DeltaFosB nepřímo reguluje Cck promotorovou aktivitu (2010)

Brain Res. 2010 Může 6; 1329: 10 – 20.

Publikováno online 2010 Březen 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ a Colleen A. McClung^{2, *}

Informace o autorovi ► Autorská a licenční informace

Konečná upravená verze tohoto článku vydavatele je k dispozici na adrese Brain Res

Viz další články v PMC to citovat publikovaný článek.

Abstraktní

Zdá se, že některé důležité biochemické, strukturální a behaviorální změny vyvolané chronickou expozicí zneužívaným lékům jsou zprostředkovány vysoce stabilním transkripčním faktorem AFos. Předchozí práce ukázala, že nadměrná exprese AFosB u myší po dobu 2 týdnů vede ke zvýšení exprese četných genů ve striatu, z nichž většina je později downregulována po 8 týdnech exprese AFosB. Je zajímavé, že velké množství těchto genů bylo také upregulováno u myší nadměrně exprimujících transkripční faktor CREB. Z této studie však nebylo jasné, zda krátkodobé AFosB reguluje tyto geny prostřednictvím CREB. Zde zjistíme, že 2 týdny nadměrné exprese ΔFosB zvyšuje expresi CREB ve striatu, což je účinek, který se rozptyluje o 8 týdny. Časná indukce je spojena se zvýšenou vazbou CREB na určité promotory cílového genu v této oblasti mozku. Překvapivě jeden gen, který byl na základě předchozích zpráv podezřelým cílem CREB, cholecystokinin (Cck), nebyl kontrolován CREB ve striatu. Dále zkoumat regulaci Cck po nadměrné expresi AFosB jsme potvrdili, že krátkodobá nadměrná exprese FosB se zvyšuje Cck promotorová aktivita a genová exprese. Také zvyšuje vazebnou aktivitu na domnělém vazebném místě CREB (CRE) v EU Cck promotor. Avšak místo CRE je nezbytné pro normální bazální expresi Cck, není vyžadováno pro indukci ΔFosB Cck. Dohromady tyto výsledky naznačují, že zatímco krátkodobá indukce AFosB zvyšuje expresi a aktivitu CREB u určitých genových promotorů, není to jediný mechanismus, kterým jsou geny za těchto podmínek upregulovány.

Klíčová slova: nucleus accumbens, transkripce, závislost

ÚVOD

Chronická expozice zneužívání drog způsobuje biochemické a strukturální změny v několika oblastech mozku. Předpokládá se, že tyto změny zahrnují změny v profilech genové exprese v mezolimbickém systému. Tento systém je složen z dopaminergních neuronů, které vyčnívají z ventrální tegmentální oblasti (VTA) ve středním mozku až ke středním ostnatým neuronům v nucleus accumbens (NAc) (ventrální striatum), jakož i z řady dalších oblastí mozku. Byly navrženy změny v aktivitě dvou transkripčních faktorů, vazebného proteinu vazebného prvku cAMP (CREB) a AFosB (protein rodiny Fos), které zprostředkovávají mnoho biochemických, strukturálních a behaviorálních změn pozorovaných při chronické expozici zneužívaným drogám ( přezkoumáno uživatelem Nestler, 2005).

CREB je všudypřítomně exprimovaný transkripční faktor, který je členem rodiny CREB / ATF. Homodimery CREB se vážou na variace sekvence CRE (konsenzus: TGACGTCA) nalezené v promotorech mnoha genů. Fosforylaci CREB (převážně na serinu 133, ačkoli byla identifikována jiná místa), lze stimulovat několika signálními kaskádami, včetně těch, které jsou downstream od dopaminových receptorů (Cole a kol., 1995). Po fosforylaci v serinu 133 získává CREB koaktivátor CREB vázající protein (CBP) nebo příbuzné proteiny, což vede ke zvýšené genové expresi (přehled: Johannessen a kol., 2004). Chronická expozice zneužívání opiátů nebo psychostimulačních drog vyvolává přechodné zvýšení aktivity CREB v nucleus accumbens (Barrot a kol., 2002; Shaw-Lutchman a kol., 2002, 2003), adaptační myšlenka ke snížení prospěšných vlastností těchto drog a přispění k negativnímu emočnímu stavu stažení drog (Nestler, 2005).

Lpředpokládá se, že trvalé adaptace na drogy zneužívání jsou částečně zprostředkovány ΔFosB, vysoce stabilní sestřihovou variantou FosB (Nestler a kol., 1999; McClung a kol., 2004; Nestler, 2008). Členové rodiny Fos dimerizují se členy Jun rodiny za vzniku aktivátorového proteinu 1 (AP-1) komplexu. Transkripční komplexy AP-1 se vážou na variace elementu odpovědi AP-1 (konsenzus: TGACTCA), aby regulovaly transkripci (přehled: Chinenov a Kerppola, 2001). Zatímco akutní expozice zneužívání drog vede k krátkodobé indukci (hodin) členů rodiny Fos (stejně jako ke zvýšené aktivitě CREB), opakovaná expozice léčiv vede k akumulaci vysoce stabilního AFosB (Hope a kol., 1994; Perrotti a kol., 2008), jehož výraz přetrvává týdny.

Bi-transgenní myši indukovatelně nadměrně exprimující buď FosB nebo CREB v dospělém striatu vykazují mnoho biochemických a behaviorálních fenotypů pozorovaných u zvířat opakovaně vystavených psychostimulancím nebo jiným zneužívaným drogám. Analýza změn genové exprese u těchto transgenních zvířat identifikovala četné geny upregulované krátkodobou (2 týdny) nadměrnou expresí AFosB, změny spojené se současným snížením odměny za léčivo. Změny v genové expresi a behaviorální odpovědi u krátkodobých AFOS byly pozoruhodně podobné změnám pozorovaným u zvířat nadměrně exprimujících CREB po 2 nebo 8 týdny (McClung a Nestler, 2003). Na rozdíl od toho, dlouhodobá nadměrná exprese (8 týdnů) AFosB snížila expresi mnoha těchto stejných genů a vedla ke zvýšení odměny za léčivo (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003).

Jeden gen identifikovaný v těchto studiích je cholecystokinin (Cck), neuropeptid produkovaný v několika oblastech mozku, včetně striata (Hokfelt a kol., 1980). CCK může modulovat dopaminergní přenos (Vaccarino, 1992) se podílí na odměňování a posilování drog (Josselyn et al., 1996; Josselyn a kol., 1997; Hamilton a kol., 2000; Beinfeld a kol., 2002; Rotzinger a kol., 2002) a je indukováno ve striatu chronickým kokainem (Ding a Mocchetti, 1992). Kromě toho Cck ukázalo se, že promotor reaguje na komplexy CREB a AP-1 (Haun a Dixon, 1990; Deavall a kol., 2000; Hansen, 2001). Protože mnoho genů (včetně Cck), které vykazovaly zvýšenou expresi po CREB i krátkodobé expresi AFosB, byly známé nebo předpokládané CREB cílové geny (McClung a Nestler, 2003) jsme chtěli zjistit, zda krátkodobá exprese AFosB vede k regulaci těchto genů (se zaměřením na Cck) prostřednictvím regulace CREB nebo prostřednictvím složitějších mechanismů genové regulace.

VÝSLEDKY

Nadměrná exprese FosB přechodně zvyšuje hladiny CREB

Western blotting jsme použili ke zkoumání, zda nadměrná exprese AFosB zvyšuje hladinu CREB proteinu ve striatu myší. Pro tuto studii jsme použili bi-transgenní myši (linie 11A), které nesou jak transgen NSE-tTA, tak transgen TetOp-AFOS. V nepřítomnosti doxycyklinu tyto myši vykazují silné zvýšení exprese AFosB v dynorfinových pozitivních neuronech ve striatu (Kelz a kol., 1999). Tato metoda nadměrné exprese AFosB byla rozsáhle zdokumentována a umožňuje regionálně specifickou nadměrnou expresi, která paralelizuje s indukcí AFosB pozorovanou u zvířat vystavených chronickému kokainu (Hope a kol., 1994; Kelz a kol., 1999). Zjistili jsme, že u 11A myší nadexprimujících ΔFosB byly hladiny CREB proteinu signifikantně zvýšené po 2 týdnech exprese a tyto hladiny se vrátily na základní úroveň po 8 týdnech exprese (Obrázek 1A, n = 8). Abychom zjistili, zda by změny hladin CREB s krátkodobou nadměrnou expresí ΔFosB mohly být replikovány v jiném systému, přechodně jsme nadměrně exprimovali ΔFosB v buňkách PC12 a zjistili jsme, že hladiny CREB se významně zvýšily (p <0.05) ve srovnání s kontrolami (Obrázek 1B, n = 4). Tyto výsledky ukazují, že krátkodobá exprese AFB zvyšuje hladinu CREB proteinu.

Hladiny CREB se zvyšují při nadměrné expresi AFosB. Analýza lyzátů metodou Western blot (A) myší striata z 11A myší mimo dox po dobu 2 nebo 8 týdnů nebo (B) Buňky PC12 nadměrně exprimují AFosB. Data v A jsou zobrazeny jako procentuální změna off dox ve srovnání ...

FOSB i CREB se vážou na promotory specifických cílových genů ve striatu po krátkodobé nadměrné expresi FosB

Použili jsme ChIP (chromatinová imunoprecipitace) stanovení striatální tkáně, abychom určili, zda k vázání AFosB nebo CREB došlo u určitých promotorů cílového genu a zda se tato vazba zvýšila po krátkodobé nadměrné expresi FosB. Analyzovali jsme vazbu na BDNF a Cck promotory, protože oba geny jsou vysoce upregulovány po krátkodobé nadexpresi AFosB, nadměrné expresi CREB nebo chronické léčbě kokainem (McClung a Nestler, 2003). Také jsme analyzovali vazbu na CDK5 promotor, protože se jedná o známý přímý cíl ΔFosB (Chen a kol., 2000; Bibb a kol., 2001; Kumar a kol., 2005). Nakonec jsme změřili vazbu na prodynorphin promotor, protože předchozí studie zjistily, že může být vázán ΔFosB a CREB za různých podmínek (Andersson a kol., 2001; Zachariou a kol., 2006).

ChIP analýza byla provedena na striatě od 11A myší nadexprimujících AFosB po dobu 2 týdnů s použitím protilátek, které rozpoznávají CREB nebo AFB. Za normálních podmínek jsme zjistili, že AFosB se váže na CDK5 a prodynorphin promotory, zatímco na proteinu není detekovatelná vazba BDNF or Cck promotéři (Tabulka 1). Nadměrná exprese AFosB dále zvýšila vazbu AFosB na CDK5 promotér, ale ne na prodynorphin promotor. Dále jsme měřili vazbu CREB na těchto promotorech a zjistili jsme, že se CREB váže na CDK5, BDNF a prodynorphin promotéry, ale ne na Cck promotor v normálním striatu a že nadměrná exprese AFosB po dobu 2 týdnů zvyšuje vazbu CREB na BDNF a prodynorphin promotéry, ale ne CDK5 promotor. Dohromady tyto výsledky ukazují, že AFosB a CREB se mohou oba vázat na určité genové promotory, jako je prodynorphin a CDK5vazba CREB je však specifická pro jiné promotory, jako je BDNF. Nadměrná exprese AFosB dále vede ke zvýšení vazby AFosB na určitých promotorech, jak by se očekávalo, ale také k vazbě CREB na specifické promotory, konzistentní s indukcí CREB zprostředkovanou AFosB pozorovanou v tomto časovém bodě.

Vazba domnělých regulačních proteinů na různé promotory u myší nadměrně exprimujících AFosB po dobu dvou týdnů.

Předchozí práce ukázaly, že změny v genové expresi vyvolané dlouhodobou nadexpresí AFOSB jsou spojeny s modifikacemi chromatinu, zejména acetylací histonu H3, na specifických genových promotorech (Kumar a kol., 2005). Abychom určili, zda by to mohlo odpovídat změnám v genové expresi po krátkodobější nadexpresi AFOSB, měřili jsme vazbu acetylovaného histonu H3 (modifikace histonu asociovaná s transkripčně aktivním chromatinem) nebo methylované histonu H3 (Lys9, modifikace histonu asociovaná s transkripcí neaktivní chromatin). Zjistili jsme, že nadměrná exprese AFosB po 2 týdny nevedla k žádným změnám ve vazbě acetylovaného H3 na žádném ze studovaných genových promotorů (Tabulka 1). Našli jsme významné snížení vazby methylovaného histonu H3 na prodynorphin promotor, ale žádná vazba na Cck promotor a žádná změna vazby na CDK5 a BDNF promotory, což naznačuje, že nejde o obecný mechanismus, kterým ΔFosB v krátkodobém horizontu reguluje genovou expresi. Byli jsme překvapeni a zajímá nás skutečnost, že jsme nenašli žádné rozdíly v našich testech ChIP, které by mohly vysvětlit nárůst v roce Cck Exprese mRNA u 11A myší po 2 týdnech exprese AFosB a rozhodla se tento mechanismus dále zkoumat.

Krátkodobě se zvyšuje FosB Cck výraz ve více systémech

Microarray charakterizace bi-transgenních 11A myší nadměrně exprimujících AFosB ve striatu zjistila, že Cck úrovně exprese se zvyšují po 2 týdnech nadměrné exprese a poté se postupně snižují s delším obdobím exprese ΔFosB (Obrázek 2A, n = 3). Tento efekt jsme ověřili pro Cck pomocí PCR v reálném čase na samostatné skupině zvířat v týdnech 2 a 8 a zjistilo se, že výsledky ve dvou časových bodech jsou podobné analýze microarray (data nejsou uvedena).

Zvýší se krátkodobá nadměrná exprese ΔFosB Cck genová exprese. (A) Cck Exprese mRNA ve striatu po nadexpresi AFosB u myší 11A po dobu 1, 2, 4 nebo 8 týdnů. Analýza mikročipů byla provedena na striatálních vzorcích a Cck úrovní ...

K dalšímu zkoumání schopnosti ΔFosB regulovat Cck Při expresi jsme použili buňky PC12 přechodně transfekované a Cck-luciferázový reportérový plazmid a buď expresní plazmid AFOSB nebo stejné množství pCDNA. Oba dva (n = 5-9) a tři (n = 11-13) dny nadměrné exprese AFosB vedly k významnému zvýšení Cck-luciferázová exprese. Navíc tři dny nadměrné exprese AFosB vedly k podstatně více Cck- indukce fluciferázy ve srovnání se dvěma dny nadměrné exprese (Obrázek 2B). Nadměrná exprese AFosB neindukovala expresi luciferázového konstruktu bez promotoru (data nejsou uvedena). Za žádných podmínek léčby nedošlo ke snížení Cck-luciferázová aktivita je zřejmá. Tyto výsledky ukazují, že krátkodobá exprese FosB zvyšuje aktivitu Cck promotor, a ponechává nezodpovězený mechanismus, kterým dlouhodobá nadměrná exprese AFos potlačuje Cck výraz.

ΔFosB nadměrná exprese zvyšuje vazbu na domnělém vazebném místě CREB v EU Cck promotor

Naše analýzy to zjistily Cck exprese je zvýšena po krátkodobé expresi AFosB, ale naše testy ChIP zjistily, že ani CREB, ani AFosB se neváží na Cck promotor. Chcete-li zjistit, zda existují nějaké změny ve vazbě proteinu na Cck promotor po nadexpresi ΔFosB, použili jsme elektroforetické testy posunu mobility (EMSA) se sondou obsahující domnělé místo podobné CRE přítomné v Cck promotor. Použitím jaderných extraktů ze striaty myší 11A nadměrně exprimujících ΔFosB po dobu 2 týdnů jsme zjistili zvýšení vazby na domnělé místo CRE v Cck promotér (Obrázek 3 A, C, n = 4). Je zajímavé, že myši 11A nadměrně exprimují AFosB po dobu 8 týdnů, které vykazují pokles Cck exprese, také ukázala zvýšenou vazbu na tomto místě (Obrázek 3B, C, n = 4). Pro srovnání jsme zkoumali vazbu na konsenzuální místo CRE u myší nadměrně exprimujících AFosB po 2 týdny a našli jsme silnou vazbu CRE ve striatálních extraktech, ale žádné zvýšení vazby po indukci AFosB (Obrázek 3F, n = 4). Takže navzdory ΔFosB-indukovanému zvýšení celkových hladin CREB pozorovanému v tomto časovém bodě, jsou tyto výsledky v souladu s našimi testy ChIP, které zjistí, že zvýšená vazba CREB na promotorech po nadexpresi AFosB je specifická pouze pro určité geny a není globálním jevem . Chcete-li zjistit, zda je CREB vázán na Cck Jako promotor v naší analýze EMSA jsme provedli supershiftové testy s protilátkou specifickou pro CREB. Ve shodě s našimi testy ChIP jsme nenašli žádnou vazbu CREB na a Cck sonda obsahující domnělé místo CRE v testech EMSA, zatímco CREB se významně váže a nahrazuje konsenzuální místo CRE (Obrázek 3D, E, n = 4). Vazebná aktivita DNA na DNA Cck promotor nebyl také ovlivněn protilátkou proti AFosB (data nejsou uvedena), za podmínek ukázaných v několika předchozích studiích, aby se blokovala vazba AFosB na bona fide AP-1 místa (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen a kol., 1995, Hiroi a kol., 1998). Provedli jsme také testy ChIP na striatě zvířat 11A po 8 týdnech exprese ΔFosB a stále jsme nenašli žádnou vazbu CREB nebo ΔFosB na Cck promotor (data nejsou zobrazena). Exprese AFosB tedy vede ke zvýšení vazby proteinu na Cck promotor po obou týdnech exprese 2 a 8; identita těchto faktorů však zůstává neznámá.

Vazba proteinu na Cck promotor. (A, B) Test elektroforetické mobility s využitím Cck Místo podobné CRE se striatální tkání od zvířat nadměrně exprimujících AFosB po dobu 2 týdnů (A) nebo 8 týdnů (B). V (A), konkurence s přebytkem neznačeného konkurenta ...

Domnělý CRE web v Cck promotor není zodpovědný za zvýšenou aktivitu promotéra

Protože jsme našli fragment vazby na protein pomocí fragmentu Cck promotor, který obsahuje domnělé místo CRE, po nadměrné expresi AFosB jsme chtěli zjistit, zda je toto místo nutné pro zvýšení Cck exprese po nadexpresi AFOS. K testování této možnosti jsme transfekovali buňky PC12 pomocí a Cck-luciferázový plazmid obsahující jeho intaktní místo podobné CRE nebo plazmid obsahující mutaci v místě, které by zrušilo jakoukoli interakci s CREB. Je zajímavé, že mutace místa podobného CRE se snížila bazální Cck aktivita promotéra o 32% (Obrázek 4A, n = 9), ale neovlivnilo to Cck indukce promotoru zvýšenou expresí ΔFosB (Obrázek 4B, n = 11-13). To naznačuje, že ačkoli Cck promotor vyžaduje intaktní místo podobné CRE pro plnou bazální aktivitu, zvýšená aktivita promotoru indukovaná nadexpresí AFosB nevyžaduje sekvenci podobnou CRE.

Projekt Cck- jako CRE web není nutný Cck indukce ΔFosB. (A) Cck-luciferázová aktivita byla měřena 2 dny po transfekci buď normálním Cck-luciferáza nebo látka, ve které bylo mutováno místo podobné CRE. * p <0.05 (B) Cck-luciferáza ...

cFos se váže na Cck promotor

Předchozí studie to zjistily cFos mRNA se zvyšuje s krátkodobou expresí AFosB, avšak po dlouhodobé expresi AFosB je snížena schopnost léčby kokainem indukovat cFos ve striatu (McClung a Nestler, 2003; Renthal a kol., 2008). Proto by mohlo být možné, že cFos přispěje ke zvýšení v roce 2007 Cck exprese po krátkodobé expresi AFos. Provedli jsme ChIP testy s protilátkou specifickou pro cFos a změřili se vazby cFos na Cck promotor s a bez krátkodobé exprese FosB. Zatímco jsme zjistili, že cFos se váže na Cck promotoru, tato vazba se signifikantně nezvýšila po nadexpresi AFosB (Obrázek 5, n = 5). To naznačuje, že protože cFos váže Cck promotor, může přispět k obecné regulaci Cck vyjádření, ale pravděpodobně se nepodílí na regulaci EU Cck promotor od FosB.

cFos se váže na Cck promotor. Imunoprecipitační testy chromatinu byly prováděny se specifickou protilátkou pro cFos s použitím striatální tkáně od myší s nadexpresí AFOSB buď na dox, nebo po 2 týdnech odstranění dox. Analýza PCR v reálném čase byla ...

DISKUSE

Tato studie potvrzuje a rozšiřuje předchozí zjištění, která ukazují, že AFos reguluje genovou expresi ve striatu, a my zjistíme, že tak činí prostřednictvím několika mechanismů po krátkodobé expresi. Ukazujeme, že po 2 týdnech nadměrné exprese se ΔFosB váže přímo na promotory v určitých genech, což vede ke změnám v expresi (tj. CDK5). Kromě toho zvyšuje hladiny proteinu CREB, což je účinek pozorovaný v kultivovaných buňkách i ve striatu, což vede ke zvýšené vazbě CREB na jiné promotory genu (tj. dynorfin a BDNF). V předchozí studii jsme zjistili, že krátkodobá nadměrná exprese ΔFosB ve striatu vede k mnoha stejným změnám genové exprese, které se vyskytují, když je CREB nadměrně exprimována, a vede k podobným behaviorálním reakcím při měření preference kokainu (McClung a Nestler, 2003). Toto zjištění, že AFos vede k indukci CREB, stejně jako vazba CREB na určité genové promotory, pomáhá vysvětlit, proč tolik změn genové exprese byly sdíleny těmito dvěma transkripčními faktory.

Indukce CREB ΔFosB je zajímavá, protože bylo prokázáno, že drogy zneužívání vyvolávají změny hladin CREB-fosforylovaného serinu 133 (Mattson a kol., 2005) a zvýšit transkripci zprostředkovanou CRE (Barrot a kol., 2002; Shaw-Lutchman a kol., 2002, 2003), aniž by došlo ke změně celkových hladin CREB. Je možné, že změny v hladinách CREB mohou být přechodné, a proto mohou být snadno vynechány v jiných studiích. V našich rukou jsme v konkrétních experimentech viděli zvýšení CREB mRNA vyvolané kokainem, tento účinek je však velmi variabilní (nepublikované pozorování). Protože jak transgenní myši 11A, tak buňky PC-12 vykazují indukci CREB po krátkodobé nadexpresi AFosB, naznačuje to, že CREB je skutečně indukován AFosB (nebo cílem AFB), což poskytuje další mechanismus pro vysvětlení změn v genu vyvolaných léky výraz.

Překvapivě jsme zjistili, že ani CREB, ani AFOSB se nevázají na Cck promotér, i když Cck Exprese je jasně regulovaná po krátkodobé expresi AFos. Cck je hojný neuropeptid exprimovaný v VTA i NAc (Hokfelt a kol., 1980) a pravděpodobně se podílí na behaviorálních reakcích na zneužívání drog (Josselyn et al., 1996; Josselyn a kol., 1997; Hamilton a kol., 2000; Beinfeld a kol., 2002; Rotzinger a kol., 2002). V testech na buněčných kulturách Cck promotor byl rozsáhle charakterizován a bylo prokázáno, že reaguje na členy rodiny CREB a AP-1 (přezkoumáno Hansen, 2001). Haun a Dixon (1990) ukázalo, že komplexy AP-1 se mohou vázat na Cck CRE-like site in vitroa později bylo pomocí buněk neuroblastomu SK-N-MC prokázáno, že mutace místa podobného CRE snížila citlivost promotoru na nadměrně exprimovanou cFos / cJun (Rourke a kol., 1999). Ve skutečnosti také zjistíme, že se zvýšila Cck propagační aktivita (Obrázek 2) a vazba na nebo kolem prvku podobného CRE (Obrázek 3) po nadměrné expresi AFosB, dalšího člena rodiny AP-1, ale nenajdeme žádnou přímou vazbu AFosB na Cck promotor in vivo or in vitro, i po jeho nadměrném vyjádření.

Hodně práce prokázalo roli CREB v regulaci Cck propagační aktivita. Cck Web typu CRE je zachován na všech obratlovcích (Hansen, 2001) a v některých testech na buněčné kultuře se komplexy CREB a AP-1 vážou k tomuto místu a jsou nezbytné pro Cck propagační aktivita (Haun a Dixon, 1990; Deavall a kol., 2000; Hansen, 2001). Kromě toho několik známých aktivátorů Cck ukázalo se, že exprese (včetně bFGF, PACAP, peptonů a depolarizace) působí prostřednictvím CREB (Hansen a kol., 1999; Deavall, a kol., 2000; Bernard a kol., 2001; Gevrey a kol., 2002; Hansen a kol., 2004). Náš Cck-luciferázová reportérová genová data podporují zásadní roli pro CRE-podobné místo v regulaci Cck promotorová aktivita, protože mutace tohoto místa snižuje bazální Cck promotérská činnost a Cck-luciferázová exprese indukovaná VP16-CREB, konstitutivně aktivní formou CREB, je ztracena, když je toto místo mutováno (nepublikované pozorování). Byli jsme proto překvapeni, když jsme zjistili, že se CREB nezdá být vázán na Cck promotor ve striatálních extraktech buď na začátku nebo po krátkodobé nadexpresi AFosB, když jsou zvýšené hladiny CREB. Toto argumentuje, že úrovně CREB samo o sobě nejsou jediným faktorem při určování výše vazby na tomto webu, a to je podporováno prací ostatních (Cha-Molstad a kol., 2004). Protože promotory jiných, dříve identifikovaných CREB cílových genů, jako je BDNF a prodynorphin, věnovali CREB, jsme přesvědčeni, že jsme zjistili, že CREB se na Cck promotor ve striatálních jaderných extraktech. Kromě toho indukce Cck-luciferázová aktivita ΔFosB nebyla závislá na intaktním místě podobném CRE, což naznačuje, že ΔFosB nereguluje Cck exprese regulováním přímé vazby CREB na Cck promotor.

Naše neschopnost detekovat interakce CREB s Cck promotér je podporován Renthal a kol. (2009), kteří použili přístup ChIP-chip ke sledování globálních změn ve fosforylované CREB (pCREB) a vázání AFosB ve striatu po chronické expozici kokainu. V těchto experimentech byly komplexy DNA-protein imunoprecipitovány protilátkami AFosB nebo pCREB a vysrážená DNA byla po značení hybridizována na mikročip promotoru. Zatímco tímto přístupem bylo identifikováno mnoho dříve charakterizovaných CREB cílových genů (např. BDNF, prodynorfin), Cck nebyl identifikován. Kromě toho bylo prokázáno, že vazba CREB na konsenzuální místo CRE se mezi kultivovanými buněčnými liniemi značně liší (Cha-Molstad a kol., 2004). Všechny předchozí studie, které zjistily interakce CREB s Cck promotor byl prováděn v buněčné kultuře (nikoli mozek, ze kterého byly získány naše vzorky EMSA a ChIP) a pro zkoumání interakcí protein-DNA byly použity testy gelového posunu. Zatímco EMSA může posoudit potenciál faktoru vázat se na sekvenci DNA, testy ChIP poskytují nový pohled na tyto interakce in vivo. Kromě toho většina údajů prokazuje buď indukci Cck promotorová aktivita nebo vazba CREB na Cck promotor byl získán z buněk, které byly stimulovány faktory, jako jsou peptony (Bernard a kol., 2001), depolarizace (Hansen a kol., 2004) nebo různé aktivátory intracelulárních signálních kaskád včetně cAMP a ERK (Hansen a kol., 1999). V našich experimentech byl jediným použitým „stimulem“ nadměrná exprese ΔFosB, která je dostatečná k vyvolání Cck výraz. Dohromady to naznačuje, že schopnost CREB se vázat na (a potenciálně regulovat) Cck promotor je vysoce závislý na typu buňky a aktivaci konkrétních signálních drah. Navíc, Cck Promotorový prvek podobný CRE (přinejmenším v neindukovaných buňkách PC12 a v myším striatu) není přímým cílem CREB ani AFosB. Zajímavé je, že regulace FosB Exprese CREB je také specifická pro typ buňky a typ stimulace. Studie Anderssona et al. zjistili, že injekce CREB antisense oligonukleotidů do myšího striata částečně inhibovala indukci FosB po podání kokainu (Andersson a kol., 2001). Zjistili však také, že schopnost L-Dopa indukovat FosB Exprese ve striatu poškozeném 6-OHDA nebyla ovlivněna přítomností CREB antisense oligonukleotidů.

Protože se zdá, že CREB a AFOS nepřímo regulují Cck promotor a změny ve struktuře chromatinu byly dokumentovány v reakci na řadu podnětů, které indukují AFosB (Tsankova a kol., 2004; Kumar a kol., 2005; Renthal a kol., 2008), usoudili jsme, že AFos může nepřímo modulovat aktivitu promotoru změnou chromatinové struktury. U myší nadměrně exprimujících ΔFosB po dobu 2 týdnů však nedošlo ke změně acetylace histonu H3 na Cck promotér (Tabulka 1). Toto je podporováno daty čipu ChIP Renthal a kol. (2009), který nehlásil žádnou změnu v acetylované vazbě H3 na Cck promotor u myší vystavených chronickému kokainu. Od roku Cck promotor je aktivní ve striatu, neočekávalo se ani nebylo pozorováno žádné represivní vázání methylovaného histonu H3. Je zajímavé, že jsme také neviděli žádnou změnu v důsledku nadměrné exprese AFosB v acetylované vazbě H3 na BDNF promotor (který vykazoval zvýšenou vazbu CREB) nebo na CDK5 a prodynorphin promotory (které vykazovaly zvýšenou vazbu FosB). Vzhledem k tomu, že se změnami v aktivitě promotoru je spojeno nesčetné množství histonových modifikací (přehled: Rando a Chang, 2009), existují pravděpodobně další modifikace chromatinu, které se spojují s indukcí těchto genů. Jakákoli jednotlivá modifikace chromatinu, i když často predikuje úroveň promotorové aktivity, se nemusí během aktivace konkrétního genu změnit. V budoucí práci by bylo zajímavé podívat se na další potenciální změny struktury chromatinu v okolí Cck promotor po nadměrné expresi AFos. Zajímavé je, že chronický kokain (pravděpodobně přes Ukázalo se, že indukce FosB indukuje expresi sirtuinu 1 a 2, histon deacetylázy třídy III, u nichž se zdá, že mění neuronální fyziologii, signalizaci ERK a behaviorální odpovědi na kokain (Renthal a kol., 2009). Indukce histon deacetylázy by měla schopnost současně regulovat expresi velkého počtu genů přes globální změny ve struktuře chromatinu.

Jeden možný kandidát zapojený do Cck regulací po nadexpresi AFosB byl člen rodiny AP-1 cFos. Exprese cFos je regulována CREB (Sheng a kol., 1990; Impey a kol., 2004) a zvyšuje se nadměrná exprese cFos (v souladu s nadměrnou expresí jeho vazebného partnera cJun) Cck propagační aktivita (Rourke a kol., 1999). Zvýšené hladiny CREB v důsledku krátkodobé nadměrné exprese ΔFosB by proto mohly zvýšit hladiny cFos a vést ke zvýšené vazbě na Cck CRE-like site. cfos mRNA je indukována u myší po dvou týdnech nadměrné exprese AFosB (McClung a Nestler, 2003) a snížený u myší vystavených chronickému kokainu nebo dlouhodobé nadměrné expresi AFosB (Renthal a kol., 2008). Zde zjistíme, že cFos se váže přímo na Cck promotor ve striatální tkáni, ale nadměrná exprese AFosB významně nezvyšuje vazbu. To naznačuje, že zatímco cFos by mohl být zapojen do regulace Cck Při expresi obecně není změna vazby cFos sama o sobě pravděpodobným mechanismem, kterým ΔFosB reguluje Cck výraz. Je však možné, že AFosB může indukovat buď posttranslační změny v cFos (např. Změněnou fosforylaci) nebo indukovat expresi vazebného partnera (jako je cJun) nebo koaktivátorového proteinu. Protože však intaktní místo podobné CRE (které se dříve ukázalo jako vazebné místo pro komplexy AP-1, viz Haun a Dixon, 1990) není požadováno pro zvýšené Cck Pokud jde o promotorovou aktivitu pozorovanou při nadexpresi AFosB (jak bylo stanoveno v našich experimentech s reportérovými geny), je logické, že další trans-působící faktory jsou také regulovány AFosB.

Projekt Cck promotorový fragment použitý v našich experimentech s luciferázovým reportérovým genem obsahuje konzervované vazebné místo Sp1 a E-box (přehled Hansen, 2002). Zejména bylo prokázáno, že sekvence E-boxu vážou četné transkripční faktory (viz Forrest a McNamara, 2004). Pomocí buněk PC12 jsme viděli, že mutace E-boxu klesá Cck promotorová aktivita, ale nemění odpověď promotoru na AFosB (data nejsou uvedena). Zajímavé je, Cck-luciferázový reportér obsahující mutace v místě CRE i E-boxu nemá detekovatelnou bazální aktivitu a neodpovídá nadměrné expresi AFosB (nepublikované pozorování). Další potenciální mediátor působení AFOS na FOSB Cck promotor jsou ATF, o kterých je známo, že jsou indukovány ve striatu chronickou psychostimulační expozicí (Green et al., 2008). Avšak nenašli jsme žádný důkaz pro indukci AFOS těchto ATF (data nejsou uvedena) a ATF by se neočekávaly, že se budou vázat na mutované místo podobné CRE na Cck promotor.

Jednou výzvou této studie je, že k nadměrné expresi AFosB využíváme bi-transgenní systém, a proto je nutné při nakládání s paralelami mezi tímto vzorcem a podáváním chronického kokainu postupovat konzervativně. Transgenní myši 11A však poskytují jedinečnou příležitost podívat se na specifické účinky AFosB ve striatu, protože nadměrná exprese je omezena na tuto oblast mozku (Chen a kol., 1998), zatímco podávání kokainu indukuje změny v celé řadě dalších oblastí mozku, které mohou pak nepřímo ovlivnit striatum. Kromě toho několik studií dokumentovalo podobné behaviorální a molekulární fenotypy u myší 11A ve srovnání s netransgenními zvířaty léčenými chronickým kokainem (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003; Renthal a kol., 2009). Dodatečně, Bibb a kol. (2001) uvedli podobné úrovně striatalu Cdk5 Indukce mRNA a proteinu ve stejném kmeni 11A ve srovnání s netransgenními odpadními koťaty ošetřenými kokainem, stejně jako podobné změny v cílech CDK5, p35 a DARPP-32.

Závěrem jsme zjistili, že krátkodobá exprese AFosB vede k indukci genů ve striatu prostřednictvím mnoha mechanismů. Patří sem přímá vazba promotoru, indukce CREB proteinu a aktivita, modifikace chromatinu, kromě dosud neurčených drah.

EXPERIMENTÁLNÍ POSTUPY

Zvířata

V této studii byly použity samci bi-transgenních zvířat 11A (NSE-tTA x TetOP-AFosB) a jsou charakterizováni Kelz a kol., 1999. K nadměrné expresi AFosB byly myši odebrány z doxycyklinu mezi 3 a 6 týdny věku, zatímco kontrolní myši byly udržovány na doxycyklinu. Všechny myši byly umístěny ve skupině a udržovány v cyklu 12: 12 světlo / tma, světla svítila v 7 am a světla zhasnuta v 7 pm, s ad lib přístup k potravě a vodě. Všechny experimenty na myších byly v souladu s protokoly schválenými komisí pro péči o zvířata a používáním Lékařského centra University of Texas Southwestern Medical Center v Dallasu.

Reportérové a expresní plazmidy

Divoký typ (WT) Cck reportér promotor-luciferáza byl připraven vložením přibližně 200 bp PCR fragmentu do vektoru pGL3-luc (Promega). Tento fragment byl získán z myší genomové DNA (primery: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' upstream a 5 'TACCTTTGGATGGGGAGAATATG 3' downstream) a zpočátku byl vložen do pGEM-T Easy vektoru (Promega, #A1360). Fragment promotoru byl poté klonován do míst restrikčního enzymu Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Chcete-li vytvořit CRE bodovou mutaci v Cck promotor, mutagenní primer zaměřený proti dříve hlášenému místu podobnému CRE (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') byl použit v kombinaci s výrobkem Mutagesis Quik Change (II) . Tím se převede hlášené místo podobné CRE (ACTGCGTCAGC) na ACTGAGCTCC. Všechny reportérové plazmidy byly potvrzeny sekvenováním DNA. Expresní plazmid AFosB obsahuje sekvenci AFosB plné délky vloženou do mnohonásobného klonovacího místa pCDNA 3.1 a byl popsán dříve (Ulery a Nestler, 2007).

Buněčné kultury a transfekce DNA

Buňky krysího feochromocytomu (PC12) byly udržovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu F-12, doplněném 10% koňským sérem, 5% fetálním bovinním sérem a 1% penicilinem / streptomycinem při 37 ° C a 5% CO₂. Buňky byly transfekovány elektroporací za použití elektroporátoru BTX 360 (350 V, 0 ohmů a 850 μF) v 800 ul Dulbeccovým fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokem v kyvetách s mezerou 4 mm s 10 μg reportéru a 5 μg expresního konstruktu. K normalizaci celkového množství DNA byl použit prázdný vektorový plazmid (pCDNA). Po transfekci byly buňky pěstovány na 35 mm miskách potažených kolagenem po stanovenou dobu.

Luciferázové testy

Dva nebo tři dny po transfekci byly buňky třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem Dulbecco, lyžovány (pomocí 3 mM glycylglycinu, 25 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), shromážděny a vyčištěny centrifugací. 30 μL lyzátu se kombinoval s testovacím pufrem luciferázy 140 μL (25 mM glycylglycin, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM fosforečnan draselný, 1 mM koenzym A, pH 7.8). Luminiscenční aktivita byla měřena pomocí fluorescenční čtečky mikrodestiček FLx-800 po automatizované injekci 40 μL 1 mM luciferinu na jamku. Luciferázová aktivita byla normalizována na celkový obsah proteinu, jak bylo stanoveno proteinovým testem BioRad.

Stanovení elektroforetické mobility

Jaderné extrakty z bilaterálních řezů striata z bi-transgenních myší 11A (které byly udržovány na nebo mimo doxycyklin po dobu 2 nebo 8 týdnů) (McClung a Nestler, 2003) byly připraveny podle Huang a Walters (1996). ³²P-značené dvouvláknové oligonukleotidové sondy byly připraveny za použití systémového protokolu Promega Gel Shift Assay (#E3300) a sondy byly purifikovány pomocí sloupců Roche Quick Spin Columns. Konsenzuální sekvence sondy CRE a AP-1 byly od Promega (#E328A a E320B) a Cck CRE sekvence byly (Cck-CRE smysl: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Vazebné reakce a elektroforéza byly provedeny pomocí modifikací postupu systému Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 CPM značené sondy byl kombinován s 10 μg striatálního jaderného extraktu. Před zavedením radioaktivně značených sond byly přidány studená konkurenční DNA nebo protilátky. Pro supershift experimenty bylo použito 2 μg CREB protilátky (Upstate Biotechnology # 06-083). Reakce byly podrobeny elektroforéze na polyakrylamidových gelech 4%, sušeny a exponovány filmu (za použití intenzifikačních obrazovek po dobu 1 hodiny až 2 dnů).

Imunoblotting

U buněk PC12 byly 35 mm destičky transfektovaných buněk promyty ledově chladným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem Dulbecco a lyzáty byly připraveny v ledově chladném lyzačním pufru RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1% deoxycholát, 1 Triton X-100, 0.1% dodecylsulfát sodný) obsahující inhibitory proteázy. Po použití ultrazvuku, vyčeření a Bradfordova proteinového testu byly lyzáty plně denaturovány a 50 ug každého vzorku bylo podrobeno elektroforéze na 10% SDS polyakrylamidových gelech. Proteiny byly přeneseny na PVDF membránu, blokovány po dobu 1 hodiny ve 3% odtučněném suchém mléce ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris obsahujícím 0.1% Tween-20 (mléko TBS-T) a sondovány přes noc při 4 ° C pomocí primárních protilátek (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, použitá v poměru 1: 1,000 8795; GAPDH-Sigma # G1, použitá v poměru 80,000: 1 5,000) zředěná v mléce TBS-T. Po několika promytích v TBS-T byly bloty sondovány po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti pomocí sekundárních protilátek konjugovaných s alkalickou fosfatázou (Sigma) zředěných 170: 6432 XNUMX v mléce TBS-T. Po několika promytích ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris byla barevná reakce provedena podle pokynů BioRad (# XNUMX-XNUMX). Membrány byly sušeny přes noc, skenovány na plochém skeneru a denzitometrie provedena pomocí ImageJ (viz níže).

U striatálních extraktů byly testy Western blot provedeny tak, jak bylo dříve publikováno (Hope a kol., 1994). Tkáň byla odstraněna z dekapitovaných myší, umístěna na led a rozdělena na mozkovou matrici o tloušťce 1 mm. Poté byly odebrány tkáňové údery a zmrazeny při -80 ° C, dokud nebyly použity. Tkáň byla sonikována na ledu v modifikovaném pufru na bázi detergentu, který obsahoval jak inhibitory fosfatázy, tak proteázy (Roche, Sigma). Po sonikaci byly vzorky denaturovány ve vroucí vodě a centrifugovány při 15,000xg po dobu 15 minut; supernatant byl následně odebrán a zpracován; množství proteinové koncentrace pak byla kvantifikována pomocí Bradfordova testu (Bio-Rad). Vzorky byly zpracovány na 10% akrylamid / bisakrylamidový gel, přeneseny na PVDF membránu, blokovány v 5% mléce a inkubovány s primárními protilátkami (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Bloty byly následně vizualizovány pomocí chemiluminiscenčního systému (Pierce). Všechny vzorky byly normalizovány na GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Byly provedeny standardní křivky, aby se zajistilo, že jsme v lineárním rozsahu testu.

Denzitometrická analýza

U imunoblotů PC12 byla provedena denzitometrická analýza s použitím ImageJ s kalibrací rodbardu. Průměrný signál pozadí byl odečten od každého měření a pro každý vzorek byl vypočten poměr signálu CREB k signálu GAPDH. Pro striatální imunobloty a EMSA analýzu byl použit Scion Image 1.62c s odečtením pozadí.

Chromatinová imunoprecipitace (ChIP)

Testy ChIP byly prováděny podle metod podle Tsankova a kol. (2004) a Kumar a kol. (2005). Stručně, dvoustranné striatální vzorky z 11A myší udržované na nebo mimo doxycyklin byly zesítěny 1% formaldehydem a zesíťování bylo ukončeno glycinem (konečná koncentrace 0.125 M). Tyto vzorky pocházely z celých mozkových řezů odebraných na úrovni nucleus accumbens s odstraněnou kůrou. Chromatin byl stříhán na přibližně 0.2 až 1 kb fragmenty pomocí sonikace, vyčištěn pomocí kuliček Proteinu G (Thermo Scientific # 22852) a vstupní vzorky byly zmrazeny na -80 ° C. Pro každou srážení bylo použito 60 až 100 μg chromatinu. Bylo použito 5-10 μg každé primární protilátky (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylovaná H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylovaná H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Komplexy protilátka-chromatin byly imunoprecipitovány s kuličkami Protein G plus podle pokynů výrobce (Thermo Scientific # 22852). Po reverzním zesítění vstupních a vysrážených vzorků byl každý vzorek podroben kvantitativní PCR (qPCR). Použití všech těchto protilátek pro ChIP bylo rozsáhle ověřeno (Tsankova a kol., 2004; Kumar a kol., 2005; Renthal a kol., 2009).

Úrovně proteinové vazby u každého požadovaného genového promotoru byly stanoveny měřením množství přidružené DNA pomocí qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Vstupní nebo celková DNA (neimunoprecipitovaná) a imunoprecipitovaná DNA byla amplifikována trojmo v přítomnosti SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Hodnoty Ct z každého vzorku byly získány pomocí softwaru Sequence Detector 1.1. Relativní kvantifikace templátové DNA byla provedena pomocí metody AACt (Tsankova a kol., 2004). Použité primery: BDNF promotor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promotor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorfinový promotor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistická analýza

Všechna data jsou uvedena jako průměr ± standardní chyba průměru. Statistický rozdíl byl určen Studentovým dvoustranným t-testem (p <0.05). Když bylo provedeno několik srovnání, hodnoty p byly upraveny pomocí Bonferroniho korekce.

Poděkování

Rádi bychom poděkovali Willovi Renthalovi a Arvindu Kumarovi za užitečné diskuse. Také bychom chtěli poděkovat NIDA za financování těchto experimentů.

Poznámky pod čarou

Zřeknutí se odpovědnosti vydavatele: Jedná se o soubor PDF s neupraveným rukopisem, který byl přijat k publikaci. Jako službu pro naše zákazníky poskytujeme tuto ranní verzi rukopisu. Rukopis podstoupí kopírování, sázení a přezkoumání výsledného důkazu před jeho zveřejněním ve své konečné podobě. Vezměte prosím na vědomí, že během výrobního procesu mohou být objeveny chyby, které by mohly ovlivnit obsah, a veškeré právní odmítnutí týkající se časopisu.

Klasifikační termíny:

Sekce: #1 Buněčná a molekulární biologie nervových systémů

Reference

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. Protein vázající se na cAMP odpověď na protein je vyžadován pro expresi genu závislého na dopaminu v intaktním, ale nikoliv na dopaminem denervovaném striatu. J Neurosci. 2001; 21: 9930 – 43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB aktivita v jádru accumbens shell kontroluje hradlování behaviorálních reakcí na emoční podněty. Proc Natl Acad Sci USA A. 2002; 99: 11435 – 40. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Léčba kokainem zvyšuje extracelulární cholecystokinin (CCK) v jádru accumbens shell vzhůru, volně se pohybujících potkanů, což je účinek, který je zvýšen u potkanů, které jsou behaviorálně senzibilizovány na kokain. J Neurochem. 2002; 81: 1021 – 7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones stimulují střevní transkripci genu pro cholecystokinin prostřednictvím vazebných faktorů cyklické adenosinové monofosfátové odpovědi. Endokrinologie. 2001; 142: 721 – 9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Účinky chronické expozice kokainu jsou regulovány neuronálním proteinem Cdk5. Příroda. 2001: 410: 376 – 80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Vazba transkripčního faktoru CREB specifická pro buněčný typ k prvku reakce cAMP. Proc Natl Acad Sci USA A. 2004; 101: 13572 – 7. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Regulace delta FosB a proteinů podobných FosB pomocí elektrokonvulzivního ošetření záchvatů a kokainu. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880 – 9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgenní zvířata s indukovatelnou cílenou expresí genu v mozku. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Indukce cyklin-dependentní kinázy 5 v hippocampu chronickými elektrokonvulzivními záchvaty: role AFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965 – 71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Blízká setkání mnoha druhů: Fos-Jun interakce, které zprostředkovávají transkripční regulační specificitu. Onkogen. 2001; 20: 2438 – 52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronální adaptace na amfetamin a dopamin: molekulární mechanismy regulace genů prodynorphinu v striatu potkana. Neuron. 1995; 14: 813 – 23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontrola transkripce genu CCK pomocí PACAP v buňkách STC-1. Am J Physiol Gastrointestinální játra Physiol. 2000; 279: G605 – 12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergní regulace obsahu mRNA cholecystokininu v striatu potkana. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77 – 83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id rodina transkripčních faktorů a tvorba vaskulárních lézí. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014 – 20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Ko-požadavek cyklických AMP- a na vápníku závislých proteinových kináz pro transkripční aktivaci genu cholecystokininu proteinovými hydrolyzáty. J Biol Chem. 2002; 277: 22407 – 13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Indukce aktivačních transkripčních faktorů (ATF) ATF2, ATF3 a ATF4 v nucleus accumbens a jejich regulace emočního chování. J Neurosci. 2008; 28: 2025 – 32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Přetečení dopaminu a cholecystokininu v jádru krysy narůstá v reakci na akutní podávání léku. Synapse. 2000; 38: 238 – 42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogenem aktivovaná protein kináza a protein kináza A signalizační dráhy stimulují transkripci cholecystokininu aktivací proteinu vázajícího prvek na cyklickou adenosin 3 ', 5'-monofosfátovou odpověď. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Regulace transkripce genu pro neuronální cholecystokinin. Scand J Clin Lab Invest. 2001; 234: 61 – 7. [PubMed]
Hansen TV. Transkripce genu pro cholecystokinin: promotorové prvky, transkripční faktory a signální dráhy. Peptidy. 2001; 22: 1201 – 11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl a forskolin synergicky up-regulují expresi genu cholecystokininu koordinační aktivací CREB a koaktivátoru CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15 – 23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Zesilovač transkripce nezbytný pro expresi potkaního cholecystokininového genu obsahuje sekvenci identickou s -296 elementem lidského genu c-fos. J Biol Chem. 1990; 265: 15455 – 63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Základní role genu fosB v molekulárních, buněčných a behaviorálních akcích chronických elektrokonvulzivních záchvatů. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952 – 62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Důkaz koexistence dopaminu a CCK v mezo-limbických neuronech. Příroda. 1980; 285: 476 – 8. [PubMed]
Naděje BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Léčba chronickým elektrokonvulzivním záchvatem (ECS) vede k expresi dlouhodobého komplexu AP-1 v mozku se změněným složením a charakteristikami. J Neurosci. 1994; 14: 4318 – 28. [PubMed]
Naděje BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Indukce dlouhotrvajícího AP-1 komplexu složeného ze změněných proteinů typu Fos v mozku chronickým kokainem a dalšími chronickými léčebnými postupy. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminergní regulace vazebné aktivity DNA transkripčního faktoru AP-1 v striatu potkana. Neurovědy. 1996; 75: 757 – 75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definování CREB regulonu: genomová analýza regulačních oblastí transkripčního faktoru. Buňka. 2004; 119: 1041 – 54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Co zapíná CREB? Buněčný signál. 2004; 16: 1211 – 27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Protikladné účinky antagonistů CCK (A) a CCK (B) na vývoj kondicionované aktivity u potkanů. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505 – 512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Důkaz účasti receptoru CCK (A) na získávání kondicionované aktivity produkované kokainem u potkanů. Brain Res. 1997; 763: 93 – 102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Exprese transkripčního faktoru deltaFosB v mozku řídí citlivost na kokain. Příroda. 1999; 401: 272 – 6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatinová remodelace je klíčovým mechanismem, který je základem plasticity vyvolané kokainem ve striatu. Neuron. 2005; 48: 303 – 14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Fosforylace CREB indukovaná kokainem v jádrech accumbens potkanů senzibilizovaných na kokain je umožněna zvýšenou aktivací kinázy související s extracelulárním signálem, ale nikoli proteinové kinázy A. J Neurochem. 2005; 95: 1481 – 94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulace genové exprese a odměny kokainu CREB a DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulární přepínač pro dlouhodobou adaptaci v mozku. Brain Res Mol Brain Res. 2004: 132: 146 – 54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Molekulární mediátor dlouhodobé nervové a behaviorální plasticity. Brain Res. 1999; 835: 10 – 17. [PubMed]
Nestler EJ. Existuje společná molekulární cesta pro závislost? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445 – 9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkripční mechanismy závislosti: role DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 55. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Rozlišující vzory indukce DeltaFosB v mozku drogami zneužívání. Synapse. 2008; 62: 358-69. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Zobrazení genomu na strukturu chromatinu. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245 – 71. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB zprostředkovává epigenetickou desenzibilizaci genu c-fos po chronické expozici amfetaminu. J Neurosci. 2008; 28: 7344 – 9. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Analýza genomové regulace chromatinu kokainem odhaluje úlohu sirtuinů. Neuron. 2009: 62: 335 – 48. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokininová modulace mezolimbické dopaminové funkce: regulace motivovaného chování. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404 – 13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negativní kooperace mezi juxtaposed E-boxem a cAMP / TPA responzivními elementy v promotoru genu pro cholecystokinin. FEBS Lett. 1999; 448: 15 – 8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regionální a buněčné mapování CRE-zprostředkované transkripce během naltrexonem vysráženého morfinu. J Neurosci. 2002; 22: 3663 – 3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Regulace transkripce zprostředkované CRE v mozku myši pomocí amfetaminu. Synapse. 2003; 48: 10 – 7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membránová depolarizace a vápník indukují transkripci c-fos fosforylací transkripčního faktoru CREB. Neuron. 1990; 4: 571 – 82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histonové modifikace v oblastech genových promotorů v hippocampu potkanů po akutních a chronických elektrokonvulzivních záchvatech. J Neurosci. 2004; 24: 5603 – 10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulace transkripční aktivity DeltaFosB fosforylací Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamin-CCK interakce v psychostimulační odměně a související chování. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Zásadní úloha ΔFosB v jádru accumbens při morfinovém působení. Nature Neurosci. 2006; 9: 205 – 11. [PubMed]