Indukce deltaFosB v orbitofrontálním kortexu potencuje lokomotorickou senzibilizaci navzdory oslabení kognitivní dysfunkce způsobené kokainem (2009)

2. Metody

Všechny experimenty byly prováděny v přísném souladu s NIH příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat a byly schváleny Institutem pro péči o zvířata a užitím výboru u UT Southwestern.

2.5. Kvantifikace mRNA

Krysy dostaly in-OFC injekce AAV-GFP nebo AAV-ΔFosB, následované 21 dvakrát denně injekcemi fyziologického roztoku nebo kokainu, přesně tak, jak je popsáno pro behaviorální experimenty. Zvířata byla použita 24 h po poslední injekci fyziologického roztoku nebo kokainu. Krysy byly usmrceny dekapitací. Mozky byly rychle extrahovány a byly získány oboustranné razníky XCUMX mm tloušťky 1 NAc a okamžitě zmrazeny a uloženy při -12 ° C až do izolace RNA. Díry z OFC byly také odstraněny pro analýzu pomocí DNA microarray, který potvrdil úspěšný virovým zprostředkovaným přenosem genů v této oblasti (vizWinstanley a kol., 2007) pro podrobnější výsledky). RNA byla extrahována z vzorků NAc za použití činidla RNA Stat-60 (Teltest, Houston, TX) podle pokynů výrobce. Kontaminační DNA byla odstraněna ošetřením DNázy (bez DNA, katalog # 1906, Ambion, Austin TX). Purifikovaná RNA byla reverzně transkribována do cDNA (Superscript First Strand Synthesis, katalog # 12371-019, Invitrogen). Transkripty pro geny, které jsou předmětem zájmu, byly kvantifikovány pomocí qPCR v reálném čase (SYBR Green, Applied Biosystems, Foster City, CA) na termocyklovačce Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96. Všechny primery byly na zakázku syntetizovány Operonem (Huntsville, AL, viz Tabulka 1 pro sekvence) a validovány pro linearitu a specificitu před pokusy. Všechna PCR data byla normalizována na hladiny glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH), která nebyla změněna léčbou kokainem podle následujícího vzorce: ΔC_t =C_t(gén zájmu) - C_t (GAPDH). Upravené hladiny exprese u potkanů ​​AAV-ΔFosB a AAV-GFP, které dostávaly kokain, a krys AAV-ΔFosB, které dostávaly chronický fyziologický roztok, byly poté vypočteny ve srovnání s kontrolami (skupina AAV-GFP daná chronickým fyziologickým roztokem) následujícím způsobem:C_t = ΔC_t - ΔC_t (kontrolní skupina). V souladu s doporučenou praxí v oboru (Livak a Schmittgen, 2001) byly vypočteny hladiny exprese ve vztahu k kontrolám s použitím následujícího výrazu: 2^-ΔΔCt.

  

Tabulka 1

Sekvence primerů používaných pro kvantifikaci hladin cDNA pomocí PCR v reálném čase.

3. Výsledek

experiment 1

Chronické podávání kokainu vyvolává senzibilizaci hyperlokomotorických účinků akutního kokainu, který je napodoben pomocí ΔFosB

Jak bylo očekáváno, byla pozorována silná lokomotorická senzibilizace u kontrolních zvířat po expozici chronického kokainu se zvířaty chronicky léčenými kokainem vykazujícím zvýšenou hyperaktivitu v reakci na akutní provokaci kokainu (Obr. 1A, chronická léčba: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Zvířata nadměrně exprimující ΔJunD, dominantní negativní mutant JunD, který působí jako antagonista ΔFosB (Zachariou a kol., 2006) v OFC byly nerozlišitelné od kontrolních zvířat (Obr. 1C, GFP vs ΔJunD, skupina: F_{1, 56} = 1.509, NS). Zvířata, nadměrně exprimující ΔFosB v OFC, která podstoupila opakované injekce ve fyziologickém roztoku, se objevila jako "pre-senzitizovaná": prokázala zvýšenou lokomotorickou odpověď na akutní kokain, která nebyla odlišitelná od senzibilizované reakce jejich protějšků léčených chronickým kokainemObr. 1B, Operace GFP vs. ΔFosB × chronická léčba: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; Pouze ΔFosB: chronická léčba: F_1,22 = 0.664, NS). Zvířata ΔFosB byly v prvním 15 min mírně hyperaktivní, protože byly umístěny do pohybových boxů (GFP vs. ΔFosB, chirurgie: F_1,56 = 4.229, p <0.04), ale úrovně pohybové aktivity byly srovnatelné s kontrolami za 15 minut před podáním kokainu (chirurgický zákrok: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Obr. 1

Lokomotorická senzibilizace kokainu. Akutní kokain způsobuje větší zvýšení pohybové aktivity u kontrolních zvířat chronicky léčených kokainem a fyziologickým roztokem (panel A). U zvířat, které nadměrně exprimují ΔFosB (panel B), byly podány opakované fyziologický roztok (více …)

Vzhledem k tomu, že při podání kokainu v průběhu 5CSRT, stejná zvířata vykazovala poměrně zvýšenou schopnost odmítnout předčasné motorické odezvy, tato hyperaktivita se jeví jako specifická pro ambulantní pohyb, tj. Druh pohybu, který se typicky zaznamenává ve studiích pohybové senzitizace. Přestože zvýšená aktivita v odezvě na stimulační léky může odrážet anxiogenní profil, intra-OFC nadměrná exprese ΔFosB nezvyšuje úzkost měřenou za použití testu zvýšeného plus bludiště nebo otevřeného pole (údaje nejsou uvedeny). Zvířata byla také dobře zvyklá na IP injekce a injekce ve fyziologickém roztoku nezměnily jejich kognitivní výkon (Winstanley a kol., 2007), proto tento motorový efekt nelze přičítat obecné reakci na injekci IP. Souhrnně tyto nálezy naznačují, že indukce ΔFosB v OFC je dostatečná (ale není nutná) pro citlivou lokomotorickou reakci na kokain, přestože ΔFosB ve stejné oblasti způsobuje toleranci k účinkům kokainu na motivaci a impulsivitu (Winstanley a kol., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

Hladiny FosB mRNA v NAc nebyly měněny buď chronickým léčením (Obr. 2A, lék: F_1,14 = 1.179, ns) nebo exprese ΔFosB v OFC (operace: F_{1, 14} = 0.235, ns). Avšak hladiny ΔFosB byly významně vyšší u zvířat chronicky léčených kokainem v souladu s předchozími zprávami (Chen a kol., 1997); Obr. 2B, lék: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Je zajímavé, že množství mRNA ΔFosB v NAc zvířat ošetřených solným roztokem bylo nižší u těch, u kterých byl tento transkripční faktor nadměrně exprimován v OFC (léčivo: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Absence interakce lék × chirurgický zákrok však naznačuje, že léčba chronickým kokainem měla stejný účinek jak ve skupinách léčených AAV-GFP, tak AAV-ΔFosB, přičemž úměrně zvyšovala hladiny ΔFosB v podobném rozsahu (lék × chirurgický zákrok: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Obr. 2

Změny mRNA v NAc zvířat nadměrně exprimujících buď GFP nebo ΔFosB v OFC a léčeny chronicky buď fyziologickým roztokem nebo kokainem. Data ukazují lineární složené změny ve výrazu jako podíl kontrolních hodnot. Zobrazená data jsou (více …)

4. Diskuse

Zde ukážeme, že nadměrná exprese ΔFosB u potkanů ​​senzitizovaných OFC na pohybové stimulační účinky kokainu, napodobující účinky chronického podávání kokainu. Již dříve jsme prokázali, že výkonnost těchto zvířat na modelech 5CSRT a zpoždění a diskontování je méně ovlivněna akutním kokainem a že podobný účinek podobný toleranci je pozorován po opakované expozici kokainu. Senzibilizace a tolerance k různým účinkům kokainu lze tedy pozorovat u stejných zvířat, přičemž obě adaptace jsou zprostředkovány přes stejnou molekulu, ΔFosB, působící ve stejné oblasti mozku. Skutečnost, že oba jevy mohou být současně vyvolány napodobením jednoho z akcí kokainu na jediném frontocortickém místě, zdůrazňuje význam kortikálních oblastí v následcích chronického příjmu drog. Dále tato data naznačují, že tolerance a senzibilizace odrážejí dva zdánlivě kontrastní, ale úzce související aspekty reakce na návykové drogy.

Vzhledem k tomu, že zvýšená exprese ΔFosB v NAc je kriticky zapojena do vývoje lokomotorické senzitizace, jedna pravděpodobná hypotéza by byla, že nadměrná exprese ΔFosB v OFC předem senzitizuje zvířata na kokain zvýšením hladin ΔFosB v NAc. Bylo však zjištěno inverzní výsledek: hladiny ΔFosB v NAc byly signifikantně nižší u zvířat nadměrně exprimujících ΔFosB v OFC. Následky tohoto poklesu v NAc ΔFosB jsou obtížné interpretovat, protože inhibice působení ΔFosB prostřednictvím nadměrné exprese ΔJunD v této oblasti snižuje mnoho účinků kokainu u myší (Peakman a spol., 2003). Existují určité paralely mezi těmito pozorováními a těmi, které se týkají dopamínového systému. Například částečná deplece dopaminu v NAc může vést k hyperaktivitě, neboť může vést k aplikaci agonistů dopaminu v této oblasti (Bachtell a kol., 2005; Costall a kol., 1984; Parkinson a kol., 2002; Winstanley a kol., 2005b). Podobně skutečnost, že zvyšující se kortikální hladiny ΔFosB může snížit subkortikální expresi, připomíná dobře zjištěné zjištění, že zvýšení prefrontalového dopaminergního přenosu je často doprovázeno vzájemným snížením úrovní striatálního dopaminu (Deutch a kol., 1990; Mitchell a Gratton, 1992). Jaký mechanismus zpětné vazby může fungovat pro intracelulární signalizační molekuly je v současné době nejasný, ale může odrážet změny ve všeobecné aktivitě určitých neuronových sítí způsobené změnou transkripce genu. Například zvyšující se ΔFosB v OFC vede k zvýšené regulaci lokální inhibiční aktivity, jak dokládá zvýšení hladin GABA_A receptoru, mGluR5 receptoru a látky P, jak je detekováno mikroskopickou analýzou (Winstanley a kol., 2007). Tato změna aktivity OFC by pak mohla ovlivnit aktivitu v jiných oblastech mozku, což by mohlo následně vést k lokální změně v expresi ΔFosB. Zda hladiny ΔFosB odrážejí relativní změny dopaminové aktivity, je otázkou, která vyžaduje další vyšetřování.

Všechna zvířata vykazovala významný nárůst hladin mRNA v ΔFosB v NAC po chronické léčbě kokainem, v souladu s předchozími zprávami o zvýšených hladinách proteinu (Chen a kol., 1997; Hope a kol., 1992; Nye a kol., 1995). Nicméně v nedávné zprávě bylo zjištěno, že hladiny ΔFosB mRNA již po chronické léčbě amfetaminem již nebyly signifikantně zvýšeny, ačkoliv se po konečné injekci pozoroval signifikantní nárůst 24 h (Alibhai a kol., 2007). Tato nesrovnalost může být způsobena rozdílem v užívaném psychostimulantu (kokain vs. amfetamin), ale vzhledem k kratšímu poločasu kokainu by bylo rozumné očekávat, že jeho účinky na expresi genů by se normalizovaly rychleji než u amfetaminu, spíše než naopak. Důkaznějším důvodem pro tyto odlišné výsledky je to, že zvířata v současné studii byla injekčně podána střednědobá dávka léku dvakrát denně za den 21 ve srovnání s jednou injekcí s vysokou dávkou pro 7 dny (Alibhai a kol., 2007). Rozsáhlejší režim léčby by mohl vést k výraznějším změnám, které se zde vyskytovaly.

Přestože změny v genové expresi pozorované v rámci NAc po chronickém kokainu obecně souhlasí s dříve popsanými nálezy, velikost těchto účinků je v současné studii nižší. Jedním z možných důvodů je to, že zvířata byla po poslední injekci kokainu usmrcena pouze 24 h, zatímco většina studií použila tkáň získaná dva týdny od poslední expozice léčiva. Studie zkoumající časový průběh pohybové senzitizace naznačují, že v pozdějším časovém bodě jsou pozorovány výraznější změny v chování a expresi genu / proteinu. I když hlásí mírné zvýšení mRNA pro dopamin D₂ receptor v NAc, obecný konsensus je, že expresní hladiny D₂ nebo D₁ receptoru nejsou trvale změněny po vývoji lokomotorické senzitizace, i když se zvyšuje a snižuje D₂ receptoru byly hlášeny krátce po ukončení senzibilizačního režimu (vizPierce a Kalivas, 1997) pro diskusi). Naše pozorování, že GluR1 a GluR2 mRNA byly nezměněny po chronické léčbě kokainem v tomto časném časovém bodě, je rovněž v souladu s předchozí zprávou (Fitzgerald a kol., 1996), přestože v pozdějších časových bodech po ukončení chronické psychostimulantní léčby bylo zjištěno zvýšení GluR1 mRNA (Churchill a kol., 1999).

Bylo však pozorováno malé zvýšení PSD95 mRNA v NAc u zvířat trvale léčených kokainem. PSD95 je molekula lešení a je jedním z hlavních proteinů v postsynaptické hustotě excitačních synapsí. Kotví několik syntetických glutamátových receptorů a přidružených signalizačních proteinů a předpokládá se, že zvýšení exprese PSD95 odráží zvýšenou synaptickou aktivitu a zvýšenou inzerci a stabilizaci glutamátových receptorů v synapsích (van Zundert a kol., 2004). Role PSD95 ve vývoji lokomotorické senzitizace byla dříve navržena (Yao et al., 2004).

Zvýšení exprese Arc je také spojeno se zvýšením synaptické aktivity. Nicméně, zatímco došlo ke zvýšení exprese oblouku v NAc 50 min po injekci amfetaminem (Klebaur a kol., 2002), naše data naznačují, že chronické podávání kokainu neupravuje oblouk v NAc trvaleji, ačkoli zvýšení oblouku bylo pozorováno u 24 h po chronickém podání antidepresivních léků (Larsen a kol., 2007) a amfetamin (Ujike a kol., 2002). Zvýšení fosforylace CREB je také pozorováno u NAc po akutním podávání kokainu a amfetaminu (Kano a kol., 1995; Konradi a kol., 1994; Self et al., 1998), ale není snad překvapující, že po chronickém podání kokainu nebylo pozorováno žádné zvýšení CREB mRNA. Signalizace cestou CREB je považována za důležitější v počátečních fázích užívání léků, přičemž transkripční faktory, jako je např. ΔFosB, přicházejí k tomu, aby převládaly ve vývoji závislosti (McClung a Nestler, 2003). Ačkoli CREB byl zapojen do odměňování účinky kokainu (Carlezon a kol., 1998), neexistují žádné zprávy o tom, že zvyšující se exprese CREB ovlivňuje lokomotorickou senzibilizaci, ačkoliv virové zprostředkované zvýšení endogenního dominantního negativního antagonisty CREB, indukovatelného cAMP časného represoru proteinu nebo ICER zvyšuje hyperaktivitu způsobenou akutní injekcí amfetaminuGreen et al., 2006).

Stručně řečeno, i když většina změn vyvolaných léčivem byla shodná s předpovědami z literatury, nenalezli jsme žádné změny v genové expresi v NAc, které by mohly vysvětlit senzibilizovanou lokomotorickou odpověď na kokain pozorovanou u neléčených zvířat léčených s intra-OFC AAV-ΔFosB. To zvedne možnost, že zvyšující se ΔFosB v OFC nemusí ovlivňovat senzibilizaci motoru prostřednictvím NAc, ačkoliv by se mohlo zapojit mnoho dalších genů, které zde nebyly studovány. Značné důkazy naznačují, že modulace mediální prefrontální kůry (mPFC) může změnit striatální aktivitu a tím přispět k senzibilizaci chování k psychostimulancům (Steketee, 2003; Steketee a Walsh, 2005), přestože je známo méně o úloze více ventrálních prefrontálních oblastí, jako je OFC. NAc obdrží několik projekcí z OFC (Berendse a kol., 1992). Nedávná a podrobná studie však identifikovala velmi málo přímých projekcí OFC-NAc: po injekcích anterográdního indikátoru do laterálních a ventrolaterálních oblastí OFC byla pozorována řídká značka nejvíce boční části pláště NAc a nejvzdálenější OFC oblast vysílá minimální projekce do jádra NAc (Schilman a kol., 2008). Centrální kaudat-putamen dostává mnohem hustší inervaci. Ve světle tohoto anatomického důkazu by většina NAc tkáně analyzovaná v našich PCR reakcích nebyla přímo inervována OFC, což snižuje pravděpodobnost, že budou všechny změny v genové expresi úspěšně detekovány.

OFC provádí těžké projekty v regionech, které jsou silně propojeny s NAc, jako je mPFC, bazolaterální amygdala (BLA), kaudate putamen a subthalamické jádro (STN). Zda by změny OFC mohly nepřímo modifikovat fungování NAc prostřednictvím svého vlivu v těchto oblastech, je otevřenou otázkou. Bylo prokázáno, že aktivita v BLA je pozměněna po lézích OFC a že to významně přispívá k deficitu v reversal učení způsobeném poškozením OFC (Stalnaker a kol., 2007), avšak jakékoli účinky v oblastech, jako je NAc, se dosud neprojevily. Může být produktivnější soustředit pozornost na další oblasti silněji spojené s OFC a které jsou také silně zapojeny do řízení motorů. STN je obzvláště slibný cíl, protože nejen léze STN a OFC mají podobné účinky na impulsivitu a Pavlovian učení (Baunez a Robbins, 1997; Chudasama a kol., 2003; Uslaner a Robinson, 2006; Winstanley a kol., 2005a), ale psychostimulantem indukovaná lokomotorická senzitizace je spojena se zvýšením exprese c-Fos v této oblasti (Uslaner a kol., 2003). Budoucí experimenty navržené k prozkoumání, jakým způsobem ovlivňují léčbu indukované změny exprese genu v OFC, ovlivňují fungování oblastí v dolní části, jako je STN. OFC také posílá malou projekci do ventrální tegmentální oblasti (Geisler a kol., 2007), což je region, o kterém je známo, že je kriticky zapojen do vývoje lokomotorické senzitizace. Je možné, že nadměrná exprese ΔFosB v OFC může ovlivnit pohybovou senzibilizaci touto cestou.

Přesná povaha vztahu mezi změnami vyvolanými léky v kognitivní funkci a pohybovou senzibilizací je v současné době nejasná a dosud jsme se zaměřili na OFC. Vzhledem k těmto zjištěním je možné, že změny v expresi genů spojené s vývojem lokomotorické senzibilizace v jiných oblastech mozku mohou naopak mít určitý vliv na kognitivní odpověď na kokain. Pokusy, které zkoumají součinnost mezi kortikálními a subkortikálními oblastmi po podání návykových látek, mohou odhalit nové světlo o tom, jak je generovaný a udržovaný závislý stav, a interaktivních rolích, které hrají v tomto procesu senzibilizace a tolerance.

Reference