пярэдняя Псіхіятрыя, 2018; 9: 81.
Апублікавана на сайце 2018 Mar 12. DOI: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Минхо Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Іім,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Пайк,5 Yae Eun Park,6,7 Донг Хьюи Чхон,7,8 Ji Eun Lee,7 Юнг-Сек Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* і Yeun-чэрвень Chung1,2,3,*
абстрактны
Фон
Захапляльны выкарыстанне Інтэрнэту і онлайн-гульняў з'яўляецца патэнцыйным псіхічным засмучэннем называецца Інтэрнэт-гульні засмучэнне (ИГД). Altered микроРНК (миРНК) профілі экспрэсіі былі зарэгістраваныя ў крыві і тканіны галаўнога мозгу пацыентаў з пэўнымі псіхічнымі засмучэннямі, і прапанаваў у якасці биомаркеров. Тым не менш, не было ніякіх паведамленняў пра микроРНК крыві профіляў ў ИГД.
Методыка
Каб выявіць ИГД-звязаны микроРНК, мы прааналізавалі профілі экспрэсіі микроРНК узораў 51 (25 IgD і элементы кіравання 26) з выкарыстаннем TaqMan нізкай шчыльнасцю микроРНК масіва. Для праверкі, мы правялі колькасны ПЦР з зваротнай транскрыпцыяй з 36 незалежных выбарак (20 IgD і кантралюе 16).
Вынікі
Праз адкрыццё і незалежнай праверкі, мы вызначылі тры микроРНК (HSA-микроРНК-200c-3p, HSA-микроРНК-26b-5p, HSA-микроРНК-652-3p), якія былі значна падаўлена ў групе IGD. Асобы з усімі тры микроРНКом змены мела значна больш высокі рызыка, чым тыя, IGD без якога-небудзь [адносіны шанцаў (OR) 22, 95% дзі 2.29-211.11] пераробкі, і Ош павялічылася дозозависимо з лікам змененага микроРНКа. Прагназуемыя мэтавыя гены трох микроРНК былі звязаны з нервовымі шляхамі. Мы даследавалі экспрэсію бялку з трох наступных генаў-мішэняў з дапамогай вестэрн-блоттинга і пацвердзілі, што экспрэсія GABRB2 і DPYSL2 была значна вышэй у групе IGD.
заключэнне
Мы заўважылі, што выразы HSA-MIR-200c-3p, HSA-MIR-26b-5p і HSA-MIR-652-3p былі душацца ў пацыентаў IgD. Нашы вынікі будуць карысныя для разумення патафізіялогіі ИГДА.
Увядзенне
Захапляльнае выкарыстанне Інтэрнэту і інтэрнэт-гульні, гэта не проста сацыяльнае з'ява ў краінах з шырокай інфраструктурай доступу ў Інтэрнэце, але патэнцыйнае псіхіятрычнае засмучэнне называецца інтэрнэт-гульні засмучэнні (IGD) (1-3). Па дадзеных эпідэміялагічных справаздач, паказчыкі распаўсюджанасці ИГДА ў падлеткаў у розных краінах, пачынаючы ад 0.8 да 26.7% (4). У прыватнасці, даследаванні паказваюць узровень распаўсюджанасці вышэй 10% у падлеткаў у многіх азіяцкіх краінах, такіх як Паўднёвая Карэя, Кітай, Тайвань, Ганконг і Сінгапур (4). ИГД зьвязана з пагаршэньнем ў спазнаньні, псіха-сацыяльных адносін і штодзённым жыцці; напрыклад, зніжэнне акадэмічнай або прафесійнай прадукцыйнасці (4-7). ИГД цяпер уваходзіць у частку III (Умовы для далейшага вывучэння) пятага перагляду дыягнастычным і статыстычнага кіраўніцтва па псіхічным засмучэнням (DSM-V) (8). Аднак, нягледзячы на яго клініка-сацыяльнае значэнне, мала вядома аб малекулярна-генетычным механізме за ИГДОМ.
Апошнія буйнамаштабныя даследаванні двайнят мяркуюць генетычны фон для IGD (9, 10). Вінко і інш. даследаваныя індывідуальныя адрозненні ў кампульсіўныя выкарыстанне Інтэрнэту з 5,247 монозиготных і дизиготных двайнят-падлеткаў у Нідэрландах Твін рэгістра і паведаміў, што 48% адрозненняў былі растлумачаны генетычнымі фактарамі (9). Ці і інш. назіраныя 825 пары кітайскіх падлеткаў блізнят і паведаміў, што генетычныя фактары растлумачаны 58-66% адрозненняў (10). Адпаведна, палімарфізм генаў, уцягнутых у нейротрансмиссии, спазнаньні, і ўвага, такія як ген рэцэптара допаміна D2 (DRD2), Катехоламінов-О-метилтрансфераза ген (ВЫПЛАТЫ), Гена пераносчыка серотоніна (5HTTLPR), А таксама холинергический рэцэптар, нікацінавы альфа-ген 4 (CHRNA4) Паведамлялася, што ў значнай ступені звязаны з інтэрнэт-залежнасцю (11-13). У апошні час Кім і інш. Экранаваныя варыянты больш 100 генаў-кандыдатаў, звязаных з вытворчасцю, дзеянні і метабалізм нейрамедыятараў шляхам наступнага аналізу пакалення секвенирования і паведаміў, што rs2229910 з NTRK3 ген звязаны з IGD (14).
У дадатак да генетычных фактараў, гэта таксама добра вядома, што нейроповеденческие фенатыпу эпигенетически кантралюецца некодирующих РНК, уключаючы микроРНК (миРНК) (15, 16). микроРНК невялікія некодирующие одноцепочечные малекулы РНК (прыблізна 20-23 нуклеатыдаў у даўжыню), якія адмоўна рэгулююць экспрэсію кадавальныя бялок генаў шляхам дэградацыі мРНК і гуляюць важную ролю ў патофизиологических працэсе розных захворванняў (17). Лініі доказаў паказалі, што микроРНК ў багацці ў чалавечай цэнтральнай нервовай сістэме (ЦНС) і дзейнічаюць, каб сапраўды наладзіць ўзроўні экспрэсіі іх генаў-мішэняў, якія ўдзельнічаюць у развіцці і паспяванні сістэмы ЦНСА (15). Сапраўды, нядаўнія даследаванні паказалі, што профілі экспрэсіі микроРНК змяняюцца ў тканіны мозгу пацыентаў з псіхічнымі расстройствамі, мяркуючы, што іх профілі экспрэсіі могуць быць биомаркеры для псіхічных расстройстваў (15, 16, 18). Так, напрыклад, праз пасмяротны аналіз, Lopez і інш. паведаміў, што экспрэсія MIR-1202, які рэгулюе экспрэсію гена метаботропных глутаматных рэцэптара-4 і прадказвае рэакцыю на антыдэпрэсант, быў падаўлены ў префронтальной кары тканінах буйных пацыентаў засмучэнні дэпрэсіі (19). З пункту гледжання биомаркеров скрынінга, гэты падыход мае выразнае абмежаванне, таму што выкананне біяпсіі тканіны ЦНС для скрынінга немагчыма. Так як микроРНК могуць быць выяўленыя ў крыві (плазме або сыроватцы), якія цыркулююць микроРНК маюць пэўную перавагу ў якасці неинвазивных биомаркеров ў псіханеўралагічных расстройстваў. Тым не менш, на сённяшні дзень не было ніякіх даследаванняў аб цыркулююць профіляў микроРНК ў ИГД. Лепшае разуменне цыркулявалай профіляў экспрэсіі микроРНК можа дапамагчы растлумачыць механізм развіцця ИГД і палягчэння клінічнага перакладу.
У дадзеным даследаванні мы імкнуліся вызначыць ИГД-звязаны микроРНК маркера шляхам назірання дыферэнцыравана выражаны плазменны микроРНКа паміж IgD і кантрольнымі групамі і вывучыць іх біялагічныя наступствы.
Матэрыялы і метады
навучальныя прадметы
Мы абследавалі 3,166 падлеткаў (ва ўзросце 12-18 гадоў) з выкарыстаннем DSM-V IGD скоринга. Сярод іх, 251 (168 самцы і самкі 83) былі дыягнаставаны як IGD ў адпаведнасці з крытэрамі DSM-V (8). У агульнай складанасці 91 асоб (49 IGDS і 42 кантролю) пры ўмове інфармаванай згоды для дадзенага даследавання. Сярод іх чатыры чалавекі былі выключаны ў адпаведнасці з крытэрамі выключэння. Нарэшце, 87 асоба (45 IgD суб'екты і фізічныя асобы здаровага кантролю 42) былі ўключаныя ў гэтым даследаванні. Сярод іх удзельнікі 51 (пацыенты 25 IgD і кіраванне 26) былі набраныя як адкрыццё набору з 2014 ў 2016. Астатнія ўдзельнікі 36 (пацыенты 20 IgD і кіруе 16) былі прынятыя на працу ў якасці незалежнага набору праверкі ад 2016. Усе ўдзельнікі былі карэйскія асобы, якія навучаюцца з лякарні сеўльскай Святой Марыі (Сеул, Паўднёвая Карэя) і сеўльскай нацыянальнага універсітэта Boramae бальніцы (Сеул, Паўднёвая Карэя). Усе ўдзельнікі прайшлі структураванае інтэрв'ю ў псіхіятра на аснове карэйскага Кидди Расклад афектыўных засмучэнняў і шызафрэніі (K-SADS-PL) (20). Усе ўдзельнікі завяршылі агрегатирования і слоўнікавы запас подтесты на карэйскім Векслера шкала інтэлекту для дзяцей, 4th выданне (K-WISC-IV) (21). Імпульсіўнасць ацэньвалі па шкале Барратт імпульсіўнасці (BIS) (22). Сістэма паводніцкага інгібіравання (БИНС) і паводніцкая сістэма актывацыі (БАВ) шкалы былі вымераныя для ацэнкі вымярэння асобы (23). Крытэрыі выключэння ў мінулым або ў цяперашні час асноўныя медыцынскія захворванні (напрыклад, цукровы дыябет), неўралагічныя засмучэнні (напрыклад, эпілепсіяй, чэрапна-мазгавая траўма), псіхічныя засмучэнні (напрыклад, вялікае дэпрэсіўны засмучэнне, трывожныя расстройствы), разумовая адсталасць, або любое злоўжыванне псіхаактыўных рэчываў (напрыклад, , тытунь, марыхуана, алкаголь). Агульныя характарыстыкі падыспытных прыведзены ў табліцы Table1.1, Гэта даследаванне было ўхвалена Саветам па інстытуцыянальным агляду каталіцкага медыцынскага каледжа універсітэта Карэі (MC16SISI0120). Усе ўдзельнікі і іх бацькі далі пісьмова інфармаваць згоду.
Табліца 1
Агульныя характарыстыкі падыспытных.
| Адкрыццё | праверка дакладнасці | Камбінаваны | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| кантроль | ИГД | P-value | кантроль | ИГД | P-value | кантроль | ИГД | P-value | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Ўзрост (гадоў) | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 13 (12-17) | 13 (12-15) | 0.759 | 15 (13-18) | 14.5 (12-18) | 0.628 | 14 (12-18) | 14 (12-18) | 0.509 |
| Штотыднёвыя гадзіны Інтэрнэт гульнявыя (з) | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 5.25 (2-17) | 18 (6-46) | 1.27E-6a | 5.5 (2-23) | 8 (1-112) | 0.374 | 5.5 (2-23) | 14 (1-112) | 1.63E-5a |
| Даход у месяц хатнюю гаспадарку (млн карэйскіх прэч) | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.588 | 4 (4-4) | 2 (2-2) | 1.000 | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.460 |
| Адукацыя (гадоў) | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 8 (7-9) | 8 (7-9) | 0.584 | 12 (12-12) | 6 (6-13) | 0.305 | 8 (7-12) | 8 (6-13) | 0.269 |
| K-WISC: блочная канструкцыя | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 10.5 (4-17) | 10 (4-16) | 0.544 | 10 (3-16) | 12.5 (4-15) | 0.125 | 10 (3-17) | 11 (4-16) | 0.598 |
| K-WISC: слоўнікавы запас | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 9 (5-17) | 7 (5-13) | 0.174 | 9.5 (8-15) | 11.5 (5-15) | 0.595 | 9 (5-17) | 9 (5-15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 24 (17-36) | 37 (22-51) | 3.81E-6a | 29 (17-34) | 59 (22-108) | 1.2E-5a | 25 (17-36) | 40 (22-108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 63 (35-75) | 67.5 (45-81) | 0.080 | 61 (45-79) | 63 (32-82) | 0.835 | 62 (35-79) | 65 (32-82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 31 (15-40) | 31 (13-51) | 0.558 | 36.5 (22-48) | 34 (27-52) | 1.000 | 32 (15-48) | 34 (13-52) | 0.637 |
| засекі | |||||||||
| Медыяна (мін-макс) | 18 (10-26) | 17.5 (13-27) | 0.642 | 18.5 (12-25) | 20 (13-21) | 0.138 | 18 (10-26) | 19 (13-27) | 0.302 |
ИГД, інтэрнэт-гульні пацыенты расстройствы; KS, карэйская Інтэрнэт-залежнасць Схільнасць Scale; ВІС, Баррэтт імпульсіўнасць Шкала; БАС, паводніцкая актывацыя сістэмы; Засекі, паводніцкая інгібіравання сістэма; KRW, карэйская вона.
aP <0.05 (тэст Мана-Уітні-Уілкаксана).
TaqMan нізкай шчыльнасці микроРНК масіва (TLDA) Эксперыменты
Перыферычная кроў збіралі ад кожнага ўдзельніка і перададзеныя ў лабараторыю на працягу 4 ч, каб звесці да мінімуму лізіс клетак крыві. Ўзор центрифугировали пры 3,000 абаротах у хвіліну на працягу 10 мін пры пакаёвай тэмпературы. Затым надосадочную вадкасць (пласт плазмы) збіралі без забруджвання клеткі крыві. Цыркулююць микроРНК былі вынятыя з выкарыстаннем TaqMan микроРНК ABC набору для ачысткі (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) у адпаведнасці з інструкцыяй вытворцы. Сцісла, 50 мкл ўзору плазмы і 100 мкл буфера ABC змешвалі. Пасля гібрыдызацыі з мэтавымі-спецыфічных анты-микроРНК магнітных шарыкаў, абмежаваныя цыркулююць микроРНК элюируют з гранул з 100 мкл буфера для элюции. У стадыі адкрыцця, 381 микроРНК былі разгледжаны з 51 узораў плазмы (25 IGDs і кіравання 26) з выкарыстаннем набору для ачысткі TaqMan микроРНК ABC (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Megaplex зваротнай транскрыпцыі і амплификации пре-рэакцыі праводзілі, каб павялічыць колькасць кДНК для аналізу экспрэсіі микроРНК з выкарыстаннем MegaplexPreAmp Грунтоўкі Human Pool A і TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Панэль TLDA v2.0 (Thermo Fisher Scientific) быў запушчаны на сістэме рэальнага часу ViiA7 ПЦР (Thermo Fisher Scientific), каб ацаніць экспрэсію микроРНК. Зыходныя дадзеныя былі апрацаваны з выкарыстаннем ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) для вызначэння значэнняў Ct для кожнага микроРНК.
Аналіз дадзеных для TLDA
Спачатку мы вымералі парогавыя цыклы (значэнне Ct) кожнай міРНК. міРНК са значэннем Ct> 35 лічыліся невызначаемымі і выключаны з наступнага аналізу. Усе значэнні Ct былі нармалізаваны да значэння Ct miR-374b (значэнне ΔCt), адной з найбольш стабільна выяўленых міРНК, якія цыркулююць у плазме чалавека (24). Каэфіцыент згіну змены log2 (значэнне ΔΔCt) экспрэсіі разлічвалі з выкарыстаннем сярэдніх значэнняў кантрольных узораў ў якасці калибратора ў пакеце HTqPCR ў Bioconductor (25). Адноснае колькаснае вызначэнне (RQ) кожнай мішэні микроРНК была вызначана як 2-ΔΔCt, Для гіпатэтычнага тэставання адрозненні ў экспрэсіі паміж двума групамі, мы ўжылі сурагатным пераменны аналіз (СВА), каб захапіць гетэрагеннасць, такія як пакетныя эфекты ў эксперыментах з выкарыстаннем СВА пакет у Bioconductor (26). микроРНК з P-значэнні <0.05 лічыліся істотна рознымі паміж дзвюма групамі.
Gene Набор Узбагачэнне аналіз
Для геннага аналізу набор ўзбагачэння, мы выкарыстоўвалі ToppFun ў ToppGene Люкс (27) Істотна зрабіць выснову, узбагачаны Генная Анталогія (GO) (28) Умовы, шляхі і тэрміны захворвання. У якасці ўваходных дадзеных для гэтага падыходу мы выкарыстоўвалі 1,230 прадказаць мэтавыя гены кандыдата микроРНК. Аналіз Шляхі быў выкарыстаны, каб знайсці шлях значнага прадказаны генаў-мішэняў у адпаведнасці з KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP і MSigDBin шляхамі ToppGene. Значэнне функцыянальнай пункту гледжання ўзбагачэння была вызначана на аснове Бонферрони скарэкціраваны P-значение.
Колькасны ПЦР з зваротнай транскрыпцыяй (АД-ПЦР QRT) Праверка і рэплікацыі
Для праверкі микроРНК 10, якія былі дыферэнцыравана выяўленыя ў стадыі адкрыцця, QRT-ПЦР праводзілі з выкарыстаннем TaqMan микроРНК аналізу (MIR-15b-5p, #000390; MIR-26b-5p, #000407; MIR-29b-3p, # 000413; микроРНК-125b-5p, #000449; микроРНК-200c-3p, #002300; микроРНК-337-5p, #002156; микроРНК-411-5p, #001610; микроРНК-423-5p, #002340; микроРНК-483 -5p, #002338 і микроРНК-652-3p, #002352) і сістэма ViiA7 (Life Technologies) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы. Дзесяць нанограммах татальнай РНК ператвараюць у першай ланцуга кДНК з микроРНК-спецыфічных праймер з выкарыстаннем TaqMan микроРНК зваротнай транскрыпцыі Kit (#4366596, Life Technologies), з наступным ПЦР ў рэальным часе з TaqMan зондаў. RQ кожнага микроРНКа быў вызначаны як 2-ΔCt, Дзе & Delta; ЕТ розніца ў парогавых цыклах для ўзору, аб якім ідзе гаворка, нармаваны ў адносінах да эндагеннай микроРНКу (MIR-374b-5p, #001319). Усе ПЦР-рэакцыі праводзілі ў трох асобніках, а іх значэння Ct былі усярэдненыя. Мы разлічылі суадносіны log2 згіну змены (ΔΔCt) кожны микроРНК такім жа чынам, як і пры аналізе масіва на аснове. Непараметрический тэст Манна-Уітні-Вілкоксона была выкананая, каб праверыць адрозненні ў узроўнях экспрэсіі микроРНК ў двух групах з парогам P-значение з 0.05.
Вестэрн-блот-аналіз
Кожны ўзор сыроваткі быў упершыню знясіленыя з верхняй 14 высокай колькасці вавёркі (альбумін, імунаглабулін G, імунаглабулін А, serotransferrin, гаптоглобина, альфа-1 антытрыпсіна, фібрынаген, альфа-2 макроглобулина, альфа-1 кіслаты глікапратэіна, імунаглабулін М, аполипопротеина AI , аполипопротеина A-II, дадатак C3 і транстиретин) з выкарыстаннем калонкі MARS-14 (4.6 × 50 мм, Agilent Technology, Санта-Клара, Каліфорнія, ЗША) да вестэрн-блот-аналізу. Незвязаных фракцыя, атрыманая з калоны МАРСА-14 канцэнтравала з выкарыстаннем цэнтрабежнага фільтра Amicon Ultracel-3 (3 кд адсечка), а затым канцэнтрацыя бялку вызначала з выкарыстаннем метаду бицинхониновой кіслаты. Тое ж колькасць (ад 10 да 30 мкг) кантролю і IgD узораў сыроваткі падзяляла на 4-20% Міні-PROTEAN TGX зборнага гель (Bio-Rad, CA, ЗША) і пераносіў у поливинилидендифторидной мембрану. Затым мембрану блакавалі ў TBS-T (190 мм NaCl, 25 мм Трис-HCl, рн 7.5 і 0.05% Tween 20) з 5% абястлушчанага сухога малака пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 мін. Затым мембраны інкубаваць з першаснымі антыцеламі супраць DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, ЗША), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Кембрыдж, Масачусэтс, ЗША), і CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, ЗША), DUSP4 (1: 500, MybioSource, Сан-Дыега, штат Каліфорнія, ЗША), і PI15 (1: 500, MybioSource, Сан-Дыега, штат Каліфорнія, ЗША) у TBS-T з 5 % абястлушчанае сухое малако ў 4 ° з на працягу ночы, а затым з адпаведнымі другаснымі антыцеламі, альбо бычынай анты-мышы (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) або козы супраць труса (1: 1,000, Cell Signaling, Беверлі, Масачусэтс, ЗША ), кан'югаванага з пероксидазой хрэна пры пакаёвай тэмпературы на працягу 1 ч. Выяўленне сігналу праводзілі з выкарыстаннем хемилюминесценции з рэагентаў ECL (GE Healthcare, Piscataway, Нью-Джэрсі, ЗША). Мы колькасна Вестэрн-блот вынікаў з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння для аналізу TotalLab 1D (Нелінейная дынаміка, Ньюкасл-эпон-Тайн, Велікабрытанія). Затым значэнне каэфіцыента денситометрии была разлічваецца шляхам дзялення значэння денситометрии кожнага ўзору, як апісана ў іншым месцы (29). У якасці кантролю для нармалізацыі, ўзор сыроваткі збіралі з 46 IGD і кантрольныя ўзоры былі выкарыстаныя для кожнага эксперыменту. Статыстычную значнасць вызначалі з выкарыстаннем непараметрического крытэра Манна-Уітні-Вілкоксона з парогам P-значение з 0.05.
Вынікі
Характарыстыкі суб'ектаў даследавання
Дэмаграфічныя і клінічныя асаблівасці падыспытных прыведзены ў табліцы Table1.1, Калі мы параўналі IgD і кантрольныя групы ў адпаведнасці з карэйска Internet Addiction схільнасці Scale (K-Scale), як апісана ў іншым месцы (20, 30), Група IGD паказала значна больш высокае сярэдняе значэнне К-Scale, чым у кантрольнай групе (37 супраць 24, P = 3.81 × 10-6) (Табліца (Table1) .1). Медыяна штотыднёвае час, праведзены на інтэрнэт-гульняў у групе ИГД значна больш, чым у кантрольных быў (18 супраць 5.25 ч, P = 1.27 × 10-6). Прымаючы пад увагу, што не было ніякіх істотных адрозненняў паміж двума групамі па ўзросце, месячны даход сям'і, працягласць адукацыі, блокавым, і вынікаў слоўніка субтестов К-WISC, ВІС, засекаў, і БАВ.
Дыферэнцыяльна Выяўлены микроРНК Між ИГД і кантролю
Каб выявіць ИГД-звязаны микроРНК, мы прынялі два кроку (адкрыццё і незалежную праверка) падыход. Дызайн даследаванні і агульная стратэгія праілюстраваны на малюнку S1 ў дадатковых матэрыялах. На стадыі выяўлення, мы прааналізавалі профілі экспрэсіі микроРНК узораў 51 (25 IGDS і кантралюе 26), выкарыстоўваючы масіў, які змяшчае микроРНК 384 микроРНК. былі выяўленыя ўзроўні экспрэсіі микроРНК 10 будуць значна адрознівацца паміж IgD і кантрольнай груп (табл (Table2) .2). Адносныя ўзроўні экспрэсіі гэтых 10 микроРНК паказаныя на малюнку Figure1.1, Сярод іх два (HSA-микроРНК-423-5p і HSA-микроРНК-483-5p) былі павышалася і восем (HSA-микроРНК-15b-5p, HSA-микроРНК-26b-5p, HSA-микроРНК-29b-3p, HSA-микроРНК-125b-5p, HSA-микроРНК-200c-3p, HSA-микроРНК-337c-5p, HSA-микроРНК-411-5p і HSA-микроРНК-652-3p) былі душацца ў групе IGD.
Табліца 2
Дыферэнцыяльна выказаў микроРНК (миРНК) і змена зморшчыны.
| микроРНК | Адкрыццё | праверка дакладнасці | Камбінаваны | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-value | Fold змяніць | P-value | Fold змяніць | P-value | Fold змяніць | |
| HSA-микроРНК-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| HSA-микроРНК-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| HSA-микроРНК-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| HSA-микроРНК-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| HSA-микроРНК-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| HSA-микроРНК-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| HSA-микроРНК-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| HSA-микроРНК-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| HSA-микроРНК-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| HSA-микроРНК-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
aмикроРНК значна зменены ў абодвух выяўлення і праверкі набораў паслядоўным чынам.
QRT-ПЦР праверкі кандыдата микроРНК
Для праверкі кандыдатаў микроРНКа 10, мы правялі QRT-PCR з незалежнай праверкай абгрунтаванасці (20 IGDS і 16 кантроль) (Табліца S1 ў дадатковых матэрыялах). Тры з гэтых микроРНК (HSA-микроРНК-200c-3p, HSA-микроРНК-26b-5p і HSA-микроРНК-652-3p) былі значна падаўлена ў групе IGD мноства праверкі (табліца (Table2) .2). Тры іншых микроРНК (HSA-микроРНК-337c-5p, HSA-микроРНК-125b і HSA-микроРНК-423-5p) былі таксама душацца ў групе IGD, але не істотна. Былі выказаны Астатнія чатыры микроРНК (HSA-микроРНК-15b-5p, HSA-микроРНК-29b-3p, HSA-микроРНК-411-5p і HSA-микроРНК-423-5p) процілегла ў наборы праверкі. Калі мы аб'ядналі выяўлення і праверкі набораў (у агульнай складанасці 45 IgD прадметаў і кіравання 42), тры правераных микроРНК былі паслядоўна значнымі (табл (Table2) .2). Падрабязная інфармацыя, храмасомныя лакацый, сталыя паслядоўнасці, і выраз узроўняў у ЦНС гэтых трох микроРНК даступныя ў табліцы S2 ў дадатковых матэрыялах.
Сінэргетычны эфект адначасовага змены трох микроРНК на ИГД рызыцы
Для таго, каб ацаніць сукупнае ўздзеянне трох микроРНК, мы назіралі адносіны шанцаў (ПРС) з чатырох падгруп (з 0, 1, 2 або 3 микроРНК зменамі). микроРНК змяненне было вызначана значэнне RQ, як апісана ў раздзеле «Матэрыялы і метады. »Паколькі ўсе тры микроРНК маркеры душацца ў групе IGD, микроРНК якога RQ значэнне было ніжэй адзінкі была змененая, як кінулі выклік сябар. Больш падрабязная інфармацыя аб кошце RQ кожнага даследаванні суб'екта для тры микроРНКа даступная ў табліцы S3 ў дадатковых матэрыялах. Для кожнай падгрупы, каэфіцыенты былі разлічаны як стаўленне колькасці элементаў кіравання да таго з IGDs, то кожныя АБО вылічалі шляхам дзялення шанцаў кожнай падгрупы з каэфіцыентам падгрупы без якіх-небудзь змяненняў микроРНКа. Асобы з трыма микроРНКом змяненняў паказалі 22 рызыкі разы вышэй, чым тыя, без якіх-небудзь змяненняў микроРНКа (АБО 22, 95% дзі 2.29-211.11). Ош паказаў тэндэнцыю да павелічэння з лікам змененага микроРНКа ад 0 да 3 (r2 = 0.996) (Малюнак (Figure22).
GO і Сцежка Аналіз мэтавых генаў-кандыдатаў микроРНК
Для таго, каб атрымаць уяўленне аб функцыях трох микроРНК маркераў значна падаўлена ў групе IGD, іх гены-мішэні былі прадказана з выкарыстаннем базы дадзеных miRWalk 2.0 (31). У агульнай складанасці генаў 1,230 паслядоўна, як прадказваў ўніз па плыні мішэняў з дапамогай чатырох алгарытмаў (miRWalk, Miranda, RNA22 і TargetScan) з выкарыстаннем базы дадзеных (miRWalk32-34) (Табліца S4 ў дадатковых матэрыялах). Набор гены Узбагачэнне аналіз з выкарыстаннем ToppFun ў ToppGene Suite, паказаў, што гены-мішэні гэтых микроРНКов былі звязаны з нервовымі шляхамі развіцця, такія як «аксоны» і GO такіх тэрмінаў, як «нейрогенез» (табліца S5 ў дадатковых матэрыялах).
Экспрэсія генаў-мішэняў прагназуемай
Сярод наступных генаў-мішэняў трох микроРНК, 140 былі прадказана адначасова для два ці больш микроРНКа (табліца S4 ў дадатковым матэрыяле). Для таго, каб даследаваць, ці адрозніваюцца паміж IgD і кантрольнымі групамі іх бялковымі выразамі узроўняў ніжэй па плыні генаў-мішэняў, мы абралі 2 генаў (DUSP4 і PI15), Якія, як прадказана ўніз па плыні мэты ўсіх 3 микроРНК і дадатковых генаў (3GABRB2, DPYSL2, і CNR1) Ад прагназуемых вынікаў па 2 микроРНК і праводзілі Вестэрн-блоттинга з ўзорамі плазмы з 28 IGDs і кіравання 28 даступных для эксперыменту. Мы параўналі выразы пяці мішэняў паміж IgD і кантрольнымі групамі шляхам вымярэння інтэнсіўнасці паласы і вобласці, як апісана ў іншым месцы (29). Сярод іх, узроўні экспрэсіі DPYSL2 (28 IGDs і кіравання 28, P = 0.0037) і GABBR2 (27 IGD і 28 элементаў кіравання, P = 0.0052) былі значна вышэй у групе IGD (мал (Figure3) .3). Тым не менш, мы не маглі назіраць дыферэнцыяльныя выразы CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) і PI15 (P = 0.6346).
Абмеркаванне
Паведамлялася, што микроРНК ўцягнутыя ў развіццё нейронаў (35, 36), І дыферэнцыяльнае выраз микроРНК мозгу назіраюцца ў псіхіятрычных захворванняў, такіх як шызафрэнія (37). Такім чынам, цалкам верагодна, што цыркулявалую профілі микроРНК можа быць карысным биомаркеров для IGD. Цыркулююць микроРНК былі прапанаваныя ў якасці биомаркеров для розных псіханеўралагічных расстройстваў (38-40); Аднак малекулярныя механізмы, якія ляжаць у развіцці ИГД па-ранейшаму ў значнай ступені невядомыя, нягледзячы на клінічнае і сацыяльнае значэнне. У прыватнасці, не было ніякіх даследаванняў на ИГД-асацыіраваных микроРНК. Мэтай дадзенага даследавання было дваякім. Па-першае, мы паспрабавалі выявіць плазменных микроРНК, звязаных з ИГД. Па-другое, мы ацэньвалі біялагічную дачыненне кандыдатаў микроРНК, даследуючы экспрэсію бялку і GO ўніз па плыні генаў-мішэняў. Праз геному скрынінга профіляў экспрэсіі микроРНК і ўніз па плыні праверкі кандыдатаў, мы выявілі, што экспрэсія трох микроРНК (HSA-микроРНК-200c-3p, HSA-микроРНК-26b-5p і HSA-микроРНК-652-3p) было значна ніжэй у пацыентаў IgD чым у кантрольнай групе. Хоць патэрны экспрэсіі іншых сем кандыдатаў микроРНКа ня былі прайграныя ў праверцы, можа быць ілжыва адмоўным з-за невялікі памер выбаркі ў дадзеным даследаванні. Наколькі нам вядома, гэта першы даклад аб магчымасці таго, што выраз микроРНК крыві профілі могуць быць карыснымі биомаркеры для IGD. Камбінацыя з трох маркераў микроРНКа можа служыць мінімальна інвазівным інструментам для ранняга выяўлення людзей, схільнага рызыцы ИГДА.
У микроРНК, выяўленыя ў дадзеным даследаванні паведамлялася, удзельнічаюць у розных псіханеўралагічных расстройстваў. Выраз HSA-MIR-200c ў крыві было паведамлена быць падаўлена ў некалькіх псіхіятрычных расстройстваў, такіх як шызафрэнія (41) І дэпрэсіўныя эпізоды (42). микроРНК-200c Паведамлялася, што больш высокі ўзровень экспрэсіі ў сінаптычных фракцый, чым у агульнай пярэдняга мозгу (43), А таксама быць звязана са смерцю нейронаў, клетак (44). Грунтуючыся на гэтых папярэдніх дакладах, микроРНК-200c ўдзельнічае ў нейроразвитиях і можа быць звязаны з нервова-псіхічныя расстройствы, калі яго выраз абураецца. Некаторыя даследаванні мяркуюць сувязь паміж микроРНК-652 і рызыкай псіханеўралагічных расстройстваў. Падобна нашаму падыходу, каб вызначыць биомаркеры крыві для шызафрэніі, Lai і інш. Праведзены аналіз TLDA з хворых шызафрэнію і нармальным кантролем, і выявілі, што сем микроРНК, уключаючы HSA-MIR-652 былі дыферэнцыяльна выяўленыя ў хворых шызафрэнію (45). У наступным даследаванні, яны распрацавалі мадэль прагназавання з выкарыстаннем экспрэсіі микроРНКа дадзеных і паспяхова адрозніваюцца шызафрэніі ад нармальнага кантролю (46). Змененая экспрэсія HSA-MIR-652 таксама назіралася ў алкаголікаў (47). HSA-микроРНК-26b было ўстаноўлена, што актывуецца падчас нейрональной дыферэнцыявання клетак (48). Перкінс і інш. паведаміў, што HSA-микроРНК-26b была падаўленая ў префронтальной кары галаўнога мозгу хворых шызафрэнію (49).
Нягледзячы на тое, што няма прамых доказаў таго, каб падтрымліваць сувязь паміж абуранай экспрэсіяй гэтага микроРНКа і патафізіялогіі IGD, мы можам зрабіць выснову, што парушэнне рэгуляцыя гэтага микроРНКа можа быць звязаныя з патафізіялогіі IGD на аснове розных папярэдніх дакладаў пра наступных генах мы прадказаны , Некаторыя з генаў ўніз па плыні трох микроРНК, такіх як GABRB2, CNR1, NRXN1, і DPYSL2 як паведамляецца, звязана з псіханеўралагічнымі засмучэннямі. Гама-аминомасляная кіслата (ГАМК) з'яўляецца асноўным ингибиторным нэўрамэдыятары ў цэнтральнай нервовай сістэме. Парушэнне рэгуляцыі рэцэптара ГАМК, удзельнічае ў нервова-псіхічных расстройстваў, уключаючы наркаманіі, трывогі і дэпрэсіі (50), Якія таксама з'яўляюцца асноўнымі асаблівасцямі IGD (8). Генетычныя палімарфізм ў генах рэцэптараў ГАМК, як паведамляецца, звязаныя з алкагольнай залежнасцю і шызафрэніі (51, 52). Дигидропиримидиназы-падобны 2 (DPYSL2) з'яўляецца членам collapsin адказу медыятара сямейства бялкоў, які гуляе ролю ў зборцы микротрубочек, сінаптычную перадачы сігналаў і рэгуляцыі росту аксонов. Такім чынам, гэтая малекула была прапанаваная ў якасці биомаркеров для псіхічных расстройстваў (53, 54). палімарфізм ў DPYSL2 ген быў таксама паведамлялася, звязаныя з ужываннем алкаголю засмучэнні (55). Папярэднія справаздачы і нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што залішняя экспрэсія GABRB2 і DPYSL2, ўніз па плыні мэтаў у душацца микроРНК, уплывае на патагенез псіханеўралагічных расстройстваў, уключаючы IGD. Канабіноіды рэцэптар тыпу 1 (CNR1) уяўляе сабой пресінаптіческой heteroreceptor, які мадулюе вызваленне нейрамедыятараў і парушэнне ў перадачы сігналаў канабіноіды звязаны з рознымі нервова-псіхічныя расстройствы (56). генетычны палімарфізм CNR1 Ген, як вядома, звязаны з наркатычнай залежнасцю ў каўказцы (57). У мадэлі на пацуках, актывацыя вентрального гіпакампа CNR1 парушае нармальнае сацыяльнае паводзіны і кагнітыўны (58). Генетычныя змены ў сям'і NRXN, як вядома, удзельнічаюць у розных псіханеўралагічных засмучэннях, у тым ліку наркаманіі (59).
Для вывучэння біялагічнай дакрананне трох кандыдатаў микроРНКа ў больш прамым шляху, мы даследаваліся экспрэсію бялку іх уніз па плыні генаў-мішэняў. З-за абмежаванай даступнасці узораў плазмы, з агульных кандыдатаў 140 (прадказаная ўніз па плыні ад 2 або больш микроРНК), мы даследавалі мэты 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 і PI15) з дапамогай Вестэрн-блоттинга і пацвердзілі, што экспрэсія GABRB2 і DPYSL2 было значна вышэй у групе IGD. Папярэднія справаздачы і нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што залішняя экспрэсія GABRB2 і DPYSL2, ўніз па плыні мэтаў у душацца микроРНК, можа мець наступствы для патагенезу псіханеўралагічных расстройстваў, уключаючы IGD. Вынікі GO і закранае шлях аналізу нейронавых шляхоў развіцця таксама падтрымліваюць нейробиологические наступствы маркераў микроРНКа. Яшчэ адзін цікавы выснова была сінэргетычны эфект адначасовага змены ў микроРНК. Асобы з паніжальным ўсе микроРНКом 3 паказалі 22 разы больш высокі рызыка, чым тыя, без паніжальнага і Ош павялічылася ў залежнасці ад дозы. Хоць дзі для гэтых трох змен былі шырока з-за абмежаванага аб'ёму выбаркі, дакладнай станоўчай карэляцыі (r2 = 0.996) падтрымлівае сінэргетычны эфект трох міРНК.
Хоць мы выявіць ИГД-звязаных микроРНК маркераў і фізічных асоб усіх трох микроРНК змены мелі 22 рызыка разоў вышэй, чым тыя, без якіх-небудзь змяненняў микроРНК, існуе некалькі абмежаванняў у дадзеным даследаванні. Па-першае, невялікі памер выбаркі павышае верагоднасць пропуску іншых важных маркераў микроРНК. Па-другое, так як нашы дадзеныя не былі дастаткова, каб удакладніць профілі плазмы микроРНК, ці з'яўляюцца альбо прычынай або следствам, мы не можам пацвердзіць біялагічную ролю гэтых неинвазивных маркераў ў клінічнай практыцы. Далей микроРНК прафіляванне і іх уніз па плыні аналізу гена з выкарыстаннем тканіны галаўнога мозгу чалавека з банка тканін мозгу можа даць больш прамы адказ. Аналіз тканіны мозгу з мадэллю гульнявога засмучэнні жывёл таксама будзе карысна. Па-трэцяе, з-за абмежаванай даступнасці узораў плазмы, мы разгледзелі толькі пяць ўніз па плыні малекул-кандыдатаў. Вывучэнне больш ўніз па плыні мэты з вялікім наборам узораў будзе карысна для далейшага разумення малекулярнай механізму IGD.
Такім чынам, з дапамогай геному скрынінга профіляў экспрэсіі микроРНК і незалежнай праверкі, мы знайшлі тры ИГД-звязаных микроРНК (HSA-микроРНК-200c-3p, HSA-микроРНК-26b-5p і HSA-микроРНК-652-3p). Многія з іх ніжэйстаячых генаў, як паведамляецца, удзельнічаюць у розных псіханеўралагічных засмучэннях, а таксама эксперыментальнае пацверджанне змененай экспрэсіі гэтых ніжэйстаячых гены падтрымліваюць вывад з микроРНКа, названы ў гэтым даследаванні. Мы выявілі, што людзі з паніжальнай ўсіх трох микроРНК падвяргаюцца высокай рызыцы ИГД. Разам з вядомымі фактарамі клінічнага або экалагічнага рызыкі і дыягнастычных крытэрыяў, нашы вынікі могуць спрыяць ранняму ўмяшанню, каб дапамагчы людзям з падвышанай рызыкай ИГД.
Заяву па этыцы
Гэта даследаванне было ўхвалена Саветам па інстытуцыянальным агляду каталіцкага медыцынскага каледжа універсітэта Карэі (MC16SISI0120). Усе ўдзельнікі і іх бацькі далі пісьмова інфармаваць згоду.
аўтар Уклады
ML і HC ў роўнай ступені да гэтай працы. ML, D-JK, і Y-JC распрацаваны даследаванне. SJ, S-МС, Ю.П., акруга Калумбія, і ДЛ былі праведзены эксперыменты і дадзеныя пакалення. J-туалет, S-HP, J-SC, і Д-Дж.К. Збіралі ўзоры крыві і клінічную інфармацыю. ОД, НС, S-Г, і Y-JC прааналізавалі дадзеныя. ML, HC, S-Г, і Y-JC апісалі рукапіс. Y-JC курыраваў праект.
Заяву аб канфлікце інтарэсаў
Аўтары заяўляюць, што даследаванне было праведзена ў адсутнасць якіх-небудзь камерцыйных або фінансавых адносін, якія маглі б быць вытлумачаны як патэнцыйны канфлікт інтарэсаў.
зноскі
Фінансаванне. Гэтая праца была падтрымана грантам праграмы Brain Research ў рамках Нацыянальнага даследчага фонду Карэі (NRF), што фінансуецца Міністэрствам навукі і ІКТ і будучыні планавання (NRF-2015M3C7A1064778).
дадатковы матэрыял
Дадатковы матэрыял для гэтага артыкула можна знайсці ў Інтэрнэце па адрасе http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Спасылкі
;