Účinek nadměrné exprese "FosB na signalizaci zprostředkovanou opioidním a kanabinoidním receptorem v nucleus accumbens (2011)

Neurofarmakologie. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

Zdroj

Ústav farmakologie a toxikologie a Ústav pro studium drog a alkoholu, Virginia Commonwealth University School of Medicine, Richmond, VA 23298, USA.

Abstraktní

Stabilní transkripční faktor ΔFosB je indukován v nucleus accumbens (NAc) chronickým vystavením několika zneužívatelným lékům a transgenní exprese ΔFosB v striatu zvyšuje obohacující vlastnosti morfinu a kokainuE. Mechanický základ těchto pozorování je však neúplný. Použili jsme bitransgenní myší model s indukovatelnou expresí ΔFosB in dopamin D (1) receptor / dynorfin obsahující striatální neurony k určení účinku exprese ΔFosB na signalizaci opioidních a kanabinoidních receptorů v NAc. Výsledky ukázaly, že aktivita G-proteinů zprostředkovaná mu opioidem a inhibice adenylylcyklázy byly zvýšeny v NAc myší, které exprimovaly ΔFosB. Podobně byla zvýšena inhibice kappa opioidu adenylylcyklázy u myší exprimujících ΔFosB. Naproti tomu signalizace zprostředkovaná kanabinoidním receptorem se nelišila mezi myší nadhodnocujícími ΔFosB a kontrolní myši. Ttato zjištění naznačují, že signalizace opioidních a kanabinoidních receptorů je diferencovaně modulována expresí ΔFosB a naznačují, že exprese ΔFosB může vyvolat některé z jeho účinků prostřednictvím zvýšené signalizace mu a kappa opioidního receptoru v NAc.

Klíčová slova: G-protein, adenylylcyklázu, striatum

1. Úvod

Opioidní receptory a kanabinoidní CB₁ receptory (CB₁R) jsou neurobiologické cíle pro dvě široce používané třídy léků, které zahrnují opiáty morfinu, heroinu a předpisu a marihuanu (Δ⁹-tetrahydrokanabinolu (THC). Akutní účinky opioidů a kanabinoidů jsou zprostředkovány receptory spojenými s G-proteinem, které aktivují primárně G_{i / o} proteiny a produkují následné efektorové odpovědi, jako je inhibice adenylylcyklázy (Childers, 1991, Childers a kol., 1992, Howlett a kol., 2002). Motor, poškození paměti a psychoaktivní účinky Δ⁹-THC jsou vyráběny CB₁R (Huestis a kol., 2001, Zimmer a kol., 1999), které jsou široce distribuovány v mozku, s vysokými hladinami bazálních ganglií, hippocampu a cerebellumu (Herkenham a kol., 1991). Analgetické a odměňující účinky většiny klinicky relevantních a zneužívaných opioidních léků jsou zprostředkovány hlavně mu opioidními receptory (MOR) (Matthes a kol., 1996), které jsou obohaceny o limbický systém a mozek (Mansour a kol., 1994). Mezolimbický systém složený z dopaminergních projekcí z ventrální tegmentální oblasti (VTA) až nucleus accumbens (NAc) hraje důležitou roli v odměňování účinku opiátů a kanabinoidů (Bozarth a Wise, 1984, Vaccarino a kol., 1985, Zangen a kol., 2006), stejně jako jiné drogy zneužívání (Koob a Volkow, 2010). Kromě toho se endogenní opioidní a kanabinoidní systémy podílejí na odměňování účinku několika tříd psychoaktivních léků (Maldonado a kol., 2006, Trigo a kol., 2010). Proto je důležité objasnit mechanismy, kterými se opiát a CB₁R signalizace jsou regulovány v NAc.

Hlavním problémem v oblasti zneužívání drog bylo zjištění proteinů, které zprostředkovávají přechod od akutních až po dlouhodobé účinky psychoaktivních léků. APK-1 transkripční faktor ΔFosB je zvláště zajímavý, protože je to stabilní zkrácený sestřihový variant produktu fosb genu, který se hromadí po opakované expozici zneužívání nebo přírodním odměnám (McClung a kol., 2004, Nestler, 2008, Nestler a kol., 1999). Zjistili jsme, že ΔFosB je indukován v mozku po opakované expozici morfinu, Δ⁹-THC, kokainu nebo ethanolu, přičemž každé léčivo produkuje jedinečný regionální vzorec exprese ΔFosB (Perrotti a kol., 2008). Důsledné zjištění u léčivých přípravků bylo, že ΔFosB byl vysoce indukován v striatu, kde všechny čtyři léky indukovaly ΔFosB v jádře NAc a všichni kromě Δ⁹-THC výrazně indukovala expresi v NAc skořápce a caudate-putamen.

Farmakologické studie ukázaly, že současné podávání dopaminu D₁ receptor (D₁R) antagonisty SCH 23390 blokovaly indukci ΔFosB v NAc a caudate-putamen po intermitentním podávání kokainu nebo morfinu, což naznačuje potenciální význam D₁R-exprimující neurony (Muller a Unterwald, 2005, Nye a kol., 1995). Účinek indukce ΔFosB na chování zprostředkované léčivem byl zkoumán pomocí bitransgenních myší, které exprimují ΔFosB v specifických neuronových populacích NAc a dorzálního striatu (Chen a kol., 1998). Myši, které exprimují ΔFosB v dynorfinu / D₁R pozitivní neurony v NAc a dorzální striatum (řada 11A) ukazují změněné reakce na léky zneužívání, zejména zvýšenou citlivost k odměňujícím účinkům kokainu nebo morfinu (Colby a kol., 2003, Kelz a kol., 1999, Zachariou a kol., 2006). Tyto změny se vyskytly v nepřítomnosti změn hladin MOR nebo různých podjednotek G-proteinů. Avšak hladiny dynorfinové mRNA byly sníženy u NAc myší exprimujících ΔFosB (Zachariou a kol., 2006), což naznačuje, že jedním z cílů ΔFosB je gen kódující endogenní opioidní peptid. Indukce ΔFosB může také vyvolat změny v chování regulací signalizace receptoru v NAc, ale tato možnost nebyla zkoumána. Proto předložené studie používaly model bitransgenního myší k určení, zda nadměrná exprese ΔFosB v dynorfinu / D₁R obsahující striatální neurony mění aktivitu G-proteinů zprostředkovanou MOR a inhibici adenylylcyklázy zprostředkovanou MOR a KOR v NAc. Účinek ΔFosB na CB₁R-zprostředkovaná G-proteinová aktivita byla také hodnocena, protože Δ⁹Podávání THC indukuje ΔFosB v NAc (Perrotti a kol., 2008) a je známo, že endokanabinoidní systém reguluje obvody odměňování mozku (Gardner, 2005, Maldonado a kol., 2006), ale účinek ΔFosB na endokanabinoidní systém nebyl zkoumán.

2. Materiály a metody

2.1. Reagencie

[³⁵S] GTPyS (1250 Ci / mmol), [a-³²P] ATP (800 Ci / mmol) a [³H] cAMP (26.4 Ci / mmol) byly zakoupeny od společnosti PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, GDP, cAMP, bovinní sérový albumin, kreatin fosfokinasa, papaverin, imidazol a WIN-55212-2 byly získány od společnosti Sigma Aldrich (St. Louis, MO). GTPyS byl zakoupen od firmy Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). Společnost DAMGO byla poskytnuta programem pro poskytování drog od Národního institutu pro zneužívání drog (Rockville, MD). Scintilační kapalina Econo-1 byla získána od firmy Fisher Scientific (Norcross, GA). Ecolite scintilační kapalina byla získána od ICN (Costa Mesa, CA). Všechny ostatní chemikálie byly získány od Sigma Aldrich nebo Fisher Scientific.

2.2. Myši

Mužské transgenní myši odvozené z NSE-tTA (linie A) × TetOp-ΔFosB (linie 11) byly generovány, jak je popsáno v Kelz et al. (Kelz a kol., 1999). Bitransgenní myši byly koncipovány a vyvedeny na doxycyklin (100 μg v pitné vodě) k potlačení exprese transgenu. Ve věku 8 byl doxycyklin vynechán z vody pro polovinu myší, aby se umožnila exprese transgenu, zatímco zbývající myši byly udržovány na doxycykinu k potlačení transgenu. Mozky byly shromážděny 8 týdny později, čas, ve kterém jsou transkripční účinky ΔFosB maximální (McClung a Nestler, 2003). Byla použita druhá transgenní myší linie, ve které je Δc-Jun, dominantní negativní antagonista c-Jun, exprimován v D₁R / dynorfin a D₂R / enkefalinových buněk striatu, hipokampu a parietální mozkové kůry (Peakman a kol., 2003). C-Jun a příbuzné proteiny rodiny Jun dimerizují s rodinnými proteiny Fos a váží se k AP-1 místu cílových genů pro regulaci transkripce. Nicméně zkrácení N-konce c-Jun (Δc-Jun) činí komplex transkripčně inaktivní a je schopen zablokovat DNA vazbu aktivních komplexů AP-1. Mužské transgenní myši odvozené z NSE-tTA (linie A) x TetOp-FLAG-Δc-Jun (řada E) byly generovány způsobem popsaným v Peakman et al. (Peakman a kol., 2003). Bitransgenní myši byly koncipovány a vyvedeny na doxycyklin (100 μg v pitné vodě) k potlačení exprese transgenu. Kočky byly odstaveny v 3 týdnech, genotypovány a rozděleny do skupin, přičemž polovina byla udržována na vodě obsahujících doxycyklin a polovinu na pravidelné pitné vodě, aby vyvolala expresi FLAG-Δc-Jun. Mozky byly shromážděny 6 týdny později, čas, kdy byly měřeny maximální hladiny FLAG-Δc-Jun (Peakman a kol., 2003). Všechny postupy na zvířatech byly prováděny v souladu s Návodem pro péči a používání laboratorních zvířat v National Institutes of Health.

2.3. Příprava membrán

Mozky byly uchovávány při -80 ° C až do dne testu. Před provedením testu byl každý mozek rozmrazen a NAc byl rozřezán na led. Každý vzorek byl homogenizován v 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, pH 7.4 (membránový pufr) s 20 tahy ze skleněného homogenizátoru při 4 ° C. Homogenát byl centrifugován při 48,000x g při teplotě 4 ° C pro 10 min, resuspendováno v membránovém pufru, opět centrifugován při 48,000 × g při 4 ° C pro 10 min a resuspendovány v 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (testovací pufr). Hladiny proteinu byly stanoveny metodou Bradford (Bradford, 1976) s použitím bovinního sérového albuminu (BSA) jako standard.

2.4. Agonist-Stimulated [³⁵S] GTPγS Vazba

Membrány byly před inkubací v 10 minutách při 30 ° C s adenosin-deaminázou (3 mU / ml) v testovacím pufru. Membrány (5-10 μg proteinu) byly potom inkubovány za 2 hodinu při 30 ° C v testovacím pufru obsahujícím 0.1% (hmotnost / objem) BSA, 0.1 nM [³⁵S] GTPγS, 30 μM GDP a adenosin deaminázy (3 mU / ml) s příslušnými koncentracemi DAMGO nebo WIN55,212-2 a bez nich. Nešpecifická vazba byla měřena pomocí 20 μM GTPγS. Inkubace byla ukončena filtrací přes filtry ze skleněných vláken GF / B, následovalo promytí 3 s 3 ml ledově chladného 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. Navázaná radioaktivita byla stanovena kapalinovou scintilační spektrofotometrií po extrakci filtrů přes noc v Econo-1 scintilační kapalině.

2.5. Stanovení adenylylcyklázy

Membrány (5-25 μg protein) byly předem inkubovány s adenosin-deaminázou, jak je popsáno výše, a poté inkubovány za 15 min při 30 ° C za přítomnosti nebo nepřítomnosti 1M forskolinu s nebo bez DAMGO, U50,488H nebo WIN55,212-2 v testovacím pufru obsahujícím 50 uM ATP, [a-³²(1.5 ™), 0.2 mM DTT, 0.1 mM DTT, 50% (hmotn./obj.) BSA, 50 μM cyklického AMP, 0.2 μM GTP, 5 mM papaverin, 20 mM fosfokreatinu, 3 jednotek / ml kreatinfosfokinázy a adenosin deaminázy / ml) v konečném objemu 100 μl. Za těchto podmínek celkový [α-³²P] cAMP byl obecně nižší než 1% z celkového množství přidaného [a-³²P] ATP v každém vzorku. Reakce byla ukončena vařením pro 3 min a [³²P] Cyklický AMP byl izolován metodou dvojitého sloupce (Dowex a oxid hlinitý) Salomonu (Salomon, 1979). [³H] cAMP (10,000 dpm) byla přidána do každé zkumavky před sloupcovou chromatografií jako interním standardem. Radioaktivita byla stanovena kapalinovou scintilační spektrofotometrií (účinnost 45% pro ³H) po rozpuštění 4.5 ml eluátu v 14.5 ml scintilační kapaliny Ecolite.

2.6. Analýza dat

Pokud není uvedeno jinak, údaje jsou uváděny jako střední hodnoty ± SE oddělených experimentů 4-8, z nichž každá byla provedena trojmo. Net-stimulated [³⁵S] GTPyS vazba se vypočítá jako vazba stimulovaná agonisty mínus bazální vazba. Čistá forskolinem stimulovaná aktivita adenylylcyklázy je definována jako forskolinem stimulovaná aktivita - bazální aktivita (pmol / mg / min). Procento inhibice aktivity adenylylcyklázy stimulované forskolinem je definováno jako (čistá aktivita stimulovaná forskolinem v nepřítomnosti agonisty - čistá forskolinem stimulovaná aktivita za přítomnosti agonisty / čisté forskolinem stimulované aktivity v nepřítomnosti agonisty) X 100. Všechny křivkové a statistické analýzy byly provedeny pomocí Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Křivky koncentračního účinku byly analyzovány iterativní nelineární regresí za účelem získání EC₅₀ a E_max hodnoty. Statistická významnost údajů o koncentračním účinku byla určena dvoustrannou analýzou rozptylu (ANOVA), která použila agonistickou dávku a indukci genu (zapnuto nebo vypnuto) jako hlavní faktory. Statistická významnost hodnot křivky (E_max nebo EC₅₀) byl stanoven nepárovým dvoustranným Studentovým t-testem, s použitím Welchovy korekce nebo druhé odmocniny transformace dat, kde je to nutné pro korekci nerovných odchylek (detekovaných F-testem) v EC₅₀ hodnoty.

3. Výsledek

3.1. Účinek exprese ΔFosB na aktivaci G-proteinů zprostředkovaných opioidním a kanabinoidním receptorem

Určit, zda MOR- nebo CB₁R-zprostředkovaná aktivace G-proteinu byla změněna indukovatelnou transgenní expresí ΔFosB v NAc, stimulovaném agonistou [³⁵S] GTPyS vazba byla zkoumána v izolovaných membránách připravených z této oblasti bitransgenních myší podmíněně exprimujících (ΔFosB on) nebo neexprimujících (ΔFosB off) transgenu ΔFosB. MOR-selektivní enkefalinový analog DAMGO byl použit pro aktivaci MOR a kanabinoid aminoalkylindol WIN55,212-2 byl použit pro aktivaci CB₁R. Tyto ligandy byly dříve prokázány jako plné agonisty u MOR a CB₁R, respektive (Breivogel a kol., 1998, Selley a kol., 1997). Nebylo možné prověřit aktivitu G-proteinů zprostředkovanou KOR, protože signál je příliš malý v mozku hlodavců (Childers a kol., 1998). Výsledky ukázaly na koncentraci závislou stimulaci aktivity G-proteinu jak DAMGO, tak WIN55,122-2 v NAc z ΔFosB off a ΔFosB na myších (Obrázek 1). Pro aktivitu stimulovanou pomocí DAMGO (Obrázek 1A), obousměrná ANOVA údajů o koncentračním účinku odhalila významné hlavní účinky stavu ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) a koncentrace DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) bez významná interakce (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Nelineární regresní analýza křivek koncentrace-účinek odhalila významně vyšší DAMGO E_max hodnota v ΔFosB na myších (E_max = Stimulace 73 ± 5.2%) ve srovnání s myšími, u kterých byla podána ΔFosB (E_max = 56 ± 4.1% stimulace; p <0.05 odlišné od ΔFosB u myší Studentovým t-testem). DAMGO EC₅₀ Hodnoty nukleotidů se liší mezi ΔFosB on a myšími nefRB (302 ± 72 nM versus 212 ± 56 nM, respektive p = 0.346).

Účinek exprese ΔFosB na agonisty stimulované [³⁵S] GTPyS v NAc. Membrány z myší s expresí ΔFosB (ΔFosB on) nebo kontrolních (ΔFosB off) byly testovány jak je popsáno v metodách s použitím různých koncentrací ...

Na rozdíl od výsledků získaných u agonisty MOR DAMGO, nebyly pozorovány žádné rozdíly v aktivitě G-proteinů závislé na stavu podle ΔFosB u kanabinoidního agonisty WIN55,212-2Obrázek 1B). Obousměrná ANOVA údajů o koncentračním účinku WIN55,212-2 odhalila významný hlavní účinek koncentrace WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), ale nikoli na stav ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) a nedošlo k žádné interakci (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Podobně nebyl žádný účinek statusu ΔFosB na WIN55,212-2 E_max (103 ± 6% versus 108 ± 8% stimulace u myší na IFF a myší, p = 0.813 podle Studentova t-testu) nebo EC₅₀ (103 ± 20 nM versus 170 ± 23 nM u myší myší a myší s ΔFosB, p = 0.123).

Na základě tvaru křivek a skutečnosti, že naše předchozí studie prokázaly dvojfázové křivky koncentrace-účinku WIN55,212-2 v mozku (Breivogel a kol., 1999, Breivogel a kol., 1998) byly také analyzovány křivky WIN55,212-2 pomocí dvoustránkového modelu. Analýza průměrovaných dat ukázala mírné zlepšení dobrého přizpůsobení pomocí modelu dvou míst (R² = 0.933 a 0.914, součet čtverců = 3644 a 5463 u myší typu ΔFosB zapnuto a vypnuto) ve srovnání s modelem jednoho místa (R² = 0.891 a 0.879, součet čtverců = 6561 a 6628 u myší na myších myších myších a myších myší). Nebyly však zjištěny žádné významné rozdíly mezi ΔFosB on a myší v E_max nebo EC₅₀ hodnoty míst s vysokou nebo nízkou účinností (Doplňková tabulka 1), ačkoli byl trend směrem k nižšímu ES₅₀ hodnota na místě s vysokou účinností u myší s ΔFosB na (EC₅₀vysoký = 28.0 ± 10.6 nM) ve srovnání s těmi s vypnutým ΔFosB (EC₅₀vysoký = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Kromě toho nebyl žádný účinek stavu ΔFosB na bazální [³⁵S] GTPyS v membránách NAc (253 ± 14 versus 226 ± 14 fmol / mg v ΔFosB on a off myší, p = 0.188). Tyto údaje ukazují, že indukovatelná transgenní exprese ΔFosB v NAc myší zvýšila aktivaci G-proteinů zprostředkovanou MOR bez významného ovlivnění CB₁R-zprostředkovanou nebo bazální G-proteinovou aktivitou.

3.2. Účinek ΔFosB na inhibici adenylylcyklázy zprostředkovanou opioidním a kanabinoidním receptorem

Pro vyhodnocení vlivu indukovatelné transgenní exprese ΔFosB na modulaci downstream efektorové aktivity MOR a CB₁R, byla inhibována aktivita adenylyl cyklázy stimulovaná 1 uM forskolinem v membránách NAc. Kromě MOR a CB₁R-zprostředkovanou inhibici aktivity adenylylcyklázy byly také zkoumány účinky KOR aktivity za použití KOR-selektivního plného agonistu U50,488 (Zhu a kol., 1997), protože předchozí výsledky ukázaly, že dynorfinová mRNA byla cílem pro ΔFosB v bitransgenním modelu (Zachariou a kol., 2006). Výsledky ukázaly, že DAMGO, U50,488 a WIN55,212-2 produkují inhibici aktivity adenylylcyklázy závislých na koncentraci v obou buňkách ΔFosB off a ΔFosB na myších (Obrázek 2). Dvojcestná data ANOVA o koncentraci DAMGO (Obrázek 2A) odhalil významné hlavní účinky stavu ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) a koncentrace DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), ale žádná významná interakce (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). Nelineární regresní analýza křivek DAMGO koncentrace-účinek odhalila významně nižší DAMGO EC₅₀ hodnota v ΔFosB u myší (101 ± 11 nM) ve srovnání s ΔFosB u myší (510 ± 182 nM, p <0.05 podle studentova t-testu). V DAMGO E však nebyl žádný významný rozdíl_max (20.9 ± 1.26% versus 19.8 ± 1.27% inhibice u myší na myších myších myších a / nebo myší, p = 0.534).

Účinek exprese ΔFosB na inhibici aktivity adenylylcyklázy v NAc. Membrány z myší exprimujících ΔFosB (ΔFosB on) nebo kontrolní (ΔFosB off) byly testovány jak je popsáno v metodách v přítomnosti 1 uM ...

KOR-zprostředkovaná inhibice adenylylcyklázy se také lišila jako funkce indukovatelné transgenní exprese ΔFosB (Obrázek 2B). Obousměrná ANOVA dat koncentrace-účinek U50,488 0.0006 ukázala významné hlavní účinky stavu ΔFosB (p = 14.53, F = 1, df = 50,488) a koncentrace U0.0001 26.48 (p <3, F = 0.833, df = 0.289) , bez významné interakce (p = 3, F = 50,488, df = XNUMX). Nelineární regresní analýza křivek koncentrace-účinek odhalila větší UXNUMX XNUMX E._max hodnota v ΔFosB u myší (18.3 ± 1.14% inhibice) ve srovnání s ΔFosB u myší (12.5 ± 2.03% inhibice; p <0.05 odlišné od ΔFosB v Studentovým t-testem), bez významného rozdílu v U50,488 EC₅₀ (310 ± 172 nM versus 225 ± 48 nM u myší myší a myší s ΔFosB, p = 0.324).

Na rozdíl od účinků pozorovaných u MOR a KOR nebyl žádný významný účinek indukce transgenní exprese ΔFosB na inhibici adenylylcyklázy kanabinoidním agonistou WIN55212-2Obrázek 2C). Obousměrná ANOVA údajů o koncentračním účinku WIN55,212-2 ukázala významný účinek koncentrace léčiva (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), ale nikoli na stav ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) ani nedošlo k významné interakci (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Kromě toho neexistoval žádný účinek statusu AFosB na bazální nebo forskolinem stimulovanou aktivitu adenylyl cyklázy v nepřítomnosti jakéhokoli agonisty. Bazální aktivita adenylylcyklázy byla 491 ± 35 pmol / mg / min v AFOS u myší ve srovnání s 546 ± 44 v AFOS u myší (p = 0.346 podle Studentova t-testu). Podobně byla aktivita adenylylcyklázy v přítomnosti 1 uM forskolinu 2244 ± 163 pmol / mg / min v ΔFosB u myší oproti 2372 ± 138 pmol / mg / min v ΔFosB u myší (p = 0.555).

3.3. Účinek ΔcJun na inhibici adenylylcyklázy zprostředkovanou opioidním a kanabinoidním receptorem

Protože indukovatelná transgenní exprese ΔFosB zvýšené transdukce inhibičního signálu z MOR a KOR na adenylylcyklázu v NAc, bylo zajímavé určit, zda by dominantní negativní inhibitor transkripce zprostředkované ΔFosB moduloval signalizaci opioidního receptoru opačným způsobem. Při řešení této otázky byla zkoumána inhibice aktivity adenylyl cyklázy stimulované forskolinem pomocí DAMGO a U50,488 v membránách připravených z NAc bitransgenních myší podmíněně exprimujících ΔcJun. Výsledky neprokázaly významný účinek exprese ΔcJun na inhibici aktivity adenylylcyklázy MOR nebo KOR (Obrázek 3). Obousměrná ANOVA křivek DAMGO koncentrace-účinek vykázala významný hlavní účinek koncentrace DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), ale nikoli stavu ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) a nedošlo k žádné významné interakci (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Podobně nebyl žádný významný rozdíl v E._max nebo EC₅₀ hodnoty mezi myší s ΔcJun na (E_max = 23.6 ± 2.6%; ES₅₀ = 304 ± 43 nM) nebo ΔcJun vypnuto (E_max = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; ES₅₀ = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Podobné výsledky byly pozorovány u U50,488 0.0001, takže obousměrná ANOVA křivek koncentrace a účinku vykázala významný účinek koncentrace (p <11.94, F = 6, df = 0.127), ale nikoli na stav ΔcJun (p = 2.391) , F = 1, df = 0.978) a nedošlo k žádné významné interakci (p = 0.190, F = 6, df = XNUMX). Stejně tak nebyly žádné významné rozdíly v E_max nebo EC₅₀ hodnoty mezi myší s ΔcJun na (E_max = 14.8 ± 2.9%; ES₅₀ = 211 ± 81 nM) nebo vypnuto (E_max = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; ES₅₀ = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Účinek exprese ΔcJun na inhibici aktivity adenylylcyklázy v NAc. Membrány z myší exprese ΔcJun (ΔcJun on) nebo kontrolní (ΔcJun off) byly inkubovány v přítomnosti DAMGO (A), U50,488H (B) nebo WIN55,212-2 ...

Exprese ΔcJun také významně neovlivnila inhibici adenylylcyklázy v NAc kanabinoidním agonistou. Obousměrná ANOVA křivek účinku koncentrace WIN55,212-2 ukázala významný hlavní účinek koncentrace WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), ale nikoli genotypu (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) a nedošlo k žádné významné interakci (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Stejně tak nebyly žádné významné rozdíly ve WIN55,212-2 E_max (13.0 ± 2.3% a 13.6 ± 0.9% inhibice v ΔcJun na protilázských myších, p = 0.821) a nebo EC₅₀ (208 ± 120 nM a 417 ± 130 nM v ΔcJun na protilázských myších, p = 0.270). Ačkoli byl u myší s expresí ΔcJun pozorován mírný trend ke snížení účinnosti WIN55,212-2, transgén významně nezměnil kanabinoidní inhibici adenylylcyklázy. Kromě toho nebyl žádný účinek stavu ΔcJun na bazální nebo forskolinem stimulovanou aktivitu adenylylcyklázy. Základní aktivita adenylylcyklázy byla 1095 ± 71 pmol / mg / min a 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) u myší s ΔcJun zapnutou nebo vypnutou. Aktivita adenylylcyklázy stimulovaná přípravkem 1 μM forskolin byla 4185 ± 293 pmol / mg / min versus 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) u myší s ΔcJun zapnutým nebo vypnutým.

3.4. Diskuse

Výsledky této studie odhalily zvýšenou aktivitu G-proteinů zprostředkovanou MOR a inhibici adenylylcyklázy v NAc myší s indukovatelnou transgenní expresí ΔFosB v dynorfin / D₁R obsahující neurony. KOR-zprostředkovaná inhibice aktivity adenylylcyklázy byla také zvýšena u NAc myší exprimujících ΔFosB, což naznačuje, že ΔFosB reguluje endogenní opioidní systém v NAc. DAMGO E_max hodnota byla vyšší u MOR-stimulovaných [³⁵S] GTPyS a jeho EC₅₀ hodnota byla nižší u inhibice adenylylcyklázy u myší s nadměrnou expresí ΔFosB ve srovnání s kontrolními myšimi. Tato zjištění naznačují možnost použití receptorové rezervy pro efektorovou modulaci, ale ne aktivaci G-proteinů za zkoumaných podmínek testu. Zjištění, že maximální inhibice adenylylcyklázy agonistou KOR byla ovlivněna expresí ΔFosB, naznačuje nízkou receptorovou rezervu pro odpověď zprostředkovanou KOR, což je v souladu s nízkou úrovní KOR vazebných míst v myším mozku (Unterwald a kol., 1991). Naproti tomu CB₁R-zprostředkovaná G-proteinová aktivita a inhibice adenylylcyklázy nebyla ovlivněna expresí ΔFosB, což naznačuje, že opioidní a kanabinoidní systémy se liší v reakci na ΔFosB v těchto neuronech NAc.

Účinek ΔFosB na signalizaci zprostředkovanou opioidním receptorem je v souladu s naší předchozí zprávou, že exprese ΔFosB v striatu měnila akutní a chronické účinky morfinu (Zachariou a kol., 2006). Jedním zjištěním této studie bylo, že myši s transgenní expresí ΔFosB v dynorfin / D₁R striatální neurony byly citlivější na morfin v místě kondicionování než kontrolní. Navíc tento účinek byl napodoben virálně zprostředkovanou expresí ΔFosB místně specifickou injekcí do NAc. Tato pozorování jsou v souladu s aktuálními výsledky, které ukazují zvýšené signalizace MOR v NAc.

Předtím jsme identifikovali kódování genu dynorfin jako cíl pro ΔFosB a navrhl, že redukovaný dynorfin by byl v souladu se zvýšenou obohacujícími vlastnostmi morfinu u bitransgenních myší ΔFosB (Zachariou a kol., 2006). Dosavadní výsledky ukazují, že KOR-zprostředkovaná inhibice adenylylcyklázy v NAc je zvýšena u myší exprimujících ΔFosB, což může odrážet kompenzační zvýšení citlivosti KOR po redukovaném dynorfinu. Předchozí studie prokázaly, že KOR byl v některých oblastech mozku myší s prodyrinfinem vyřazeným z mozku upregulován, včetně NAc (Clarke a kol., 2003).

Na rozdíl od ΔFosB indukovatelná transgenní exprese ΔcJun, dominantní negativní zkrácený mutant vazebného partnera ΔFosB cJun, nezměnila inhibici adenylylcyklázy agonisty MOR nebo KOR. Tyto výsledky naznačují, že bazální hladiny exprese ΔFosB, které jsou relativně nízké, hrají významnou roli při udržování signalizace opioidního receptoru na této úrovni signální transdukce v NAc. Skutečnost, že podmíněný odměňující účinek morfinu byl snížen expresí ΔcJun v naší předchozí studii (Zachariou a kol., 2006) naznačuje, že morfinová indukce ΔFosB během procesu kondicionování je důležitá při regulaci behaviorálních odpovědí na léčivo nebo že transkripční účinky ΔFosB jiné než ty, které ovlivňují proximální signalizaci opioidními receptory, mohou ovlivnit opioidní odměnu. V každém případě výsledky této studie jasně ukazují, když je exprese ΔFosB zvýšena nad bazální hladiny v striatálním dynorfinu / D₁R-exprimující neurony, dochází k silnému zvýšení vazby MOR a KOR na inhibici adenylylcyklázy v NAc.

Mechanismy, kterými jsou MOR a KOR zprostředkovaná signalizace rozšířena o nadměrnou expresi ΔFosB, jsou nejasné, ale předtím jsme prokázali, že hladiny MOR,³H] naloxonu se v NAc na AFosB liší od myší (Zachariou a kol., 2006). Stejná studie zjistila, že Gα_iHodnoty 1 a 2 proteinu nebyly v této oblasti ovlivněny expresí ΔFosB. Nicméně předchozí analýza genových expresních polí ukázala, že Gα_o mRNA byla upregulována v NAc dFosB na myších (McClung a Nestler, 2003). Bude zajímavé v budoucích studiích komplexně zkoumat vliv transgenní exprese ΔFosB na expresi G-proteinové podjednotky na úrovni proteinů, stejně jako na expresi mnoha modulujících proteinů G-proteinů.

Je zajímavé, že exprese ΔFosB nezvýšila CB₁R-zprostředkovanou signalizaci v NAc. Je možné, že změny v CB₁R signalizace se vyskytuje v diskrétní populaci neuronů, která je zakryta v celém přípravku NAc. Například administrace Δ⁹- THC významně indukoval ΔFosB v jádru, ale ne ve skořápce NAc (Perrotti a kol., 2008). jábylo prokázáno, že výzva s Δ⁹-THC po opakovaném podání Δ⁹-THC zvýšilo uvolňování dopaminu v jádře NAc, ale snížilo uvolnění v skořápce (Cadoni a kol., 2008). Je také důležité poznamenat, že řada 11A bitransgenních myší exprimuje ΔFosB pouze v dynorfinu / D₁R pozitivní středně špinavé neurony striatum, ale CB₁R jsou vyjádřeny v dynorfinu / D₁R a enkefalin / D₂R pozitivních striatálních neuronů (Hohmann a Herkenham, 2000), jakož i na terminálech kortikálních aferentů (Robbe a kol., 2001). Exprese dominantního negativního regulátoru transkripce zprostředkované ΔFosB, ΔcJun, také neměla významný vliv na signalizaci kanabinoidního receptoru, ačkoliv ΔcJun je indukovatelně exprimován jak v D₁ a D₂- obsahují populace středně špinavých neuronů u těchto myší (Peakman a kol., 2003). Je však možné, že bazální exprese ΔFosB je dostatečně nízká, že ΔcJun neovlivní signalizaci receptoru, jak to naznačují výsledky s MOR a KOR. Je také možné, že CB₁R signalizaci je skromně zesílena bazální expresí ΔFosB, takže další zvýšení exprese ΔFosB nebo blokování jejích účinků s ΔcJun mělo jen nepatrné účinky, které nedosáhly úrovně statistické významnosti. Nepřímou podporu této interpretace lze vidět porovnáním WIN55,212-2 EC₅₀ hodnoty mezi myšími exprimujícími ΔcJun versus ΔFosB. Poměr WIN55,212-2 EC₅₀ hodnota pro inhibici adenylylcyklázy u myší s indukovanou expresí ΔcJun na jeho EC₅₀ hodnota pro aktivaci G-proteinu u myší s indukovanou expresí ΔFosB byla 4.0, zatímco stejný poměr u myší bez indukce obou transgenů byl 1.2.

Alternativně mohou kanabinoidy indukovat expresi ΔFosB bez přímého účinku na CB₁R signalizace. V tomto scénáři by kanabinoidy mohly modulovat reakci na psychoaktivní účinky jiných léků pomocí transkripční regulace zprostředkované ΔFosB. IVe skutečnosti správa d⁹-THC vyvolává křížovou senzibilizaci vůči opioidům a amfetaminu (Cadoni a kol., 2001, Lamarque a kol., 2001), v souladu s touto hypotézou. Navíc se uvádí, že opakované podávání kanabinoidního agonisty CP55,940 zvyšuje aktivitu G-proteinu zprostředkovanou MOR v NAc, podobně jako u myší indukujících expresi ΔFosB v předkládané studii (Vigano a kol., 2005). Vliv výrazu ΔFosB na Δ⁹-THC-zprostředkované chování nebylo vyhodnoceno, ale současné výsledky nevylučují interakci. Výsledky této a naší předchozí studie (Zachariou a kol., 2006) ukazují indukce DFosB v MOR a KOR / dynorfin v striatu. Odměňující účinky Δ⁹-THC, měřeno podle místa, jsou zrušeny u MOR nulových myší, zatímco delece KOR atenuovaného Δ⁹- THC umístila odpor a odhalila Δ⁹-TM místo preference (Ghozland a kol., 2002). Podobně kondici s kondicionovaným místem na Δ⁹-THC chybí při pro-dynorfinovém vyřazení ve srovnání s divokými myší (Zimmer a kol., 2001). Z těchto údajů vyplývá, že Δ⁹-THC může být více odměňující po indukci ΔFosB a následné indukci signalizace MOR se snížením exprese dynorfinu.

V souhrnuy, výsledky této studie ukázaly, že exprese ΔFosB v D₁R / dynorfin pozitivní striatální neurony zlepšily signalizaci zprostředkovanou MOR a KOR na úrovni inhibice aktivity adenylylcyklázy zprostředkované G-proteinem v NAc. Toto zjištění je v souladu se studiemi, které prokázaly úlohu endogenního opioidního systému za odměnu (Trigo a kol., 2010) a poskytnout potenciální mechanismus pro efekty zprostředkované ΔFosB na odměně. Naproti tomu CB₁R-zprostředkovaná signalizace v NAc nebyla signifikantně ovlivněna striatální expresí ΔFosB za zkoumaných podmínek, ačkoliv jsou pro stanovení účinku indukce ΔFosB na endocannabinoidní systém odůvodněny další studie.

Významné body výzkumu

MOR signalizace je zvýšena v nucleus accumbens myší, které exprimují ΔFosB
KOR inhibice adenylylcyklázy je také zvýšena u myší exprimujících ΔFosB
Exprese ΔFosB nezmění CB₁R signalizace v nucleus accumbens

Doplňkový materiál

01

Klikněte zde pro zobrazení.^{(45K, pdf)}

Poděkování

Autoři děkují Hengjun He, Jordan Cox a Aaron Tomarchio za technickou pomoc s [³⁵S] GTPyS. Tato studie byla podpořena USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) a P01 DA08227 (EJN).

Poznámky pod čarou

Zřeknutí se odpovědnosti vydavatele: Jedná se o soubor PDF s neupraveným rukopisem, který byl přijat k publikaci. Jako službu pro naše zákazníky poskytujeme tuto ranní verzi rukopisu. Rukopis podstoupí kopírování, sázení a přezkoumání výsledného důkazu před jeho zveřejněním ve své konečné podobě. Vezměte prosím na vědomí, že během výrobního procesu mohou být objeveny chyby, které by mohly ovlivnit obsah, a veškeré právní odmítnutí týkající se časopisu.

Reference

Bozarth MA, Wise RA. Anatomicky odlišné oblasti opiátových receptorů zprostředkovávají odměnu a fyzickou závislost. Science. 1984;224: 516-517. [PubMed]
Bradford MM. Rychlá a citlivá metoda pro kvantifikaci mikrogramových množství bílkovin s využitím principu vazby na proteinové barvivo. Anální. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Chronická delta⁹-tetrahydrokanabinolu způsobuje časově závislou ztrátu proteinů G-aktivovaných kanabinoidních receptorů v mozku. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Účinnost kanabinoidního receptorového agonisty pro stimulaci [³⁵S] GTPyS vázané na membrány krysích mozkových buněk koreluje s poklesem afinity indukované agonisty. J. Biol. Chem. 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Behaviorální senzitizace po opakované expozici přípravku Delta 9-tetrahydrokanabinol a křížová senzitizace s morfinem. Psychofarmakologie (Berl) 2001;158: 259-266. [PubMed]
Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Behaviorální senzitizace na delta 9-tetrahydrokanabinol a křížová senzitizace morfinem: diferenciální změny v akumulačním skořápce a jádrovém přenosu dopaminu. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgenní zvířata s indukovatelnou cílenou expresí genu v mozku. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495-503. [PubMed]
Childers SR. Druhé posly spojené s opioidním receptorem. Life Sci. 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S. Opioid a inhibice kanabinoidního receptoru adenylylcyklázy v mozku. Ann. NY Acad. Sci. 1992;654: 33-51. [PubMed]
Childers SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Kappa opioidní receptorová stimulace [³⁵S] GTPyS v mozku morčat: Nedostatek důkazů pro kappa₂selektivní aktivaci G-proteinů. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kuchyně I. Regionální selektivní upregulace mikro-, delta- a kappa-opioidních receptorů, ale nikoliv receptorů 1 podobných opioidním receptorům v mozku enkefalinu a knockoutových myší s dynorfinem. Neurovědy. 2003;122: 479-489. [PubMed]
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadměrná exprese DeltaFosB specifického pro typ buňky zvyšuje motivaci kokainu. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
Gardner EL. Endokanabinoidní signalizační systém a odměna mozku: důraz na dopamin. Pharmacol. Biochem. Behav. 2005;81: 263-284. [PubMed]
Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Motivační účinky kanabinoidů jsou zprostředkovány mu-opioidními a kappa-opioidními receptory. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Charakterizace a lokalizace kanabinoidních receptorů v mozku krys: kvantitativní in vitro autoradiografická studie. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
Hohmann AG, Herkenham M. Lokalizace cannabinoidní CBR (1) receptorové mRNA v neuronálních subpopulacích krysího striatu: double-label in situ hybridizační studie. Synapse. 2000;37: 71-80. [PubMed]
Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. Mezinárodní farmakologická unie. XXVII. Klasifikace kanabinoidních receptorů. Farmakologický přehled. 2002;54: 161-202.
Huestis MA, Gorelick DA, Heishman SJ, Preston KL, Nelson RA, Moolchan ET, Frank RA. Blokování účinků kouření marihuany selekčním antagonistou kanabinoidního receptoru CB1 SR141716. Oblouk. Gen. Psychiatrie. 2001;58: 322-328. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Exprese transkripčního faktoru deltaFosB v mozku řídí citlivost na kokain. Příroda. 1999;401: 272-276. [PubMed]
Koob GF, Volkow ND. Neurocircuitry závislosti. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217-238. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Chronická léčba Delta (9) -tetrahydrokanabinolem zvyšuje lokomotorickou odpověď na amfetamin a heroin. Důsledky zranitelnosti vůči drogové závislosti. Neurofarmakologie. 2001;41: 118-129. [PubMed]
Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Zapojení endokanabinoidního systému do závislosti na drogách. Trendy Neurosci. 2006;29: 225-232. [PubMed]
Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. mu-opioidní receptorové exprese mRNA v potkaní CNS: porovnání s vazbou mu-receptoru. Brain Res. 1994;643: 245-265. [PubMed]
Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, Kuchyň I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Ztráta analgezie indukovaná morfinem, účinek odměn a abstinenční příznaky u myší postrádajících gen u-opioidního receptoru. Příroda. 1996;383: 819-823. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulace genové exprese a odměny kokainu CREB a DeltaFosB. Nat. Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulární přepínač pro dlouhodobou adaptaci v mozku. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;132: 146-154. [PubMed]
Muller DL, Unterwald EM. Dopaminové receptory D1 modulují indukci deltaFosB v striatum krys po přerušovaném podání morfinu. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
Nestler EJ. Posouzení. Transkripční mechanismy závislosti: role DeltaFosB. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: molekulární mediátor dlouhodobé neurální a behaviorální plasticity. Brain Res. 1999;835: 10-17. [PubMed]
Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologické studie regulace chronické indukce antigenu FOS souvisejícího s kokainem v striatu a nucleus accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibilní exprese dominantního negativního mutantu c-Jun u transgenních myší specifickou pro oblast mozku snižuje citlivost na kokain. Brain Res. 2003;970: 73-86. [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Rozlišující vzory indukce DeltaFosB v mozku drogami zneužívání. Synapse. 2008;62: 358-369. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. Lokalizace a mechanismy působení kanabinoidních receptorů na glutamatergických synapsech myších nucleus accumbens. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
Salomon Y. Analýza anylátové cyklázy. Adv. Cyclic Nucleotide Res. 1979;10: 35-55. [PubMed]
Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Liu Q, Childers SR. Mu opioidní receptor stimulovaný [³⁵S] GTPyS v thalamu potkana a kultivovaných buněčných liniích: mechanizmy transdukce signálu, které jsou základem účinnosti agonisty. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87-96. [PubMed]
Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. Endogenní opioidní systém: běžný substrát v závislosti na drogách. Alkohol drog závisí. 2010;108: 183-194. [PubMed]
Unterwald EM, Knapp C, Zukin RS. Neuroanatomická lokalizace k1 a k2 opioidních receptorů v mozku krys a morčat. Brain Res. 1991;562: 57-65. [PubMed]
Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Blokáda opiátových receptorů nucleus accumbens zmírňuje intravenózní odměnu heroinu u potkanů. Psychofarmakologie (Berl) 1985;86: 37-42. [PubMed]
Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Molekulární mechanismy podílející se na asymetrické interakci mezi kanabinoidními a opioidními systémy. Psychofarmakologie (Berl) 2005;182: 527-536. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Podstatná role DeltaFosB v nucleus accumbens při morfinovém působení. Nat. Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
Zangen A, Solinas M., Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Dvě místa mozku pro kanabinoidní odměnu. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
Zhu J, Luo LY, Li JG, Chen C, Liu-Chen LY. Aktivace klonovaného lidského kappa opioidního receptoru agonisty zvyšuje vazbu [35S] GTPyS na membrány: stanovení potencí a účinnosti ligandů. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, Hahn H, Valverde O, Maldonado R. Absence dysforických účinků delta-9-tetrahydrokannabinolu u myší s deficitem dynorfinu. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. Zvýšená úmrtnost, hypoaktivita a hypoalgie u kanabinoidních myší s vyřazenými receptory CB1. Proc. Natl. Acad. Sci. Spojené státy americké 1999;96: 5780-5785. [PMC bezplatný článek] [PubMed]