Spatiotemporální dynamika dendritických trnů v živém mozku (2014)

Dendritické páteře jsou všudypřítomná postsynaptická místa většiny excitačních synapsí v mozku savců, a mohou tedy sloužit jako strukturální ukazatele funkčních synapsí. Poslední práce naznačují, že neuronální kódování vzpomínek může být spojeno s rychlými změnami ve tvorbě a eliminaci páteře. Technologický pokrok umožnil vědcům studovat dynamiku páteře in vivo během vývoje i za různých fyziologických a patologických podmínek. Věříme, že lepší pochopení časoprostorových modelů dynamiky páteře pomůže objasnit principy obvodově závislé modifikace obvodu a zpracování informací v živém mozku.

ÚVOD

Dendritické páteře fascinovaly generace neurovědců od jejich prvotního popisu Santiago Ramón y Cajal před více než stoletím (Ramon y Cajal, 1888). Tyto jemné výčnělky vycházejí z dendritického dříku a připomínají „štětinaté trny nebo krátké trny“, jak to živě popsal Cajal. Jsou to postsynaptická místa velké většiny (> 90%) excitačních glutamatergických synapsí v mozku savců a obsahují základní molekulární komponenty pro postsynaptickou signalizaci a plasticitu. Proto mohou páteře a jejich strukturální dynamika sloužit jako indikátory synaptické konektivity a jejích modifikací (Segal, 2005; Tada a Sheng, 2006; Harms a Dunaevsky, 2007).

Nejčasnější studie dendritické páteře zkoumaly fixovanou nervovou tkáň světelnou nebo elektronovou mikroskopií (Lund a kol., 1977; Woolley a kol., 1990; Harris a Kater, 1994; Hering a Sheng, 2001; Lippman a Dunaevsky, 2005). Přestože poskytovaly základní informace o morfologii a distribuci páteře, tato pevná vyšetřování tkání zachytila ​​pouze statické „snímky“ páteře. Zavádění fluorescenčních značkovacích technik a multi-fotonové mikroskopie revoluci v poli. V 2002, průkopnická práce ze dvou laboratoří (Grutzendler a kol., 2002; Trachtenberg a kol., 2002) prokázala možnost sledovat stejnou páteř v živém mozku po dlouhou dobu (tj. týdny). Dynamika páteře v zásadě představuje dynamiku synapse. Zatímco stabilní páteře většinou představují synaptické kontakty, pouze malá část přechodných páteří představuje krátkodobé synaptické kontakty a zbytek z nich představuje neúspěšnou synaptogenezi (Trachtenberg a kol., 2002; Knott a kol., 2006; Cane a kol., 2014). Z těchto časosběrných zobrazovacích studií se objevil dynamický obraz páteří: páteře se tvoří, zvětšují, zmenšují a stahují po celou dobu života zvířete. Kromě toho se jejich morfologie a dynamika liší mezi typy neuronů, napříč vývojovými stádii a v reakci na zkušenosti, jako je smyslová stimulace a deprivace, obohacení prostředí a různé paradigmata učení (Holtmaat a Svoboda, 2009; Fu a Zuo, 2011).

Tento přehled se zaměřuje na výsledky z roku 2005 in vivo zobrazovací studie. Při charakterizaci dynamiky páteře vědci zvažovali hlavně dva aspekty: celkové změny hustoty páteře a specifické umístění podél dendritu, kde dochází k tvorbě a eliminaci páteře. Zatímco hustota páteře poskytuje přibližný odhad celkového počtu excitačních synapsí na postsynaptický neuron, umístění páteře ovlivňuje příspěvek jejích synapticky přenášených elektrických a chemických signálů k integrované odpovědi u soma (Nevian a kol., 2007; Spruston, 2008). Pochopení toho, jak dynamika páteře koreluje s anatomickými a fyziologickými rysy specifických nervových obvodů v různých behaviorálních kontextech, je zásadní pro objasnění mechanismů zpracování a ukládání informací v mozku.

SPINOVÁ DYNAMIKA BĚHEM ROZVOJE

Hustota páteře se výrazně liší v různých populacích neuronů, což pravděpodobně odráží rozmanitost morfologie a funkce neuronů (Nimchinsky a kol., 2002; Ballesteros-Yanez a kol., 2006). Rovnováha mezi tvorbou páteře a eliminací určuje změnu hustoty páteře: nadbytek tvorby páteře nad eliminací podél dendritického segmentu na něm zvyšuje hustotu páteře a naopak. V mozkové kůře, zatímco dendritické větve jsou většinou stabilní v čase (Trachtenberg a kol., 2002; Mizrahi a Katz, 2003; Chow a kol., 2009; Mostany a Portera-Cailliau, 2011; Schubert a kol., 2013), trny jsou neustále utvářeny a odstraňovány. Rychlosti tvorby páteře a vylučování se v průběhu času mění, což vede k nemonotonické změně hustoty páteře (Obrázek Obrázek11). Například páteře na apikálních dendritech vrstvy 2 / 3 pyramidálních neuronů v kortexu hlodavců vykazují postupně klesající motilitu (prodloužení a zkrácení páteře) a míru obratu (definovanou jako celková částka zisků a ztrát páteřů) mezi postnatálním dnem 7 a 24 (P7-24; Lendvai a kol., 2000; Cruz-Martin a kol., 2010). Během této doby se však hustota páteře neustále zvyšuje (Cruz-Martin a kol., 2010). Po této počáteční fázi čistého zisku páteře začne eliminace páteře předcházet tvorbě, což vede k celkovému snížení hustoty páteře (Holtmaat a kol., 2005; Zuo a kol., 2005b; Yang a kol., 2009). Mezi P28 a P42 je 17% páteřů eliminováno podél apikálních dendritů pyramidálních neuronů vrstvy 5 v kortexu hlavně, zatímco ve stejném časovém období se tvoří pouze 5% nových páteřů (Zuo a kol., 2005a, b). Důležité je, že ne všechny páteře jsou stejně náchylné k eliminaci: ty s velkými hlavami jsou stabilnější než tenké. Protože velikost hlavy páteře koreluje se synaptickou silou, tento jev naznačuje, že silnější synapse jsou stabilnější (Holtmaat a kol., 2005). Navíc nově vytvořené hřbety budou s větší pravděpodobností eliminovány než dříve existující hřbety (Xu a kol., 2009) a většina stabilních páteří vytvořených před dospíváním zůstává začleněna do dospělého neuronálního obvodu (Zuo a kol., 2005a; Yang a kol., 2009; Yu a kol., 2013). Konečně, u dospělých zvířat dosahuje tvorba a eliminace páteře rovnováhy; hustota páteře zůstává zhruba konstantní až do začátku stárnutí (Zuo a kol., 2005a; Mostany a kol., 2013).

 

OBRÁZEK ​​1

Přepracování páteře v různých fázích života zvířete. Po rychlé postgenální poranění následuje po adolescenci postupné stříhání páteře. V dospělosti dosahuje tvorba a eliminace páteře rovnováhy, s malým zlomkem páteře ...

SPINOVÁ DYNAMIKA ODPOVĚDI NA SENZORNÍ ZKUŠENOSTI

Mozková kůra má úžasnou schopnost reorganizovat své obvody v reakci na zkušenosti. Proto je pro neurovědce velký zájem o to, jak smyslové zážitky (nebo jejich nedostatek) ovlivňují dynamiku páteře. Ukázalo se, že jak akutní, tak chronické smyslové manipulace zásadně ovlivňují dynamiku páteře, ale přesný účinek závisí na paradigmatu a délce manipulace a na vývojovém stadiu zvířete. Během časného postnatálního období hrají senzorické vstupy instruktážní roli při stabilizaci a zrání páteře. V vizuální kůře myši zabránilo zbavení zrakového vstupu od narození snížení motility páteře a zrání morfologie páteře (Majewska a Sur, 2003; Tropea a kol., 2010). Genetická delece PirB receptoru napodobovala účinek monokulární deprivace na pohyblivost páteře (Djurisic a kol., 2013). U myší, které byly dříve vystaveny vizuální deprivaci, by maturace páteře vyvolaná světlem mohla být částečně napodobena farmakologickou aktivací systému GABAergic, což naznačuje důležitou roli inhibičních obvodů při maturaci excitačních synapsí (Tropea a kol., 2010). Později smyslový zážitek řídí ořezávání páteře (definované jako čistá ztráta páteře). Jednostranné oříznutí všech vousů u myší s 1 měsícem po dobu 4 nebo 14 dní dramaticky snížilo vylučování páteře v kůře hlavně, ale tvorba páteře z velké části nebyla narušena (Zuo a kol., 2005b; Yu a kol., 2013). Farmakologická blokáda NMDA receptorů napodobovala účinek ořezávání vousů, což ukazuje na zapojení NMDA receptorové dráhy do takové aktivity-dependentní eliminace páteře (Zuo a kol., 2005b).

Zatímco úplné ořezávání vousů globálně odstraňuje smyslové vstupy, oříznutí každého dalšího vousu („ořezávání šachovnice“) pravděpodobně zesiluje jakýkoli rozdíl v úrovních aktivity a vzorech sousedních sudů, čímž přináší nový smyslový zážitek. Ukázalo se, že takové paradigma podporuje obrat páteře a selektivně stabilizuje nově vytvořené páteře v podtřídě kortikálních neuronů (Trachtenberg a kol., 2002; Holtmaat a kol., 2006). Nové spiny byly přednostně přidány do pyramidálních neuronů vrstvy 5 se složitými apikální chomáčky, než na ty s jednoduchými chomáčky (Holtmaat a kol., 2006). U myší s defektem aCaMKII-T286A se ořezávání šachovnice nepodařilo zvýšit stabilizaci nových perzistentních ostnů na hranici mezi ušetřenými a zbavenými sudy (Wilbrecht a kol., 2010). Nedávno elegantní studie kombinující optogenetickou stimulaci a in vivo zobrazování ukázalo, že je to stabilita dendritických páteřů spíše než struktura neuronové aktivity (nikoli velikost)Wyatt a kol., 2012).

Podobně jako ořezávání šachovnice, krátká monokulární deprivace (MD) zvyšuje disparitu mezi vstupy ze dvou očí. Bylo tedy zjištěno, že MD podobně jako ořezávání šachovnice zvyšuje tvorbu páteře podél apikálních dendritických chomáčků pyramidálních neuronů vrstvy 5 v binokulární zóně vizuální kůry myši. Tento účinek však nebyl pozorován ve vrstvě 2 / 3 neuronů, ani v monokulární zóně (Hofer a kol., 2009), opět označující přestavbu synapse specifické pro typ buňky. Je zajímavé, že druhé MD nedokázalo dále zvýšit tvorbu páteře, ale selektivně zvětšilo páteře vytvořené během počátečního MD, což naznačuje, že nová páteře vytvořená během počátečního MD měla funkční synapse, které byly reaktivovány během druhého MD (Hofer a kol., 2009).

SPINE DYNAMICS BĚHEM UČENÍ

Vysoce dynamická povaha dendritických páteří vyvolává převládající myšlenku, že páteře mohou sloužit jako strukturální substrát pro učení a paměť. To bylo navrhl, že nově se objevil spiny (typicky s malými hlavami) underlie získávání paměti, zatímco stabilní spiny (typicky s velkými hlavami) slouží jako místa ukládání paměti (Bourne a Harris, 2007). Vskutku, in vivo zobrazovací studie ukázaly, že v mozkové kůře dynamika páteře přímo koreluje s učením. V motorické kůře myši začíná tvorba páteře okamžitě, jakmile se zvíře učí nové úloze. Po této rychlé spinogenezi se hustota páteře vrátí na základní úroveň zvýšenou eliminací páteře (Xu a kol., 2009; Yu a Zuo, 2011). U ptáků zpěvů bylo zjištěno, že vyšší základní míra obratu páteře před učením písniček koreluje s větší kapacitou pro následné napodobování písní (Roberts a kol., 2010). U myší množství páteř získaných během počátečního učení úzce koreluje s motorickým výkonem získávání učení (Xu a kol., 2009); a přežití nových páteří koreluje s udržením motorické dovednosti (Yang a kol., 2009). Kromě toho jsou různé motorické dovednosti pravděpodobně kódovány různými subpopulacemi synapsí v motorické kůře, protože učení nového motorického úkolu u předem trénovaných myší pokračuje v indukci robustního obratu v motorické kůře dospělých (Xu a kol., 2009). Nedávno bylo také zjištěno, že hladina glukokortikoidů ovlivňuje dynamiku páteře vyvolanou motorickým učením. Cvičení myší na vrcholech glukokortikoidů mělo za následek vyšší rychlost tvorby páteře, zatímco glukokortikoidové žlaby po tréninku byly nezbytné pro stabilizaci páteř vytvořených během tréninku a dlouhodobou retenci paměti (Liston a kol., 2013). Závislost, která byla považována za patologické učení (Hyman, 2005), vyvolává podobné časové změny v dynamice páteře jako motorické učení. Při použití paradigmatu preferovaného místa s kokainem ukázala nedávná zobrazovací studie, že počáteční expozice kokainu podporovala tvorbu páteře ve frontální kůře a že množství nových perzistentních páteří korelovalo s preferencí pro kontext spárovaný s kokainem (Munoz-Cuevas a kol., 2013). Zajímavější je, že dynamika páteře v různých kortikálních oblastech se může při stejném úkolu lišit. Například paradigma kondicionování strachu, při kterém se slučují sluchové narážky s otřesy nohou, prokázala opačné účinky ve sluchové a frontální kůře. Ve sluchové kůře bylo zjištěno, že zvýšená tvorba páteře korelovala s párovým kondicionováním strachu, zatímco nepárová kondice byla spojena se zvýšeným vylučováním páteřů (Moczulska a kol., 2013). V kortexu frontální asociace bylo zjištěno, že zvýšená eliminace páteře je spojena s učením, zatímco tvorba páteře byla spojena s vyhynutím strachu a rekondicionování eliminovaných páteří vytvořených během vymírání (Lai a kol., 2012). Dohromady tyto studie odhalují rozmanitost časových pravidel, která jsou základem dynamiky páteře vyvolané učení. To, zda se v průběhu učení vytvářejí nebo odstraňují páteře, závisí na paradigmatu chování, jakož i na konkrétních typech neuronových obvodů a buňkách účastnících se procesu učení.

Je třeba poznamenat, že všechny výše uvedené příklady se týkají nedeklarativní paměti, která nezahrnuje vědomé vzpomínky na konkrétní čas, místo a epizodický zážitek (tj. Deklarativní paměť). Průzkum in vivo dynamika páteře spojená s deklarativní pamětí je mnohem náročnější. Na jedné straně je hippocampus, struktura rozhodující pro tvorbu deklarativní paměti, pohřben pod kůrou a mimo dosah standardní dvoufotonové mikroskopie. Na druhé straně se předpokládá, že deklarativní paměť je difuzně uložena ve velkých neokortikálních sítích, což ztěžuje cílené zobrazování. Proto pokrok v technikách hlubokého zobrazování mozku (např. Mikroendoskopie, adaptivní optika) spolu s lepším pochopením alokace paměti v kůře drží klíč k budoucímu zkoumání dynamiky páteře, která je základem deklarativní paměti.

SPINÁLNÍ DYNAMIKA U CHOROB

U různých neurologických a neuropsychiatrických onemocnění byly pozorovány změny hustoty dendritických páteřů. Každá porucha má své vlastní charakteristické abnormality v dynamice páteře, což dále potvrzuje myšlenku, že páteře jsou strukturální oporou pro správné kognitivní fungování. Roste konsenzus, že abnormalita páteře je spojena s poruchou chování a poklesem kognitivních funkcí (podrobnosti viz Fiala a kol., 2002; Penzes a kol., 2011).

U modelů mrtvice je ukázáno, že těžká ischemie vede k rychlé ztrátě páteře, která je reverzibilní po reperfuzi, pokud je záchrana provedena v krátkém časovém období (20 – 60 min; Zhang a kol., 2005). Po cévní mozkové příhodě se tvorba páteře a následné eliminace zvyšuje v peri-infarktové oblasti, ale ne v kortikálních územích vzdálených od infarktu nebo v kontralaterální hemisféře (Brown et al., 2009; Johnston a kol., 2013). Tato plasticita způsobená zraněním dosahuje svého vrcholu v 1 týdnu po mrtvici; od té doby se rychlost tvorby a eliminace páteře neustále snižuje. Tento jev naznačuje existenci kritického období, během něhož jsou přežívající peri-infarktové kortikální tkáně nejvíce přístupné terapeutickým zásahům (Brown et al., 2007, 2009). V myším modelu chronické bolesti zvyšuje částečná ligace sedacího nervu tvorbu páteře a její eliminaci. Podobně jako u modelu mrtvice, zvýšení rychlosti tvorby páteře předchází eliminaci, což vede k počátečnímu zvýšení hustoty páteře s následným snížením. Tyto účinky by mohly být odstraněny blokádou tetrodotoxinu, což naznačuje, že remodelace páteře po lézi je závislá na aktivitě (Kim a Nabekura, 2011).

Změněná dynamika páteře byla také popsána na zvířecích modelech degenerativních chorob. Například ztráta páteře je zrychlena v blízkosti β-amyloidních plaků v mozkové kůře (Tsai a kol., 2004; Spiers a kol., 2005). Ve zvířecím modelu Huntingtonovy choroby se rychlost tvorby páteře zvyšuje, ale nově vytvořené páteře nepřetrvávají v začlenění do lokálních obvodů, což má za následek čistý pokles hustoty páteře (Murmu a kol., 2013). Zatímco neurodegenerativní onemocnění jsou obvykle spojena se ztrátou páteře, neurodevelopmentální poruchy vykazují různé fenotypy páteře. V myším modelu syndromu Fragile X jsou páteře četnější a vyšší procento z nich se objevuje nezralé po vyšetření dospělých fixovaných tkání (Comery a kol., 1997; Irwin a kol., 2000). In vivo studie dále ukázaly, že u těchto zvířat se obrat páteře zvýšil v různých kortikálních oblastech (Cruz-Martin a kol., 2010; Pan et al., 2010; Padmashri a kol., 2013) a ani ořezávání vousů ani motorické učení nemohlo dále změnit dynamiku páteře (Pan et al., 2010; Padmashri a kol., 2013). U myší nadměrně exprimujících MECP2, gen související s Rettovým syndromem, bylo zjištěno, že jak zisky, tak ztráty páteře jsou zvýšené. Nicméně nová páteře jsou náchylnější k eliminaci než u myší divokého typu, což vede k čisté ztrátě páteře (Jiang a kol., 2013).

GLICKÝ PŘÍSPĚVEK NA DYNAMIKU SPINACE

Nervový systém zahrnuje dvě třídy buněk: neurony a glie. Nejzajímavější úlohou gliových buněk je jejich účast na synaptickém fungování a dynamice. Nedávno několik vzrušujících studií prozkoumalo roli gliové signalizace při zrání a plasticitě páteře. Ukázalo se například, že blokáda absorpce astrocytového glutamátu urychluje vylučování páteře závislé na zkušenostech během vývoje adolescentů (Yu a kol., 2013). Bylo také zjištěno, že další typ gliových buněk, mikroglie, je v těsném kontaktu s dendritickými páteři. Motilita mikrogliálních procesů a kontakt s páteří jsou aktivně regulovány smyslovou zkušeností a podílejí se na eliminaci páteře (Tremblay a kol., 2010). Kromě toho vyčerpání mikroglie mělo za následek významné snížení tvorby páteře vyvolané motorickým učením a selektivní odstranění neurotrofického faktoru pocházejícího z mozku (BDNF) v mikrogliích rekapitulovalo účinky mikrogliální deplece (Parkhurst a kol., 2013).

SPATIÁLNÍ MANIFESTACE DYNAMIKY SPINY

Strukturální zobrazování páteřů naznačuje, že vznik a zánik páteře není rovnoměrný ani náhodný podél dendritů, ale spíše se vyskytují v prostorově selektivních „horkých bodech“. mají tendenci se shlukovat. Kromě toho přidání druhé nové páteře do shluku je často spojeno s rozšířením první nové páteře. Naproti tomu páteře vytvořené během tandemového provádění různých motorických úkolů nebo během obohacení motoru se neskupují (Fu a kol., 2012). Celkově tato pozorování naznačují, že pro seskupený vznik druhé nové páteře je nutná opakovaná aktivace první nové páteře. Podobná prostorová selektivita dynamiky páteře byla pozorována v paradigmatu strachu kondicionování: páteř eliminovaná během strachu kondicionování je obvykle nahrazena páteří v její blízkosti (uvnitř 2 μm) během vymírání strachu (Lai a kol., 2012). Zajímavé je, že dynamika páteře je také ovlivňována dynamikou inhibičních synapsí. Monokulární deprivace významně zvyšuje koordinovanou dynamiku páteř a inhibičních synapsí poblíž pyramidálních neuronů ve vrstvě 2 / 3 (Chen a kol., 2012). Tato zjištění podporují klastrovaný model plasticity, který předpokládá, že klastrované synapsy se budou pravděpodobně podílet na kódování stejných informací než synapsy rozptýlené v dendritickém altánu (Govindarajan a kol., 2006).

Kombinace in vivo celobuněčný patch patch a single pine vápnikové zobrazování, nedávná práce ukázala, že páteře vyladěné pro různé vrcholové frekvence jsou rozptýleny podél dendritů pyramidálních neuronů v sluchové kůře myši (Chen a kol., 2011). Toto zjištění vyvolává zajímavou otázku: Odpovídají seskupené nové hřbety vstupům s podobnými nebo odlišnými charakteristikami (např. Vzorce aktivity, ladicí vlastnosti)? Aby bylo možné tuto otázku vyřešit, bude nutné vzorkovat páteře na široké ploše dendritického trnu, identifikovat „hotspoty“ remodelace páteře a kombinovat strukturální zobrazování páteře s funkčním zobrazováním v reálném čase. Takové experimenty nejen pomohou objasnit buněčné mechanismy remodelace páteře závislé na aktivitě, ale také poskytují vodítka pro reprezentaci informací a jejich ukládání v neuronech.

BUDOUCÍ POKYNY

V tomto článku jsme zhodnotili nedávná šetření dynamiky dendritických páteř v živém mozku. Ačkoli tyto studie významně pokročily v našem chápání toho, jak se dynamika páteře mění časově a prostorově, zůstává mnoho otázek na různých frontách. Existují například molekulární markery, které odlišují stabilní páteře od nově vytvořených páteří a páteří, které mají být eliminovány? Je celkový počet páteř udržován pomocí homeostatického mechanismu, aby dendrit mohl udržovat metabolickou potřebu synaptického přenosu? Odráží seskupení nových trnů změny v síle existujících spojení se stejným axonem (při zachování stejné topologie sítě), nebo naznačuje navázání dalších spojení s dříve nepřipojenými axony v blízkosti? Stojí za zmínku, že všechna výše diskutovaná díla se zaměřila na postsynaptickou stránku, což je jen polovina příběhu. Další hlavní determinant distribuce a dynamiky páteře leží na presynaptické straně: identita a geometrie presynaptických axonů a dostupnost axonálních boutonů. Znalost takových presynaptických informací je rozhodující pro vyřešení mnoha otázek vyplývajících z pozorování dynamiky páteře. Avšak identifikace presynaptického partnera zobrazované dendritické páteře zůstává technickou výzvou, protože presynaptický axon může pocházet z řady zdrojů a obvykle se mísí s mnoha dalšími axonálními procesy. Kromě toho je ještě mnoho co učit o sekvenci strukturální remodelace, ke které dochází v místě kontaktu mezi axonálním boutonem a páteří, a o tom, jak se tato sekvence spojuje s tvorbou a eliminací synapsí. Simultánní zobrazování axonálních boutonů a jejich partnerských osten v kontextu manipulace s chováním poskytne hojné informace k řešení této otázky. Retrospektivní ultrastrukturální vyšetření, jako je elektronová mikroskopie (Knott a kol., 2009) a Array Tomography (Micheva a Smith, 2007; Micheva a kol., 2010) se také mohou doplňovat in vivo zobrazení pro ověření přítomnosti synapsí a odhalení molekulárních otisků zobrazovaných struktur.

Časová sekvence a prostorově selektivní přestavby neuronálních spojení a to, jak tyto změny kolektivně přispívají ke změnám chování v důsledku zkušeností, je jednou ze základních otázek v neurovědě. Pokrok v zobrazovacích technikách spolu s vývojem v elektrofyziologii, molekulární genetice a optogenetice pomohou odhalit plán neuronálních obvodů na mikroskopické úrovni, jakož i mechanismy kódování informací, integrace a ukládání v mozku.

PŘÍSPĚVKY AUTORŮ

Chia-Chien Chen udělal postavu. Rukopis napsal Chia-Chien Chen, Ju Lu a Yi Zuo.

Prohlášení o konfliktu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez obchodních či finančních vztahů, které by mohly být považovány za potenciální střet zájmů.

Poděkování

REFERENCE