PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstraktní
Změny vyvolané kokainem v genové expresi způsobují změny v morfologii a chování neuronů, které mohou záviset na závislosti na kokainu. Identifikovali jsme základní roli dimethylace histonu 3 lysinu 9 (H3K9) a lysin-dimethyltransferázy G9a v kokainem indukované strukturální a behaviorální plasticitě. Opakované podávání kokainu snížilo globální hladiny dimethylace H3K9 v nucleus accumbens. Tjeho snížení histonové methylace bylo zprostředkováno represí G9a v této oblasti mozku, která byla regulována transkripčním faktorem ΔFosB indukovaným kokainem. Při použití podmíněné mutageneze a virového přenosu genů jsme zjistili, že G9a downregulace zvyšuje plasticitu dendritické páteře neuronů nucleus accumbens a zvyšuje preference kokainu, čímž se stává zásadní roli histonové methylace při dlouhodobém působení kokainu.
Úvod
Opakovaná expozice kokainu je charakterizována přetrvávajícími změnami v genové expresi a změněnou morfologií neuronů v nucleus accumbens (NAc), což je klíčovou složkou motivačního obvodu mozku (1-2). Chromatin remodeling je důležitý v aberantních transkripčních změnách v této oblasti mozku, které mohou být základem aspektů závislosti na kokainu (3-9). Kokainová regulace struktury chromatinu v NAc vyplývá částečně z přímých modifikací enzymatického chromatinového zařízení indukovaných kokainem, což vede ke změnám acetylace a fosforylace histonu (4, 7-9); nicméně role enzymů kontrolujících histonovou methylaci ještě nebyly zkoumány.
Nedávná genomová promotorová analýza s využitím chromatinového imunoprecipitace spojeného s mikročipy (ChIP-Chip) identifikovala změněné vzorky metylace represorních histonů H3 lysinu 9 (H3K9) a 27 (H3K27) u specifických genových promotorů v NAc po opakované léčbě kokainem6). Proto jsme profilovali mnoho lyzin methyltransferáz (KMT) a demetylas (KDM), o kterých je známo, že kontrolují methylaci H3K9 nebo H3K27 (Obr. 1A). Pouze dva enzymy G9a a GLP vykazovaly perzistentní transkripční regulaci 24 hodiny po opakovaném podávání kokainu, kdy byla exprese obou genů významně snížena. Vzhledem k tomu, že G9a a GLP specificky katalyzují dimethylaci H3K9 (H3K9me2), jejich downregulace kokainem je v souladu se sníženými globálními hladinami euchromatického H3K9me2 pozorovaného v tomto časovém okamžiku (Obr. 1B). Naproti tomu globální hladiny heterochromatické methylace H3K27 zůstaly nezměněny opakovanou expozicí kokainu (Obrázek S1 při podpoře online materiálu). Kvůli vysokým hodnotám katalytické aktivity in vitro a in vivo (10), jsme se rozhodli dále zkoumat funkční význam represe G9a po opakované expozici kokainu v NAc. Úrovně proteinu G9a, stejně jako hladiny jeho mRNA, byly významně sníženy o 24 hodiny po opakovaném podání kokainu (Obr. S2). Ačkoli exprese mRNA G9a byla snížena o 35% v NAc, imunohistochemická analýza odhalila mírnější redukci 15% v hladinách proteinu G9a, což je v souladu s pozorovaným poklesem 21% u H3K9me2 po opakovaném podání kokainuObr. 1B). G9a exprese mRNA byla také v této oblasti mozku snížena o 20% po opakovaném samo-podání kokainu (Obr. S3).
Abychom zjistili, zda změny v eukromatickém H3K9me2 korelují s celkovými změnami v genové expresi v NAc, jsme použili analýzy mikroskopu pro zkoumání profilů genové exprese indukovaných provokační dávkou kokainu u zvířat s anamnézou předchozí expozice kokainu nebo bez ní gen seznamy v Tabulky S1-S3). Zvířata, která dostávali opakovaný kokain, výrazně zvýšily genovou expresi 1 hodiny po podání kokainu ve srovnání s akutně léčenými zvířaty (Obr. 1C). Tato zvýšená exprese genu se stále vyskytovala v reakci na výskyt kokainu, který byl podán po týdnu odchodu z opakovaného kokainu 1. V souladu s předchozími zprávami malé procento genů (~ 10%) vykazovalo desenzibilizované transkripční odpovědi po opakovaném podávání kokainu (Obr. 1C; vidět Tabulka S1) (5). Abychom přímo zkoumali úlohu downregulace G9a ve zvýšené exprese genu pozorované po opakovaném kokainu, myši dostaly intra-NAc injekce vektorů viru Herpes simplex (HSV), které exprivovaly buď GFP nebo G9a a byly ošetřeny fyziologickým roztokem nebo opakovaným kokainem, aby se zjistilo, zda nadměrná exprese G9a byla dostatečná k blokování opakovaného zvýšení exprese genu vyvolaného kokainem. Z množiny 12 náhodně vybraných genů, které vykazovaly zvýšené hladiny exprese po opakovaném kokainu, jsme pozorovali, že G9a významně snížil zvýšenou expresi 50% těchto genů (Tabulka S4).
Abychom zjistili protiproudové transkripční události, které zprostředkovávají opakovanou represi indukovanou kokainem exprese G9a, jsme zkoumali možnou úlohu pro ΔFosB, vysoce stabilní spojovací produkt okamžitého časného genu fosB. ΔFosB se akumuluje v NAc po opakované expozici kokainu, kde je spojena se zvýšenou odměnou za kokain (11). ΔFosB může působit buď jako transkripční aktivátor nebo represor v závislosti na použitém cílovém genu (3, 5, 6, 12). Použití bitransgenního NSE-tTA × tetOP-ΔFosB myší, kde exprese ΔFosB může být indukována selektivně v NAc a dorzální striatum dospělých zvířat (13) jsme zkoumali dopad exprese ΔFosB na regulaci kokainu H3K9me2 a KMTs v NAc. Nadměrná exprese ΔFosB byla dostatečná ke snížení hladin H3K9me2 (Obr. 1D) a výraz G9a (Obr. 1E), čímž se napodobují účinky opakovaného kokainu. Naproti tomu ΔFosB neznižuje expresi GLP v této oblasti mozku a nemá žádný účinek na SUV39H1 a EZH2, hlavní trimethylační enzymy pro H3K9 a H3K27, resp. (Obr. S4). Pro potvrzení těchto údajů pomocí nezávislého systému s nadměrným expresí ΔFosB dospěl dospělým myším divokých typů oboustranné intra-NAc injekce adeno-asociovaného viru (AAV) vektory exprimující buď GFP, nebo ΔFosB. Virově zprostředkovaná nadměrná exprese ΔFosB snižovala hladinu exprese G9a v této oblasti mozku (Obr. 1E).
Taková výrazná a specifická regulace G9a nás vedla ke zkoumání, zda změna exprese G9a specificky v neuronech NAc reguluje reakce na chování kokainu. Myši divokého typu dostaly intra-NAc injekce HSV vektorů exprimujících GFP nebo G9a a pak byly analyzovány za použití nestranné paradigmatu podmíněného místa kokainu, která poskytuje nepřímou míru odměny léku. Virová nadměrná exprese G9a u neuronů NAc byla potvrzena po testování chování (Obr. 2A). Nadměrná exprese G9a významně snížila přednost kokainu ve srovnání se zvířaty, která nadměrně exprimují GFP (Obr. 2B) a zvýšené hladiny H3K9me2 v NAc (Obr. 2C). Nadměrná exprese katalyticky mrtvého mutantu G9a (G9aH1093K) (14) neovlivnila preference kokainu (Obr. 2B) a neměl žádný vliv na hladiny H3K9me2 v této oblasti mozku (Obr. 2C).
Pro další studium úlohy G9a v chování kokainu a konkrétněji k napodobení opakovaného potlačování exprese G9a indukované kokainem v NAc, dospělý G9afl / fl myší (14) dostávaly intra-NAc injekce AAV vektorů exprimujících Cre rekombinázu nebo GFP jako kontrolu. AAV-Cre zeslabení G9a v NAc, který byl imunohistochemicky potvrzen (Obr. S5) výrazně zvýšily účinky kokainu na experimenty s kondicionováním a snížily hladiny H3K9me2 v NAc (Obr. 2D, E). Komerčně dostupný farmakologický inhibitor G9a a GLP, BIX01294 (15-16), byla použita k ověření, zda inhibice enzymu podobně ovlivňuje reakce na chování kokainu. Farmakologická inhibice přípravků G9a a GLP značně zvýšila přednost kokainu a snížila hladinu H3K9me2 v NAc (Obr. 2F, G).
Opakované podávání kokainu zvyšuje hustotu dendritických trupů na neuronech středního spinku NAc (17), proces spojený s funkčními změnami excitačních glutamatergických synapsí na tyto neurony (18-19) a senzibilizované reakce na chování (17, 20). Předpokládali jsme tedy hypotézu, že snížení regulace aktivity G9a v NAc opakovaným kokainem může zprostředkovat schopnost kokainu regulovat dendritickou hustotu páteře NAc neuronů. Pomocí chromatinového imunoprecipitace (ChIP) s protilátkou proti G9a jsme identifikovali několik předpokládaných G9a genových cílů v NAc, z nichž každá byla předtím zapojena do dendritické plasticity indukované kokainem (Obr. 3A) (20-26). Zjistili jsme, že opakované podávání kokainu významně snížilo vazbu G9a, stejně jako hladiny H3K9me2 na těchto genových promotorech (Obr. 3B). Naproti tomu akutní podávání kokainu rychle nabralo G9a na některé z těchto stejných genových promotorů, což je v souladu se zvýšenou expresí G9a pozorovanou v hodině NAc 1 po akutní dávce kokainuObr. S6). Přestože vazba G9a na specifických genových promotorech koreluje se změnami v jeho expresi, zůstává nejasné, zda jsou tyto události zprostředkovány změnami globálních hladin G9a v NAc a / nebo rozdíly v náboru G9a po akutní vs opakované podávání kokainu.
Na základě G9ovy regulace četných genů souvisejících s plasticitou v NAc jsme přímo zkoumali, zda udržování exprese G9a v této oblasti mozku po opakované léčbě kokainem postačuje k blokování tvorby dendritické páteře vyvolané kokainem. Použitím protokolu k léčbě kokainu, který dříve prokázal, že podporuje indukci dendritické páteře v NAc (20), jsme zkoumali hustotu páteře u zvířat injektovaných buď HSV-GFP nebo HSV-G9a. V souladu s předchozími zjištěními jsme zaznamenali významný nárůst hustoty dendritické páteře v NAc po léčbě kokainem, což bylo zcela blokováno nadměrnou expresí G9a (Obr. 3C). Samotná exprese G9a nebyla dostatečná pro snížení hustoty dendritické páteře NAc za nepřítomnosti kokainu. Doplnit tato data G9afl / fl myši dostávaly intra-NAc injekce HSV-Cre a hustota páteře byla kvantifikována a porovnána se zvířaty, které dostávaly HSV-GFP v nepřítomnosti kokainu. Vyřazení exprese G9a významně zvýšilo hustotu páteře na neuronech středního spiny neuronu NAc (Obr. 3C).
Vzhledem k důkazu, že G9a downregulace v NAc po opakovaném kokainu je zprostředkována pomocí ΔFosB, jsme dále zkoumali, zda je tento transkripční faktor podobně zapojen do regulace dendritických nosníků NAc. Ačkoli ΔFosB nebyl dříve spojen kauzálně s takovou dendritickou plastičností, některé z jeho cílů, včetně podjednotek Cdk5 a NFκB, byly tak zapleteny (20-23), a persistentní exprese ΔFosB v neuronech NAc koreluje se zvýšenou hustotou dendritické páteře po opakované léčbě kokainem (27). Nejprve jsme zjistili, že indukce ΔFosB u bitransgenních myší v nepřítomnosti kokainu, která snížila expresi G9a a H3K9me2 (Obr. 1D, E), snížila vazbu G9a na četné geny spojené s plasticitou, z nichž mnohé se rovněž ukázaly být přímými cíly samotného ΔFosB (Obr. 3D) (3, 6). Dále jsme ukázali, že virová nadměrná exprese ΔFosB v NAc významně zvyšuje hustotu dendritického páteře za bazálních podmínek, podobně jako po opakovaném podávání kokainu (Obr. 3E). Naopak, nadměrná exprese v NAc z ΔJunD, dominantní negativní mutantní protein, který antagonizuje transkripční aktivitu ΔFosB, blokuje schopnost opakovaného kokainu zvyšovat tvorbu dendritické páteře v NAc (Obr. 3C).
Naše pozorování, že ΔFosB reguluje expresi G9a v NAc, a že ΔFosB a G9a regulují některé stejné cílové geny, nás vedly ke zkoumání dalších interakcí mezi ΔFosB a G9a. Po akutním kokainu, kdy byly zvýšeny hladiny G9a, se vazba G9a na fosB genu byl zvýšený, zatímco po opakovaném kokainu, kdy byla potlačena exprese G9a, se G9a váže na fosB genu byl snížen (Obr. 3A). Taková snížená vazba na G9a po opakovaném kokainu nebyla pozorována c-fos, kde se vazba G9a zvyšuje opakovaným kokainem (Obr. S7). To je v souladu s tím, že na rozdíl od toho fosB, c-fos je potlačena, není vyvolána, chronickou expozicí psychostimulantu (5). Nadměrná exprese ΔFosB u bitransgenních myší byla dostatečná k významnému snížení vazby G9a na fosb genu (Obr. 3D). Navíc nadměrná exprese G9a byla dostatečná ke snížení zvýšené exprese ΔFosB po opakovaném podávání kokainu (Tabulka S4). Tyto údaje naznačují autoregulační smyčku, při které G9a zpočátku omezuje indukci ΔFosB akutním podáním kokainu. Nicméně, když se ΔFosB akumuluje s opakovanou expozicí léku, potlačuje G9a a tím potencuje vlastní vlastní další indukci.
Závěrem jsme prokázali, že metylace histinového lyzinu v NAc je kriticky zapojena do regulace exprese neuronových genů v reakci na kokain. Reprodukce G9a a H3K9me2 po opakovaném podávání kokainu podporuje kokainovou preference částečně prostřednictvím transkripční aktivace četných genů, které regulují aberantní formy dendritické plasticity. Získat lepší pochopení genů, které jsou regulovány prostřednictvím takových mechanismů, zlepší naše znalosti o složitém biologickém základu drogové závislosti a pomohou při rozvoji účinnější léčby návykových poruch.
Materiály a metody
Zvířata a ošetření
Pokud není uvedeno jinak, byly myši uloženy v kolonii s kolonií 12 hodinový světelný / tmavý cyklus (světla od 7: 00 AM do 7: 00 PM) při konstantní teplotě (23 ° C) s podle libosti přístup k vodě a potravinám. Všechny protokoly na zvířatech byly schváleny IACUC na obou UT Southwestern Medical Center a Mount Sinai School of Medicine.
Pro pokusy s kokainem [imunohistochemie, western blotting, kvantitativní PCR (qPCR), analýza mikroskopu a chromatinová imunoprecipitace (ChIP)] se použili 8- až 10-týdenní samci C57BL / 6J myši. Zvířata dostávali denně injekce buď "fyziologického roztoku" (7 ošetřovacího roztoku, ip), "akutního" kokainu (6 léčivý roztok + jedna léčba 20 mg / kg kokain-HCl, ip) kokain-HCl, ip). Myši byly usmrceny buď za 7 hodinu nebo 20 hodiny po konečném ošetření. Při studiích s mikroskopickými mikroorganismy byla zvířata denně ošetřována buď "fyziologickým roztokem" (fyziologický roztok 1, ip), "akutní" kokain (24 léčba fyziologickým roztokem + 15 léčba 14 mg / kg kokain-HCl, ip) 1 léčba fyziologickým roztokem + 20 léčba 7 mg / kg kokain-HCl, ip) nebo opakované stažení + akutní kokain (8 léčba 20 mg / kg kokain-HCl + 7 léčba fyziologickým roztokem + 20 provokační léčba 7 mg / kg kokain- ip) a byly usmrceny 1 hodiny po konečné léčbě. V behaviorálních experimentech byly myši jednotlivě umístěny po chirurgickém zákroku a byly ošetřeny dávkou 20 mg / kg kokain-HCl, ip, jak je popsáno níže. Pro analýzu dendritické páteře a validaci mikroskopií po infekci HSV-GFP a HSV-G1a-GFP byly myši ošetřeny "fyziologickým roztokem" (fyziologický roztok 10, ip) nebo opakovaným kokainem (9 ošetření 5 mg / kg kokain- ) v průběhu 5 dnů, jelikož byl dříve prokázán, že tento injekční protokol zvyšuje hustotu páteře na neuronech nucleus accumbens (NAc) v časovém rámci exprese transgenu viru Herpes simplex (HSV) (Doplňkový odkaz S1). Myši použité pro analýzu dendritické páteře byly usmrceny 4 hodiny po posledním ošetření.
Abychom indukovali lokální deleci transkriptu G9a omezeného na neurony NAc, použili jsme mutantní myši homozygotní pro floxovanou alelu G9a, které byly podrobně popsány jindeS2). Cre-indukovaná rekombinace produkuje exon 22 k 25 sestřihu mimo rámce, což vede k nezmysl-zprostředkovanému rozpadu mutovaného transkriptu. Použili jsme G9a floxované myši, které byly plně zpětně křížené myším C57BL / 6J. Myši byly sterotaxicky injikovány do vektorů NAc s adeno-asociovaným virem (AAV) (sérotyp 2) exprimujícími GFP nebo Cre-GFP mezi věkem týdnů 7 a 10. Imunohistochemická analýza byla použita k ověření účinnosti Cre-zprostředkované rekombinace (viz Doplňkový obrázek S5). Použili jsme 21 injekční zvířata AAV po chirurgickém zákroku, protože rekombinace u G9a flosovaných myší byla stabilní a maximální v tomto časovém bodě, v souladu s publikovanými zprávami (S3-S4). Experimenty s nadměrnou expresí G9a a ΔJunD byly podobně provedeny za použití vektorů viru HSV exprimujících buď GFP, G9a-GFP divokého typu, katalyticky mrtvý G9aH1093K-GFP nebo ΔJunD-GFP (viz S2 pro podrobnosti týkající se vývoje konstrukcí G9a). Myši s nadměrnou expresí HSV byly použity 3 dny po operaci, protože nadměrná exprese byla v tomto časovém okamžiku maximální, jak bylo pozorováno pomocí imunohistochemie. Vzhledem k přechodné povaze exprese HSV a podstatně stabilnější povaze exprese AAV byly HSV vektory používány v experimentech vyžadujících rychlou, krátkodobou transgenní expresi, zatímco AAV vektory byly použity v experimentech vyžadujících prodloužené periody exprese transgenu. Oba vektory byly v rozsáhlých předcházejících studiích prokázány infikovat pouze těla neuronálních buněk uvnitř oblasti injektovaného mozku bez infekce aferentních nebo eferentních neuronů.
Pro behaviorální experimenty s použitím farmakologického inhibitoru G9a / GLP BIX01294 (25 ng / μl) byly myši sterotaxicky implantovány do NAc dvěma subkutánními mini-pumpami a dvojstrannými vodícími kanylami. Mini-pumpy byly aktivovány 12 hodiny před implantací zahájením kontinuálního podání (0.25 μl / hodinu) jakéhokoliv vehikula (5 hydroxypropyl β-cyklodextrin) nebo léku na 14 dny, během kterých byly provedeny behaviorální hodnocení.
Pro experimenty s nadměrnou expresí ΔFosB [Western blotting, qPCR a ChIP], samčí bitransgenní NSE-tTA × tetOP-ΔFosB byly použity myši (10 týdenní), přičemž v nepřítomnosti tetracyklinového derivátu doxycyklin (8 týdny mimo doxycyklin) zvířata vykazovala robustní striatální omezenou konstitutivní expresi ΔFosB (S5). Nadměrná exprese ΔFosB u těchto myší byla potvrzena pomocí qPCR. Chcete-li potvrdit nález pomocí NSE-tTA × tetOP-ΔFosB myší, myši C8BL / 57J ve věku 6 týdnů divokého typu byly sterotaxicky injikovány intra-NAc s AAV vektory exprimujícími buď GFP, nebo ΔFosB-GFP. V tomto případě byly použity AAV vektory pro zajištění maximální exprese ΔFosB v 8 týdnech po chirurgickém zákroku, což umožňuje přímé srovnání mezi virálně infikovanými a bitransgenními myši s nadměrnou expresí ΔFosB. Virová nadměrná exprese byla potvrzena pomocí qPCR v týdnech 8 po chirurgickém zákroku (v místě vpichu byly odříznuty punčochy NAn cDNAX). AAV-GFP a AAV-ΔFosB-GFP s nadměrnou expresí myší, které nebyly použity pro qPCR, byly ošetřeny fyziologickým roztokem (15 ošetření fyziologickým roztokem, ip) nebo opakovaným kokainem (14 léčba 14 mg / kg kokain- chirurgická operace. Po 30 dnech po ukončení léčby byly mozky fixovány 6% paraformaldehydem, rozděleny na vibratom a použity pro analýzu dendritické páteře.
Western blot analýza
14-gauge NAc razníky byly odebrány z koronálních úseků 1 mm získaných pomocí myší mozkové mozkové hmoty z nerezové oceli a sonikovány v lýzovém pufru 1 M HEPES (1% SDS) obsahujícím inhibitory proteázy a fosfatázy. 10-30 μg vzorky celkového proteinu byly elektroforézovány na gelu 18% SDS. Proteiny byly přeneseny na PVDF membrány a inkubovány buď s anti-H3K9me2 (myší monoklonální, 1: 500), anti-β-tubulin (myší monoklonální, 1: 60,000), anti-totální histon H3 (králičí polyklonální, 1: 5,000) (králičím polyklonálním, 1: 1000), anti-H3K27me3 (králičí polyklonální, 1: 500) nebo protilátky proti aktinu (myší monoklonální, 1: 60,000), které byly použity k ověření stejné exprese viru v děrovaném tkáni 4 ° C (všechny membrány byly zablokovány v mléku 5% nebo 5% bovinní sérový albumin). Membrány byly potom inkubovány s peroxidázou značenými sekundárními protilátkami (1: 15,000-1: 60,000 v závislosti na použité primární protilátce) a pásy byly vizualizovány za použití substrátu SuperSignal West Dura. Pásy byly kvantifikovány softwarem NIH Image J Software a pásy H3K9me2 byly normalizovány na aktin nebo β-tubulin a na celkový histon H3 pro kontrolu stejného zatížení. Opakovaný kokain neměl žádný vliv na hladiny aktinu (Obr. S8) nebo celkový histon 3 (Obr. S1) v NAc. Navíc HSV-G9a-GFP a HSV-G9aH1093K-GFP infekce neměly vliv na celkové hladiny β-tubulinu v NAc (Obr. S8).
Imunohistochemie
Myši byly sedated smrtelnou dávkou chloralhydrátu a perfundovány s paraformaldehydem 4% před analýzou jednorázovou nebo dvojitou imunohistochemií, jak bylo popsáno výše (S6). Stručně řečeno, post-fixované mozky byly inkubovány při pokojové teplotě přes noc v 30% sacharóze před rozdělením na 35 μm (mozky používané pro analýzu dendritické páteře byly rozděleny na vibratom v sekcích 100 μm za nepřítomnosti 30% sacharózy). Volně plovoucí části NAc byly promyty 1X PBS, blokovány (3% normální oslové sérum, 0.1% tritonX, 1X PBS) a později inkubovány s anti-GFP (kuřecí polyklonální, 1: 8000) a / , 9: 1) v blokujícím roztoku. Sekce analyzované pro dendritické trny byly inkubovány s králičím polyklonálním anti-GFP protilátkou u 500: 1. Po inkubaci přes noc byly části NAc promyty 200 krát pro 3 minuty s 10X PBS a následně inkubovány s Cy1 a / nebo Cy2 fluorescenčně vázanými sekundárními protilátkami v blokovacím roztoku 3X PBS pro 1 hodiny. Sekce použité pro morfologické studie byly inkubovány v sekundární protilátce přes noc při pokojové teplotě. Jaderné ko-barvení bylo dosaženo inkubací sekcí v 2X PBS obsahujících DAPI (1: 1) za 50,000 minuty. Částice byly znovu promyty, následován dehydratací etanolu a upevněním pomocí DPX. Všechny úseky byly zobrazeny pomocí konfokální mikroskopie.
RNA izolace a qPCR
Dvoustranné razníky NAc o rozměru 14 byly homogenizovány v Trizolu a zpracovány podle pokynů výrobce. RNA byla purifikována pomocí kolon RNAesy Micro a spektroskopie potvrdila, že dávky RNA 260/280 a 260/230 byly> 1.8. RNA byla poté reverzně transkribována pomocí soupravy Bio-Rad iScript Kit. cDNA byla kvantifikována qPCR pomocí SYBR Green. Každá reakce byla prováděna v duplikátu nebo triplikátu a analyzována pomocí metody AACt, jak byla dříve popsána, s použitím glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) jako kontroly normalizace (S7). Vidět doplňující tabulka S5 pro mRNA primerové sekvence.
DNA microarray analýza
Pro studii microarray byly použity čtyři skupiny (3 nezávislé biologické repliky pro každou skupinu), celkem 12 microarrays. Po hodině 1 po poslední injekci kokainu byla zvířata rychle vykolejena a mozky byly odstraněny a umístěny na led. Disekce NAc byla odebrána pomocí razidla jehly 15 a byla rychle zmražena na suchém ledu, dokud nebyla extrahována RNA. Bilaterální punčochy byly shromážděny ze čtyř zvířat na repliku, což představuje celkem 12 myši na skupinu. Izolace RNA, zpracování mikromatic a analýza dat byla provedena jak bylo popsáno výše (S8). Stručně, RNA byla izolována a purifikována, jak je popsáno výše, a byla kontrolována kvalita pomocí Agilent's Bioanalyzer. Reverzní transkripce, amplifikace, značení a hybridizace na pole Illumina MouseWG-6 v2.0 byla provedena za použití standardních postupů pomocí mikročipového jádra UT Southwestern. Surová data byla odečtena na pozadí a kvantilizována pomocí softwaru Beadstudio. Normalizovaná data byla analyzována pomocí softwaru GeneSpring a genelisty byly generovány pomocí kritérií významnosti mezní hodnoty 1.3násobné změny ve spojení s nepřiměřenou mezní hodnotou p p <0.05.
Z těchto důvodů udržujeme vysokou míru důvěry v tyto údaje. Za prvé, všechna zvířata byla zpracovávána, ošetřována a zabíjena ve stejném čase za stejných podmínek. Rovněž bylo provedeno všechno zpracování RNA a pole. Zadruhé jsme provedli trojnásobné soubory a shromáždili několik zvířat na vzorku pole, čímž jsme minimalizovali rozdíly v důsledku individuální variability a zvýšení statistické síly (S9). Zatřetí, kritéria analýzy dat používaná pro naši studii jsou doporučována v rámci projektu MicroArray Quality Control, neboť tato kritéria byla ověřena tak, aby poskytla vysoký stupeň reprodukovatelnosti interstrátů a reprodukovatelnosti uvnitř a uvnitř platformy (S10-S11).
Konstrukce virových vektorů
Vzhledem k omezením velikosti inzerce virového vektoru byly kódující sekvence G9a (G9a) nebo katalyticky mrtvé G9a (G9aH1093K) subklonovány do bicistronického p1005 + HSV plazmidu exprimujícího GFP pod kontrolou lidského primárního promotoru cytomegaloviru (CMV) (G9a velikost inzerce byla ~ 3.96 kb, která překračuje maximální velikost inzerce pro vektory AAV-2). Promotor IE4 / 5 řídí výraz G9a. Fragmenty byly subklonovány do plazmidu bicistronického plazmidu p1005 + HSV pomocí ligací s tupými konce s Glennormanem ošetřeným PmeI a EcoRI štěpeným G9a (z pcDNA3.1) a CX ošetřeným p1005 + po štěpení EcoRI. Pro produkci HSV-ΔJunD-GFP byla kódující sekvence DJunD ohraničená restrikčními místy EcoRI vytvořena pomocí PCR za použití primerových oligonukleotidů obsahujících místo EcoRI. Produkt PCR byl potom ligován do místa EcoRI vektoru p1005 +. Místní exprese Cre rekombinázy v NAc neuronech byla dosažena virálně zprostředkovaným přenosem genu za použití vektoru AAV, jak je popsáno (S12). GFP nebo N-koncová fúze GFP na Cre byla subklonována do rekombinantního AAV-2 vektoru obsahujícího promotor CMV s akceptorovou sekvencí donoru sestřihu a polyadenylačním signálem. Všechna vektorová inzerce byla potvrzena dideoxy sekvenováním. Virové vektory byly produkovány s použitím metody tripletransfekce, bez pomocníka, jak bylo popsáno výše (S13). Vyčištěný virus byl skladován při -80 ° C. Kvalita viru byla stanovena pomocí infekčního titru vyhodnoceného v buňkách HEK293. Byly připraveny podobně AAV-ΔFosB-GFP viry. Pro expresi HSV-Cre byla exprese Cre řízena promotorem IRES, na rozdíl od promotoru IE4 / 5, aby se minimalizovala exprese Cre a zabránila neuronální toxicitě (viz S14 pro virové konstrukce). Ve všech případech byla ověřena virální nadměrná exprese in vitro a in vivo přes qPCR a imunokistochemicky potvrzeny viry, které vykazují po operaci expresi omezenou NAc.
Stereotaxická chirurgie
V anestezii ketaminu (100 mg / kg) / xylazinu (10 mg / kg) byla myši umístěna v stereotaxickém přístroji s malým zvířetem a povrch lebeční kůže byl vystaven. Pro dvojnásobné naplnění 0.5 μl viru do NAc v úhlu 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) bylo použito třicet tři injekčních stříkačkových jehel s rychlostí 0.1 μl / min. Zvířata, které dostávaly HSV injekce, se nechaly obnovit 2 dny po operaci, zatímco myši používané pro testování chování, které dostaly vektory AAV, se nechaly regenerovat 20 dny předtím, než byly podrobeny kondicionování. Tyto časy jsou konzistentní s periody maximální exprese transgenu zprostředkované virem pro dva vektory. U infuze BIX01294 byla každá ze dvou mini-čerpadel umístěna subkutánně na záda myši. Umístění kanyly bylo dosaženo vrtáním dvou malých kraniálních děr nad NAc a dodávkou kanyly z bregma (AP + 1.5, ML + 1.0, DV-5.4). Myši byly ponechány zotavit se z chirurgického zákroku pro 4 až 5 dní před začátkem procesu kondicionování místa kokainu, jak je popsáno níže.
Upřednostňovaná předvolba místa
Způsob kondicionování místa byl prováděn jak bylo popsáno výše, s následujícími modifikacemi (S7). Stručně řečeno, 3 dny po infúzi HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP nebo HSV-GFP uvnitř NAc byly myši umístěny do kondicionovacích komor, které se skládají ze tří odlišných prostředí. Myši, které vykazovaly významnou preferenci pro kteroukoli ze dvou kondicionovacích komor, byly ze studie vyloučeny (<10% všech zvířat). Skupiny kondicionování byly poté vyváženy, aby se přizpůsobily jakémukoli zkreslení komory, které může stále existovat. V následujících dnech byla zvířatům injekčně podána fyziologická roztoka a odpoledne byla po dobu 30 minut uzavřena do jedné komory a poté byla injekčně podána injekce s kokainem (10 mg / kg, ip) a večer byla po dobu 30 minut (dva solný roztok a dvě párování kokainu). V den testu byly myši umístěny zpět do aparátu bez ošetření na 2 minut a testovány, aby se vyhodnotilo, které straně dávají přednost. Lokomotorické odpovědi na kokain byly hodnoceny pomocí paprskových zlomů v komorách spárovaných s kokainem, aby byla zajištěna účinnost léčby drogami. Pro experimenty AAV a BIX20 CPP byl použit mírně upravený protokol. Zvířata byla znovu injikována solným roztokem nebo kokainem (01294 mg / kg, ip) a omezena na konkrétní komory po dobu 10 minut, místo toho byla kondicionována pouze jednou denně po dobu 30 dnů, následovala zkouška 4. den (zvířata byla kondicionována večer se střídaly kondiční procedury). U všech skupin byla hodnocena základní lokomoce v reakci na fyziologický roztok, aby bylo zajištěno, že lokomoce nebyla ovlivněna léčbou viry nebo inhibitory.
Intravenózní kokainová samospráva
Byla získána samčí dospívající potkanka Long-Evans, která váží 230-250 g na začátku experimentu. Byly umístěny v prostředí s ochranou proti vlhkosti a teplotě v reverzním cyklu 12 světlo / tma (světla jsou vypnuty na 9: 00 am) s podle libosti přístup k jídlu a vodě. Potkani byli ponecháni se aklimatizovat v novém prostředí a byli manipulováni denně pro týden 1 před začátkem experimentu. Veškeré postupy byly prováděny v souladu s příručkou Národního ústavu pro zdravotní péči a používání laboratorních zvířat a byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a užitím zvířat v Mount Sinai. Samodiagnostická zařízení byla vybavena infračervenými paprsky pro měření pohybového poměru. Samodávka byla prováděna tak, jak bylo popsáno výše (S15-S16) katétry implantovanými do pravé jugulární žíly v anestezii isofluranem (2.4–2.7%). Katetry byly propláchnuty 0.1 ml solného roztoku obsahujícího 10 U heparinu a ampicilinu (50 mg / kg). Po jednom týdnu rekonvalescence po chirurgickém zákroku začalo během temné fáze cyklu světlo / tma trénovat samopodávání. Zvířatům byl umožněn 3hodinový denní přístup ke kokainu (0.75 mg / kg / infuze) v rámci posilovacího plánu fixního poměru 1 (FR1), kde 1 aktivní pákový lis vedl k jediné infuzi léku. Krysy stabilizovaly svůj příjem kokainu po 6 dnech (<15% variace v míře odpovědi během 3 po sobě jdoucích dní, přičemž nejméně 75% reagovalo na zesílenou páku). 24 hodin po závěrečné relaci vlastního podávání byly krysy rychle dekapitovány, mozky rychle odstraněny a zpracovány na izolaci RNA a qPCR.
Chromatinová imunoprecipitace (ChIP)
Čerstvé raznice NAc byly zesítěny formaldehydem a připraveny pro ChIP, jak bylo popsáno výše (S17-S18) s drobnými úpravami. Ve stručnosti byly shromážděny XnUMX 4-gauge NAc razníky na zvíře (zvířata 14 seskupená na vzorek), zesíťována s 5% formaldehydem a zahuštěna glycinem 1 M před zmrazením při -2 ° C. 80 den před sonikací vzorku, ovčí anti-králík / myš (v závislosti na srážecí protilátce) IgG magnetické kuličky byly připraveny inkubací vhodných magnetických kuliček buď s anti-G1a (králičím polyklonálním ChIP grade) nebo anti-H9K3me9 (myší monoklonální stupeň ChIP) protilátek přes noc při teplotě 2 ° C za konstantní rotace v blokovém roztoku. Tkáňová sonikace a strihání chromatinu byly prováděny způsobem popsaným výše (S17). Po sonikaci byly stejné koncentrace chromatinu přeneseny do nových zkumavek a bylo ušetřeno ~ 5% konečných produktů, které sloužily jako "vstupní" kontroly. Po důkladném promytí a resuspendování směsi konjugovaných perliček / protilátek byly do každého vzorku chromatinu přidány stejné objemy směsí protilátka / perlička (~ 7.5 μg protilátky / vzorek) a inkubovány po dobu ~ 16 za konstantní rotace při 4 ° C. Vzorky byly dále promyty a reverzně zesíťovány při 65 ° C přes noc před purifikací DNA za použití purifikačního kitu PCR. Po purifikaci DNA byly vzorky podrobeny qPCR a normalizovány podle příslušných "vstupních" kontrol, jak bylo popsáno výše (S17). Byly provedeny také imunoprecipitace s myšími polyklonálními anti-IgG protilátkami pro kontrolu myší vhodného obohacení signální amplifikace. Adenin-fosforibozyltransferáza (APRT) byla použita jako negativní kontrola pro experimenty s nadměrnou expresí kokainu a ΔFosB. Vidět Doplňková tabulka S5 pro promotorové primerové sekvence.
Analýza dendritické páteře
Abychom studovali úlohu G9a v regulaci morfologie neuronů in vivo, použili jsme metody popsané dříve s následujícími modifikacemi (S1). Tři dny po injekci HSV-GFP byly HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (všechny viry použity u myší C57Bl / 6J divokého typu) nebo HSV-Cre-GFPfl / fl myši), kdy byla maximální exprese viru, byly myši perfundovány, mozky byly kryoprotektovány a později rozděleny na 100 μm na vibratomu. Sekce byly potom imunologicky zbarveny s použitím protilátky proti GFP, jak je popsáno výše (viz Immunohistochemistry). Abychom zhodnotili účinky nadměrné exprese a vyřazení G9a na čísla páteře, stejně jako vliv nadměrné exprese ΔJunD, jsme změřili počet trnů na neuronech přibližně 1-2 na neuron rovnajícím se nejméně 299 μm sekundárních dendritů z Nc média exprimujícího GFP nepravidelných neuronů (MSN). Vzhledem k tomu, že MSN jsou morfologicky odlišné od ostatních populací neuronů v NAc, stejně jako předchozí zprávy naznačující, že HSV primárně infikuje neurony exprimující DARPP-32 v této oblasti mozku (S19), jsme přesvědčeni, že MSN byly v těchto studiích vyhodnocovány výhradně. Pro každé zvíře jsme zkoumali ~ 6-8 neurony u zvířat 3-4 v každé skupině (skupiny 7), po které se získala průměrná hodnota pro každé zvíře pro statistickou analýzu. Pokusy zaměřené na zkoumání účinků nadměrné exprese ΔFosB na hustotu páteře NAc byly prováděny podobně jako výše popsané s výjimkou toho, že AAV vektory byly používány k expresi GFP nebo ΔFosB-GFP po delší časové období (8 týdny). Všechny snímky HSV byly zachyceny pomocí konfokálního mikroskopu s objektivem 100X na olejovou imerzi (obrázky AAV byly zachyceny objektivem 63X oil-immersion). Obrázky byly pořízeny s dírkou nastavenou na libovolné jednotce 1 a velikostí rámečku 1024 × 1024. Dendritická délka byla měřena za použití softwaru NIH Image J a čísla páteře byla slepena primárním experimentem, jelikož sklíčka byla kódována před experimentálním skenováním. Průměrný počet trnů na 10 μm dendrit byl vypočítán.
Statistická analýza
Byly provedeny jednočinné a dvoucestné ANOVA k určení významu pro preference podmíněného místa a analýzy dendritické páteře s více než dvěma skupinami. Studentské testy byly použity pro další srovnání zahrnující qPCR, western blotting, analýzu dendritické páteře porovnávající HSV-GFP s HSV-Cre v G9afl / fl myši, microarray analýzy (viz výše) a experimenty s imunoprecipitací chromatinu. Po obousměrné analýze ANOVA hustoty dendritické páteře po nadměrné expresi ΔFosB byly použity plánované t-testy studenta s potvrzením významných hlavních účinků léčby drogami a virem. Všechny hodnoty obsažené v legendách obrázku představují průměr ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Podrobné statistické analýzy pro Obr. 1-3 v hlavním textu jsou uvedeny v: Legendy o podrobném obrázku včetně statistik.
Poznámky pod čarou
Potvrzuji, že žádný z materiálů obsažených v rukopise nemá nárok Podstatná role histon-methyltransferázy G9a v kokainem indukované plasticitě byly dříve publikovány nebo jsou zvažovány jinde, včetně internetu.
Veškerá práce zahrnující používání zvířat byla prováděna v souladu s institucionálními pokyny a směrnicemi IACUC jak na Southwestern Medical Center v Texaské univerzitě, tak na Lékařské škole Mount Sinai.
Odkazy a poznámky
;
