Abstraktní
Psychostimulantem vyvolaná změna dendritických spinů na dopaminoceptivních neuronech v nucleus accumbens (NAcc) byla hypoteticky považována za adaptivní neuronální odpověď, která je spojena s dlouhodobým návykovým chováním. NAcc je do značné míry složen ze dvou odlišných subpopulací středně velkých ostnatých neuronů exprimujících vysoké hladiny buď dopaminových D1 nebo D2 receptorů. V této studii jsme analyzovali dendritickou hustotu páteře po chronické léčbě kokainem v odlišných středně velkých spinálních neuronech s D1 nebo D2 receptorem v NAcc. Tyto studie využívaly transgenních myší, které exprimovaly EGFP pod kontrolou promotoru D1 nebo D2 receptoru (Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP). Po 28 dnech léčby kokainem a 2 dnů po vysazení byla hustota páteře zvýšena u neuronů pozitivních jak na Drd1-EGFP, tak na Drd2-EGFP. Zvýšení hustoty páteře však bylo udržováno pouze u neuronů pozitivních na Drd1-EGFP 30 dnů po vysazení léčiva. Zvýšená exprese AFosB byla také pozorována u neuronů pozitivních na Drd1-EGFP a Drd2-EGFP po 2 dnech odvykání léku, ale pouze u neuronů pozitivních na Drd1-EGFP po 30 dnech po vysazení léčiva. Tyto výsledky naznačují, že zvýšená hustota páteře pozorovaná po chronické léčbě kokainem je stabilní pouze u neuronů obsahujících receptor D1 a že exprese AFosB je spojena s tvorbou a / nebo udržováním dendritických páteří u D1 a neuronů obsahujících receptor D2 v NAcc.
Mezolimbická dopaminergní dráha se skládá z neuronů ve ventrální tegmentální oblasti, které inervují nucleus accumbens (NAcc), olfaktorický tuberkul, prefrontální kortex a amygdala (1), zatímco nigrostriatální dopaminergní neurony v substantia nigra (pars compacta) poskytují vzestupnou projekci na dorzální striatum (2). Psychostimulanty zvyšují synaptické koncentrace dopaminu v NAcc: kokain, blokováním příjmu dopaminu ze synaptické štěrbiny a amfetaminu podporou uvolňování dopaminu z nervových terminálů (3-5). Opakované, intermitentní podávání psychostimulancií má za následek zvýšené behaviorální reakce (senzibilizace) na akutní stimulační účinky těchto léčiv (6-8). Většina důkazů naznačuje, že adaptivní změny ve ventrální tegmentální oblasti - dopaminergním systému NAcc jsou ústředním bodem změn v plasticitě závislé na zkušenosti, která je základem chování vyvolaného drogami.
Kromě dopaminu je glutamát nezbytný pro rozvoj behaviorální senzibilizace v reakci na psychostimulanty (9, 10). Středně velké ostnaté neurony (MSN) ve ventrálním striatu dostávají excitační glutamátergické projekce z prefrontálního kortexu, který se synchronizuje na hlavy dendritických páteří. MSNs jsou také hlavním cílem dopaminergních axonů, které se synchronizují na krční páteře (1, 11, 12). Proto dendritické páteře v MSN představují buněčný kompartment, kde jsou zpočátku integrovány dopaminergní a glutamátergní přenosy.
Dopamin působí na dvě hlavní podtypy receptorů, podrodinu D1 (podtypy D1 a D5) a podrodinu D2 (podtypy D2, D3 a D4)13). V dorzálním striate, anatomické studie ukázaly, že striatonigrální MSN obsahují vysoké hladiny D1 receptorů (spolu s látkou P a dynorphin), zatímco striatopallidní MSN převážně exprimují D2 receptory (spolu s enkefalinem) (14-17). Projekce z NAcc jsou komplexnější než u dorzálního striata, přičemž skořápka a jádrové části NAcc promítají do odlišných subregionů ventrální pallidum a ventrální tegmentální oblasti a substantia nigra (18). Zatímco receptory D2 a enkefalin jsou vysoce vyjádřeny v projekcích ventrálního pallidu, receptory D1 a substance P jsou shledány rovnoměrně distribuovány v projekcích ventrální palidum a ventrální tegmentální oblasti (19). Studie agonistů a antagonistů selektivních pro D1 nebo D2 receptory ukázaly, že jak D1, tak D2 receptory jsou potřebné pro psychostimulační změny závislé na chování (20-25). Zdá se však, že role těchto receptorů se liší. Například stimulace receptorů D1 zmírňuje snahu o kokain vyvolanou injekcemi kokainu a environmentálními podněty souvisejícími s kokainem, zatímco stimulace receptorů D2 usnadňuje navrácení vyvolané kokainem (26-28).
Abnormality chování spojené s psychostimulační závislostí jsou extrémně dlouhodobé. Proto existuje značný zájem o identifikaci dlouhotrvajících změn vyvolaných léky na molekulární a strukturní úrovni v neuronálních okruzích regulovaných dopaminem a glutamátem (29-32). Zejména bylo zjištěno, že dlouhodobá expozice kokainu nebo amfetaminu zvyšuje počet dendritických větví a spiny MSN v NAcc (33-35). Bylo prokázáno, že tyto strukturální změny přetrvávají až do ≈1 – 3.5 měsíců po poslední expozici léku (30, 35) a byly navrženy tak, aby podporovaly dlouhodobé změny synaptické plasticity spojené s psychostimulační expozicí.
Cílem této studie bylo zkoumat strukturní změny dendritických páteří vyvolané kokainem v subpopulacích akumulovaných MSN, které exprimují buď D1 nebo D2 receptory. V těchto studiích jsme použili transgenní myši bakteriálního umělého chromozomu (BAC), které exprimují EGFP pod kontrolou buď promotoru D1 (Drd1-EGFP) nebo dopaminového receptoru D2 (Drd2-EGFP) (36). Výsledky ukazují, že ačkoliv se zvýšená hustota páteře zpočátku vyskytuje u MSN s obsahem D1 receptoru a MSN obsahujících receptor D2, změněná hustota páteře je stabilní pouze u neuronů obsahujících receptor D1. Kromě toho nalézáme podobné změny v expresi transkripčního faktoru AFosB, což naznačuje, že AFosB může být zapojen do tvorby a / nebo udržování dendritických spinů v D1, stejně jako neuronů obsahujících receptor D2 v NAcc.
výsledky
Analýza MSN v Drd1-EGFP a Drd2-EGFP BAC transgenních myších.
Projekční obraz MSNs z dorzálního a ventrálního striata u Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP BAC transgenních myší byl charakterizován analýzou exprese GFP (36). Diferenciální exprese GFP v MSN dorzálního striata odpovídá obecně endogennímu receptoru D1 nebo D2 (v tomto pořadí).36). Dále jsme analyzovali diferenciální expresi GFP v NAcc u myší Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP (Obr. 1a a b). Ačkoli ≈58% neuronů v NAcc exprimovalo GFP u myší Drd1-EGFP (Obr. 1a), -48% neuronů v NAcc exprimovalo GFP u myší Drd-2-EGFP (Obr. 1b). MSNs představují 90 – 95% všech neuronů v NAcc (12, 37). Receptory D1 jsou exprimovány pouze v MSN a receptory D2 jsou exprimovány v MSN a v cholinergních interneuronech, které představují 1 – 3% striatálních neuronů (37). Při zohlednění těchto faktorů výsledky naznačují, že minimálně xNUMX – 10% MSNs v NAcc pravděpodobně exprimuje D15 i D1 receptory.
Analýza dendritických spinů u myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP.
Exprese GFP v myších Drd1-EGFP a Drd2-EGFP byla užitečná pro barvení těl neuronálních buněk. Signál GFP v dendritech a dendritických páteřích však byl příliš slabý, aby umožnil jejich analýzu po imunoznačení anti-GFP protilátkami. Balistické dodávání fluorescenčních barviv zprostředkované částicemi bylo v nedávné době používáno pro značení neuronových populací rychlým a účinným způsobem (38). Pomocí této techniky lze označit celé neurony a metoda se jeví jako srovnatelná s barvením Golgiho-Coxovým barvením. Pro analýzu dendritické morfologie neuronů v NAcc byly fixní akumulační řezy označeny lipofilním fluorescenčním barvivem 1,1®-diotadecyl-3,3,3 ', 3-tetramethylindokarbocyanin perchlorátem (DiI) za použití genového děla. Příklad DIN-barveného MSN je ukázán v Obr. 1c. Za použitých podmínek jsme obecně pozorovali značené neurony bez překrývajících se dendritů z jiných značených neuronů. Při větším zvětšení bylo možné pozorovat podrobnou dendritickou morfologii, včetně dendritických páteří (Obr. 1d).
Pak jsme použili kombinaci značení DiI a imunohistochemie pro GFP v transgenních myších Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP, což bylo umožněno použitím nízké koncentrace detergentu pro permeabilizaci tkáně (viz Metody). Pečlivým porovnáním barviva DiI a exprese GFP v tělech buněk MSN jsme mohli identifikovat DiI- a GFP-pozitivní nebo DiI-pozitivní a GFP-negativní neurony v Drd1-EGFP (Obr. 2a) nebo Drd2-EGFP (Obr. 2b) myši. V následujících studiích jsme analyzovali dendritickou morfologii pouze u DiI a GFP-pozitivních neuronů z Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP myší.
Chronická léčba kokainem vede ke zvýšené hustotě páteře v akumulovaných MSN exprimujících buď Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP.
Myši Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP byly opakovaně injikovány kokainem (30 mg / kg) nebo fyziologickým roztokem po dobu čtyř po sobě následujících týdnů (viz Metody). Dva dny (2WD) nebo 30 dny (30WD) po posledním léčení lékem byly mozky zpracovány pro DiI značení a imunohistochemii, jak je popsáno výše. Předchozí studie uváděla, že chronická léčba amfetaminem zvyšuje hustotu páteře na distálních, ale nikoli proximálních dendritech MSN v NAcc (35). Proto jsme omezili naši analýzu na distální dendrity (tj. Ty s větvemi druhého nebo třetího řádu), včetně koncových oblastí. Při analýze na 2WD bylo zjištěno, že hustota páteře vzrůstá v MSNs pozitivních na Drd1-EGFP (128% fyziologické skupiny) (Obr. 3a a c) av menší míře u neuronů pozitivních na Drd2-EGFP (115% fyziologické skupiny) (Obr. 3 b a d). Po 30WD byla zvýšená hustota páteře udržována v neuronech pozitivních na Drd1-EGFP (118% kontroly fyziologického roztoku) (Obr. 3 a a c), ale ne v neuronech pozitivních na Drd2-EGFP (Obr. 3 b a d).
Morfologie dendritických páteří je variabilní co do délky a šířky hlavy páteře. Proto jsme klasifikovali dendritické výčnělky do čtyř tříd páteře (stubby, hub, hub, filopodie) u 2WD z kokainu (data nejsou uvedena). Hustota houbovitého typu (119.7 ± 4.0%, P <0.01) a tenké trny (120.0 ± 3.4%, P <0.01) byla zvýšena léčbou kokainem v Drd1-EGFP-pozitivních MSN, zatímco hustota podsaditého (182.4 ± 21.6%, P <0.05) a hřibové houby (122.5 ± 5.0%, P <0.01) byla zvýšena u MSN pozitivních na Drd2-EGFP. Nezjistil se žádný významný nárůst podsaditých trnů v neuronech pozitivních na Drd1-EGFP nebo tenkých trnů v neuronech pozitivních na Drd2-EGFP.
Chronický kokain indukuje expresi AFosB v Drd1-EGFP- nebo Drd2-EGFP-pozitivních MSN v NAcc.
AFosB je členem Fos rodiny transkripčních faktorů. Zatímco akutní podávání kokainu vyvolává rychlou a přechodnou indukci několika izoforem Fos v NAcc, opakovaná expozice kokainu zvyšuje hladinu AFosB. Kromě toho, zvýšení exprese AFosB přetrvává v NAcc týdny až měsíce po přerušení podávání léčiva a bylo navrženo, že se podílí na dlouhodobé regulaci genové exprese, dokonce i po ukončení užívání léčiva (29, 39, 40).
Pro zkoumání indukce AFosB v NAcc z myší Drd1-EGFP nebo Drd2-EGFP po léčbě kokainem jsme analyzovali expresi FosB a GFP dvojitým značením (Obr. 4 a Tabulka 1) Protilátka proti FosB rozpoznává všechny formy FosB, ale předpokládáme, že zvýšená imunostain představuje AFosB (viz Metody pro další diskusi). U myší ošetřených fyziologickým roztokem 16% Drd1-EGFP-pozitivních neuronů a 15% Drd2-EGFP-pozitivních neuronů exprimovalo imunoreaktivitu FosB s relativně slabou intenzitou (Obr. 4 a a b a Tabulka 1). Opakovaná léčba kokainem následovaná 2WD vedla k významnému zvýšení počtu Drd1-EGFP-pozitivních neuronů, které koexprimovaly AFosB (55% GFP-pozitivních neuronů) (Obr. 4c a Tabulka 1). Menší, ale stále významné zvýšení exprese AFosB bylo zjištěno u neuronů pozitivních na Drd2-EGFP (25% GFP-pozitivních neuronů) (Obr. 4d a Tabulka 1). Stejně jako u změn hustoty páteře byla zvýšená exprese AFosB udržována v neuronech pozitivních na Drd1-EGFP (46% neuronů pozitivních na GFP), ale ne na neuronech pozitivních na Drd2-EGFP (15% neuronů pozitivních na GFP). 30WD (Obr. 4 e a f a Tabulka 1). Všimněte si, že zvýšená exprese AFosB pozorovaná v Obr. 4f je přítomen v Drd2-EGFP-negativních neuronech.
Diskuse
Má se za to, že dlouhodobé adaptace dopaminergní neurotransmise jsou základem návykového chování spojeného s psychostimulačními léky. Zejména psychostimulantem indukované zvýšení dendritické hustoty páteře MSNs v NAcc bylo předpokládáno, že je spojeno s reorganizací synaptické konektivity (30). NAcc je do značné míry složen ze dvou odlišných subpopulací MSN exprimujících vysoké hladiny buď dopaminových receptorů D1 nebo D2. V této studii jsme analyzovali hustotu páteře v různých MSN v D1 nebo D2 receptorech v NAcc po chronické léčbě kokainem. Získané výsledky ukazují, že ačkoli se zpočátku zvyšuje hustota páteře u MSN s obsahem D1 receptoru a MSN obsahujících receptor D2, změněná hustota páteře je stabilní pouze u neuronů obsahujících receptor D1. Kromě toho nacházíme podobný model změn v expresi transkripčního faktoru AFosB v MSN s obsahem D1 a D2 receptoru.
Tyto studie využívaly BAC transgenních myší, které exprimují GFP ve specifických subpopulacích MSN pod kontrolou buď promotoru D1 nebo D2 receptoru. Dále jsme vyvinuli metodu dvojitého značení, která kombinovala imunohistochemii pro GFP s balistickým značením neuronů pomocí DiI. Předchozí studie použily Golgiho-Coxovu metodu k analýze účinku psychostimulancií na hustotu páteře (34) a metoda DiI zde použitá poskytla výsledky, které byly kvantitativně srovnatelné. Vyvinuli jsme metodu dvojitého značení, protože Golgiho barvení není kompatibilní s imunohistochemií. Imunologické barvení obvykle vyžaduje tkáňovou permeabilizaci s detergenty, což je proces, který typicky vede k solubilizaci lipofilních barviv z membrány (38). V našich současných studiích však GFP imunologické barvení nevyžadovalo vysokou koncentraci detergentu pro permeabilizaci tkání a mohlo by tedy být použito ve spojení s lipofilním barvením. Naše metoda dvojitého značení by měla být obecně užitečná pro studium strukturálních změn v dendritických páteřích, například při analýze BAC transgenních myších linií, kde je GFP exprimován ve specifických populacích neuronů v kortexu (36).
Ačkoli ještě poněkud sporný, to je věřil, že D1 a D2 receptory jsou velmi anatomicky segregované k přímému (striatonigral) a nepřímému (striatopallidal) striatal projekce neurons, příslušně (17, 41). Počáteční charakterizace lokalizace GFP v myších Drd1-EGFP a Drd2-EGFP byla v souladu s tímto závěrem (36). Naše analýza počtu GFP-pozitivních neuronů v NAcc z myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP je navíc v souladu se závěrem, že ≈50% MSN exprimuje pouze receptory D1, které ≈35 – 40% exprimují pouze receptory D2, a že ≈10 – 15% koexprimuje receptory D1 i D2. Tato hodnota koexprese je podobná hodnotě implikované ve studiích dorzálního striata, které kombinovalo patch-clamp analýzu jednotlivých striatálních neuronů s RT-PCR technikami k izolaci a amplifikaci mRNA (≈17% koexprese enkefalinu a substance P) (42). Je třeba poznamenat, že naše současné studie se nezabývají otázkou exprese D3, D4 a D5 receptorů, ani se nezabývají otázkou nízkých hladin exprese D1 receptorů v MSN exprimujících vysoké hladiny D2 receptorů nebo naopak.
Několik předchozích studií zkoumalo neuronální lokalizaci exprese Fos vyvolanou psychostimulantem a úlohu receptorů D1 a D2 (43-45). Tyto studie podpořily závěr, že indukce Fos a AFosB je zprostředkována aktivací D1 receptorů. Buněčná lokalizace exprese Fos je však ovlivněna environmentálním kontextem, ve kterém jsou podávány psychostimulační léky (46, 47). Například amfetamin nebo kokain podané v domácí kleci indukují bezprostřední časné geny (včetně Fos) přednostně v buňkách P-pozitivních látek, které koexprimují receptory D1. Naproti tomu tato léčiva mohou indukovat expresi Fos v MSN obsahujících D1 a D2 receptor, když jsou podávány v novém prostředí. Protokol použitý v našich současných studiích nezahrnoval párování injekcí s léčivým přípravkem s expozicí novému prostředí. Nelze však vyloučit určitý druh kontextuálně závislého stresu, který je zodpovědný za expresi AFosB v MSN obsahujících receptor D2.
Pozoruhodným rysem současných výsledků byl paralelní vzorec zvýšené hustoty páteře a exprese AFosB. Zvýšená hustota páteře a exprese AFosB se zpočátku vyskytovaly v MSN exprimujících Drd1-EGFP a Drd2-EGFP. Tyto změny však byly stabilní pouze u neuronů obsahujících receptor D1. Jedním z možných vysvětlení pozorování, že zvýšená hustota páteře a exprese AFosB byla přechodně nalezena v neuronech obsahujících receptor D2, je to, že k tomu došlo v malé frakci MSN, které koexprimují dopaminové receptory D1 a D2. Přechodná povaha těchto zvýšení může být tedy spojena s antagonistickými účinky aktivace receptoru D2 na signálních drahách závislých na D1 (48). Je zajímavé, že změny v hustotě páteře a expresi AFosB byly reverzibilní, což může odrážet schopnost signálních drah závislých na receptoru D2 ovlivňovat stabilitu AFosB.
Pozorování, že existují paralelní změny v expresi AFosB a hustoty páteře, je v souladu s myšlenkou, že AFosB se podílí na počáteční tvorbě a následném udržování dendritických páteří v neuronech obsahujících receptor D1 v NAcc. Exprese AFosB je řízena signální dráhou závislou na D1 / DARPP-32 / PP1 v MSN (49). Několik studií ukázalo, že AFosB hraje důležitou roli v odměňujících a lokomotoricky aktivačních činnostech psychostimulancií (39), pravděpodobně ovlivňováním exprese více genů, které zahrnují neurotransmiterové receptory, signální proteiny a proteiny podílející se na regulaci neuronální morfologie (50). Specifické molekulární mechanismy podílející se na chronické tvorbě páteře indukované kokainem však v současné době nejsou známy. Naše předchozí studie ukázaly, že intraakumální infúze inhibitoru Cdk5 roskovitinu oslabila zvýšení hustoty páteře vyvolané kokainem (51). Navíc Cdk5 je cílový gen pro downstream cíl pro AFosB a byl zapojen do kompenzačních adaptivních změn spojených s chronickou léčbou kokainem (52). Změny fosforylace závislé na Cdk5 jsou tedy hodnověrným mechanismem, který je základem tvorby kokainu a / nebo stability páteře. PAK (53), β-kateninu (54), PSD-95 (55) a spinofilinu (56) jsou substráty pro Cdk5 a všechny se podílejí na regulaci morfogeneze páteře (57-60). Další charakterizace těchto a dalších Cdk5 substrátů ve spinech doufejme vrhne světlo na mechanismy podílející se na regulaci tvorby páteře psychostimulanty.
Metody
Zvířata.
Myši nesoucí EGFP transgen pod kontrolou buď dopaminových receptorů D1 nebo D2 byly generovány Gensat BAC transgenním projektem (36). Transgenní myši použité v této studii byly staré 4 – 5 a byly na švýcarsko-websterském pozadí. Myši byly udržovány v cyklu 12: 12-h světlo / tma a byly umístěny ve skupinách přípravku 2 – 5 s jídlem a vodou dostupnou ad libitum. Všechny protokoly na zvířatech byly v souladu s National Institutes of Health Guide pro péči a použití laboratorních zvířat a byly schváleny Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee.
Léčba léků.
Chronická léčba kokainem (30 mg / kg, denně) vykazovala výrazné zvýšení hustoty páteře MSN v jádru i v shellu NAcc od potkanů, ale nižší dávka (15 mg / kg) zvýšila hustotu páteře pouze u skořápka (61). Proto jsme použili vyšší dávku kokainu k indukci strukturní modifikace v obou částech NAcc. Myši dostávaly jednu injekci (ip) 30 mg / kg kokain-HCl (nebo fyziologický roztok) každý den po dobu 5 po sobě následujících dnů, následovaly dny bez injekcí 2 a tento postup byl opakován po dobu 4 po sobě následujících týdnů. Injekce byly prováděny v domácí kleci. 2WD nebo 30WD, myší mozky byly zpracovány pro DiI značení a / nebo imunohistochemii.
Balistické značení s fluorescenčním barvivem DiI.
Myši byly anestetizovány 80 mg / kg pentobarbitalu sodného a perfundovány transkardiálně pomocí 5 ml PBS, s následnou rychlou perfuzí s 40 ml 4% paraformaldehydu v PBS (20 ml / min). Mozky byly rychle odstraněny z lebky a postfixovány v 4% paraformaldehydu pro 10 min. Řezy mozku (100 μm) byly značeny balistickou dodávkou fluorescenčního barviva DiI (Molecular Probes), jak je popsáno v ref. 38. Kombinovaná metoda DiI značení - imunohistochemie byla vyvinuta s nízkou koncentrací detergentu. Řezy značené diI byly permeabilizovány pomocí 0.01% Triton X-100 v PBS pro 15 min a pak inkubovány v 0.01% Triton X-100 a 10% normálním kozím séru v PBS pro 1 h, aby se minimalizovalo nespecifické značení. Tkáňové řezy pak byly inkubovány s 1% normálním kozím sérem / 0.01% Triton X-100 a anti-GFP protilátkou (Abcam, Cambridge, MA) pro 2 h při teplotě místnosti, promyty a inkubovány v 1: 1,000 ředění FITC- konjugované sekundární protilátky (Molecular Probes). Řezy byly umístěny na mikroskopické sklíčka a zakryty montážním médiem. Metoda balistického značení umožnila podrobnou analýzu struktury dendritické páteře a získané výsledky byly kvalitativně a kvantitativně srovnatelné s předchozími studiemi pomocí metody Golgiho-Coxovy impregnace v řezech mozku krysy (34). Nicméně, na rozdíl od předchozích studií, jsme zřídka pozorovali dvouhlavé páteře v neuronech barvených DiI. Tento rozdíl může být způsoben citlivostí metod barvení nebo variabilitou myší (tato studie) oproti tkáni potkanů (34).
Imunohistochemie.
Zvířata byla anestezována a perfundována, jak je popsáno výše. Mozky byly odstraněny a uloženy přes noc v 4% paraformaldehydu při 4 ° C. Mozky byly přeneseny do roztoku 30% sacharózy v roztoku PBS pro kryoprotekci. Koronální řezy (12 μm) byly rozříznuty na zmrazovacím mikrotomu (Leica) a poté zpracovány pro imunohistochemii. Části mozku byly pak permeabilizovány v 0.3% Triton X-100 v PBS pro 15 min a dvakrát promyty v PBS. Řezy byly preinkubovány v 10% normálním kozím séru v PBS pro 1 h při 37 ° C, vystaveny primárním protilátkám (zředěným v 1% normálním kozím séru v PBS) přes noc při 4 ° C, a pak promyty v PBS a inkubovány se sekundárním podáním. protilátky pro 1 h při 37 ° C. Byly použity následující protilátky: králičí anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), myší anti-NeuN (Chemicon), králičí anti-GFP, anti-králičí IgG konjugovaný s FITC a rhodaminem. konjugované anti-myší IgG (Molecular Probes). Pro trojité značení (AFosB, NeuN a GFP) byly části mozku nejprve imunoznačeny protilátkou anti-pan FosB a anti-NeuN protilátkou a poté inkubovány se sekundárními protilátkami (rhodaminem konjugovaný anti-králičí IgG a cyanem konjugovaný anti-myší IgG). ). Dvoubarevné mozkové řezy byly dále zpracovány pro GFP imunoznačení za použití technologie značení Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Protilátka anti-pan-FosB byla zvýšena na N konci FosB a rozpoznává AFosB a FosB plné délky (62). Na základě předchozích studií, které ukázaly, že po chronické léčbě kokainem je stabilně exprimován AFosB, ale ne FosB nebo jiné antigeny související s Fos, předpokládáme, že dlouhodobé zvýšení imunoreaktivity představuje stabilní expresi AFosB. Nicméně identita imunoreaktivního FosB signálu pozorovaného u myší ošetřených fyziologickým roztokem není známa. Statistická analýza v roce 2006. \ T Tabulka 1 použil Studentovy t test.
Analýza dendritické páteře.
Jednotlivé MSN v NAcc byly vybrány pro analýzu páteře na základě několika kritérií. (i) Došlo k minimálnímu nebo žádnému překrývání s jinými značenými buňkami, aby se zajistilo, že procesy z různých buněk nebudou zmateny. (ii) Aby byly buňky použity pro analýzu, musí být viditelné alespoň tři primární dendrity. (iii) Byly zkoumány distální dendrity (koncové dendrity nebo blízko koncového dendritu). Byly analyzovány dendrity z obou MSN v jádru a plášti NAcc. I když jsme pozorovali řídce spined MSN (ostnatý typ II), analyzovali jsme pouze hustě spined MSN (ostnatý typ I). Pro výpočet hustoty páteře byla pomocí konfokálního mikroskopu (Zeiss LSM 20) s čočkou s olejovou imerzí (× 510) sledována délka dendritu (> 40 μm dlouhá). Všechny obrázky dendritů byly pořízeny různě z úrovně (0.5 – 1 μm hloubkové intervaly) pro zkoumání morfologie dendritických páteří. Všechna měření byla provedena pomocí softwaru pro analýzu obrazu metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistická analýza použila Kolmogorov-Smirnovův test.
Výčnělky z dendritů byly rozděleny do čtyř typů na základě jejich délky, jak je popsáno v refs. 63 a 64. Výčnělky třídy 1, nazývané také podsadité výčnělky, byly <0.5 μm dlouhé, postrádaly velkou hlavu páteře a nezdálo se, že mají krk; třída 2, neboli hřibovité hřbety, byly mezi 0.5 a 1.25 μm dlouhé a vyznačovaly se krátkým krkem a velkou hlavou páteře; třída 3 nebo tenké trny, se pohybovaly mezi 1.25 a 3.0 μm a měly protáhlé krky páteře s malými hlavami; třída 4, nebo filopodiální rozšíření, byly dlouhé vláknité výčnělky, které postrádaly rozeznatelnou hlavu páteře.
Poděkování
Tato práce byla podpořena Grantem DA10044 (pro PG a ACN) a americkou nadací The Simons Foundation, nadací Petera J. Sharpa, nadací Picower a nadací FM Kirby Foundation.
Zkratky
- NAcc
- nucleus accumbens
- MSN
- středně velký ostnatý neuron
- BAC
- bakteriální umělý chromozom
- Drd1
- promotor dopaminového receptoru D1
- Drd2
- promotor dopaminového receptoru D2
- DiI
- 1,1′-diotadecyl-3,3,3®, 3®-tetramethylindokarbocyanin chloristan
- 2WD
- 2 dnů po poslední léčbě
- 30WD
- 30 dnů po poslední léčbě.
Reference
;
