santa Cruz Biotexnologiya membranların sonra DPYSL100 qarşı əsas antikor ilə kürt edildi , Inc., Santa Cruz, CA, ABŞ), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, Amerika Birləşmiş Ştatları) və PI15 (1: 500 ilə 5, MybioSource, San Diego, CA, ABŞ) TBS-T gecə və sonra müvafiq orta antikor bilərsiniz iribuynuzlu anti-siçan ilə 4 ° C% -i qeyri-yağ quru süd (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) və ya keçi anti-dovşan (1: 1,000, Mobil Siqnalizasiya, Beverly, MA, Amerika Birləşmiş Ştatları ) 1 h üçün otaq temperaturunda horseradish peroksidaza konjuge edilmişdir. Signal aşkarlanması ECL reagenti (GE healthcare, Piscataway, NJ, USA) ilə chemiluminescence istifadə edilmişdir. TotalLab 1D analizi proqramı (Qeyri-linear Dynamics, Nyukasq-Tyn-Tyne, Böyük Britaniya) istifadə edərək, qərb blotunun nəticələrini təyin etdik. Sonra, densitometriya nisbəti dəyəri hər bir nümunənin densitometriya dəyərini başqa bir yerdə təsvir edildikdə bölüşdürməklə hesablanmışdır (29). Normalizasyon üçün bir kontrol olaraq, hər bir sınaq üçün 46 IGD-dən birləşdirilmiş bir serum nümunəsi və nəzarət nümunələri istifadə edilmişdir. Statistik əhəmiyyəti bir eşik ilə qeyri-parametrik bir Mann-Whitney-Wilcoxon testi ilə təyin edildi P0.05 dəyər.
Nəticələr
Tədqiqat mövzusunun xüsusiyyətləri
Tədqiqatın demoqrafik və klinik xüsusiyyətləri Cədvəldə göstərilmişdir Table1.1. IGD və nəzarət qruplarını Koreya İnternet Addiction Proneness ScaleK-Scale) başqa bir yerdə təsvir edildiyi kimi (20, 30), IGD qrupu, nəzarət qrupundan (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Cədvəl (Table1) .1). IGD qrupundakı internet oyunlarına sərf olunan həftəlik medianlar nəzarətdən (18 vs 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). K-WISC, BIS, BINS və BAS-ın yaşı, aylıq hanehalkı gəlirləri, təhsil müddəti, blok dizaynı və söz ehtiyatı subtest nəticələri arasında iki qrup arasında əhəmiyyətli fərq yox idi.
IGD və Controls arasında fərqli ifadə miRNA
IGD ilə əlaqəli miRNA aşkar etmək üçün biz iki addım (kəşf və müstəqil qiymətləndirmə) yanaşma qəbul etdik. Araşdırmanın dizaynı və ümumi strategiyası Əlavə Materialda Şəkil S1-də təsvir edilmişdir. Kəşf mərhələsində biz 51 miRNA'ları olan miRNA array istifadə edərək, 25 nümunələrinin (26 IGDs və 384 nəzarət) miRNA ifadə profillərini təhlil etdik. 10 miRNA'ların ifadə səviyyələri IGD və nəzarət qrupları arasında fərqliliklərdən fərqlənirdi (Cədvəl (Table2) .2). Bu 10 miRNA'larının nisbi ifadə səviyyələri Şəkildə göstərilmişdir Şəkil 1.1. Onların arasında iki (HSA-Mir-423-5p və HSA-mir-483-5p) səkkiz (HSA-Mir-15b-5p, HSA-mir-26b-5p, HSA-mir-29b-3p upregulated edilmişdir, HSA-mir-125b-5p, HSA-mir-200c-3p, HSA-mir-337c-5p, HSA-mir-411-5p və HSA-mir-652-3p) IGD qrup downregulated edildi.
Cədvəl 2
Fərqli mikroRNA (miRNA) və qat dəyişiklikləri.
| miRNA | Kəşf | Qiymətləndirmə | Kombinə | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-value | Fold dəyişikliyi | P-value | Fold dəyişikliyi | P-value | Fold dəyişikliyi | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA'lar həm kəşf və doğrulama qruplarında əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmişdir.
QRT-PCR Namizəd miRNA'larının təsdiqlənməsi
10 namizədi miRNA'larını doğrulamak üçün, bağımsız bir doğrulama seti (20 IGDs ve 16 denetimleri) ile QRT-PCR (Tablo S1, əlavə materyal). Bu miRNA-ların üçü (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p və hsa-miR-652-3p) validasiya qrupunun IGD qrupunda (Table2) .2). IGD qrupunda üç digər miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b və hsa-miR-423-5p) aşağı səviyyədə idi. Validasiya setində əksinə dörd miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p və hsa-miR-423-5p) qalıb. Kəşf və doğrulama dəstləri (ümumi 45 IGD subyektləri və 42 nəzarətləri) birləşdirildikdə, üç etibarlı miRNA-nı ardıcıl əhəmiyyətli idi (Cədvəl (Table2) .2). Bu üç miRNA-nun MNS-dəki ətraflı məlumatları, xromosomal yerləri, yetkin ardıcıllığı və ifadə səviyyələri Əlavə Materialda Cədvəl S2-də mövcuddur.
Üç miRNA-nın IQD Riskinə Eşzamanlı Alınmasının Synergistic Etkisi
Üç miRNA-nun birləşmiş təsirini qiymətləndirmək üçün biz dörd alt qrupun (0, 1, 2 və ya 3 miRNA dəyişiklikləri) odds nisbətlərini (OR) müşahidə etdik. miRNA dəyişməsi RQ dəyəri ilə müəyyən edilmişdir "Material və metodlar"Bütün üç miRNAs markerləri IGD qrupunda aşağı salındığından, RQ dəyəri birinin aşağı olduğu bir miRNA dəyişdirilmişdir. Üç miRNA üçün hər bir tədqiqatın RQ dəyərinin ətraflı məlumatı Əlavə Materialda Cədvəl S3-də mövcuddur. Hər bir alt qrup üçün odds idarələrin sayının IGDs nisbətinə nisbəti kimi hesablanmışdır, onda hər bir OR hər bir kiçik qrupun ehtimalını hər hansı bir miRNA dəyişiklik etmədən alt qrupun dərəcələrinə bölməklə hesablanmışdır. Üç miRNA dəyişikliyi olan fərdlər hər hansı bir miRNA dəyişiklik etmədən (22, 22% CI 95-2.29) olmayanlara nisbətən 211.11 dəfə yüksək risk göstərdilər. OR'lar 0-dan 3-ə qədər dəyişmiş miRNA-ların sayı ilə artan bir trend göstərdir2 = 0.996) (Şəkil (Şəkil 22).
Namizəd miRNA'larının hədəf genlərinin GO və Pathway təhlili
IGD qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə aşağı səviyyədə aşağı salınan üç miRNA markerinin funksiyalarını öyrənmək üçün onların hədəf genləri miRWalk 2.0 verilənlər bazası (31). Toplam 1,230 genləri, miRWalk verilənlər bazasını istifadə edərək, dörd alqoritm (miRWalk, miRanda, RNA22 və Targetscan) tərəfindən aşağı istiqamətli hədəflər kimi ardıcıl şəkildə proqnozlaşdırıldı32-34) (Əlavə Materialda Cədvəl S4). ToppGene Suite-də ToppFun istifadə edərək Gene zənginləşdirmə təhlillərini təyin etdi ki, miRNA-ların hədəf genləri "Axon rəhbərliyi" və "Nörogenezi" kimi əlavə sinir inkişaf yolları ilə əlaqəli idi (Əlavə Materialda Cədvəl S5).
Hədəflənmiş hədəf genlərinin ifadəsi
Üç miRNA-nın aşağı axın hədəf genləri arasında, 140 iki və ya daha çox miRNA üçün eyni zamanda proqnozlaşdırıldı (Əlavə Materialda Cədvəl S4). IGD və nəzarət qrupları arasında aşağı axın hədəf genlərinin protein ifadələrinin səviyyəsi fərqli olub olmadığını araşdırmaq üçün biz 2 genləri (DUSP4 və PI15), bütün 3 miRNA'larının aşağı axın hədəfləri və əlavə 3 genləriGABRB2, DPYSL2və CNR1) 2 miRNAs üçün nəzərdə tutulanlardan və sınaq üçün mövcud olan 28 IGDs və 28 nəzarətindən olan plazma nümunələri ilə qərb blot analizini aparmışdır. IGD və nəzarət qrupları arasındakı beş hədəf ifadələrini bandın sıxlığı və başqa bir yerdə təsvir edildiyi sahəni ölçməklə müqayisə etdik (29). Bunlar arasında DPYSL2 (28 IGDs və 28 nəzarətləri, P = 0.0037) və GABBR2 (27 IGD və 28 nəzarət, P = 0.0052) IGD qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (Şəkil (Şəkil3) .3). Ancaq CNR1 (fərqli ifadələr)P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) və PI15 (P = 0.6346).
Müzakirə
MiRNA'ların neyron inkişafı ilə məşğul olduğu bildirilmişdir (35, 36) və beyin miRNA'larının diferensial ifadə edilməsi şizofreniya kimi psixiatrik xəstəliklərdə müşahidə olunur (37). Buna görə də, miRNA dövran edən profillər IGD üçün faydalı biomarker ola bilər ki, məqbuldur. Circulatory miRNAs müxtəlif nöropsikiyatrik xəstəliklər üçün biomarkerlər kimi təklif edilmişdir (38-40); İGD inkişafının arxasındakı molekulyar mexanizmlər klinik və sosial əhəmiyyətinə baxmayaraq hələ də əsasən qeyri-müəyyəndir. Xüsusilə, IGD ilə əlaqəli miRNA'lar haqqında heç bir araşdırma edilməmişdir. Bu işin məqsədi iki dəfə olmuşdur. Birincisi, biz IGD ilə əlaqəli plazma miRNAları aşkar etməyə çalışdıq. İkincisi, miRNA namizədlərinin bioloji təsiri qiymətləndirildikdə, zülal ifadəsini və aşağı hədəf genlərin GO'unu araşdırdıq. MiRNA ekspresyon profillerinin genomun geniş tarama ve adayların aşağı doğru doğrulanmasıyla, üç miRNA'nın (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ve hsa-miR-652-3p) İGD xəstələrində nəzarətdən daha aşağı düşür. Digər yeddi miRNA namizədinin ifadə nümunələri qiymətləndirmədə təkrarlanmadıqlarına baxmayaraq, bu tədqiqatın kiçik nümunəsi sayəsində yanlış mənfi ola bilər. Bizim biliklərimizə görə, bu, qan MiRNA ifadə profillərinin IGD üçün faydalı biomarker ola biləcəyi ehtimalı haqqında ilk hesabatdır. Üç miRNA markerinin birləşməsi IGD riskinə məruz qalan insanları erkən müəyyənləşdirmək üçün minimal invaziv vasitə ola bilər.
Bu işdə müəyyən edilmiş miRNA'ların müxtəlif nöropsikiyatrik xəstəliklərdə iştirak etdiyi bildirilmişdir. Hs-miR-200c nin qan şəklində şizofreniya kimi bir neçə psixiatrik pozğunluqda41) və əsas depressiv epizodlar (42). miR-200c sinaptik fraqmentlərdə daha yüksək ifadə olunan forebrin43) və həmçinin nöronal hüceyrə ölümü ilə əlaqəli olmaq (44). Bu əvvəlki hesabatlara əsasən, miR-200c nevroloji prosesdə iştirak edir və onun ifası nəzərə çarpan nöropsikiyatrik xəstəliklərlə əlaqəli ola bilər. Bir neçə tədqiqat miR-652 və nöropsikiyatrik xəstəliklər riski arasındakı əlaqəni təklif etmişdir. Bizim yanaşmağımızda olduğu kimi, şizofreniya üçün qan biolomarkerlərini müəyyən etmək üçün Lai et al. şizofreniya xəstələri və normal nəzarət ilə TLDA təhlili aparmış və hsa-miR-652, o cümlədən yeddi miRNA-nın şizofreniya xəstələrində fərqli şəkildə ifadə olunmuşdur45). Sonrakı araşdırmada, miRNA ifadə məlumatlarını istifadə edərək bir proqnozlaşdırma modelini hazırladılar və müvəqqəti şizofreniyi fərqli olaraq normal nəzarətdən46). Hs-miR-652-ın dəyişmiş ifadəsi də spirtli içində47). Hsa-miR-26b'nin nöronal hüceyrə diferensiyasiyasında aktivləşməsi olduğu təsbit edildi (48). Perkins et al. hsa-miR-26b, şizofreniya xəstələrinin prefrontal korteksinde49).
Bu miRNA'ların dəhşətli ifadəsi və IGD'nin patofizyolojisi arasındakı əlaqəni dəstəkləmək üçün birbaşa dəlil olmasa da, bu miRNA-ların düzəldilməsinin IGD'nin patofizyolojisi ilə əlaqəli ola biləcəyini düşünə bilərik ki, . Belə ki, üç miRNA-nın aşağı axın genləri GABRB2, CNR1, NRXN1və DPYSL2 Nöropsikiyatrik xəstəliklərlə əlaqəli olduğu bildirildi. Gamma-aminobutirik turşusu (GABA) CNS-də əsas inhibitor nörotransmitterdir. GABA reseptorunun tənzimlənməsi, asılılıq, narahatlıq və depressiya (daxil olmaqla) nöropsikiyatrik xəstəliklərə də aiddir50), həmçinin IGD'nin əsas xüsusiyyətləri olan8). GABA reseptor genlərində genetik polimorfizmlərin spirtli bağımlılığı və şizofreniya ilə əlaqəli olduğu bildirilir (51, 52). Dihidropirimidinaz kimi 2 (DPYSL2), mikrotübül montajında, sinaptik siqnalda və aksonal böyümənin tənzimlənməsində rol oynayan çöküntü müdaxilə vasitəçiliyi ailənin üzvüdür. Nəticə olaraq, bu molekul psixiatrik xəstəliklər üçün biyomarker kimi təklif edilmişdir (53, 54). Polimorfizm DPYSL2 genə də spirt istifadə istifadəsi ilə əlaqəli olduğu bildirildi (55). Əvvəlki hesabatlar və məlumatlarımız göstərir ki, GABRB2 və DPYSL2-ın aşırı ekspresyonu, aşağı tənzimlənmiş miRNA-nın aşağı axın hədəfləri IGD daxil olmaqla nöropsikiyatrik xəstəliklərin patogenezinə təsir göstərir. Cannabinoid reseptor tipli 1 (CNR1) neyrotransmitter sindromunu modulant edən bir presinaptik heteroreseptordur və kannabinoid sinyalizasiyasında pozğunluqlar müxtəlif nöropsikiyatrik xəstəliklərlə56). Genetik polimorfizm CNR1 genin Qafqazlarda maddə asılılığı ilə əlaqəli olduğu bilinir (57). Sıçan modelində ventral hipokampusun CNR1 aktivasiyası normal sosial davranışı və idrakını pozur (58). NRXN ailəsindəki genetik dəyişikliyin asılılığı (o cümlədən) müxtəlif nöropsikiyatrik xəstəliklərə59).
Üç miRNA namizədinin bioloji təsirini daha dəqiq bir şəkildə araşdırmaq üçün onların aşağı axın hədəf genlərinin protein ifadəini araşdırdıq. 140 ümumi namizədlərinin (2 və ya daha çox miRNA'ların aşağı axınında nəzərdə tutulan) plazma nümunələrinin məhdud mövcudluğu səbəbindən biz QNQX hədəflərini (GABRB5, DPYSL2, CNR2, DUSP1 və PI4) qərb blotu ilə araşdırdıq və GABRB15 və DPYSL2 IGD qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi. Əvvəlki hesabatlar və məlumatlarımız göstərir ki, GABRB2 və DPYSL2-in aşırı ekspresyonu, downRegulated miRNA-ların aşağı istiqamətləri, IGD daxil olmaqla nöropsikiyatrik xəstəliklərin patogenezinə təsir göstərə bilər. Nörob inkişaf yollarının GO və yol təhlili nəticələrinin də miRNA göstəricilərinin nörobiyoloji təsiri dəstəklənir. Digər bir maraqlı tapıntı miRNA'ların eyni zamanda dəyişməsinin sinergetik təsiridir. 2 miRNA'larının aşağı səviyyədə tənzimlənməsi olan fərdlər 3 dəfə yüksək risk göstərməmişlərdir və OR'lar doza nisbətdə artmışdır. Bu üç dəyişiklik üçün CI məhdud nümunə ölçüsü sayəsində geniş olsa da, aydın müsbət korrelyasiya (r2 = 0.996) üç miRNA-nın sinergetik təsirini dəstəkləyir.
IGD ilə əlaqəli miRNA markerlərini aşkar etdik və hər üç miRNA dəyişikliyinə sahib olan şəxslərin hər hansı bir miRNA dəyişiklik etmədən xNUMX dəfə yüksək risk riski var idi, bu işdə bir neçə məhdudiyyət var. Birincisi, kiçik nümunə ölçüsü digər əhəmiyyətli miRNA markerlərinin itkin olma ehtimalını artırdı. İkincisi, plazma miRNA profillerinin ya səbəb olub-olmadığını aydınlatmak üçün yeterli değildiğinden, klinik ortamda bu non-invaziv belirteçlerin biyolojik rollerini doğrulayamayız. Beyin toxuması bankından insan beyninin toxumasını istifadə edərək, miRNA profilləri və onların aşağı gen analizləri daha birbaşa cavab verə bilər. Bir oyun bozukluğu heyvan modeli ilə beyin toxuma analiz də faydalı olardı. Üçüncüsü, plazma nümunələrinin məhdud mövcudluğu səbəbindən biz yalnız beş downstream aday molekulunu araşdırdıq. Böyük bir nümunə dəsti ilə daha aşağı axın hədəflərinin araşdırılması IGD'nin molekulyar mexanizmini daha da dərk etmək üçün faydalı olacaqdır.
Xülasə, miRNA ifadə profillərinin və müstəqil qiymətləndirmənin genomun genişləndirilməsi yolu ilə üç IGD ilə əlaqəli miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p və hsa-miR-652-3p) aşkar etdik. Aşağıdakı genlərin bir çoxunun müxtəlif nöropsikiyatrik xəstəliklərə cəlb ediləcəyi bildirilir və bu aşağı genlərin dəyişdirilmiş ifadəsinin eksperimental validasiyası bu işdə müəyyən edilmiş miRNA'ların təsirini dəstəkləyir. Bütün üç miRNA-nın aşağı səviyyədə tənzimlənməsi olan şəxslərin IGD riski yüksək olduğunu təsbit etdik. Məlum klinik və ya ekoloji risk faktorları və diaqnostika meyarları ilə birlikdə, bizim tapıntılar insanlara IGD riskinin daha yüksək olması üçün erkən müdaxiləni asanlaşdıra bilər.
Etik bəyanatı
Bu iş, Katolik Universitetinin Koreya Tibb Kollecinin (MC16SISI0120) İnstitusional İnceleme Şurası tərəfindən təsdiqləndi. Bütün iştirakçılar və onların valideynləri yazılı razılığa gəldilər.
Müəllif iştirakları
ML və HC bu kağıza bərabər iştirak etdi. ML, D-JK və Y-JC tədqiqatı hazırladılar. SJ, S-MC, YP, DC və JL eksperimentləri və məlumatların istehsalını həyata keçirdi. J-WC, S-HP, J-SC və D-JK qan nümunələri və klinik məlumatları topladı. ML, HC, S-HY və Y-JC məlumatları təhlil etmişdir. ML, HC, S-HY və Y-JC əl yazmasını təsvir etmişdir. Y-JC layihəni nəzarət etdi.
Maraqların Münaqişəsi
Müəlliflər bildirirlər ki, tədqiqat potensial münaqişələr kimi başa düşülə bilən hər hansı bir kommersiya və ya maliyyə əlaqəsi olmadıqda həyata keçirilir.
Dəyişikliklər
Maliyyələşdirmə. Bu iş Elm və İKT və Gələcək Planlaşdırma (NRF-2015M3C7A1064778) tərəfindən maliyyələşdirilən Koreya Milli Tədqiqat Fondu (NRF) vasitəsilə Beyin Tədqiqat Proqramı vasitəsilə qrantla dəstəkləndi.
Əlavə material
Bu maddənin əlavə materialı onlayn olaraq da tapa bilərsiniz http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
References
;
