Experimenty s léčivými přípravky epigeneticky primují indukovatelnost genu Fosb v nucleus accumbens krys (2012)

Abstraktní

Úvod

Drogová závislost je charakterizována kompulzivním hledáním drog a užíváním navzdory závažným nepříznivým důsledkům (Kalivas a kol., 2005; Hyman a kol., 2006). Expozice chronických léků způsobuje přetrvávající změny v genové expresi ve ventrálním striatu (nebo nucleus accumbens; NAc) a dorzálním striatu (nebo kaudate putamen; CPu), striatálních strukturách zapojených do odměny a závislosti na drogách (Freeman a kol., 2001; Robinson a Kolb, 2004; Shaham a Hope, 2005; Bludiště a Nestler, 2011). AFosB, zkrácený a stabilní protein kódovaný bezprostředně časným genem, Fosbje dobře charakterizovaný transkripční faktor indukovaný v NAc a CPu chronickým vystavením prakticky všem drogám zneužívání, kde zprostředkovává senzitivní behaviorální reakce na opakované podávání léčiv (Nestler, 2008). Nicméně, zda předchozí chronická expozice léku zneužívání mění následnou indukci AFosB zůstává neznámá.

Nedávno jsme předpokládali, že modifikace chromatinu v reakci na chronickou expozici léku mohou změnit indukovatelnost specifických genů v cílových oblastech mozku (Robison a Nestler, 2011). Zvyšující se důkazy ukázaly, že drogy zneužívání po chronickém podávání mění strukturu a transkripční dostupnost chromatinu prostřednictvím řady typů modifikací, včetně fosforylace, acetylace a methylace histonových ocasů. Nedávnější práce v systémech buněčných kultur se zaměřila na nábor RNA polymerázy II (Pol II) na promotor „indukovatelných“ genů před jejich expresí, přičemž Pol II se trvale vázal na proximální promotorové oblasti a kolem místa startu transkripce (TSS). ) ve „zastaveném“ stavu (Jádro a Lis, 2008; Nechaev a Adelman, 2008). Předpokládá se, že aktivace zastaveného Pol II je zodpovědná za jeho únik z promotorů a oblastí TSS a jeho transkripci těchto „primovaných“ genů (Zeitlinger a kol., 2007; Saha a kol., 2011; Bataille a kol., 2012).

Zde ukážeme, že předchozí chronická expozice kokainu, po níž následuje prodloužená ochranná lhůta, mění induciblitu \ t Fosb K následnému podání kokainu se použije gen NAc, přičemž NAc je aktivován pro indukci, zatímco CPu není. Pak identifikujeme odlišné signatury chromatinu na Fosb promotor genu v NAc a CPu, které jsou spojeny s takovou aberantní indukovatelností. \ t Fosb gen, včetně náboru zastaveného Pol II na. \ t Fosb pouze proximální promotor v NAc, stejně jako změny v několika aktivačních nebo represivních modifikacích histonu v obou oblastech mozku. Tyto výsledky poskytují nový pohled na dynamiku chromatinu na úrovni Fosb genový promotor a poprvé označují mechanismus, kterým se blokuje Pol II Fosb pro větší aktivaci v NAc po opětovném vystavení kokainu.

Materiály a metody

výsledky

Větší Fosb indukovatelnost u NAc, ale ne CPu, u potkanů, kteří byli léčeni kokainem

Zkoumat vliv předchozího chronického průběhu kokainu, po němž následuje prodloužená doba vysazení na indukovatelnost Fosb krysy, které byly dříve injikovány ip dvakrát denně fyziologickým roztokem nebo kokainem (15 mg / kg) po dobu 10 dnů, byly podány provokační dávky léku po 28 dnech vysazení (Obr. 1A). Nejprve jsme změřili lokomoční odezvy u jedné skupiny zvířat, abychom potvrdili indukci lokomotorické senzibilizace předchozí expozicí kokainu, což je očekávaný trvalý důsledek podávání léků. Potkani, kteří byli léčeni kokainem a kteří byli léčeni na koži, vykazovali ekvivalentní výchozí lokomotorickou aktivitu, s kokainovou výzvou pro zvířata bez předchozího léku zvyšující jejich pohyb (Obr. 1B. Opakovaná měření dvoucestná ANOVA, léčba: F_1,66 = 30.42, p <0.0001; kokainová výzva: F_2,66= 58.39, p <0.0001; léčba x kokainová výzva: F_2,66= 8.56, p = 0.0005, Bonferroniho post-testy ^{^}p <0.001). Tato výzva kokainu vyvolala významně větší lokomotorickou aktivitu, tj. Senzibilizaci, u potkanů ​​se zkušenostmi s kokainem (Bonferroni post-testy * p <0.001).

  

Obrázek 1

Vliv předchozí chronické expozice kokainu na pohybovou aktivitu a. \ T Fosb indukce v NAc a CPu po opětovném vystavení léku

Pro vyhodnocení účinků tohoto režimu předběžné léčby kokainem na expresi AFosB v NAc a CPu jsme změřili protein AFosB imunohistochemickými metodami 24 h po tom, co byla zvířata bez předchozí léčby kokainem a kokainem léčena pomocí 0, 1, 3 nebo 6 denně. injekcí (15 mg / kg; viz Obr. 1A). Jak již bylo zjištěno (Nye a kol., 1995), Injekce kokainu 3 byly dostatečné k tomu, aby významně indukovaly protein AFosB v NAc a CPu u dosud neléčených zvířat a jeho akumulace zůstala významná i po 6 dnech injekcí kokainu (Obr. 1C. Opakovaná měření dvoucestná ANOVA, NAc jádro, léčba: F_1,28= 23.5, p <0.0001; kokainová výzva: F_3,28= 49.16, p <0.0001; léčba x kokainová výzva: F_3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc shell, ošetření: F_1,28= 18.69, p <0.0001; kokainová výzva: F_3,28= 31.52, p <0.0001; léčba x kokainová výzva: F_3,28= 3.21, p <0.05; CPu, léčba: F_1,28= 9.47, p <0.001; kokainová výzva: F_3,28= 19.74, p <0.0001; léčba x kokainová výzva: F_3,28= 0.94, p> 0.05. V post-testech NAc core, shell a CPu Bonferroni ^{^}p <0.05). U zvířat, která již měla zkušenosti s kokainem, nebyly žádné důkazy o přetrvávající indukci ΔFosB v NAc nebo CPu po 28 dnech vysazení, což odpovídá předchozím zprávám, že signál ΔFosB se do tohoto časového bodu plně rozptýlí (Nye a kol., 1995), tento důvod byl v této studii použit. Překvapivě však potkani, kteří byli léčeni kokainem a kteří dostávali injekci 3 nebo 6 kokainem, vykazovali signifikantně vyšší indukci AFosB proteinu v NAc, což je zřejmý účinek jak u subregionů jádra, tak u shell subregionů (Obr. 1C. Bonferroni post-testy * p <0.05). Naproti tomu u CPu nebyla pozorována žádná taková větší indukce proteinu AFosB; místo toho byla v této oblasti pozorována ekvivalentní indukce ΔFosB po 3 nebo 6 dnech injekčních dávek kokainu u dosud neléčených a nezkušených krys (Obr. 1C).

Abychom získali přehled o transkripčních změnách vyskytujících se v NAc a CPu v reakci na kokainovou výzvu, studovali jsme časový průběh (45, 90 a 180 min) indukovatelnosti transkriptů mRNA pro FosB a FosB na jednu injekci kokainu nebo fyziologického roztoku. potkanům bez předchozí léčby kokainu a zkušeným potkanům po 28 dnech vysazení (viz Obr. 1A). V porovnání s fyziologickým podnětem vyvolala provokační dávka kokainu rychlý nárůst hladin mRNA AFosB a FosB ve všech třech časových bodech jak u NAc, tak u CPu u zvířat dosud neléčených na kokain (Obr. 1D. Opakovaná měření jednosměrné ANOVA za časový bod; Bonferroni post-testy ^{^}p <0.05). V NAc jsme pozorovali větší indukci mRNA ΔFosB a FosB u zvířat, která již měla zkušenosti s kokainem, ve srovnání se zvířaty dosud neléčenými kokainem po provokaci kokainem, přičemž účinek byl významný po 90 minutách, zatímco na rozdíl od toho byla indukovatelnost mRNA ΔFosB a FosB v CPu významně poklesla u zvířat, která již měla zkušenosti s kokainem (Obr. 1D. Bonferroni post-testy ^%p = 0.08, * p <0.05).

Charakterizace upstream signálních drah u NAc a CPu u krys, u kterých byl zjištěn kokain

Jedno možné vysvětlení pro změnu indukovatelnosti Fosb gen v NAc a CPu po předchozím chronickém průběhu kokainu je to, že vzdálená historie expozice kokainu může vyvolat trvalé změny signálních drah, které jsou před Fosb indukce genu tak, že provokace kokainu pak indukuje gen aberantním stupněm. Pro studium této hypotézy jsme analyzovali dva transkripční faktory, SRF a CREB, u nichž bylo nedávno prokázáno, že jsou potřebné pro indukci kokainu AFosB v těchto oblastech mozku (Vialou a kol., 2012) spolu s proteinkinázami proti proudu, ERK a AKT, také zapojenými do účinku kokainu (Valjent a kol., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau a kol., 2009). Nepodařilo se nám zjistit žádné změny v celkových nebo fosforylovaných hladinách těchto různých proteinů, které by mohly vysvětlit změněnou indukčnost Fosb pozorovány žádné změny v SRF, CREB nebo AKT (Obr. 2B, C). Nedostatek změny v pSRF a pCREB v NAc v reakci na výzvu pro kokain je v souladu s nedávnou zprávou, která zjistila jak významně indukovanou pouze chronickým kokainem (Vialou a kol., 2012).

  

Obrázek 2

Účinek předchozí chronické expozice kokainu na kaskády molekulární signalizace nahoře v NAc a CPu

U NAc a CPu u dosud neléčených zvířat 20 min po počáteční expozici léku (Obr. 2A), jedna kokainová výzva snížila hladiny pERK42 / 44 (Obr. 2B, C. Dvoustranný Studentův t-test: * p <0.05). Existují předchozí zprávy o zvýšených hladinách pERK v těchto oblastech po akutním podání kokainu (Valjent a kol., 2000). To je obtížné srovnávat s jinými dokumenty zkoumajícími fosforylaci ERK v NAc během vysazení z opakovaných injekcí kokainu (Boudreau a kol., 2007; Shen et al., 2009), jako v naší studii byl pERK kvantifikován po 28 dnech vysazení a po podání kokainu nebo fyziologického roztoku. Relativní expozice kokainu u potkanů, kteří byli léčeni kokainem a po 28 dnech po vysazení, v porovnání s dosud neléčenými zvířaty, kteří zažili kokain, způsobila významné zvýšení hladin pERK42 / 44 v CPu (Obr. 2B, C. T-test studenta se dvěma ocasy: * p <0.05).

Chromatínová krajina Fosb genový promotor v NAc a CPu potkanů, kteří byli léčeni kokainem

Dále jsme zkoumali, zda změny v Fosb Genová indukovatelnost je spojena se změnami ve struktuře chromatinu. ChIP byl prováděn na NAc a CPu s použitím protilátek namířených proti třem dobře charakterizovaným formám histonových modifikací: trimethylace Lys4 histonu H3 (H3K4me3) asociovaného s genovou aktivací a H3K27me3 a H3K9me2 asociovaného s represí genů. Analyzovali jsme kokain-naivní a -zkušené krysy po 28 dnech vysazování buď bez nebo s provokační injekcí kokainu, kdy zvířata zkoumala 1 hod později (Obr. 3A). V NAc jsme nezjistili signifikantní změny ve vazbě žádné z těchto tří modifikací histonů na. \ T Fosb genového promotoru v nepřítomnosti kokainové výzvy, i když byl trend snížení hladin H3K9me2 (Obr. 3B-D. Studentský t-test se dvěma ocasy. ^#p = 0.2 ve srovnání s příslušnými kontrolami léků na léky). Tento účinek byl významný po provokaci kokainu a byl specifický pro proximální promotorovou oblast genu (Obr. 3C. * p <0.05). Zatímco hladiny H3K9me2 jsou u některých genů velmi nízké, Fosb genový promotor vykazuje znatelné hladiny této značky v NAc za kontrolních podmínek (Maze a kol., 2010, data nejsou ukázána). Naproti tomu v CPu jsme zjistili malý, ale významný pokles vazby H3K4me3 a zvýšení vazby H3K27me3 na adrese Fosb promotor v nepřítomnosti kokainové výzvy, účinky ztracené po expozici (\ tObr. 3D. * p <0.05).

  

Obrázek 3

Vliv předchozí chronické expozice kokainu na epigenetický priming. \ T Fosb gen v NAc a CPu

Dále jsme zkoumali vazbu Pol II na Fosb gen, založený na nedávných poznatcích v buněčné kultuře, že zastavení Pol II u TSS, které je charakterizováno jeho fosforylací na Ser 5 v jeho opakované oblasti CTD, je spojeno s primingem genů (viz Úvod). Analyzovali jsme tedy vazbu Pol II-pSer5 Fosb ve čtyřech odlišných oblastech genu (Obr. 3B). Tato analýza odhalila významné obohacení Pol II-pSer5 na Fosb v jeho proximální promotorové oblasti a kolem jeho TSS u NAc u zvířat léčených kokainem, po prodlouženém vysazení, v nepřítomnosti kokainové stimulace ve srovnání s kontrolami (\ tObr. 3E. * p <0.05). Toto obohacení nebylo patrné ve dvou oblastech těla genu Fosbv souladu s Pol II stalling popsaným v jednodušších experimentálních systémech. Je zajímavé, že po provokaci kokainem vazba Pol II-pSer5 stále vykazovala známky obohacení, i když již ne významně, při Fosb proximální promotorová oblast (Obr. 3E. ^%p = 0.1), ale vrátil se ke kontrolním úrovním v TSS. Zjištění v CPu byla více variabilní, přičemž nebyl pozorován jasný vzor vazby Pol II-pSer5.

Diskuse

Tato studie poskytuje nový pohled na trvalou regulaci Fosb týdnů po ukončení opakované expozice kokainu. Ukazujeme, že předchozí chronické podávání kokainu způsobuje Fosb V případě NAc je gen indukovatelnější, což vede k rychlejší akumulaci AFosB po opětovném vystavení léčivu. Vzhledem k převažujícímu důkazu, že indukce AFosB v NAc zprostředkovává senzitivní reakce na chování kokainu (Nestler, 2008), naše nálezy odhalily nový mechanismus pro rychlejší obnovení takových citlivých odpovědí po prodlouženém vysazení.

Prokázali jsme, že zvýšená indukce AFosB v NAc je spojena se změnami chromatinu na Fosb geny, u kterých by se očekávalo, že je připraví pro větší indukci. Ukazuje se tedy zvýšená vazba Pol II na proximální promotor a oblasti TSS genu, které jsou přítomné po 4 týdnech vysazení z předchozího chronického podávání kokainu. Takové obohacení Pol II v TSS se rychle ztrácí při expozici kokainu a Fosb indukce, konzistentní s modelem v buněčné kultuře, který se po aktivaci genu uvolňuje z IIS (viz Úvod). Výzva kokainu také indukuje rychlý pokles vazby H3K9me2 - známky potlačení genů - na Fosb promotor. Naopak jsme nezjistili žádnou trvalou indukci několika transkripčních faktorů nebo jejich upstream kináz, o nichž je známo, že zprostředkovávají Fosb indukce kokainem. Tyto výsledky podporují naši hypotézu, že zvýšená indukce AFosB v NAc je zprostředkována epigenetickým primingem Fosb přes upregulaci upstream událostí.

Pro CPu byly získány velmi odlišné výsledky. Nebylo prokázáno, že by Pol II stagnoval Fosb u potkanů, kteří byli léčeni kokainem před kokainovou výzvou, i když byly malé, ale významné modifikace histonů konzistentní s genovou represí: zvýšená vazba H3K27me3 a snížení vazby H3K4me3. Také nedošlo k žádné změně v upstream transkripčních faktorech nebo kinázách v souladu se sníženými Fosb indukce. Tato zjištění naznačují, že po chronickém podávání kokainu slouží epigenetické modifikace k tlumení Fosb indukovatelnost genu v CPu, na rozdíl od primingu pozorovaného v NAc. I když tyto účinky potlačují indukci AFosB mRNA po opětovném vystavení kokainu, nedochází ke ztrátě akumulace AFosB proteinu. Mechanismus, který je základem tohoto paradoxu, nyní vyžaduje další šetření.

Obecněji řečeno, naše výsledky podporují model, ve kterém změny v chromatinové krajině u specifických genů v odezvě na chronické podávání kokainu slouží k primárnímu nebo tupému ovlivnění těchto genů pro následnou indukci po opakované expozici léku. Takové změny chromatinu, které lze považovat za „epigenetické jizvy“, by byly vynechány v analýzách hladin mRNA genů v ustáleném stavu. Tímto způsobem, charakterizace epigenomu závislosti slibuje odhalit nové informace o molekulární patogenezi poruchy, která může být těžena pro vývoj nových léčebných postupů.

Poděkování

Reference