Journal of Neuroscience, 6 září 2006, 26 (36): 9196-9204; doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1124-06.2006
Peter Olausson1, J. David Jentsch2, Natalie Tronsonová1, Rachel L. Neve3, Eric J. Nestler4, a Jane R. Taylor1
1.Korespondence by měla být adresována Jane R. Taylorové, katedře psychiatrie, divize molekulární psychiatrie, Lékařské fakultě Yale University, výzkumnému středisku Ribicoff Research Center, Mentálnímu centru pro zdraví v Connecticutu, 34 Park Street, New Haven, CT 06508.[chráněno e-mailem]
Abstraktní
Změny v motivaci byly zahrnuty v patofyziologii několika psychiatrických poruch, včetně zneužívání návykových látek a deprese. Je známo, že opakovaná expozice lékům zneužívání nebo stresu trvale indukuje transkripční faktor AFosB v nucleus accumbens (NAc) a dorzální striatum, předpokládané účinky přispívají k neuroadaptaci v signalizaci regulované dopaminem. Je však málo známo o specifickém zapojení AFosB do dysregulace chuťově motivovaného chování. Zde jsme ukázali, že indukovatelná nadměrná exprese AFosB v NAc a dorzální striatum bitransgenních myší, nebo specificky v NAc jádru potkanů použitím virově zprostředkovaného přenosu genů, zlepšila instrumentální výkon zesílený potravou a progresivní poměr reagující. Velmi podobné účinky na chování byly zjištěny po předchozí opakované expozici kokainu, amfetaminu, MDMA [(+) - 3,4-methylendioxymetamfetaminu] nebo nikotinu u potkanů. Tyto výsledky ukazují silnou regulaci motivačních procesů pomocí AFosB a poskytují důkazy o tom, že změny v genové expresi vyvolané léky prostřednictvím indukce AFosB v jádru NAc mohou hrát klíčovou roli v dopadu motivačních vlivů na instrumentální chování.
Úvod
Opakovaná expozice léku způsobuje časově dynamické změny v transkripci genů, které produkují trvalé neuroadaptace v rámci nucleus accumbens (NAc) (Nestler, 2004). Tato oblast mozku hraje rozhodující úlohu jak v procesu posilování drog, tak i v procesu přirozeného posilování (Kelley a Berridge, 2002), i když je málo informací o transkripčních faktorech, které ovlivňují chování motivované nondrugem, apetitivní zesilovače, jako jsou potraviny. AFosB je transkripční faktor aktivovaný v NAc a dorzálním striatu chronickou expozicí léku (Konradi et al., 1994; Nye a kol., 1995; Chen a kol., 1997; Pich a kol., 1997; Shaw-Lutchman a kol., 2003) a nutkavého chodu kola (Werme a kol., 2002). V těchto oblastech je také indukován několika formami chronického stresu (Perrotti a kol., 2004). Zlepšení procesů posilování léků spojených s indukcí striatálního AFosB je dobře zavedeno (Kelz a kol., 1999; Colby a kol., 2003; Zachariou a kol., 2006). Důsledky zvýšených hladin AFosB v těchto oblastech na instrumentální chování motivované přirozenými zesilovači však nejsou známy.
Výkon instrumentálních odpovědí je nezbytnou součástí chování užívajícího drogy, které se může stát dysregulovaným nebo nepružným, jak postupuje přechod k závislosti (Jentsch a Taylor, 1999; Berke a Hyman, 2000; Berridge a Robinson, 2003; Everitt a Robbins, 2005). NAc se podílí na mnoha aspektech instrumentálního chování s významem pro závislost (Balleine a Killcross, 1994; Corbit a kol., 2001; de Borchgrave et al., 2002; Di Ciano a Everitt, 2004b; Everitt a Robbins, 2005). Je proto pravděpodobné, že neuroadaptace vyvolané léky v rámci NAc by mohly ovlivnit výkon instrumentálních akcí. Chronická expozice kokainu ve skutečnosti posiluje instrumentální výkon zesílený sacharózou (Miles et al., 2004) a manipulace s myšlenkou blokovat neuroplasticitu v jádru NAc, včetně inhibice PKA (proteinkinázy A) nebo syntézy proteinů, interferují s instrumentálními odpověďmi odměněnými potravinami (Baldwin a kol., 2002a; Hernandez a kol., 2002). Jádro NAc také zprostředkovává motivační vliv podmíněných vlivů na instrumentální chování (Parkinson a kol., 1999; Corbit a kol., 2001; Hall a kol., 2001; Di Ciano a Everitt, 2004a; Ito a kol., 2004), poskytující neurobiologický substrát, přičemž indukce AFosB by mohla silně ovlivnit instrumentální výkon a motivaci pro apetitivní zesilovače, jako jsou potraviny, voda nebo léky zneužívající.
Zde jsme zkoumali účinky AFosB na potravinově motivované instrumentální chování pomocí dvou komplementárních genetických přístupů: (1) indukovatelná nadměrná exprese AFosB v NAc a dorzálním striatu bitransgenních myší (NSE-TA × TetOp-AFosB) a (2) nadexprese FosB v NAc jádru specificky použitím genového přenosu zprostředkovaného viry u potkanů. Rovněž jsme hodnotili, zda by předchozí opakovaná expozice kokainu, amfetaminu, (+) - 3,4-methylendioxymetamfetaminu (MDMA) nebo nikotinu, za podmínek, o nichž se uvádí, že zvyšují AFosB, posílila instrumentální odezvu zesílenou potravou a / nebo motivaci pomocí progresivního poměru, jak bylo prokázáno u samopodniků zesílených drogami (Horger a kol., 1990, 1992; Piazza a kol., 1990; Vezina a kol., 2002; Miles et al., 2004). Naše výsledky ukazují trvalé účinky AFosB na instrumentální chování a naznačují, že tento transkripční faktor může působit v NAc jádru jako regulátor motivační funkce.
Materiály a metody
Zvířata a péče o zvířata
Experimentálně naivní krysy Sprague Dawley byly získány od Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Mužské bitransgenní myši 11A byly odvozeny z křížení mezi homozygotními transgenními myšmi exprimujícími neuronově specifickou enolázu (NSE) -tTA tetracyklin transaktivátorový protein (linie A) a myši exprimující TetOp (promotor citlivý na tetracyklin) -FosB (linie 11); rodičovské linie byly udržovány na pozadí smíšeného původu (50% ICR a 50% C57BL6 × SJL) (Chen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999). Tyto bitransgenní myši 11A exprimují AFosB pouze tehdy, když: (1) jsou oba transgeny přítomny ve stejné buňce a (2) transkripční aktivace tTA není inhibována přítomností tetracyklinových antibiotik, jako je doxycyklin. Podávání doxycyklinu těmto myším může tedy vykazovat časovou kontrolu nad expresí AFosB a může být použito k zabránění exprese během vývoje; podávání doxycyklinu je spojeno s žádnou detekovatelnou expresí úniku AFosB (Chen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999). Kromě toho byla pro předkládané experimenty vybrána řada bitransgenních myší 11A, protože vykazují expresní vzor, který je primárně omezen na striatální neurony obsahující dynorfin (jak NAc, tak dorzální striatum), velmi podobný vzoru indukce AFosB chronickým lékem. expozice (Kelz a kol., 1999). Kvantifikace této striatální exprese AFosB byla navíc kvantifikována dříve (Chen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999). Myši byly generovány na University of Texas Southwestern a udržovány a testovány v zařízeních Yale. V průběhu gestace a vývoje byly všechny myši udržovány doxycyklinem až do doby, kdy 8 – 9 týdnů stáří v koncentraci 100 μg / ml v pitné vodě, což je stav, o němž je známo, že udržují transgeny řízené TetOp v „vypnutém“ stavu a používají počáteční 6. týdnů mimo doxycyklin, když se exprese AFosB stane maximální (Kelz a kol., 1999). Všechny experimenty zahrnovaly srovnání bitransgenních myší v porovnání s doxycyklinem, což samo o sobě nemá žádný vliv na motivované chování (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003; Zachariou a kol., 2006).
Všichni experimentální jedinci byli chováni ve dvojicích (krysy) nebo ve skupinách (myši, čtyři až pět v kleci) za řízených teplotních a vlhkostních podmínek v cyklu 12 h světlo / tma (světlo na 7: 00 AM a vypnuto na 7: 00 ODPOLEDNE). Před jakoukoli studií jim bylo povoleno alespoň 7 d přizpůsobit se bytovým zařízením. Zvířata měla po celou dobu ad libitum přístup k vodě a omezený přístup k potravě, jak je popsáno níže. Všechna zvířata byla provedena v souladu s National Institutes of Health Guide pro péči a použití laboratorních zvířat a byla schválena Výbory pro péči o zvířata a použití na University of Texas Southwestern a Yale University.
Drogy
Hydrochlorid kokainu [laskavě poskytl Národní institut pro zneužívání drog (NIDA)], sulfát d-amfetaminu (Sigma, St. Louis, MO), hydrochlorid MDMA (laskavě poskytnutý NIDA) a hydrogenuhličitan nikotinu (Sigma ) byly rozpuštěny ve sterilním fyziologickém roztoku (0.9%) a injikovány intraperitoneálně v objemu 5 ml / kg (myši) nebo 2 ml / kg (krysy). PH roztoku nikotinu bylo upraveno hydrogenuhličitanem sodným před injekcí.
Virové vektory
Virově zprostředkovaný přenos genů byl prováděn tak, jak bylo popsáno výše (Carlezon a kol., 1998; Perrotti a kol., 2004). Stručně řečeno, cDNA kódující specifické proteiny byly vloženy do amplikonu viru herpes simplex (HSV) HSV-PrPUC a zabaleny do viru pomocí pomocného 5dl1.2. Vektory, které řídí expresi buď HSV-LacZ, kódující kontrolní protein p-galaktosidázu, nebo HSV-AFosB, kódující AFosB, byly následně infundovány do NAc jádra podle experimentálního protokolu.
experimentální procedura
Obrys.
Experiment 1 zkoumal účinky předchozí opakované expozice léku na přístrojově zesílený přístrojový výkon a progresivní poměr. Krysy byly náhodně rozděleny do pěti experimentálních skupin (n = 9 – 10 / skupina). Tyto skupiny dostávaly dvakrát denně injekce (intraperitoneálně; u 9: 00 AM a 5: 00 PM) fyziologickým roztokem nebo jedním z následujících léků: nikotin, 0.35 mg / kg; MDMA, 2.5 mg / kg; kokain, 15 mg / kg; nebo amfetamin, 2.5 mg / kg pro 15 po sobě následující dny. Dávky byly vybrány na základě našich dříve publikovaných údajů (Taylor a Jentsch, 2001; Olausson a kol., 2003) a léčebně indukovaná lokomotorická stimulace byla sledována v průběhu dnů léčby 1 a 15. Po 5 d odběru byla zvířata trénována na instrumentální reakci po 10 po sobě jdoucích dnech a následně testována na progresivní poměr reagující na další den. Dvě zvířata byla ze statistické analýzy vyloučena, protože nezískala instrumentální odezvu, takže na každé ze tří závěrečných tréninkových tréninků nebylo více než jedna aktivní páková odpověď.
Experimenty 2 a 3 zkoumaly vliv indukovatelné striatální nadměrné exprese AFosB u bitransgenních myší na instrumentální výkon a reagovaly na progresivní poměr zesílení. Indukovatelná nadměrná exprese AFosB u těchto myší byla dříve prokázána jako napodobující účinky opakované expozice léku v paradoxech lokomotorické aktivity a podmíněných preferencí (Kelz a kol., 1999; Zachariou a kol., 2006). Tyto myši mohou poskytnout kritické informace o příspěvku striatálního AFosB ke specifickým procesům chování. Samci myší s genotypem byli udržováni na doxycyklinu nebo byli převedeni na vodu z vodovodu ve věku 8 týdnů. Experimenty byly zahájeny po 6 týdnech po vysazení doxycyklinu, kdy je exprese transgenu maximální (Kelz a kol., 1999). V experimentu 2 byla zvířata (n = 16) omezena na potravu a trénována na níže popsaný instrumentální postup (viz níže, Instrumentální reakce a progresivní poměrové testování) po 10 po sobě jdoucích dnech. Po dokončení instrumentálního testování byla u těchto myší hodnocena lokomoční stimulace vyvolaná kokainem. V experimentu 3 byla oddělená skupina myší (n = 18) trénována na instrumentální odezvu pro 10 po sobě následující dny za podmínek, během kterých bylo podáno maximum 50 zesilovačů. V den 11 byly všechny myši testovány na progresivní poměr. V den 12 jsme určili účinky devalvace zesilovače prefeeding na progresivní poměr reagovat.
Experimenty 4 a 5 zkoumaly účinky virově zprostředkované nadměrné exprese AFosB specificky v NAc. Experiment 4 testoval účinky nadměrné exprese AFosB na instrumentální výkon. Zde byly krysy infuzovány HSV-AFosB (n = 8) nebo HSV-LacZ (n = 8) do NAc jádra a byly trénovány na instrumentální proceduře začínající 40 h později. Po denních trénincích 10 byly stanoveny základní hladiny aktivity pro všechna zvířata v zařízení pro monitorování lokomotorické aktivity, jak je popsáno níže (viz níže, lokomotorická aktivita). Experiment 5 vyhodnotil účinky NAc AFosB nadměrné exprese specificky na progresivní poměr reagující. Zde byly krysy nejprve trénovány na 15 po sobě jdoucí dny, přiřazené experimentálním skupinám a následně infundovány HSV-AFosB (n = 8) nebo HSV-LacZ (n = 7) v NAc jádru. Zvířata byla ponechána netestovaná a neošetřená pro 4 d, aby se umožnilo expresi AFosB na vrchol. V den 5 po infuzi byla všechna zvířata testována na pákové stlačení na postup progresivního poměru. Po posledním dni testování byly všechny krysy usmrceny a umístění infuzních kanyl do NAc jádra bylo histochemicky ověřeno. Na základě umístění infuzních kanyl byly dvě krysy vyloučeny z experimentu 4 a jednoho potkana z experimentu 5.
Charakterizace genové exprese byla provedena v oddělené skupině zvířat. Zde byl HSV-LacZ infundován do NAc jádra a zvířata byla později usmrcena 3 d. Exprese p-galaktosidázy byla následně hodnocena imunohistochemicky.
Pohybová aktivita.
Lokomotorická aktivita byla měřena za použití měřičů aktivity (Digiscan zvířecí aktivita; Omnitech Electronics, Columbus, OH). Měřiče aktivity byly vybaveny dvěma řadami infračervených fotosenzorů, přičemž každá řada se skládala z 16 senzorů umístěných od sebe 2.5 cm. Měřiče aktivity byly řízeny a data z měřičů aktivity shromážděných počítačem PC pomocí softwaru Micropro (Omnitech Electronics).
Pokusná zvířata byla umístěna do průhledných plastových boxů (25 × 45 × 20 cm), které byly vloženy do měřičů aktivity. Zvířata byla původně ponechána navyknout na záznamové zařízení lokomotorické aktivity pro 30 min. V některých experimentech byla zvířata následně odebrána, injikována kokainem, amfetaminem, nikotinem nebo vehikulem podle experimentálního designu a umístěna zpět do krabic. Lokomotorická aktivita byla pak zaznamenána pro 60 min, počínaje 5 min po injekci léku, aby se zabránilo nespecifické injekčně indukované hypermotilitě. Všechny experimenty byly prováděny během světelné fáze zvířat (mezi 9: 00 AM a 6: 00 PM).
Instrumentální reakce a progresivní zkoušení poměru.
Instrumentální odpověď byla hodnocena s použitím standardních operačních komor pro krysy (30 × 20 × 25 cm) nebo myší (16 × 14 × 13 cm) řízených softwarem MedPC (Med Associates, St. Albans, VT). Každá komora byla umístěna ve zvukotěsné vnější komoře vybavené generátorem bílého šumu a ventilátorem pro snížení dopadu vnějšího hluku. Na zadní stěně svítilo osvětlení domu. Zásobník pelet dodal potravinové pelety (20 nebo 45 mg; Bio-Serv, Frenchtown, NJ) jako výztuhu do zásobníku. Vstupy hlavy byly detekovány fotobuňkou namontovanou nad nádobou zesilovače. V tomto časopise bylo podnětné světlo. U potkanů byla na každé straně zásobníku umístěna jedna páka. Pro myši byly na zadní stěně komor umístěny dva otvory pro nosní trysky (tj. Naproti zásobníku pro výztuž).
Během 5 d bezprostředně před začátkem tréninku byla zvířata omezena na 90 min přístup k potravě denně a vystaveny potravinovým peletám na bázi obilí (myši, 20 mg; krysy, 45 mg) v jejich domácích klecích. Během zkušebního období byly potravinové pelety přerušovaně dostupné v operačních komorách podle protokolu chování (viz níže), stejně jako v neomezeném množství v domácí kleci pro 90 min, počínaje 30 min po denní testovací relaci. Tento plán přístupu k potravinám umožňuje každému jednotlivému zvířeti dosáhnout individuálního bodu sytosti a snižuje variabilitu způsobenou konkurencí mezi dominantními a podřízenými zvířaty. V našich rukou tento rozvrh umožňuje pomalý přírůstek hmotnosti po počátečním úbytku hmotnosti ~85 – 90% hmotnostních hodnot volného krmení. Hmotnosti zvířat byly monitorovány v průběhu experimentu.
Všichni pacienti byli zpočátku zvyklí na testovací přístroj pro 2 d; během těchto zasedání, potravinové pelety byly dodány do časopisu výztuže na pevném časovém plánu 15 (FT-15). Počínaje příštím dnem absolvovali subjekty denní trénink pro 10 po sobě následující dny. Reakce na potraviny byla testována na základě dříve publikovaných instrumentálních procedur (Baldwin a kol., 2002b). Reakce na správnou (tj. Aktivní) páku / nosepoke byla posílena, zatímco reakce na jinou (neaktivní) páku / nosní páku neměla žádné naprogramované důsledky. Poloha aktivní nosní špičky nebo páky (vlevo / vpravo) byla vyvážena pro všechny experimentální skupiny. Dokončení požadavku na odezvu (viz níže) vedlo k nástupu světelného stimulu časopisu, následovaného 1em později dodáním jediné potravinové pelety. O dvě sekundy později bylo světlo podnětu vypnuto. První zesilovače 10 byly získány po úspěšném dokončení reakce podle plánu pevných poměrů (FR1), po kterém byly pelety dostupné po reakci na rozvrh variabilního poměru (VR2). Relace trvala pro 15 min.
Experimenty 3 (myši) a 5 (krysy) používaly alternativní tréninkové plány, aby se zabránilo potenciálnímu dopadu rozdílů v instrumentální výkonnosti během tréninku na následnou reakci progresivního poměru (podrobněji níže). V experimentu 3 byly myši trénovány na programu FR1 pro 2 d a pak na plánu FR2 pro 8 d. První 3 d testování použilo 60 min session. V posledních 7 tréninkových dnech byla relace ukončena, když byly získány 50 zesilovače. V experimentu 5, krysy byly trénovány na FR1 / VR2 plánu v 15 min relacích, jak je popsáno výše pro všechny ostatní experimenty se dvěma výjimkami. Nejprve byl dodán maximální počet 150 pelet / session. Za druhé, tato zvířata dostávala 5 další dny tréninku (tj. Celkem 15 d), aby se umožnilo stanovení stabilního výkonu před jakoukoliv experimentální manipulací.
Zvířata byla také testována na reakci na potravu na progresivním rozvrhu zesílení. V tomto testu byl požadavek na odpověď na získání potravy zahájen jako plán FR1, ale postupně se zvyšoval pomocí 2 za účelem získání následného zesilovače (tj. Odpovědí 1, 3, 5, 7, X + 2). V experimentu s léky na léky používající krysy byl program 5 postupně zvyšován, což poskytlo konečný plán 1, 6, 11, 16…, X + 5. Všechny ostatní parametry byly udržovány identické s výše popsaným tréninkovým postupem. Test byl ukončen, když nebyla provedena žádná aktivní odezva pro 5 min.
Devalvace zesilovače.
Účinek devalvace výztuže byl zkoumán s použitím prefeedingu specifického pro výztuž. V tomto případě bylo myši ponecháno jíst neomezené potravinové pelety na bázi obilí ve své domovské kleci během 3 h před testováním na progresivním poměru výztuže, jak je popsáno výše.
Chirurgické techniky.
Zvířata byla anestetizována použitím Equithesinu [směs obsahující pentobarbital (35 mg / kg) a chloralhydrát (183.6 mg / kg) v ethanolu (10% obj./obj.) A propylenglykolu (39% obj./obj.); podávány při 4.32 ml / kg, ip]. Kanyly (Plastics One, Roanoke, VA) byly chirurgicky implantovány zaměřené nad NAc jádrem za použití Kopf stereotaktického vybavení. Stereotaktické souřadnice použité vzhledem k bregma byly následující: anterior / posterior, + 1.5 mm; laterální / mediální, ± 1.5 mm; ventrální / hřbetní, −6.0 mm (Paxinos a Watson, 1986). Kanyly byly ukotveny k lebce pomocí šroubů a dentálního cementu. Do vodicích kanyl se umístily překážky, aby se zabránilo zablokování. Po operaci byla zvířata podrobena standardní pooperační péči a byla ponechána zotavit se pro 5 d před zahájením jakéhokoliv experimentu.
Infuze.
Intracerebrální infuze virových vektorů byly prováděny bilaterálně 40 h před nástupem tréninku (viz níže). Injekční stříkačky (měrka 31), rozprostírající se 1 mm pod špičkou vodicích kanyl, byly pomalu spouštěny současně do levého a pravého NAc a 1.0 μl / strana byla podána infuzí po dobu 4 min rychlostí infuze 0.25 μl / ml. min za použití mikroinfúzní pumpy (PHD-5000; Harvard Apparatus, Holliston, MA). Infuzní jehly byly ponechány na místě pro 1 min po dokončení infuze a figuríny byly nahrazeny. Umístění kanyly bylo histologicky ověřeno po dokončení behaviorálních experimentů (viz obr. 6B) a do statistické analýzy experimentálních dat byly zahrnuty pouze zvířata se správně umístěnými kanylami.
Histologické analýzy a imunoznačení.
Po dokončení experimentů byla zvířata, která byla součástí experimentu, anestetizována Equithesinem a perfundována transkardiálně pomocí 0.1 m PBS (5 min) a 10% formalinu (10 min) podle standardních postupů. Mozky byly postfixovány ve formalinu a následně umístěny do fosfátem pufrovaného roztoku sacharózy (30%). Všechny mozky pak byly řezány v řezech 40 μm na mikrotomu a použity pro histologické analýzy umístění kanyly a exprese proteinu.
Umístění kanyly bylo provedeno v řezech kontrastně zbarvených neutrální červenou barvou a umístěných na mikroskopických sklíčkách v plastifikátoru distyrenu a xylenu (DPX) po dehydrataci ethanolem. Imunohistochemie byla provedena, jak bylo popsáno výše (Hommel a kol., 2003). Stručně řečeno, exprese p-galaktosidázy po infuzi HSV-LacZ byla stanovena imunofluorescenčním barvením použitím kozí anti-p-galaktosidázové primární protilátky (1: 5000; Biogenesis, Kingston, NH). Po inkubaci přes noc byly řezy promyty a následně inkubovány s fluorescenční oslí anti-kozí sekundární protilátkou konjugovanou s Cy2 (1: 200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Řezy se opět promyjí, následuje dehydratace ethanolem a montáž v DPX. Sousední kontrolní sekce byly ošetřeny identicky bez zahrnutí primárních protilátek. Imunofluorescence byla hodnocena při 520 nm za použití a Zeiss (Oberkochen, Německo) mikroskop s FITC filtrem a snímky pořízené při stejných expozičních časech Zeiss Digitální zobrazovací systém Axiovision.
Statistika
Data ze všech experimentů byla hodnocena pomocí jedno-, dvou- nebo třícestné ANOVA následované Scheffeho nebo Dunnettovým post hoc testem, případně korigovaným na mnohonásobná srovnání pomocí Holmova testu postupného odmítnutí. Hodnota p ≤ 0.05 byla považována za statisticky významnou.
výsledky
Experiment 1: účinky opakované expozice léku na přístrojový výkon a reagování na progresivní poměr
Abychom potvrdili, že naše opakované paradigma vystavení účinkům léků produkuje funkčně významné neuroadaptace, nejprve jsme hodnotili lokomotorickou senzibilizaci jako prototypové behaviorální měřítko chronického účinku léků. Krysy dostaly dvakrát denně injekce nikotinu (0.35 mg / kg), MDMA (5 mg / kg), kokainu (15 mg / kg) nebo amfetaminu (2.5 mg / kg) a lokomotorická aktivita byla testována po první injekci. dny léčby 1 a 15 (doplněk Obr. 1A – E, k dispozici na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál). Statistická analýza odhalila signifikantní léčbu interakcí ve dne (F(4,42) = 9.335; p ≤ 0.0001). S výjimkou MDMA (p = 0.62) vyvolaly všechny léky signifikantně větší lokomotorickou aktivitu (tj. Senzibilizaci) v den 15 ve srovnání se dnem 1 (nikotin, p ≤ 0.001; kokain, p ≤ 0.001; amfetamin, p ≤ 0.01). Opakované injekce fyziologického roztoku neměly žádný účinek. Žádná z léčebných léků nezměnila základní lokomotorickou aktivitu měřenou během období návyku v den 15 (doplněk Obr. 2A, dostupný na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál).
Pět dní po poslední injekci léku jsme zkoumali účinky předchozího opakovaného vystavení nikotinu, MDMA, kokainu nebo amfetaminu na potravinové chování posílené potravou. Data jsou uvedena pro každý lék samostatně v Obrázek 1A – H s použitím stejné kontrolní skupiny fyziologického roztoku pro srovnání. Zjistili jsme, že předchozí expozice každé z těchto léků významně a selektivně zvýšila potravinové zesílení zesílené potravou (léčba pákou tréninkového dne, F(36,378) = 1.683; p <0.01; post hoc analýza: nikotin, p <0.01; MDMA, p <0.05; kokain, p <0.01; amfetamin, p <0.001). Trvalé zvýšení instrumentální odpovědi pozorované při asymptotickém výkonu naznačovalo možné zvýšení motivace v souladu s dříve hlášeným zvýšením po opakované psychostimulační expozici (viz Diskuse). Proto jsme testovali, zda předchozí opakovaná expozice léku zvýšila motivaci pomocí progresivního rozvrhu. Byl zjištěn statistický účinek předchozí expozice léku na reakci na aktivní páku (léčba pákovou interakcí, F(4,42) = 3.340; p ≤ 0.05) (Obr. 2A) stejně jako konečný bod zlomu (F(4,42) = 5.560; p ≤ 0.001) (Obr. 2B). Další analýza ukázala, že všechny léčby zvýšily jak počet aktivních odpovědí (nikotin, p <0.001; MDMA, p <0.05; kokain, p <0.001; amfetamin, p <0.001) a bod zlomu (nikotin, p <0.001; MDMA , p ≤ 0.01, kokain, p ≤ 0.0001, amfetamin, p ≤ 0.0001) konzistentní s účinkem těchto léčeb na motivaci. Vzhledem k nedostatečnému účinku léčiv na základní lokomotorickou aktivitu a nedostatečnému účinku na inaktivní pákové lisy je nepravděpodobné, že zvýšená reakce na potraviny za těchto podmínek odráží nespecifické zvýšení motorické aktivity.
Obrázek 1.
Účinek předchozích opakovaných injekcí nikotinu (0.35 mg / kg), MDMA (2.5 mg / kg), kokainu (15 mg / kg) nebo amfetaminu (2.5 mg / kg) dvakrát denně pro 15 d na následné instrumentální chování. Zvířata byla testována společně, ale z důvodu přehlednosti jsou účinky každého léčiva prezentovány odděleně za použití stejné kontrolní skupiny ošetřené fyziologickým roztokem. A (aktivní reakce) a B (neaktivní reakce) ukazují účinky předchozí expozice nikotinu; C, D, MDMA; E, F, kokain; G, H, amfetamin. Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM.
Obrázek 2.
Vliv předchozí opakované léčby (dvakrát denně, 15 dní) fyziologickým roztokem, nikotinem (0.35 mg / kg), MDMA (2.5 mg / kg), kokainem (15 mg / kg) nebo amfetaminem (2.5 mg / kg) na instrumentální odpověď na progresivním poměrovém rozvrhu výztuže. Data jsou reprezentována jako průměr ± SEM. *** p <0.001; ** p <0.01; * p <0.05. Sal, fyziologický roztok; Nic, nikotin; Coc, kokain; Amph, amfetamin; PR, progresivní poměr.
Předchozí expozice léku také neměla žádný vliv na tělesnou hmotnost zaznamenanou před omezením potravy, na první nebo poslední den instrumentálního tréninku nebo bezprostředně před testem progresivního poměru (doplněk Obr. 2B, dostupný na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál). Omezený přístup k potravinám pro 3 d zpočátku snížil tělesnou hmotnost v průměru na 91 – 92% hmotnosti krmiva. Na konci behaviorálního testování se váhy vrátily na 97 – 99% předčasné tělesné hmotnosti a nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi zvířaty vystavenými léčivu a zvířaty ošetřenými fyziologickým roztokem. Změny tělesné hmotnosti a rozdíly v hladu nebo chuti k jídlu by tedy neměly významně přispívat k pozorovanému posílení instrumentálního výkonu nebo motivace.
Experiment 2: indukovatelná nadměrná exprese AFosB u bitransgenních myší; instrumentální výkon
Dále jsme zkoumali, zda byla také zvýšena instrumentální výkonnost u bitransgenních myší, které indukovatelně zvýšily expresi AFosB s výraznou selektivitou v NAc a dorzálním striatu (Kelz a kol., 1999). V tomto experimentu byly myši s nadměrnou expresí AFosB srovnávány s kontrolami u samců, kteří nadměrně exprimovali AFosB, protože jsou udržovány na doxycyklinu (viz Materiály a metody). Zjistili jsme, že nadměrná exprese AFosB významně zvýšila odezvu zesílenou potravou (genová exprese pákou tréninkového dne, F(9,126) = 3.156; p ≤ 0.01) (Obr. 3A). Počet nosepoke odpovědí provedených v neaktivním otvoru se mezi oběma skupinami nelišil (Obr. 3B). Tyto údaje společně ukazují, že nadměrná exprese AFosB v NAc a dorzální striatum selektivně zvyšovala instrumentální výkon
Obrázek 3
Účinek indukovatelné nadměrné exprese striatu AFosB u bitransgenních myší na instrumentální výkon. A, Aktivní reakce. B, Neaktivní reakce. Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM.
Aby se vyloučilo, že zvýšení instrumentálního výkonu u zvířat s nadměrnou expresí AFosB by mohlo být vysvětleno změnami chuti k jídlu nebo hladu, byla tělesná hmotnost zaznamenána před omezením potravy a v prvním a posledním dni tréninku. AFosB neměl žádný vliv na tělesnou hmotnost před omezením potravy, ani nebyl ovlivněn tělesná hmotnost během behaviorálního testování. Omezený přístup k potravinám pro 3 d snížil tělesnou hmotnost v průměru na 87 – 89% volných krmných dávek. Na konci behaviorálního testování byly hmotnosti zvířat 97 – 99% předběžně tělesných hmotností, s ekvivalentními změnami pozorovanými u AFosB a kontrolních myší (doplňkové Obr. 3A, dostupné na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál). Je tedy nepravděpodobné, že by potenciální účinky nadměrné exprese AFosB na hlad nebo chuť k jídlu mohly odpovídat za zlepšení pozorované instrumentální reakce.
Když bylo dokončeno testování na instrumentálním výkonu, nadměrná exprese AFosB nezměnila základní lokomotorickou aktivitu měřenou během periody 30 min (doplněk Obr. 3B, dostupný na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál). Toto pozorování podporuje názor, že nespecifická změna aktivity neprispívá ke zlepšenému instrumentálnímu výkonu pozorovanému u těchto zvířat. Bylo však popsáno, že bitransgenní myši s nadměrnou expresí AFosB vykazují zvýšenou lokomoční reakci na akutní a opakovaný kokain (Kelz a kol., 1999). Vzhledem k tomu, že jsme použili mírně odlišný plán vysazení z doxycyklinu k indukci genové exprese (6 týdny s omezením potravy), rozhodli jsme se tento fenotyp potvrdit. Myši s nadměrnou expresí AFosB prokázaly významně větší zvýšení lokomotorické aktivity při injekci kokainu ve srovnání s jejich kontrolami v souběžné době na doxycyklinu (léčba genovou expresí, F(1,44) = 4.241; p ≤ 0.05) (doplněk Obr. 3C, k dispozici na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál).
Experiment 3: indukovatelná nadměrná exprese AFosB u bitransgenních myší; progresivní poměr
Vzhledem k tomu, že předchozí expozice léku indukuje striatální ΔFosB (Nestler a kol., 2001) a bylo zjištěno, že se zde zvyšuje progresivní poměr reakce, dále jsme testovali, zda transgenní striatální nadměrná exprese AFosB také zvyšuje výkonnost na progresivním poměru zesílení. Nová skupina myší byla vycvičena na instrumentální reakci za podmínek (viz Materiály a metody), které nevytvořily významné rozdíly v instrumentálním výkonu před testováním na progresivní poměr reagující (F(1,16) <1). V testu progresivního poměru jsme však pozorovali významnou genovou expresi interakcí páky (F(1,16) = 5.30; p ≤ 0.05) (Obr. 4A) a zjistili, že myši s nadměrnou expresí AFosB, ve srovnání s kontrolními myšmi, které byly ošetřeny na soutermate, udržovány na doxycyklinu, dosáhly většího počtu aktivních odpovědí (p <0.05), zatímco počet neaktivních reakcí páky nebyl odlišný. Nadměrně exprimované myši AFosB také dosáhly vyššího bodu zlomu (F(1,16) = 5.73; p ≤ 0.05) (Obr. 4B). Tato data naznačují, že podobně jako u předchozí psychostimulační expozice, i nadvýrazná exprese FSosB zvyšuje motivaci. Protože počet neaktivních odpovědí nebyl u myší s nadměrnou expresí AFosB změněn, není pravděpodobné, že by nespecifické zvýšení aktivity přispělo k těmto účinkům. Tento pohled byl dále podpořen stanovením základní lokomotorické aktivity, ve které nebyl žádný rozdíl mezi myšmi nadměrně exprimujícími AFosB a kontrolní myši s mláďaty, které byly udržovány na doxycyklinu. Žádné hrubé rozdíly v tělesné hmotnosti mezi zvířaty s nadměrnou expresí AFosB a kontrolními zvířaty nebyly patrné, jak bylo měřeno v den testu. Ačkoliv zvířata s nadměrnou expresí AFosB budou vydávat instrumentální reakce s vyšším obsahem potravy, nezdá se, že by spotřebovávaly více potravin, pokud jsou volně dostupné. Nejpravděpodobnějším vysvětlením pro toto pozorování je, že ačkoli motivace určuje, jak těžké zvíře bude pracovat, aby získal zesilovač, mnoho dalších faktorů (chuť k jídlu, sytost, metabolický stav atd.) Ovlivňuje krmné chování a skutečnou spotřebu potravin.
Obrázek 4.
Účinek indukovatelné nadměrné exprese FosB u bitransgenních myší na instrumentální reakci podle progresivního poměrového harmonogramu zesílení před a po znehodnocení zesilovače vyvolané sytostí. A, B, základní linie: reakce páky (A), bod zlomu (B). C, D, Po devalvaci výztuže: reakce páky (C), bod zlomu (D). Data jsou reprezentována jako průměr ± SEM. * p <0.05.
BitFgenové myši AFosB zde použité exprimují AFosB v celém striatu. Zatímco ventrální striatum (včetně NAc) bylo zapojeno do motivačních procesů, dorsální striatum je argumentováno, že se podílí na získání instrumentálních návyků (Yin a kol., 2004; Faure et al., 2005). I když jsme nezaznamenali rozdíly v instrumentální výkonnosti během tréninkové fáze s použitím nízkého poměrového schématu s maximálními limity zesílení, podmínek relativně odolných vůči vývoji instrumentálních návyků (Dickinson, 1985), je možné, že stanovení návyků by mohlo ovlivnit reakci podle harmonogramu progresivního poměru. Tato možnost byla testována přímo vyhodnocením vlivu devalvace zesilovače prefeedingem na progresivní poměr. Takové prefeeding eliminovalo účinek AFosB na progresivní poměr reagující, bez rozdílů v reagujících nebo zlomových bodech pozorovaných mezi AFosB-overexprimujícími a kontrolními myšmi (F(1,16) <1) (Obr. 4CD). Tyto údaje společně naznačují, že nadměrná exprese FosB v striatální struktuře nemění citlivost na změny hodnoty odměřených výsledků při použití tohoto testovacího plánu. Spíše se zdá, že instrumentální reakce pozorovaná v testu progresivního poměru je cílená a zvýšený bod zlomu pozorovaný u myší s nadměrnou expresí AFosB je pravděpodobně způsoben zvýšenou motivací a nikoli zvýšenou reakcí podobnou návyku.
Experiment 4: virově zprostředkovaná nadměrná exprese AFosB v NAc jádru: instrumentální výkon
Pro posouzení, zda by nadměrná exprese AFosB selektivně v NAc mohla odpovídat za chování pozorované u bitransgenních myší, jsme infuzí HSV-AFosB nebo HSV-LacZ jako kontroly selektivně do NAc jádra krys a studovali účinek této manipulace na potravu. - posílené instrumentální výkony (Obr. 5A, B). Po tréninku časopisu byl HSV-AFosB nebo HSV-LacZ infuzován do NAc jádra 40 h před zahájením behaviorálního testování. Umístění infuze a rozsah genové exprese zprostředkované viry jsou uvedeny v. \ T Obrázek 6, A a B. NAc infúze HSV-AFosB způsobily trvalé zvýšení počtu aktivních odpovědí (genová exprese pákou, F(1,12) = 8.534; p ≤ 0.05) (Obr. 5A), který přetrvával v průběhu experimentu. Tyto účinky byly selektivní, protože nebyly pozorovány žádné významné účinky nadměrné exprese AFosB v rámci NAc jádra na počet neaktivních odpovědí (Obr. 5B) nebo na základní lokomotorické aktivitě zaznamenané den po dokončení experimentu (data nejsou uvedena). Nadměrná exprese AFosB v NAc tak napodobila behaviorální účinky předchozí expozice léku nebo nadměrnou expresi striatálního delta AFosB.
Obrázek 5.
Vliv infuzí HSV-AFosB do NAc jádra před tréninkem na instrumentální reakci. A, Aktivní reakce. B, Neaktivní reakce. Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM.
Obrázek 6.
A, Umístění míst infuze pro experimenty s virovým vektorem. Nahoru, naplněné černé kruhy odpovídají zamýšlenému místu infuze. Pouze infuze do ∼0.5 mm této oblasti (tj. Uvnitř jádra NAc), jak je naznačeno kruhem, byly považovány za přijatelné. Zvířata s infuzí vyrobenými mimo tuto oblast byla ze statistických analýz vyloučena. Dolní část, místo infuze uvnitř NAc u reprezentativního zvířete. B, Imunohistochemické ověření exprese proteinu po infuzi HSV-LacZ. Horní panely ukazují expresi p-galaktosidázy v jádru NAc (2.5 a 10 × zvětšení). Spodní panely demonstrují nedostatek imunofluorescence v sousedních kontrolních řezech za použití stejného imunohistochemického postupu bez zahrnutí primární protilátky.
Experiment 5: virově zprostředkovaná nadměrná exprese AFosB v NAc jádru: progresivní poměr
Konečný experiment přímo určil, zda omezená nadměrná exprese AFosB v NAc jádru za použití virově zprostředkovaného přístupu přenosu genů byla dostatečná pro zvýšení motivace u potkanů. Zde byl HSV-AFosB infundován pouze po dokončení instrumentálního tréninku, což eliminovalo jakýkoliv potenciální vliv nadměrné exprese AFosB během tréninku na následném testu progresivního poměru. Nová skupina krys byla vycvičena stejně jako dříve a rozdělena do vyvážených experimentálních skupin na základě jejich výkonu v posledních dnech tréninku. Zvířata následně dostávala bilaterální infuze HSV-AFosB nebo HSV-LacZ do NAc jádra a byly testovány na progresivní poměr reagující po nadměrné expresi 5 d. Statistická analýza odhalila významnou genovou expresi pomocí pákové interakce (F(1,12) = 14.91; p ≤ 0.01) (Obr. 7A). Krysy infuzované HSV-AFosB provedly více aktivních odpovědí (p <0.01) ve srovnání s těmi, kteří byli infuzováni HSV-LacZ, zatímco reakce na neaktivní páku nebyla ovlivněna. V souladu s tímto zvýšením měly krysy infundované HSV-AFosB také vyšší bod zlomu (F(1,12) = 18.849; p ≤ 0.001) (Obr. 7B) než zvířata infikovaná HSV-LacZ. Neexistoval žádný účinek ofFosB na základní lokomotorickou aktivitu testovaný 1 h před testem progresivního poměru (viz obr. 4A, dostupný na www.jneurosci.org jako doplňkový materiál). Rovněž v den progresivního testování nebyly pozorovány žádné rozdíly v tělesné hmotnosti (doplňkové obr. 4B, dostupné na adrese www.jneurosci.org jako doplňkový materiál). Tato zjištění podporují naše pozorování u transgenních myší s nadměrnou expresí AFosB a ukazují, že selektivní nadměrná exprese AFosB v NAc je dostatečná pro zvýšení motivace spojené s jídlem.
Obrázek 7.
Vliv infuzí HSV-ΔFosB 5 d před testováním na instrumentální reakci podle progresivního poměru harmonogramu zesílení. A, Pákové reakce. B, Bod zlomu. Data jsou reprezentována jako průměr ± SEM. *** p <0.001; ** p <0.01.
Diskuse
Tato studie demonstruje, že nadměrná exprese AFosB v NAc zvyšuje instrumentální chování posílené potravour. Předchozí expozice kokainu, amfetaminu, MDMA nebo nikotinu zvýšila trvalé zvýšení následného instrumentálního výkonu. Expozice těchto léků také zvýšila chování motivované jídlem v režimu progresivního posilování. Tyto účinky předchozí expozice léku byly napodobeny omezenou nadměrnou expresí AFosB ve striatu, s použitím indukovatelných bitransgenních myší (NSE-tTA × TetOP-AFosB) nebo s použitím nových virových vektorů pro expresi AFosB selektivně v NAc.. Pozoruhodně, nadměrná exprese AFosB v NAc jádru, poté, co již byla získána instrumentální odpověď, zvýšila motivaci pro potraviny v režimu progresivního poměru. Naše zjištění společně identifikují AFosB v jádru NAc jako potenciálního mediátora neuroadaptací vyvolaných léky, které mohou podporovat instrumentální chování, čímž rozšiřují úlohu tohoto transkripčního faktoru tak, aby zahrnovaly procesy, které mají význam pro motivační vlivy na chování chování zesílené potravou. Také zvyšují možnost, že podmínky, které indukují expresi AFosB v NAc, mohou ovlivnit motivační vlastnosti jak přírodních tak lékových zesilovačů..
AFosB se akumuluje v dynorfin-exprimujících středních ostnatých neuronech jak NAc, tak dorzálního striata po chronické, ale ne akutní expozici drogám zneužívání. Tento regionální vzor exprese je reprodukován v indukovatelných bitransgenních AFosB-nadměrně exprimujících myších, které se zde používají. U těchto myší \ t zvýšené striatální hladiny ΔFosB zvyšují citlivost zvířat na kokain a morfin, měřeno preferencí podmíněného místa (Kelz a kol., 1999; Zachariou a kol., 2006). To také zvyšuje progresivní poměr reagující na kokain, což naznačuje, že motivace k self-podání kokainu je zvýšena nadměrnou expresí striatálního ΔFosB (Colby a kol., 2003). Zde jsme zjistili, že striatální AFosB nadměrná exprese u těchto myší také zvýšila progresivní poměr reagující na potravinový zesilovač a že tyto účinky byly reprodukovány omezenou virově zprostředkovanou nadměrnou expresí AFosB v NAc jádru u potkanů. Naše data naznačují, že AFosB může působit jako modulátor transkripce motivace pro primární zesilovače, ať už jde o potraviny, léky nebo možná cvičení, což je myšlenka konzistentní s předběžnými pozorováními, že striatální exprese AFosB je zvýšena po chronickém běhu kola nebo pití sacharózy (McClung a kol., 2004). Tato data naznačují, že nadměrná exprese NAcFosB může zvýšit motivační dopad jak přírodních tak lékových zesilovačů.
Subregiony NAc byly argumentovány k diferencovanému zprostředkování vlivu pavloviánských nebo instrumentálních motivačních procesů na instrumentální výkon. (Corbit a kol., 2001; de Borchgrave et al., 2002), zatímco obecnější motivační vlivy na instrumentální výkon mohou být kódovány jinými regiony, jako je centrální jádro amygdaly (Corbit a Balleine, 2005). Jádro NAc však bylo také navrženo jako kritické místo pro získání cíleného instrumentálního učení (Smith-Roe a Kelley, 2000; Baldwin a kol., 2002a,b; Kelley, 2004). Ukazujeme ekvivalentní účinky předchozích expozic léku a nadměrné exprese transgenní striatální AFosB na zvýšení instrumentálního chování. Infúze HSV-AFosB omezené na NAc jádro také zvýšily potravinové zesílení zesílené potravou. Ačkoli tyto experimenty nevylučují přínos dorzálního striata v těchto chováních, silně naznačují, že změny v genové expresi v NAc vyvolané AFosB jsou dostatečné pro zvýšení potravinové motivace. Vzhledem k tomu, že reakce na progresivní poměr byla také zvýšena, když byl AFosB exprimován poté, co bylo dříve dosaženo stabilního instrumentálního výkonu, role pro motivační vlivy na instrumentální chování se jeví jako pravděpodobná. Možnost, že naše manipulace ovlivní také proces instrumentálního učení, však nemůže být zcela vyloučena. Na podporu našich závěrů, zvýšení instrumentální výkonnosti pozorované po předchozí perorální expozici kokainu (\ tMiles et al., 2004) bylo hlášeno, že zahrnuje motivační změny odpovídající schopnosti chronické léčby nikotinem zvýšit progresivní poměr reagující u myší (Brunzell a kol., 2006). Kromě toho myši s vyřazeným dopaminovým transportérem, u kterých jsou zvýšené hladiny extracelulárního dopaminu, vykazují jak zvýšenou imunoreaktivitu AFosB, tak i motivaci k posílení potravy, ale nezmění učení (Cagniard a kol., 2006). Navícjsme zjistili, že nadměrná exprese striatálního AFosB u myší neovlivnila výkon, když bylo krmivo „devalvováno“ předběžným krmením.. Tato data ukazují, že zvířata byla citlivá na motivační hodnotu zesilovače a že reakce byla zaměřena na cíl.
Předchozí opakované vystavení účinkům drog může také zlepšit kontrolu chování vyvolanou podmíněnými stimuly spojenými s přirozenými zesilovači, měřenou pavloviánským přístupem (Harmer a Phillips, 1998; Taylor a Jentsch, 2001; Olausson a kol., 2003), podmíněná výztuž (Taylor a Horger, 1999; Olausson a kol., 2004), a přenos pavlovian-to-instrumental (Wyvell a Berridge, 2001). Tam je nyní přesvědčivý důkaz, že NAc jádro, na rozdíl od shell, se podílí na kontrole drogově motivované chování pavlovian podmíněné podněty (Parkinson a kol., 1999, 2002; Hall a kol., 2001; Dalley a kol., 2002; Ito a kol., 2004). Naše výsledky mohou naznačovat, že indukce vyvolaná lékem AFosB v NAc může být jedním z mechanismů, kterými je v těchto postupech zvýšena kontrola chování. Je také možné, že pavlovské podmíněné podněty, které působí jako podmíněné zesilovače, přispívají k současným efektům chování. Zvýšená kontrola chování takových podmíněných podnětů zprostředkovaná zvýšením striatálního AFosB může také přispět k účinku proteinu na preferenci kondicionovaného místa indukovaného léčivem. (Kelz a kol., 1999; Zachariou a kol., 2006) a progresivní poměr reagující na kokain (\ tColby a kol., 2003). Změny v motivačních procesech byly předpokládány tak, aby přispěly k rozvoji a udržení návykového chování (Robinson a Berridge, 1993; Jentsch a Taylor, 1999; Robbins a Everitt, 1999; Nestler, 2004). Současná data jsou také v souladu s dalšími teoriemi, které zdůrazňují více instrumentálních a pavlovských procesů v návykovém chování (Everitt a Robbins, 2005). Nyní je zapotřebí další práce k definování úlohy neuroadaptací indukovaných léky a AFosB v NAc a dalších limbicko-striatálních subregionech s ohledem na specifické asociativní nebo motivační faktory, které mohou usnadnit instrumentální výkon a přispět k nutkavému chování.
Přesné molekulární mechanismy, kterými nejsou známy změny ovlivňující chování NAc motivované primárními nebo podmíněnými zesilovači (Kelley a Berridge, 2002), GABAergní střední ostnaté neurony NAc jsou považovány za kritický substrát pro plasticitu závislou na léčivech a zkušenostech. Zde se dopaminergní vstup z ventrální tegmentální oblasti a glutamatergický vstup z kortikolimbických afferentů sbíhají na běžné dendrity a dendritické spiny (Sesack a Pickel, 1990; Smith a Bolam, 1990). Chronická psychostimulační expozice zvyšuje hustotu takových spinů na neuronech v NAc shell a jádru (Robinson a Kolb, 1999; Robinson a kol., 2001; Li et al., 2003, 2004). V poslední době byla indukce behaviorální senzibilizace spojena specificky se zvýšením dendritických spinů v jádru NAc (Li et al., 2004). Zejména kokainem indukované zvýšení hustoty páteře přetrvává pouze v D1-pozitivní neurony, které koexprimují AFosB (Robinson a Kolb, 1999; Lee et al., 2006). AFosB v NAc jádru tak může přispět k trvalé synaptické plasticitě, která by mohla ovlivnit instrumentální chování. Kritická úloha pro dopamin-glutamátovou neurotransmisi (Smith-Roe a Kelley, 2000), aktivita protein kinázy A (Baldwin a kol., 2002a) a de novo proteosyntéza (Hernandez a kol., 2002) v rámci jádra NAc o instrumentální výkonnosti byly dříve hlášeny. Nyní identifikujeme AFosB jako transkripční faktor, který může trvale zvyšovat reakci zesílenou potravou při nadměrné expresi v NAc jádru. Specifické geny nebo proteiny podílející se na těchto účincích musí být přesně definovány. AFosB reguluje expresi více proteinů v NAc zapojeném do neuroplasticity (McClung a Nestler, 2003). Nedávná analýza mikročipů charakterizovala vzorce exprese genů v NAc bitransgenních myší exprimujících AFosB zde použitých a identifikovala podskupinu genů, které byly regulovány relativně krátkodobou expresí AFosB (McClung a Nestler, 2003). BDNF byl jedním z takových genů a je známo, že BDNF v tomto nervovém okruhu zvyšuje odpověď na podněty související s léčivy a potravinami (Horger a kol., 1999; Grimm a kol., 2003; Lu et al., 2004). Další požadovaný gen je cyklin-dependentní kináza 5 (Bibb a kol., 2001), který je také indukován AFosB, a může regulovat jak strukturální plasticitu vyvolanou kokainem (Norrholm a kol., 2003) a motivace měřená progresivním poměrem reagujícím na přírodní nebo lékové zesilovače (JR Taylor, nepublikovaná pozorování). Dalšími kandidáty jsou GluR2 podjednotka AMPA glutamátových receptorů (Kelz a kol., 1999) a transkripční faktor NFκB (jaderný faktor κB) (Ang a kol., 2001). Bylo by důležité hodnotit tyto a další regulované proteiny v subregionech NAc jako kandidáty pro zprostředkování behaviorálních účinků AFosB na instrumentální výkon a motivaci.
Projekt současná série experimentů poskytuje důkaz, že nadměrná exprese AFosB uvnitř NAc může zvýšit chování motivované jídlem a tím regulovat instrumentální výkon, jak bylo dříve prokázáno pro odměny za léčiva. Tato data poskytují nový důkaz, že AFosB může působit jako obecný molekulární přepínač spojený se zlepšením motivačních aspektů zesilovačů na cílovém chování. Naše zjištění zvyšují možnost, že indukce NAc AFosB, například návykovými látkami, stresem nebo možná vysoce odměnou potravin, může být kritickým mechanismem, kterým dysfunkční motivační stavy způsobují psychiatrické poruchy spojené s nutkavým chováním.
Poznámky pod čarou
o Přijato březen 15, 2006.
o Revize byla přijata v červnu 23, 2006.
o Přijato srpen 2, 2006.
Tato práce byla podpořena granty z Národního institutu pro zneužívání drog, Národního institutu duševního zdraví a Národního institutu pro zneužívání alkoholu a alkoholismu. Vděčně oceňujeme cennou pomoc Dilje Kruegerové, Drewa Kiralyho, Dr. Ralpha DiLeoneho, Roberta Searsho a Dr. Jonathana Hommela na katedře psychiatrie na univerzitě v Yale. Jsme také vděční Dr. Jennifer Quinnové a Dr. Paulu Hitchcottovi za poskytnutí užitečných poznámek k tomuto rukopisu.
Korespondence by měla být adresována Jane R. Taylorové, katedře psychiatrie, divize molekulární psychiatrie, Lékařské fakultě Yale University, výzkumnému středisku Ribicoff Research Center, Mentálnímu centru pro zdraví v Connecticutu, 34 Park Street, New Haven, CT 06508.[chráněno e-mailem]
Copyright © 2006 Společnost pro neurovědy 0270-6474 / 06 / 269196-09 $ 15.00 / 0
Reference
1. ↵
1. Ang E,
2. Chen JS,
3. Zagouras P,
4. Magna H,
5. Holland J,
6. Schaeffer E,
7. Nestler EJ
(2001) Indukce NFκB v nucleus accumbens chronickým podáváním kokainu. J Neurochem 79: 221 – 224.
2. ↵
1. Baldwin AE,
2. Sadeghian K,
3. Holahan MR,
4. Kelley AE
(2002a) Postihové instrumentální učení je narušeno inhibicí cAMP dependentní proteinové kinázy v nucleus accumbens. Neurobiol Naučte se Mem 77: 44-62.
3. ↵
1. Baldwin AE,
2. Sadeghian K,
3. Kelley AE
(2002b) Chutné instrumentální učení vyžaduje souběžnou aktivaci NMDA a dopaminu D1 receptory v mediální prefrontální kůře. J Neurosci 22: 1063 – 1071.
4. ↵
1. Balleine B,
2. Killcross S
(1994) Účinky lézí kyseliny ibotenové v jádru accumbens na instrumentální působení. Behav Brain Res 65: 181 – 193.
5. ↵
1. Berke JD,
2. Hyman SE
(2000) Závislost, dopamin a molekulární mechanismy paměti. Neuron 25: 515-532.
6. ↵
1. Berridge KC,
2. Robinson TE
(2003) Odměna za analýzu. Trendy Neurosci 26: 507 – 513.
7. ↵
1. Bibb JA,
2. Chen J,
3. Taylor JR,
4. Svenningsson P,
5. Nishi A,
6. Snyder GL,
7. Yan Z,
8. Sagawa ZK,
9. Ouimet CC,
10. Nairn AC,
11. Nestler EJ,
12. Greengard P
(2001) Účinky chronické expozice kokainu jsou regulovány neuronálním proteinem Cdk5. Příroda 410: 376-380.
8. ↵
1. Brunzell DH,
2. Chang JR,
3. Schneider B,
4. Olausson P,
5. Taylor JR,
6. Picciotto MR
(2006) nikotinové acetylcholinové receptory obsahující beta2-Subunit se podílejí na zvýšení podmíněného zesílení nikotinu, ale ne progresivního poměru reagujícího na potraviny u myší C57BL / 6. Psychofarmakologie (Berl) 184: 328 – 338.
9. ↵
1. Cagniard B,
2. Balsam PD,
3. Brunner D,
4. Zhuang X
(2006) Myši s chronicky zvýšeným dopaminem vykazují zvýšenou motivaci, ale ne učení, pro odměnu za jídlo. Neuropsychofarmakologie 31: 1362 – 1370.
10. ↵
1. Carlezon WA Jr.,
2. Thome J,
3. Olson VG,
4. Lane-Ladd SB,
5. Brodkin ES,
6. Hiroi N,
7. Duman RS,
8. Neve RL,
9. Nestler EJ
(1998) Regulace odměny kokainu ze strany CREB. Věda 282: 2272 – 2275.
11. ↵
1. Chen J,
2. Kelz MB,
3. Doufám, že BT,
4. Nakabeppu Y,
5. Nestler EJ
(1997) Chronické Fos-příbuzné antigeny: stabilní varianty ΔFosB indukované v mozku chronickými léčebnými postupy. J Neurosci 17: 4933-4941.
12. ↵
1. Chen J,
2. Kelz MB,
3. Zeng G,
4. Sakai N,
5. Steffen C,
6. Shockett PE,
7. Picciotto MR,
8. Duman RS,
9. Nestler EJ
Transgenní zvířata s indukovatelnou, cílenou genovou expresí v mozku. Mol Pharmacol 54: 495 – 503.
13. ↵
1. Colby CR,
2. Whisler K,
3. Steffen C,
4. Nestler EJ,
5. Vlastní DW
(2003) Nadměrná exprese specifická pro Striatální buněčný typ AFosB zvyšuje pobídku pro kokain. J Neurosci 23: 2488 – 2493.
14. ↵
1. Corbit LH,
2. Balleine BW
(2005) Dvojitá disociace bazolaterálních a centrálních lézí amygdaly na obecné a výsledně specifické formy pavloviansko-instrumentálního přenosu. J Neurosci 25: 962 – 970.
15. ↵
1. Corbit LH,
2. Muir JL,
3. Balleine BW
(2001) Úloha nucleus accumbens v instrumentální kondici: důkaz funkční disociace mezi akumulovaným jádrem a shellem. J Neurosci 21: 3251 – 3260.
16. ↵
1. Dalley JW,
2. Chudasama Y,
3. Theobald DE,
4. Pettifer CL,
5. Fletcher CM,
6. Robbins TW
(2002) Nucleus accumbens dopamin a učení s diferencovaným přístupem: interaktivní účinky lézí 6-hydroxydopaminu a systémové podávání apomorfinu. Psychofarmakologie (Berl) 161: 425 – 433.
17. ↵
1. de Borchgrave R,
2. Rawlins JN,
3. Dickinson A,
4. Balleine BW
(2002) Účinky cytotoxického poškození nucleus accumbens na instrumentální kondici u potkanů. Exp Brain Res 144: 50 – 68.
18. ↵
1. Di Ciano P,
2. Everitt BJ
(2004a) Přímé interakce mezi bazolaterální amygdala a jádrem accumbens jádrem podmiňují chování kokainu hledající krysy. J Neurosci 24: 7167 – 7173.
19. ↵
1. Di Ciano P,
2. Everitt BJ
(2004b) Kondicionované zesilovací vlastnosti podnětů spárovaných s kokainem, heroinem nebo sacharózou podávanými samostatně: důsledky pro přetrvávání návykového chování. Neurofarmakologie 47 ([Suppl 1]) 202 – 213.
20. ↵
1. Dickinson A
(1985) Akce a zvyky: rozvoj autonomie chování. Philos Trans R Londýn B Biol Sci 308: 67 – 78.
21. ↵
1. Everitt BJ,
2. Robbins TW
(2005) Neurální systémy posilování drogové závislosti: od akcí ke zvyklostem k donucování. Nat Neurosci 8: 1481 – 1489.
22. ↵
1. Faure A,
2. Haberland U,
3. Conde F,
4. El Massioui N
(2005) Léze na nigrostriatální dopaminový systém narušuje tvorbu návyku - reakce. J Neurosci 25: 2771 – 2780.
23. ↵
1. Grimm JW,
2. Lu L,
3. Hayashi T,
4. Doufám, že BT,
5. Su TP,
6. Shaham Y
(2003) Časově závislé zvýšení hladiny neurotrofního faktoru odvozeného od mozku v rámci mesolimbického dopaminového systému po vysazení z kokainu: implikace pro inkubaci touhy po kokainu. J Neurosci 23: 742 – 747.
24. ↵
1. Hala J,
2. Parkinson JA,
3. Connor TM,
4. Dickinson A,
5. Everitt BJ
(2001) Zapojení centrálního jádra jádra amygdaly a nucleus accumbens do zprostředkování Pavlovovských vlivů na instrumentální chování. Eur J Neurosci 13: 1984 – 1992.
25. ↵
1. Harmer CJ,
2. Phillips GD
(1998) Zvýšená chuť k jídlu po opakovaném předběžném ošetření d-amfetaminem. Behav Pharmacol 9: 299 – 308.
26. ↵
1. Hernandez PJ,
2. Sadeghian K,
3. Kelley AE
(2002) Včasná konsolidace instrumentálního učení vyžaduje syntézu proteinů v nucleus accumbens. Nat Neurosci 5: 1327 – 1331.
27. ↵
1. Hommel JD,
2. Sears RM,
3. Georgescu D,
4. Simmons DL,
5. DiLeone RJ
(2003) Lokální genový knockdown v mozku za použití virově zprostředkované RNA interference. Nat Med 9: 1539 – 1544.
28. ↵
1. Horger BA,
2. Shelton K,
3. Schenk S
(1990) Preexpozice senzibilizuje krysy na odměňující účinky kokainu. Pharmacol Biochem Behav 37: 707 – 711.
29. ↵
1. Horger BA,
2. Giles MK,
3. Schenk S
(1992) Preexpozice amfetaminu a nikotinu predisponuje krysy k tomu, aby si sami podávali nízkou dávku kokainu. Psychofarmakologie (Berl) 107: 271 – 276.
30. ↵
1. Horger BA,
2. Iyasere CA,
3. Berhow MT,
4. Messer CJ,
5. Nestler EJ,
6. Taylor JR
(1999) Zvýšení pohybové aktivity a podmíněné odměny kokainu neurotrofickým faktorem odvozeným od mozku. J Neurosci 19: 4110 – 4122.
31. ↵
1. Ito R,
2. Robbins TW,
3. Everitt BJ
(2004) Diferenciální kontrola chování kokainu při hledání jádra a shellu. Nat Neurosci 7: 389 – 397.
32. ↵
1. Jentsch JD,
2. Taylor JR
(1999) Impulsivita vyplývající z frontostriatální dysfunkce při zneužívání drog: implikace pro kontrolu chování podnětů souvisejících s odměnou. Psychofarmakologie (Berl) 146: 373 – 390.
33. ↵
1. Kelley AE
(2004) Ventrální striatální kontrola chuťové motivace: role v ingestivním chování a učení souvisejícím s odměnou. Neurosci Biobehav Rev 27: 765 – 776.
34. ↵
1. Kelley AE,
2. Berridge KC
(2002) Neurovědy přirozených odměn: význam pro návykové drogy. J Neurosci 22: 3306 – 3311.
35. ↵
1. Kelz MB,
2. Chen J,
3. Carlezon WA Jr.,
4. Whisler K,
5. Gilden L,
6. Beckmann AM,
7. Steffen C,
8. Zhang YJ,
9. Marotti L,
10. Vlastní DW,
11. Tkatch T,
12. Baranauskas G,
13. Surmeier DJ,
14. Neve RL,
15. Duman RS,
16. Picciotto MR,
17. Nestler EJ
(1999) Exprese transkripčního faktoru ΔFosB v mozku řídí citlivost na kokain. Příroda 401: 272-276.
36. ↵
1. Konradi C,
2. Cole RL,
3. Heckers S,
4. Hyman SE
(1994) Amfetamin reguluje expresi genu v striatu krysy pomocí transkripčního faktoru CREB. J Neurosci 14: 5623 – 5634.
37. ↵
1. Lee KW,
2. Kim Y,
3. Kim A,
4. Helmin K,
5. Nairn AC,
6. Greengard P
(2006) Kokainem indukovaná tvorba dendritické páteře u D1 a D2 dopaminového receptoru obsahujícího střední spinální neurony v nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci USA 103: 3399 – 3404.
38. ↵
1. Li Y,
2. Kolb B,
3. Robinson TE
(2003) Umístění trvalých změn vyvolaných amfetaminem v hustotě dendritických páteří na středních ostnatých neuronech v nucleus accumbens a caudate-putamen. Neuropsychofarmakologie 28: 1082 – 1085.
39. ↵
1. Li Y,
2. Acerbo MJ,
3. Robinson TE
(2004) Indukce senzibilizace chování je spojena se strukturní plasticitou vyvolanou kokainem v jádru (ale nikoliv v skořápce) nucleus accumbens. Eur J Neurosci 20: 1647 – 1654.
40. ↵
1. Lu L,
2. Dempsey J,
3. Liu SY,
4. Bossert JM,
5. Shaham Y
(2004) Jediná infuze neurotrofního faktoru odvozeného z mozku do ventrální tegmentální oblasti indukuje dlouhodobou potenciaci hledaného kokainu po vysazení. J Neurosci 24: 1604 – 1611.
41. ↵
1. McClung CA,
2. Nestler EJ
(2003) Regulace genové exprese a odměny kokainu CREB a AFosB. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215.
42. ↵
1. McClung CA,
2. Ulery PG,
3. Perrotti LI,
4. Zachariou V,
5. Berton O,
6. Nestler EJ
(2004) AFosB: molekulární přepínač pro dlouhodobou adaptaci v mozku. Brain Res Mol Brain Res 132: 146 – 154.
43. ↵
1. Miles FJ,
2. Everitt BJ,
3. Dalley JW,
4. Dickinson A
(2004) Kondicionovaná aktivita a instrumentální zesílení po dlouhodobé perorální konzumaci kokainu potkani. Behav Neurosci 118: 1331 – 1339.
44. ↵
1. Nestler EJ
(2004) Molekulární mechanismy drogové závislosti. Neurofarmakologie 47 ([Suppl 1]) 24 – 32.
45. ↵
1. Nestler EJ,
2. Barrot M,
3. Vlastní DW
(2001) ΔFosB: trvalý molekulární přepínač pro závislost. Proc Natl Acad Sci USA 98: 11042-11046.
46. ↵
1. Norrholm SD,
2. Bibb JA,
3. Nestler EJ,
4. Ouimet CC,
5. Taylor JR,
6. Greengard P
(2003) Kokainem indukovaná proliferace dendritických páteří v nucleus accumbens je závislá na aktivitě cyklin-dependentní kinázy-5. Neuroscience 116: 19 – 22.
47. ↵
1. No HE,
2. Doufám, že BT,
3. Kelz MB,
4. Iadarola M,
5. Nestler EJ
(1995) Farmakologické studie regulace chronické indukce antigenu související s FOS kokainem v striatu a nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther 275: 1671-1680.
48. ↵
1. Olausson P,
2. Jentsch JD,
3. Taylor JR
(2003) Opakovaná expozice nikotinu zvyšuje u potkanů učení související s odměnou. Neuropsychofarmakologie 28: 1264 – 1271.
49. ↵
1. Olausson P,
2. Jentsch JD,
3. Taylor JR
(2004) Opakovaná expozice nikotinu zvyšuje reakci s podmíněným zesílením. Psychofarmakologie (Berl) 173: 98 – 104.
50. ↵
1. Parkinson JA,
2. Olmstead MC,
3. Burns LH,
4. Robbins TW,
5. Everitt BJ
(1999) Disociace účinků lézí jádra accumbens jádra a skořepiny na chutném pavlovianském přístupovém chování a zesílení podmíněné posilování a lokomoční aktivity d-amfetaminem. J Neurosci 19: 2401 – 2411.
51. ↵
1. Parkinson JA,
2. Dalley JW,
3. Kardinál RN,
4. Bamford A,
5. Fehnert B,
6. Lachenal G,
7. Rudarakanchana N,
8. Halkerston KM,
9. Robbins TW,
10. Everitt BJ
(2002) Deplece dopaminu acebsensu poškozuje jak získávání, tak výkonnost apetitivního přístupu Pavlovianova přístupu: důsledky pro funkci mesoaccumbens dopaminu. Behav Brain Res 137: 149 – 163.
52. ↵
1. Paxinos G,
2. Watson C
(1986) Mozek krysy ve stereotaxických souřadnicích (Academic, Sydney).
53. ↵
1. Perrotti LI,
2. Hadeishi Y,
3. Ulery PG,
4. Barrot M,
5. Monteggia L,
6. Duman RS,
7. Nestler EJ
(2004) Indukce AFosB v mozkových strukturách souvisejících s odměnou po chronickém stresu. J Neurosci 24: 10594 – 10602.
54. ↵
1. Piazza PV,
2. Deminiere JM,
3. le Moal M,
4. Simon H
(1990) Stresová a farmakologicky indukovaná senzibilizace chování zvyšuje zranitelnost vůči získání amfetaminové samosprávy. Brain Res 514: 22 – 26.
55. ↵
1. Pich EM,
2. Pagliusi SR,
3. Tessari M,
4. Talabot-Ayer D,
5. Hooft van Huijsduijnen R,
6. Chiamulera C
(1997) Běžné neurální substráty pro návykové vlastnosti nikotinu a kokainu. Věda 275: 83 – 86.
56. ↵
1. Robbins TW,
2. Everitt BJ
(1999) Závislost na drogách: špatné návyky se zvyšují. Příroda 398: 567-570.
57. ↵
1. Robinson TE,
2. Berridge KC
(1993) Nervový základ touhy po drogách: pobídkově-senzitizační teorie závislosti. Brain Res Brain Res Rev 18: 247 – 291.
58. ↵
1. Robinson TE,
2. Kolb B
(1999) Změny v morfologii dendritů a dendritických páteří v nucleus accumbens a prefrontálním kortexu po opakované léčbě amfetaminem nebo kokainem. Eur J Neurosci 11: 1598 – 1604.
59. ↵
1. Robinson TE,
2. Gorny G,
3. Mitton E,
4. Kolb B
(2001) Samopodání kokainu mění morfologii dendritů a dendritických páteří v nucleus accumbens a neokortexu. Synapse 39: 257 – 266.
60. ↵
1. Sesack SR,
2. Pickel VM
(1990) V mediálním jádru krysy accumbens se hipokampální a katecholaminergní terminály sbíhají na ostnatých neuronech a navzájem se nacházejí. Brain Res 527: 266 – 279.
61. ↵
1. Shaw-Lutchman TZ,
2. Impey S,
3. Storm D,
4. Nestler EJ
(2003) Regulace transkripce zprostředkované CRE v mozku myší amfetaminem. Synapse 48: 10 – 17.
62. ↵
1. Smith AD,
2. Bolam JP
(1990) Neuronová síť bazálních ganglií odhalená studiem synaptických spojení identifikovaných neuronů. Trendy Neurosci 13: 259 – 265.
63. ↵
1. Smith-Roe SL,
2. Kelley AE
(2000) Současná aktivace NMDA a dopaminu D1 Receptory v jádru nucleus accumbens jsou potřebné pro chuťové instrumentální učení. J Neurosci 20: 7737 – 7742.
64. ↵
1. Taylor JR,
2. Horger BA
(1999) Zvýšená reakce na podmíněnou odměnu vyvolanou amfetaminem uvnitř akumulace je potencována po senzibilizaci kokainu. Psychofarmakologie (Berl) 142: 31 – 40.
65. ↵
1. Taylor JR,
2. Jentsch JD
(2001) Opakované občasné podávání psychomotorických stimulačních léků mění získávání pavloviánského přístupu u potkanů: rozdílné účinky kokainu, d-amfetaminu a 3,4-methylenedioxymetamfetaminu („extáze“) Biol Psychiatry 50: 137 – 143.
66. ↵
1. Vezina P,
2. Lorrain DS,
3. Arnold GM,
4. Austin JD,
5. Suto N
(2002) Senzibilizace reaktivity dopaminového neuronu středního mozku podporuje pronásledování amfetaminu. J Neurosci 22: 4654 – 4662.
67. ↵
1. Werme M,
2. Messer C,
3. Olson L,
4. Gilden L,
5. Thoren P,
6. Nestler EJ,
7. Brene S
(2002) ΔFosB reguluje chod kola. J Neurosci 22: 8133 – 8138.
68. ↵
1. Wyvell CL,
2. Berridge KC
(2001) Incentivní senzibilizace při předchozí expozici amfetaminu: zvýšená „vyvolávající“ cue vyvolaná odměna za sacharózu. J Neurosci 21: 7831 – 7840.
69. ↵
1. Yin HH,
2. Knowlton BJ,
3. Balleine BW
(2004) Léze dorsolaterálního striatum zachovávají očekávání výsledku, ale narušují tvorbu návyků v instrumentálním učení. Eur J Neurosci 19: 181 – 189.
70. ↵
1. Zachariou V,
2. Bolanos CA,
3. Selley DE,
4. Theobald D,
5. Cassidy MP,
6. Kelz MB,
7. Shaw-Lutchman T,
8. Berton O,
9. Sim-Selley LJ,
10. Dileone RJ,
11. Kumar A,
12. Nestler EJ
(2006) Zásadní úloha pro AFosB v nucleus accumbens při působení morfinu. Nat Neurosci 9: 205 – 211.
;