Výskyt gonadálních hormonů ovlivňuje dopaminergní funkce během puberty (2010)

Gonadální vlivy steroidů na závislost

Gonadální účinky steroidů na dopaminergní funkce související se závislostí

Gonadální účinky steroidů na anatomii dopaminových systémů

Chování závislostí během dospívání

Zvířecí modely poskytují zásadní pohled na to, jak se během adolescence mění chování závislá na závislostech, protože experimentální studie na lidech jsou eticky nepřípustné a naturalistické studie jsou vážně zmateny socioekonomickými, environmentálními a genetickými složitostmi, které vyžadují analýzu, která je nad rámec současného stavu. Posouzení. Většina těchto studií byla provedena na hlodavcích; tyto studie budou přezkoumány níže.

Charakteristické behaviorální účinky mnoha návykových drog se mění s dospíváním adolescentů a změny obecně mají tendenci být konzistentní napříč drogami pro dané chování. Jedinou výjimkou může být lokomotorická aktivita, protože změny lokomotorické odpovědi v období adolescence jsou do určité míry specifické pro léčivo. Tyto studie jsou přezkoumávány společností Schramm-Sapyta (Schramm-Sapyta et al. 2009). Amfetamin a metamfetamin stimulují pohybovou aktivitu u mladších adolescentů méně než u dospělých, zatímco lokomotorická stimulace kokainem je během rané adolescence vyšší než v dospělosti. Bylo popsáno, že nikotin snižuje nebo zvyšuje pohybovou aktivitu vývojově specifickým způsobem, v závislosti na studované dávce nebo druhu. Snížení lokomoce je výsledkem léčby nikotinem u myší a toto snížení je u adolescentů menší (Lopez a kol. 2003). U potkanů ​​se uvádí, že nikotin zvyšuje lokomoce a dospívající jsou na tento účinek spíše citlivější než méně citlivé (Faraday a kol. 2001).

Lokomotorická senzibilizace, o které se předpokládá, že odráží neuroplastické jevy během časné návykové závislosti na drogách, se postupně zvyšuje po adolescenci po léčbě amfetaminem, kokainem nebo methylfenidátem: senzibilizace je nízká, když je léčba zahájena v perinatálním období, je během adolescence silnější, ale je větší v dospělosti než v dospívání (Kolta a kol. 1990; McDougall a kol. 1994; Ujike a kol. 1995; Bowman a kol. 1997; Laviola a kol. 1999; Tirelli a kol. 2003; Frantz a kol. 2007). Výjimkou může být senzibilizace po expozici jednotlivým lékům, protože naše laboratoř pozorovala zvýšenou senzibilizaci jednou dávkou u dospívajících ve srovnání s dospělými (Caster a kol. 2007). Senzibilizace nikotinu vyvolaná léčbou dospívajících potkanů ​​je menší než pozorovaná po srovnatelné léčbě dospělých potkanů, ačkoli křížová senzibilizace na kokain a amfetamin byla u dospívajících mužů vyšší než u dospělých mužů (Collins a Izenwasser 2004; Collins a kol. 2004; Cruz a kol. 2005; McQuown a kol. 2009).

CPP u většiny návykových látek včetně nikotinu, kokainu a amfetaminu je během dospívání zvýšen (Vastola a kol. 2002; Belluzzi a kol. 2004; Badanich a kol. 2006; Kota a kol. 2007; Torres a kol. 2008; Brenhouse a Andersen 2008a; Schramm-Sapyta et al. 2009; Shram a Le 2009; Zakharova a kol. 2009), ačkoli u kokainu i amfetaminu byly hlášeny protichůdné nálezy (Adriani a Laviola 2003; Tirelli a kol. 2003; Schramm-Sapyta et al. 2004). Existují konfliktní údaje o ethanolu CPP u potkanů ​​a myší (Philpot a kol. 2003; Dickinson a kol. 2009) a kanabinoidní agonista WIN5512-2 způsobuje CPP při nižších dávkách u dospělých než u dospívajících potkanů ​​(Pandolfo a kol. 2009). Souhrnně lze říci, že CPP je u dospívajících ve srovnání s dospělými lepší, zatímco senzibilizace je u zvířat léčených opakovaně psychostimulanty v dospívání méně než u dospělých léčených jako dospělí. Tyto rozdílné výsledky naznačují, že adolescenti zažívají jak posilovací, tak neuroplastické účinky návykových látek, ale ty druhé mohou být sníženy ve srovnání s dospělými, zatímco první jsou přehnaná. Zvýšené zesilující účinky nejvíce návykových látek u dospívajících hlodavců jsou v souladu se zvýšenou odpovědí na odměnu uvedenou výše, která byla pozorována jak u lidí, tak u hlodavců.

Standardem pro hodnocení závislosti drogové závislosti na zneužívání je samospráva. Studie na zvířatech, ve kterých bylo srovnáváno vlastní podávání začínající v období dospívání a dospělosti, přinesly konzistentní nálezy pro některé léky, ale protichůdné nálezy pro jiné léky. Obecně je u adolescentů získávání sebepodávání ethanolu stále rychlejší (Bell et al. 2003; Brunell a Spear 2005; Doremus et al. 2005; Bell et al. 2006; Vetter a kol. 2007). U adolescentů bylo hlášeno rychlejší získání nikotinu v porovnání se zvířaty, která si samy podávají jako dospělí (Chen a kol. 2007; Levin a kol. 2007) a dospívající, ale nikoli dospělé myši, budou pít roztoky obsahující nikotin dobrovolně (Adriani a kol. 2002). Avšak dospívající si podávají méně nikotinu než dospělí v náročných harmonogramech posilování a vykazují rychlejší vymírání a menší relaps než dospělí (Shram a kol. 2008; Shram a kol. 2008). Některé z těchto nekonzistentností ve zprávách o podávání nikotinu u adolescentů a dospělých mohou odrážet relativní význam odměny a stažení v různých věkových skupinách. Zatímco dospívající mají tendenci být citlivější na prospěšné účinky nikotinu (viz výše), mají tendenci vykazovat méně výraznou závislost (O'Dell a kol. 2004; O'Dell a kol. 2006; Wilmouth a Spear 2006; O'Dell a kol. 2007; Shram a kol. 2008). A konečně nálezy se sebepodáváním kokainu byly nejednoznačné. Ačkoli rychlejší získání samopodávání bylo pozorováno alespoň u zvířat s nízkou preferencí sacharinu (Perry a kol. 2007), několik dalších studií ukázalo, že stabilní samo-podávání se neliší v závislosti na tom, zda se samoobsluha začíná během dospívání nebo dospělosti (Frantz a kol. 2007; Kantak a kol. 2007; Kerstetter a Kantak 2007; Li a Frantz 2009). Většina z těchto studií používá tradiční plány s pevným poměrem, které netestují klíčové přechody na kompulzivitu a eskalaci, které jsou testovány režimy eskalace (Vanderschuren a Everitt 2004). Literatura obecně naznačuje, že adolescenti mohou být citlivější na posílení účinků drog zneužívání, ale zatím neexistují žádná data, která by posoudila, zda adolescenti eskalaují užívání a postupují k nutkavému užívání rychleji než dospělí.

Puberta jako vliv zranitelnosti na závislost v adolescenci?

Vznik sexuálních rozdílů v působení návykových drog

Dobře zavedená stimulace dopaminergní funkce estradiolem popsaná výše naznačuje, že zvýšení estradiolu, ke kterému dochází při nástupu estrální cyklicity, by mělo vyvolat zvýšení uvolňování dopaminu a behaviorální reakci na návykové drogy. Ve skutečnosti se sexuální rozdíly v chování souvisejícím s více závislostmi objevují během dospívání u hlodavců a ve velmi malém počtu studií primátů, které existují. Objevující se důkazy však ukazují, že ovariální i testikulární steroidy mohou přispět k těmto změnám.

Naše laboratoř ukázala, že mladí adolescentní samci potkanů ​​vykazovali větší lokomoce stimulovanou kokainem, větší aktivaci downstream signálních drah v dorzálním striatu (měřeno aktivací c-fos) a větší jednorázovou senzibilizaci lokomotorického chování než dospělí (Caster a kol. 2005; Caster a kol. 2007). Porovnání lokomoce stimulované kokainem u dospívajících a dospělých mužů a žen ukázalo, že dospívající muži a ženy reagují podobně na kokain, a že v adolescenci se objevuje pohlavní rozdíl v lokomoce stimulované kokainem. Rozdíl v pohlaví odráží částečně pokles aktivity stimulované kokainem u mužů a zvýšení lokomoce stimulované kokainem u žen (Parylak a kol. 2008). Byla zaznamenána podobná vývojová změna lokomotorické odpovědi na methylfenidát: zatímco adolescenti mužů a žen vykazovali srovnatelnou lokomotorickou stimulaci, methylfenidát stimuloval významně více lokomotorické aktivity u dospělých žen než u mužů (Wooters a kol. 2006). Morfinem indukovaná lokomotorická stimulace vykazovala poněkud odlišný vzorec: adolescentní muži vykazovali více lokomotorické stimulace než dospělí muži, ale dospívající a dospělé ženy byly rovnocenné dospělým mužům - v dospívání byl rozdíl pohlaví, ale nikoli dospělost (White a kol. 2008). Vyšší citlivost samců myší na inhibici lokomoce nikotinem ve srovnání se ženami se objevuje po adolescenci (Lopez a kol. 2003) Konečně se lokomotorická stimulace spojená s nízkými dávkami ethanolu zvyšuje s dospělostí opic (Schwandt a kol. 2007).

Během dospívání se také objevují sexuální rozdíly v senzibilizaci. Křížová senzibilizace mezi nikotinem a psychostimulanty kokainem a amfetaminem je větší u samců než u samic dospívajících potkanů ​​(Collins a Izenwasser 2004; Collins a kol. 2004). Podobně byly u dospělých, ale nikoli u dospívajících myší hlášeny rozdíly v senzibilizaci na etanol u myší, což naznačuje, že tyto rozdíly se objevují během puberty (Itzhak a Anderson 2008). Během dospívání byla hlášena lokomotorická senzibilizace vyvolaná etanolem u samičích, ale nikoli samčích nehumánních primátů (Schwandt a kol. 2008).

Během dospívání se také objevují sexuální rozdíly v posilovacích účincích návykových látek. Vyšší citlivost žen na kokain CPP se objevuje během dospívání (Zakharova a kol. 2009). Dospělé, ale nikoli dospívající samice myší mají větší CPP než kokain než muži ve věkuBalda a kol. 2009). Jedna studie neukázala žádný pohlavní rozdíl v morfinu ani kokainu CPP, když se porovnaly dospívající a dospělé potkany, ale počet experimentálních subjektů byl natolik malý, že by nebylo pravděpodobné takový rozdíl detekovat, pokud by nebyl extrémně velký (Campbell a kol. 2000).

Během adolescence se objevují sexuální rozdíly v samopodávání mnoha návykových látek. Ukázali jsme, že dospělé, ale nikoli prepubertální samice potkanů ​​požívají více kokainu a dvě laboratoře hlásily výskyt rychlejšího získávání kokainu v průběhu adolescence (Perry a kol. 2007; Carroll a kol. 2008; Lynch 2008; Walker a kol. 2009). Zatímco adolescentní samci i samice potkanů ​​získávají nikotinovou samoobsluhu rychleji než dospělí, úroveň samoobsluhy ve skutečnosti u mužů klesá, jakmile vstoupí do dospělosti, zatímco samice udržují úroveň příjmuLevin a kol. 2003; Levin a kol. 2007). Samice a samci vykazují srovnatelné podávání nikotinu podle schématu progresivního poměru na počátku adolescence, ale na konci adolescence ženy berou více nikotinu než muži (Lynch 2009). Konečně, dospívající myši si samy podaly méně dávek oxykodonu než dospělí, ale tento výsledek byl interpretován jako větší citlivost na účinky oxykodonu na dopaminergní neurotransmiter, protože na konci vlastního podání prokázaly přehnané zvýšení dopaminu ve ventrálním striatu (Zhang et al. 2009).

U hlodavců i primátů (kromě člověka) byl zaznamenán výskyt pohlavních rozdílů při požití alkoholu, i když specifické rozdíly v pohlaví závisí na druhu. Samice potkanů ​​požívají více alkoholu než samci potkanů ​​a tento rozdíl v pohlaví se objeví během dospívání (Lancaster a Spiegel 1992; Lancaster a kol. 1996). Jedna studie primátů, která existuje, ukazuje, že muži a ženy požívali v těchto studiích stejná množství ethanolu (Schwandt a kol. 2008).

Vývojové změny v odpovědích na amfetamin se liší od ostatních léků, které byly studovány, a proto jsou popsány samostatně. Samci i samice adolescentních potkanů ​​získali samopodávání amfetaminu rychleji než dospělí ve studii Shabazi (Shahbazi a kol. 2008). Dospělí muži v této studii užívali méně amfetaminu v progresivním poměru, než dospělí muži, zatímco mladé dospělé ženy braly více než starší dospělé ženy. V jiné studii vykazovaly adolescentní ženy větší senzibilizaci na amfetamin než dospělé ženy nebo muži jednoho věku, ale v této studii nebyly pozorovány žádné rozdíly v pohlaví ani u amfetaminem indukované lokomoce, ani u CPP, která se odchyluje od literatury (Mathews a McCormick 2007). Jednou důležitou výzvou při interpretaci pohlavních rozdílů při samopodávání amfetaminu je to, že metabolismus amfetaminu je podpořen testosteronem, a tedy pravděpodobné změny v adolescenci (Meyer a Lytle 1978; Becker a kol. 1982; Milesi-Halle et al. 2005).

V našich informacích jsou některé významné mezery v rozdílech pohlaví v účincích návykových látek u dospívajících zvířat. O posílení účinků kanabinoidů existuje jen málo informací. Higuera-Matas zkoumal důsledky léčby dospělých samců a samic potkanů ​​agonistou CB1 CP55,940 z PN28-38 a ukázal, že samice vykazovaly zvýšené samopodávání kokainu (Higuera-Matas a kol. 2008; Higuera-Matas a kol. 2009). Wiley a jeho kolegové srovnali akutní účinky THC na kanabinoidní tetrad: katalepsii, hypolocomotion, analgezii a hypotermii, jakož i toleranci a senzibilizaci po opakovaném THC. Zjistili, že adolescentky byly méně citlivé než dospělé ženy na katalepsii, antinocicepci a podchlazení a měly tendenci vykazovat menší toleranci, zatímco adolescentní muži byli citlivější na inhibici lokomoce než dospělí muži (Wiley a kol. 2007). Nejdůležitější je, že neexistují žádné studie změn účinků návykových látek během dospívání u primátů (kromě člověka), kromě dvou hlášených pro ethanol.

Gonadální steroidní role ve vzniku sexuálních rozdílů v účincích návykových drog v dospívání

Studie sexuální diferenciace reprodukčního a nereprodukčního chování ukázaly, že puberta představuje druhé „kritické období“, ve kterém organizační účinky gonadálních steroidů vyvolávají nevratné účinky na pohlavně dimorfní mozkové struktury a funkce (viz výše). Aktivační účinky gonadálních steroidů také začínají během puberty, a tak oba procesy mohou přispívat ke vzniku sexuálních dimorfismů, které jsou náchylné k závislosti během dospívání. Tyto studie ukazují, že časné vývojové okno těsně před a po narození přispívá k organizačním účinkům gonadálních steroidů na působení návykových látek.

Behaviorální studie podporují roli ovariálních a testikulárních steroidů při sexuální diferenciaci behaviorální reakce na návykové drogy, ale relativní příspěvek organizačních a aktivačních účinků není zdaleka jasný. Několik studií podporuje roli organizačních účinků gonadálních steroidů na účinky návykových látek. Ovariektomie nebo masculinizace štěňat samic potkanů ​​androgenní léčbou hned po narození zabránila výskytu zvýšených odpovědí žen na lokomotorické stimulační účinky amfetaminu (Forgie a Stewart 1993; Forgie a Stewart 1994). Jedna studie slabého estrogenového bisfenolu ukázala, že i gestační expozice může ovlivnit ontogenii dopaminergních neuronů, protože expozice bisfenolu během prenatálních dnů 11-18 potlačovala amfetaminem indukovanou CPP u samic potomstva (Laviola a kol. 2005).

Nedávné studie z naší laboratoře naznačují, že puberta může představovat další okno, během kterého organizační účinek gonadálních steroidů ovlivňuje účinky návykových látek. V řadě studií jsme porovnávali účinky pre- a post-pubertální ovariektomie nebo kastrace. Ovariektomie v dospělosti nebo před pubertou potlačila lokomoce stimulovanou kokainem. Pre-, ale ne postpubertální kastrace však významně zvýšila lokomoce stimulovanou kokainem u mužů (Kuhn a kol. 2001; Walker a kol. 2001; Parylak a kol. 2008). Předpubertální chirurgie byla provedena na PN25, po dobře popsaném perinatálním období citlivosti steroidních hormonů na organizaci mozku. Tyto údaje podporovaly roli ovariálních hormonů u žen, ale také naznačovaly, že dříve nerozpoznaný organizační účinek androgenu přispěl k normálnímu vývojovému poklesu kokainem stimulovaného chování u mužů. Tato zjištění naznačují, že gonadální steroidy zvyšují chování související se závislostí u žen a potlačují je u mužů během dospívání.

Vznik sexuálních rozdílů v dopaminergních funkcích během dospívání

Výše uvedené behaviorální studie ukazují, že lokomotorická aktivace, zesílení související s léčivem a samostatné podávání léčiva se u hlodavců během dospívání stávají sexuálně dimorfními. Vzhledem k prokázané důležitosti aktivace dopaminergních neuronů vyvolané léky v těchto pohlavních rozdílech je logické navrhnout, aby sexuální diferenciace dopaminergních funkcí tyto účinky zprostředkovávala.

U hlodavců se prenatálně objevují sexuální rozdíly v anatomii dopaminergních projekcí do předního mozku. Ovtsharoff (Ovtscharoff a kol. 1992) ukázaly, že ženy mají prenatálně v kaudátu vyšší hustotu inervace dopaminergních vláken. Dále bylo naznačeno, že genetický sex spíše než cirkulující hladiny hormonů ovlivňuje dopaminergní neurony v mozku hlodavců (Beyer a kol. 1991; Kolbinger a kol. 1991). Ukázka, že gen varlata určující varlata je exprimována v dopaminergních neuronech, kde může regulovat expresi tyrosinhydroxylázy nezávislé na hladinách hormonů, dále podporuje pravděpodobnost, že existuje pohlavně specifická regulace dopaminergních neuronů (Dewing a kol. 2006), i když se jedná o nově vznikající oblast s malými daty.

Dosud je málo důkazů o účinku gonadálních steroidů na dopaminergní funkci během kritických období během časného postnatálního a pubertálního vývoje. Údaje o chování však naznačují, že expozice samců androgenům perinatálně nebo během puberty a expozice žen estrogenu během puberty poskytuje kritické hormonální narážky (viz nedávný přehled Becker (Becker 2009)). Jedinou existující studií je ukázka, že gonadální steroidy nepřispívají k dospívajícímu prořezávání receptorů D2 (Andersen a kol. 2002).

Gonadální příspěvek steroidů ke změnám dopaminergních funkcí během dospívání

Naše laboratoř začala charakterizovat vznik pohlavních rozdílů v dopaminergních buněčných tělech v oblasti substantia nigra a ventrální tegmentální oblasti a jejich terminálních projekcích, abychom pochopili potenciální přínos dopaminergních funkcí ke změně zranitelnosti závislostí během puberty. Naše předchozí zjištění ukázala, že kokain zvýšený přetečení dopaminu v dorzálním striatu je 3 krát vyšší u mladých dospívajících než dospělých samců potkanů. Tento vývojový rozdíl je regionálně selektivní, protože se nevyskytuje v jádru nucleus accumbens (Walker a Kuhn 2008). Naše behaviorální studie předpovídaly, že nástup estrální cyklicity u žen během dospívání by mohl zabránit podobnému vývojovému poklesu kokainem stimulovaného přetečení dopaminu u žen.

Abychom prozkoumali tuto možnost, měřili jsme stimulované přetečení dopaminu v různých časech po podání kokainu (10 mg / kg) u dospívajících (den 28) a dospělých (den 65) samců a samic potkanů ​​pomocí rychlé skenovací cyklické voltametrie, jak bylo dříve popsáno u obou dospívajících a dospělí (Walker a kol. 2000; Walker a kol. 2006; Walker a Kuhn 2008). Obrázek 2 ukazuje procento zvýšení dopaminu vzhledem k základní stimulaci při 20 Hz. Přetečení dopaminu stimulovaného kokainem bylo vyšší u dospívajících potkanů ​​obou pohlaví ve srovnání s dospělými a dospívající muži a ženy byli navzájem srovnatelní. Přestože byl přebytek dopaminu stimulovaný kokainem menší v dospělosti než v adolescentech obou pohlaví, pokles z dospívání do dospělosti u žen byl menší než pokles pozorovaný u mužů (Walker a kol. 2000; Walker a kol. 2006). Tato zjištění naznačují, že dopaminergní funkce klesá během dospívání sexuálně specifickým způsobem. Tato studie však nemohla stanovit příspěvek organizačních nebo aktivačních účinků gonadálních steroidů k ​​těmto změnám v uvolňování dopaminu.

  

Obrázek 2

Časový průběh přetečení dopaminu vyvolaného kokainem u dospívajících (PN28) nebo dospělých (PN65-75) samců a samic potkanů. Data ukazují procentní nárůst extracelulárního dopaminu v různých časech po kokainu (10 mg / kg). N = 5-9 / skupina. ANOVA označila P <001 ...

Literatura u dospělých naznačuje, že aktivační účinky estradiolu jsou primární vliv gonadálních steroidů na dopaminergní funkci u dospělých potkanů. Naše údaje o chování (Parylak a kol. 2008) uvedli, že důležité organizační účinky ovariálních nebo testikulárních steroidů mohou přispívat k adolescentním změnám endokrinní funkce. Pro zkoumání této možnosti jsme provedli prepubertální kastraci nebo ovariektomii na PN25 a vyhodnotili jsme kokainem stimulovaný přetečení dopaminu 30 o několik dní později, abychom odpovídali našim předchozím behaviorálním studiím. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v Čísla 3 a a4.4. Jak se očekávalo, prepubertální ovariektomie snížila přetečení stimulované kokainem (Obrázek 3). Překvapivě, prepubertální kastrace způsobila významné zvýšení kokainem stimulovaného přetečení dopaminu (Obrázek 4). Vzhledem k dobře popsaným účinkům estradiolu na dopaminergní funkci je obtížné rozlišit relativní příspěvek aktivačních a organizačních účinků k výsledkům u žen. Závažnost literatury prokazující nedostatek androgenních účinků na dorzální striatální uvolňování dopaminu u dospělých zvířat však naznačuje, že androgen může mít dříve nepopsaný organizační účinek na dopaminergní funkce během puberty. Tento výsledek odpovídá zjištěním chování, které jsme popsali výše, což prokázalo významné zvýšení chování stimulovaného kokainem po prepubertální, ale nikoli dospělé kastraci.

  

Obrázek 3

Kokainem stimulovaný přetečení dopaminu u samic potkanů ​​1 měsíc po prepubertální (25) simulaci nebo aktivní ovariektomii. Data byla shromážděna, jak je popsáno v Obrázek 3. N = 4-5 / skupina. ANOVA indikovala P <001 pro účinek času ap <001 ...

  

Obrázek 4

Kokainem stimulovaný přetečení dopaminu u samců potkanů ​​1 měsíc po prepubertální (den 25) simulaci nebo aktivní kastraci. Data byla shromážděna, jak je popsáno v Obrázek 3. N = 4-5 / skupina. ANOVA označila P <001 pro účinek času a p <001 pro ...

Mechanismy, kterými ovariální i testikulární steroidy ovlivňují dopaminergní funkce v období adolescence, nejsou známy. Protože jsme nedávno ukázali, že estradiol zvyšuje dopaminergní reakce na psychostimulanty částečně udržováním počtu dopaminergních neuronů, provedli jsme pilotní studii, abychom určili, zda se v pubertě objevily rozdíly v počtu dopaminergních neuronů. Pro zkoumání této možnosti jsme zabili spárované kohorty samců a samic potkanů ​​na PN21, 28, 42 a 65 a spočítali se počet dopaminergních neuronů v substantia nigra a ventrální tegmentální oblasti, jádra, ze kterých vycházejí dopaminové projekce do předního mozku, pomocí nezaujaté stereologie .

Zvířata byla hluboce anestetizována a transkardiálně perfundována 10% neutrálním pufrovaným formalinem. Po perfuzi byly mozky extrahovány a dodatečně fixovány přes noc v 10% formalinu, ekvilibrovány v kryoprotektantu 30% sacharózy a skladovány při 4 ° C. Sériové koronální řezy (30 um) byly nařezány na kryostatu, rozmrazeny na sklíčka a sušeny přes noc při 37 ° C. Řezy byly opláchnuty v PBS a inkubovány v 0.3% peroxidu vodíku v methanolu po dobu 30 minut, opláchnuty a blokovány v 0.5% BSA + 0.3% Triton X-100 po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Po blokování byly řezy inkubovány v primární protilátce zředěné v blokovacím pufru (1: 10000, Immunostar, Inc., Hudson, WI) přes noc při 4 ° C. Následující den byly řezy opláchnuty a inkubovány v biotinylované koňské anti-myší sekundární protilátce (1: 1000, Vector Labs, Burlingame, CA) po dobu 1 hodinu při pokojové teplotě. Řezy byly poté opláchnuty a inkubovány v komplexu avidin-biotin po dobu 1 za laboratorní teploty, opláchnuty a obarveny DAB (Vector Labs). Řezy byly opláchnuty, dehydratovány přes odstupňované alkoholy, kontrastně barveny krezylovou fialkou, namontovány a zakryty. Neobjektivní stereologický odhad celkového počtu buněčných těl TH-IR a TH-IN v SNpc a VTA byl proveden pomocí metody optické frakcionace (West a kol. 1991). Pro odhad celkového počtu buněk byl použit počítačový počítací systém obsahující mikroskop Nikon Optiphot-2, fotoaparát (Dage) a motorizované jeviště (Ludl). Jednotlivá buněčná těla byla vizualizována pomocí 100 × olejové imerzní čočky (numerická apertura = 1.3). Bylo spočítáno dost buněk, aby bylo dosaženo koeficientu chyby, který byl <0.10. Tato studie byla prováděna bez tepelně zprostředkovaného získávání antigenu a počet buněk byl nižší, než je možné pomocí této techniky detekovat. Z tohoto experimentu však vyšel jasný a neočekávaný vzorec. Jak je uvedeno v Obrázek 5, došlo k dramatickému poklesu počtu buněk DA během dospívání. Zdálo se, že tento pokles náhorních plošin u žen ve dne 65, když se objevil charakteristický rozdíl v pohlaví.

  

Obrázek 5

Tyrosinhydroxyláza imunoreaktivní neurony v substantia nigra v postnatálním věku. N = 5-7 / skupina. ANOVA označuje p <001 pro účinek věku ap <. 01 pro interakci věku × pohlaví.

Tato zjištění naznačují, že během dospívání krys, samců i samic, dochází k významné vlně dopaminergní buněčné smrti. Okamžitě po narození a kolem PN14 dochází ke dvěma dřívějším vlnám apoptotické buněčné smrti.Jackson-Lewis a kol. 2000; Burke 2003; Burke 2004). Relevance poklesu v období adolescence na dopaminergní funkci není jasná, protože k tomu dochází ve stejné době, kdy se zvyšuje hustota inervace v terminálních oblastech (viz výše). To bylo navrhl, že buňky, které podstoupí apoptózu byly ty, které nedosáhly jejich cíle přiměřeně a tak nepřijal trofický vstup od cílových neuronů (Oo et al. 2003; Burke 2004). Vznik rozdílu mezi pohlavími v počtu dopaminových neuronů až po pubertě podporuje naši počáteční hypotézu, že trofické účinky estradiolu mohou přispět k udržení dopaminergních neuronů v dospělosti. Je zajímavé, že změny v počtu dopaminergních neuronů jsou paralelní se změnami účinků kokainu na uvolňování dopaminu, které jsme viděli: dramatický pokles v dospívání, jen část byla sexuálně dimorfní. V současné době zkoumáme, zda anatomické změny v těle buňky a / nebo v koncových oblastech přispívají k regulaci závislosti na návykových látkách gonadálními steroidy.

Význam adolescentních změn v dopaminergní funkci předního mozku pro závislost

Výše uvedené studie ukazují, že dopaminergní funkce v dorzálním striatu prochází jeho konečným zráním, po kterém následuje „prořezávání zpět“ na funkci dospělého, jak se vyvíjí adolescent. Během tohoto časového období se objevují pohlavní rozdíly v dopaminergních funkcích a v chování regulovaném dopaminem. Zdá se, že tyto účinky odrážejí jak nástup aktivačních účinků estradiolu na zvýšení dopaminergní funkce u žen, tak i organizační účinek androgenu, který potlačuje dopaminergní funkci u mužů. Obrázek 6 shrnuje jeden potenciální systém, který by mohl vysvětlit současné poznatky. Zleva doprava ukazuje obrázek tři fáze vývoje dopaminergních neuronů. Panel zcela vlevo ukazuje dopaminovou neurogenezi. Střední panel zobrazuje období růstu axonu a inervaci cílů, k nimž dochází během postnatálního života a dospívání. Závěrečná fáze vývoje dopaminergních neuronů je znázorněna na pravém panelu, protože receptory „sklouzávají“ zpět. Dopaminergní neurony jsou ztraceny v každé fázi procesu na základě údajů v této studii a dříve publikovaných (Burke 2003; Burke 2004). Předpokládáme, že během adolescence je poslední fáze apoptotické buněčné smrti dopaminergních neuronů ve středním mozku zvýšena androgenem a kompenzována trofickými účinky estradiolu. To je indikováno menším počtem buněk ve středním a pravém panelu u mužů a šedým neuronem ve spodním panelu označujícím populaci neuronů udržovaných estradiolem u žen. Do panelu vlevo je také zahrnut šedý neuron, protože studie v kultuře naznačují, že ženy mohou mít více neuronů v raných fázích vývoje, ačkoli jsme tyto rozdíly nezjistili na začátku adolescence (Beyer a kol. 1991). Na konci adolescence / puberty mají ženy více dopaminergních neuronů, o nichž se domníváme, že přispívají k dopaminovým funkcím pozorovaným u žen. K vzniku pohlavních rozdílů v dopaminergních funkcích však pravděpodobně přispívají další účinky nad rámec těch na počet dopaminergních buněčných těl. Potenciální kandidáti zahrnují výskyt cyklických účinků estradiolu na DAT a receptory, jakož i aktivační účinky androgenu na kortikální nervové obvody zapojené do výkonné funkce. Kromě toho může aferentní vstup (snad GABAergická zpětná vazba na dopaminergní neurony, uvedený v pravém dolním panelu) také přispět k další regulaci dopaminergních funkcí u žen.

  

Obrázek 6

Hypotetický model vlivu estradiolu a testosteronu na ontogenii dopaminových systémů předního mozku.

Existuje jedna námitka při interpretaci relevance těchto zjištění pro závislost. Hlavní změny adolescence v dopaminergních funkcích, které jsme pozorovali, se vyskytly v dorzálním striatu. Dopaminergní neurony, které vyčnívají z VTA do nucleus accumbens, mohou být důležitější pro počáteční fáze posílení léku (Koob 1996; McBride a kol. 1999; Di Chiara 2002). Avšak zvýšení dopaminu v dorzálním striatu je považováno za kritické pro přechod od dobrovolného užívání drog k učení návyků, což je klíčová fáze ve vývoji závislosti (Vanderschuren a Everitt 2004; Volkow a kol. 2006; Viz et al. 2007; Dalley a Everitt 2009). Jedním z důsledků těchto zjištění je, že ačkoli posilující účinky léků nemusí být během dospívání jednotně větší, přechod na návykové vzorce chování se může objevit rychleji u lidí, kteří užívají drogy v časném dospívání.

Výskyt pohlavních rozdílů v dopaminergních funkcích byl superponován na normální vývojové vlivy. Tato data jsou opět v souladu s epidemiologickou literaturou, která ukazuje, že adolescenti obou pohlaví jsou ve větším riziku experimentovat s návykovými drogami a stát se závislými na návykových látkách, ale že genderové specifické problémy se objevují také s dospíváním dospívajících. Důležitou otázkou zůstává behaviorální význam oslabené dopaminergní funkce, která se u mužů vyvíjí v období dospívání. Je to spojeno se zvýšenou nebo sníženou zranitelností vůči závislosti? Epidemiologické studie naznačují, že dřívější užívání drog začíná (v časné adolescenci, na začátku pubertálního vývoje u mužů), čím větší je riziko budoucí drogové závislosti. Jak rostoucí testosteron ovlivňuje chování při užívání drog? Zajímavé studie, že testosteron samotný je podáván samostatně prostřednictvím akcí, které zahrnují jak androgeny, tak estrogeny, naznačují důležitou roli androgenu, který dosud nebyl charakterizován (Dřevo 2004; Sato a kol. 2008; Dřevo 2008). Studie na zvířatech, které zkoumají samopodávání léků u mužů, kteří dostali prepubertální kastraci, mohou pomoci odpovědět na tyto otázky.

Podpora NIDA grantu DA019114 a 009079 je vděčně potvrzena. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu se zvířecími protokoly schválenými Duke University IACUC.