Podmínka pro stanovení podmínek etanolu a změny v ΔFosB Po podání adolescentního nikotinu se liší u potkanů ​​vykazujících vysokou nebo nízkou behaviorální reaktivitu v novém prostředí (2014)

Behav Brain Res. Autorský rukopis; k dispozici v PMC 2015 Jun 5.

Publikováno v posledním editovaném formuláři:

Behav Brain Res. 2014 Apr 1; 262: 101 – 108.

Publikováno online 2014 Jan 7. doi:  10.1016 / j.bbr.2013.12.014

PMCID: PMC4457313

NIHMSID: NIHMS554276

Přejít na:

Abstraktní

Tato studie stanovila účinky adolescentního podávání nikotinu na preference alkoholu u dospělých potkanů, které vykazují vysokou nebo nízkou behaviorální reaktivitu na nové prostředí, a zjistilo se, zda nikotin změnil ΔFosB ve ventrálním striatu (vStr) a prefrontální kůře (PFC) bezprostředně po podání léčiva nebo po zrání krys do dospělosti.

Zvířata byla charakterizována jako vykazující vysokou (HLA) nebo nízkou (LLA) lokomotorickou aktivitu v novém otevřeném poli v postnatálním dni (PND) 31 a dostávala injekce fyziologického roztoku (0.9%) nebo nikotinu (0.56 mg volné báze / kg) z PND 35 –42. Ethanolem indukovaná preferovaná kondicionovaná místa (CPP) byla hodnocena na PND 68 po 8 dnech kondicionování ve zkresleném paradigmatu; FosB byl měřen na PND 43 nebo PND 68. Po expozici nikotinu dospívajícím HLA zvířata vykazovala CPP, když byla kondicionována ethanolem; LLA zvířata nebyla ovlivněna. Dále, expozice nikotinu u adolescentů po dobu 8 dní zvýšila hladinu AFosB v limbických oblastech u potkanů ​​HLA i LLA, ale toto zvýšení přetrvávalo do dospělosti pouze u zvířat LLA.

Výsledky ukazují, že expozice nikotinu u adolescentů usnadňuje stanovení ethanolového CPP u HLA potkanů ​​a že trvalé zvýšení ΔFosB není pro stanovení etanolového CPP v dospělosti nezbytné nebo postačující. Tyto studie zdůrazňují význam hodnocení behaviorálního fenotypu při určování behaviorálních a buněčných účinků expozice nikotinu u dospívajících.

Klíčová slova: Závislost, Adolescent, AFos, Ethanol, Nicotine, Reward

1. Úvod

Četné studie naznačily, že vysoké vyhledávání a objevování novinek jsou spojeny se zvýšenou citlivostí na odměnu za léky [1-8]. Ukázalo se, že adolescenti vykazují větší úsilí o vyhledávání a objevování novinek než dospělí [9-11] a několik zpráv prokazuje, že adolescenti jsou při zahájení užívání drog častěji než dospělí k závislosti na závislostech [12-18]. Adolescenti tak mohou být náchylnější k posilovacím a odměňujícím účinkům zneužívaných drog a adolescenti s vysokým profilem hledajícím citlivost mohou představovat nejzranitelnější skupinu obyvatel.

Dvěmi drogami, které dospívající nejčastěji používají, jsou nikotin a alkohol [19, 20] a důkazy naznačují, že užívání nikotinu ovlivňuje konzumaci alkoholu. K chování s kouřením a pitím často dochází společně, s četností každého chování spojeného s frekvencí druhého [21]. Grant [22] uvedli, že téměř 29% jednotlivců, kteří začnou kouřit před dosažením věku 14, se stává závislým na alkoholu a 8% progreduje ke zneužívání alkoholu během svého života. Dále, 19% těch, kteří zahajují kouření mezi 14 a 16, se stane závislým na alkoholu, přičemž 7% těchto jedinců postupuje ke zneužívání alkoholu. Je zajímavé, že u jedinců, kteří nezačnou kouřit až do věku 17, je poloviční pravděpodobnost, že se stanou závislými na alkoholu nebo že se stanou závislými. Kouření s časným nástupem je tedy silným prediktorem celoživotního pití a závislosti na alkoholu a jeho zneužívání [22].

Ukázalo se, že expozice nikotinu u dospívajících zvyšuje prospěšné účinky několika léků u dospělých laboratorních zvířat, včetně nikotinu, kokainu a diazepamu [23-26]. Dále Riley a kol. [27] prokázali, že podávání nikotinu myším během dospívání, ale nikoli dospělosti, zvyšuje citlivost na odnětí ethanolu při měření v dospělosti, a navrhlo, že dospívání představuje kritické období citlivosti na nikotin, které vede ke změnám v mozku, které přetrvávají do dospělosti. Tato myšlenka je podporována několika studiemi prokazujícími, že expozice nikotinu u dospívajících vede v dospělosti k anxiogennímu stavu [28-30]. Je možné, že trvalé změny po expozici adolescentního nikotinu zahrnují transkripční faktor ΔFosB, u kterého bylo prokázáno, že vyvolává přetrvávající senzibilizaci mezolimbické dráhy a zvyšuje citlivost na motivační vlastnosti několika zneužívaných drog, včetně alkoholu [31-34] a jehož nadměrná exprese v limbickém systému zvyšuje preference léků [31, 35]. Je zajímavé, že adolescentní zvířata vykazují větší nárůst než dospělí u AFosB v nucleus accumbens (NAcc) v reakci na podávání kokainu nebo amfetaminu [36]; účinek podávání nikotinu během adolescence na AFosB nebyl zkoumán. Protože dospívající zvířata vykazují zvýšenou regulaci AFosB ve srovnání s dospělými v reakci na zneužívané léky, mohou být citlivější na odměňující podněty po opakované expozici než podobně vystavení dospělí. Tato myšlenka je podporována studiemi, které ukazují, že dospívající krysy, které po injekcích 4 vyvolají nikotinem indukovanou preferovanou kondici místa, vykazují zvýšení FosB imunoreaktivity (sestřihová varianta AFosB nebyla specificky měřena) ve ventrální tegmentální oblasti (VTA), NAcc a prefrontální kůra (PFC) bezprostředně po testování chování [37].

Navzdory důkazům, že adolescence je období zvýšené snahy o senzaci a první užívání drog, je to, že užívání nikotinu je spojeno se zvýšeným užíváním ethanolu, a že zvýšená citlivost na zneužívané drogy je spojena s akumulací AFosB [31], vliv expozice nikotinu adolescentem na hladinu ΔFosB a jeho dlouhodobé důsledky na odměnu za ethanol jsou nejasné. Tato studie: 1) proto určovala účinky podávání adolescentního nikotinu na preference alkoholu u dospělých krys charakterizovaných během adolescence na základě jejich behaviorální reaktivity na nové prostředí, tj. Vykazující vysokou nebo nízkou lokomotorickou aktivitu; a 2) zjistili, zda nikotin změnil ΔFosB ve ventrálním striatu (vStr) a PFC těchto zvířat bezprostředně po podání v dospívání nebo po potkanech zrajících do dospělosti.

2. Metody

Materiály 2.1

Ethanol byl získán od AAPER Alcohol and Chemical Company (Shelbyville, KY). Všechna ostatní činidla byla zakoupena od Sigma-Aldrich Life Sciences (St. Louis, MO), pokud není uvedeno jinak.

Předměty 2.2

Jako subjekty byly použity samci a samice potomků (n = 89) načasovaných březích potkanů ​​(n = 10); den narození byl definován jako den po narození 0 (PND 0). Aby byl zajištěn podobný vývoj napříč vrhy, byla všechna vrhy vyřazena štěňatům 10 – 12 (samci 5 – 6 / samice 5 – 6) na PND 1 a zůstala ustájena s příslušnými matkami až do PND 21, kdy byla zvířata odstavena a ustájena ve stejných pohlavních skupinách 3u ve standardních polypropylenových klecích s podestou kukuřice. Všechna zvířata byla umístěna na University of South Florida v viváriu s regulovanou teplotou a vlhkostí v cyklu 12: 12-hr světlo-tma (7 am / 7 pm). Pokusy byly prováděny během fáze světla a péče o zvířata a jejich používání byly v souladu s pokyny stanovenými Výborem pro ústavní péči o zvířata a jejich použití a Národními zdravotnickými instituty pro péči o zvířata a jejich používání. V souladu s těmito pokyny experimenty využívaly co nejmenší počet zvířat na skupinu nezbytný k získání smysluplných údajů.

2.3 Charakterizace behaviorální reaktivity na nové prostředí

Lokomotorická aktivita byla použita k charakterizaci behaviorální reaktivity potkanů ​​do nového prostředí. Aby se toho dosáhlo, byla na PND 31 zvířata vyjmuta z jejich domácí klece a umístěna do kruhové arény (průměr 100 cm) pod mírným osvětlením (20 lux) po dobu 5 min. Celková ujetá vzdálenost (TDM) byla zaznamenána automaticky videokamerou a analyzována pomocí softwaru EthoVision (Noldus Information Technology, Leesburg, VA), jak je popsáno [38]. Zvířata byla klasifikována jako vykazující vysokou (HLA) nebo nízkou (LLA) lokomotorickou aktivitu v novém otevřeném poli za použití mediánové splitové strategie, přičemž první vykazovala aktivitu v horních 50% a druhá v nižších 50% vzhledem k jejich sourozenci [4].

Injekce nikotinu 2.4

Zvířata dostávaly injekce (sc) fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS, 0.9%) nebo hydrogen-bitartrátu nikotinu v PBS (0.56 mg nikotinu ve formě volné báze / kg) jednou denně po dobu 4 nebo 8 dní počínaje PND 35. Bylo prokázáno, že tato dávka nikotinu zvyšuje reakci na podmíněné podněty [39, 40] a zvýšit breakpointy pro posílenou reakci [41] což naznačuje, že je to prospěšné a posilující, a bylo použito v předchozí studii adolescentů [38]. Pro každou injekci byla zvířata přepravena ve své domovské kleci do tlumeně osvětlené procedurální místnosti, umístěna do nové klece lemované čerstvou podestýlkou, injikována a vrácena do své domácí klece.

2.5 Podmíněná předvolba místa (CPP)

Pro měření CPP dostaly krysy injekce nikotinu z PND 35 – 42 a 18 dní po poslední injekci nikotinu, na PND 60, zvířatům (n = 40; 4 – 5 na skupinu) byl umožněn volný přístup do dvou vzájemně propojených komor z plexiskla (každá komora: šířka 21 cm × délka 18 cm × výška 21 cm) obsahující zřetelné vizuální (svislé nebo vodorovné černé a bílé pruhy) a hmatové podněty (pogumovanou nebo brusnou podlahu) po tři intervaly 5 min. Průměrná doba strávená na každé straně přístroje byla použita pro stanovení preferencí základní komory pro každé zvíře. Ačkoli každé zvíře vykazovalo na začátku základní preferenci, v populaci neexistovala tendence k preferování konkrétní komory. Během následujících 8 dnů, od PND 61 do 68, bylo použito předpjaté kondicionační paradigma, kde byla zvířata trénována, aby spojovala nepřednostní komoru se subjektivními účinky ethanolu. Pro kondicionování každé zvíře dostalo injekci ethanolu (17%; 1.0 g / kg, ip) a následně bylo omezeno na původně nepřednostní komoru po dobu 15 min. Ukázalo se, že tato dávka a koncentrace ethanolu stanoví CPP během pozdní adolescence [42] a významně zvýšit dopamin v NAcc u dospívajících a mladých dospělých zvířat [43, 44]. Kontrolní zvířata byla po injekci fyziologického roztoku (15%, ip) po dobu 0.9 min. Uzavřena do původně nepřednostní komory. Jak etanolem upravená, tak kontrolní zvířata dostávaly injekce solného roztoku před tím, než byly omezeny na původně preferovanou komoru pro 15 min každý den. Každé zvíře tak dostalo tréninkové sezení 2 denně, jednu pro zpočátku nevhodné a jednu pro preferovanou komoru. Pořadí těchto zasedání se měnilo každý den a probíhalo ráno a odpoledne, oddělené nejméně 5 hodinami. Na PND 69, přibližně 16 – 18 hodin po posledním tréninku, byla zvířatům umožněn volný přístup do obou komor po dobu 5 min a byla měřena doba strávená v každé komoře pro vyhodnocení CPP. Skóre preference bylo vypočteno odečtením času stráveného v původně preferované komoře od času stráveného v původně nepřednostní komoře.

2.6 Western blot analýzy

Pro imunoblotové analýzy byly krysy rychle dekapitovány a vStr a PFC izolovaly 24 hodiny po injekci nikotinu 4th nebo 8th na PND 39 nebo 43 (n = 32; 4 na skupinu) nebo 26 dní po 8th injekci na PND 69 (n = 16; 4 na skupinu), což odpovídá dni, kdy byl CPP hodnocen v oddělené skupině zvířat. Tkáň byla rychle zmrazena na suchém ledu a skladována při -80 ° C, dokud nebyla homogenizována, jak je popsáno [38]. Proteiny byly separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (10% polyakrylamid) a elektroforeticky přeneseny na polyvinylidenfluoridové membrány. Membrány byly blokovány po dobu 1 ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris obsahujícím 0.1% Tween 20 a 5% sušené mléko. Následně primární protilátka [FosB (5G4) #2251, 1: 4000; Cell Signaling, Danvers, MA], který produkuje robustní značení ΔFosB [45], byl přidán do blokujícího roztoku a membrány byly inkubovány přes noc při 4 ° C. O šestnáct hodin později byly membrány promyty a inkubovány se sekundární protilátkou [kozí anti-králičí IgG-HRP, 1: 2000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA] v blokovacím roztoku po dobu 1 za laboratorní teploty a signály vizualizováno pomocí zvýšené chemiluminiscence. Po imunodetekci byly bloty stripovány, blokovány a inkubovány s primární protilátkou namířenou proti p-tubulinu [H-235, Santa Cruz Biotechnology, Inc., 1: 16,000] jako kontrola plnění. Pás XDUMX / 35 kDa představující AFos a pás 37 kDa odpovídající P-tubulinu byly kvantifikovány na každém blotu s použitím digitalizačního softwaru denzitometru a Un-Scan-It (Silk Scientific Inc., Orem, Utah). Optická hustota prvního z nich byla normalizována na druhý vzorek pro každý vzorek a výsledky jsou vyjádřeny jako procento odpovídajících fyziologických kontrol na každé skvrně, aby se eliminovala variabilita přes bloty.

Statistické analýzy 2.7

K určení účinků na CPP [(mužský nebo ženský) × (HLA nebo LLA) × (expozice fyziologickému roztoku nebo nikotinu) × (kondicionování fyziologickým roztokem nebo ethanolem)] byla použita 4faktorová analýza rozptylu (ANOVA)] a post hoc byl použit Tukeyho test zjistit významné rozdíly mezi skupinami. K určení rozdílů v ΔFosB mezi samci a samicemi HLA a LLA zvířat [(samci nebo samice) × (HLA nebo LLA) × (fyziologický roztok nebo nikotin)] pomocí Studentova t-testu provedeného post hoc ke zjištění významných hodnot byla použita 3faktorová ANOVA. rozdíly mezi skupinami. Hladina p <0.05 byla přijata jako důkaz významného účinku. Protože velikost vzorku v těchto studiích byla malá, což vedlo ke snížení statistické síly, velikosti efektu (η2ρ) nebo Cohenova D) byla stanovena pro všechny analýzy a nevýznamné účinky s velikostí účinku větší než 0.06 (η2ρ) nebo 0.4 (D).

3. Výsledek

3.1 behaviorální reaktivita v novém prostředí

Lokomotorická aktivita vykazovaná adolescentními krysy v novém otevřeném poli pro 5 min je znázorněna v Obrázek 1. TDM byl normálně distribuován (Kolmogorov-Smirnov D = 0.083, p> 0.05), přičemž zvířata vykazovala rozsah pohybu mezi 4339 a 7739 cm / 5 min. Medián TDM byl 5936 cm / 5 min, přičemž u jednoho zvířete byl medián (zobrazen v šedém kruhu), který byl odstraněn z další studie. TDM pro skupiny HLA a LLA byl významně odlišný [t (86) = 12.15, p <0.05; Cohen's D = 2.56] s TDM 6621 TDM ± 71 cm / 5 min pro zvířata HLA a 5499 ± 59 cm / 5 min pro zvířata LLA. Zvířata byla systematicky zařazována do experimentálních skupin podle reaktivity chování na nové prostředí, aby bylo zajištěno, že všechny skupiny vykazovaly rovnocennost v nové aktivitě na otevřeném poli a obsahovaly stejný počet zvířat HLA a LLA (Tabulka 1). Dále, každé skupině nebylo přiděleno více než samce 1 a samice 1 z daného vrhu.

Obr. 1  

Klasifikace behaviorální reaktivity dospívajících potkanů ​​do nového prostředí. Lokomotorická aktivita dospívajících zvířat (N = 89) byla stanovena změřením celkové ujeté vzdálenosti (TDM) v novém otevřeném poli po dobu 5 min. Zvířata byla klasifikována ...
Tabulka 1  

Nové aktivity v otevřeném terénu vystavené dospívajícími krysy

3.2 Ethanol CPP v dospělosti po expozici nikotinu během dospívání

První sada experimentů stanovila, zda expozice nikotinu během dospívání zvýšila zranitelnost vůči prospěšným účinkům alkoholu v dospělosti, a zjistilo se, zda odpovědi závisely na behaviorální reaktivitě krys v novém prostředí. Po klasifikaci potkanů ​​jako HLA nebo LLA byla zvířatům podána injekce fyziologického roztoku nebo nikotinu z PND 35 – 42 a byl stanoven CPP na ethanol, když byli potkani mladí dospělí na PND 69. Výsledky jsou uvedeny v Obrázek 2. ANOVA naznačila významnou třícestnou interakci mezi novou aktivitou v otevřeném poli (HLA nebo LLA), expozicí nikotinu a úpravou ethanolem [F (3) = 1,19, p <5.165], s pozorovanou silou 0.05 a odhadovaným účinkem velikost (η2ρ) 0.214. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi muži a ženami jako hlavní účinek nebo interakce a velikost účinku (η2ρ) byla ve všech případech menší než 0.06, což naznačuje, že tato proměnná měla malý dopad na pozorované výsledky. Zvířata HLA vystavená nikotinu během dospívání a kondicionovaná ethanolem v dospělosti vykazovala preferenci oddělení párovaného s ethanolem ve srovnání se zvířaty HLA, která byla vystavena buď nikotinu a kondicionována solným roztokem nebo fyziologickým roztokem nebo kondicionována ethanolem [p <0.05]. Zdálo se, že zvířata LLA vystavená nikotinu vykazují averzi vůči komoře spárované s ethanolem ve srovnání s odpovídajícími zvířaty vystavenými solnému roztoku s velikostí účinku (Cohenova D) 0.80, ale tento účinek nedosáhl významnosti [t (7) = 1.346, p> 0.05] při pozorovaném výkonu 0.425. Data tedy naznačují, že adolescenti s HLA mají zranitelnost vůči odměně za ethanol, kterou lze vyvolat nebo zahájit adolescentní expozicí nikotinu, zatímco zvířata s HLA vystavená LLA a solnému roztoku vykazují odpovědi na ethanol typické pro dospělé krysy [42, 46].

Obr. 2  

Účinky expozice nikotinu u adolescentů na etanolem indukované preferované místo (CPP) u dospělých. Krysy byly klasifikovány jako vykazující HLA nebo LLA na PND 31, jak bylo popsáno, a dostávaly injekce buď fyziologického roztoku (0.9%) nebo nikotinu (0.56 mg volné báze / kg) ...

3.3 ΔFosB v dospívání během opakované expozice nikotinu

Protože zvýšení ΔFosB v limbických strukturách zvyšuje preference léků [15,16], experimenty stanovily, zda expozice nikotinu u adolescentů měla odlišný účinek na hladiny tohoto transkripčního faktoru v vStr a PFC u potkanů ​​HLA a LLA. Po klasifikaci chování dostali samci a samice potkanů ​​injekce buď fyziologického roztoku nebo nikotinu po dobu 4 nebo 8 dní počínaje PND 35. Vzorky mozku byly izolovány 24 hodiny po poslední injekci na PND 39, respektive 43, a byly podrobeny westernovým imunoblotovým analýzám. Výsledky měření ΔFosB ve vStr (Obrázek 3) naznačil významný hlavní účinek jak počtu dnů injekcí [F (1, 16) = 4.542, p <0.05; η2ρ=0.221] a expozice léčivu [F (1, 16) = 18.132, p <0.05; η2ρ=0.531] a interakce mezi expozicí léčivu a fenotypem, který se přiblížil významu [F (1, 16) = 3.594, p = 0.076; η2ρ=0.183]. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi muži a ženami jako hlavní účinek nebo interakce a velikost účinku (η2ρ) byla ve všech případech menší než 0.025, což naznačuje, že pohlaví mělo malý vliv na pozorované výsledky. Čtyři dny expozice nikotinu významně zvýšily hladiny ΔFosB (p <0.05) pouze u vStr HLA potkanů ​​a toto zvýšení přetrvávalo po 8 dnech expozice nikotinu, v době, kdy také nikotin významně (p <0.05) zvýšil hladiny ΔFosB ve vStr z LLA krysy. Analýza ΔFosB v PFC odhalila významnou interakci mezi počtem dnů injekcí a expozicí léku [F (1, 16) = 7.912, p = 0.05; η2ρ=0.331]. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi muži a ženami jako hlavní účinek nebo interakce; interakce pohlaví s injekčními dny a expozicí léčivu se však přiblížila významnosti (p = 0.055; η2ρ=0.211) u mužů mají tendenci vykazovat vyšší hodnoty ΔFosB po 4 dnech nikotinu než u žen. Celkově byly hladiny ΔFosB v PFC nezměněny po 4 dnech expozice nikotinu buď u zvířat HLA nebo LLA, ale 8 dní expozice nikotinu vedlo k podobnému významnému (p <0.5) zvýšení ΔFosB v tkáni jak u HLA, tak u LLA potkanů. Nikotin měl tedy rozdílný časový účinek na hladiny ΔFosB ve vStr od HLA a LLA potkanů, ale nikoli na hladiny v PFC.

Obr. 3  

Účinky expozice nikotinu u dospívajících na hladiny AFOS ve ventrálním striatu a prefrontální kůře. Krysy byly klasifikovány jako vykazující HLA nebo LLA na PND 31, jak bylo popsáno, dostávaly injekce buď fyziologického roztoku (0.9%) nebo nikotinu (0.56 mg zdarma) ...

3.4 ΔFosB v dospělosti po expozici nikotinu během dospívání

Aby se určilo, zda nikotinem vyvolaná zvýšení ΔFosB pozorovaná v adolescenci přetrvávala až do mladého dospělosti, po behaviorální klasifikaci krys, zvířata dostávala injekce fyziologického roztoku nebo nikotinu po dobu 8 od PND 35 – 42 a 27 dní později, na PND 69, byly izolovány vStr a PFC a kvantifikovány AFOSB. Výsledky měření ΔFosB ve vStr (Obrázek 4) naznačil významný hlavní účinek obou fenotypů [F (1, 16) = 14.349, p <0.05; η2ρ=0.642] a expozice léčivu [F (1, 16) = 7.368, p <0.05; η2ρ=0.479]. Podobně výsledky měření ΔFosB v PFC naznačily významný hlavní účinek fenotypu [F (1, 16) = 9.17, p <0.05; η2ρ=0.534] a expozice léčivu [F (1, 16) = 10.129, p <0.05; η2ρ=0.559]. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi muži a ženami jako hlavní účinek nebo interakce pro měření AFOS v vStr nebo PFC. Velikost efektu (η2ρ) pro hlavní účinek pohlaví byl 0.143 a 0.191 pro vStr a PFC, přičemž muži měli tendenci vykazovat vyšší hodnoty ΔFosB než ženy. Hladiny ΔFosB se nezměnily jak u vStr, tak u PFC u zvířat HLA, která dostávala nikotin během dospívání, ve srovnání s jejich protějšky vystavenými působení solného roztoku. Naproti tomu hladiny ΔFosB jak vStr, tak PFC od LLA potkanů, kterým byl během dospívání podáván nikotin, byly významně (p <0.05) vyšší než u zvířat LLA, kterým byl injikován fyziologický roztok [vStr t (3) = 2.47, p <0.05; PFC t (3) = 2.013, p <0.05] nebo zvířata s HLA injekcí s nikotinem [vStr t (6) = 3.925, p <0.05; PFC t (6) = 2.864, p <0.05]. Ačkoli tedy 8 dní adolescentní expozice nikotinu vedlo k okamžitému zvýšení hladin ΔFosB ve vStr a PFC jak u zvířat HLA, tak u LLA, tento účinek přetrvával do dospělosti pouze u zvířat LLA.

Obr. 4  

Účinky expozice nikotinu u dospívajících na hladinu AFOS ve ventrálním striatu a prefrontální kůře dospělých. Krysy byly klasifikovány jako vykazující HLA nebo LLA na PND 31, dostávaly 8 injekce buď fyziologického roztoku (0.9%) nebo nikotinu (0.56 mg zdarma) ...

4. Diskuse

Tato studie ukazuje, že expozice nikotinu během adolescence má odlišné účinky na CPP v ethanolu a změny v FosB v limbických oblastech od potkanů ​​s různými reaktivitami chování v novém prostředí. Expozice nikotinu u dospívajících usnadnila stanovení CPP v ethanolu v dospělosti pouze u zvířat, která vykazovala vysokou lokomotorickou aktivitu v novém prostředí v období dospívání. Dále, ačkoli expozice nikotinu u adolescentů po 8 dnech podání zvýšila hladiny AFOSB ve vStr a PFC, toto zvýšení přetrvávalo do dospělosti pouze u zvířat, která vykazovala nízkou lokomotorickou aktivitu v novém prostředí.

Výsledky tedy ukazují, že účinky expozice nikotinu dospívajícím na etanol CPP v dospělosti závisí na behaviorálním fenotypu zvířat, a naznačují, že trvalé zvýšení AFOSB v limbických oblastech není nezbytné nebo dostatečné k usnadnění CPP ethanolu v dospělosti.

Zjištění, že expozice nikotinu u dospívajících usnadňuje CPP vůči ethanolu v dospělosti u HLA zvířat, souhlasí se zjištěními, že jedinci se zvýšenou reaktivitou chování na nové podněty vykazují větší citlivost na prospěšné účinky zneužívaných sloučenin než jedinci s nižší reaktivitou [1-8]. Je však třeba poznamenat, že CPP lze vyrobit posílením specifického chování během kondicionování nebo může být výsledkem podmíněných účinků léků [47], a proto by při interpretaci výsledků CPP mělo být postupováno opatrně, což svědčí o zvýšené odměně za léky. Smith a kol. [48] nezaznamenali zvýšený příjem ethanolu u dospělých potkanů ​​Sprague-Dawley po expozici nikotinu u dospívajících, což naznačuje, že prospěšné vlastnosti ethanolu nebyly na základě předchozí zkušenosti s nikotinem změněny. Tito autoři však použili paradigma nepřetržité expozice během 21 dní a nerozlišovali zvířata na základě lokomotorické aktivity v novém prostředí. Výsledky této studie naznačují, že důsledky denních injekcí nikotinu se mohou lišit od důsledků způsobených kontinuální expozicí nikotinu a prokazují důležitost rozlišení mezi krysy HLA a LLA, což může být zvláště důležité při studiu dospívajících. Ačkoli mnoho vyšetřovatelů uvedlo, že dospívající populace může být citlivější na prospěšné a posilující účinky drog [49-51], toto pozorování pravděpodobně odráží vývojovou tendenci dospívajících mít vlastnosti HLA zvířat [10]. Studie v lidské populaci skutečně prokázaly, že píky při hledání senzace během adolescence a poté klesají, přičemž u těch, kteří udržují senzaci jako adolescenti, je největší pravděpodobnost, že budou zvyšovat konzumaci alkoholu [52].

Výsledky naznačující rozdílný účinek expozice nikotinu dospívajícím na AFOSB v mozku od krys HLA a LLA podtrhují inherentní rozdíly mezi těmito skupinami zvířat. Výsledky ukazují jasné zvýšení hladin AFOS v vStr a PFC z obou skupin potkanů ​​po 8 dnech po expozici nikotinu adolescentům, ale tento účinek přetrvával do dospělosti pouze v mozku potkanů ​​LLA. Soderstrom a kol. [53] prokázali, že 10 dny expozice nikotinu (0.4 mg / kg, ip) z PND 34 – 43 zvýšily FosB imunoreaktivitu v NAcc v 37 dnech po poslední injekci nikotinu, ale tito autoři neměřili specificky ΔFosB nebo charakterizovali fenotyp chování zvířata. Výsledky naznačující, že k dlouhodobému zvýšení ΔFosB po expozici nikotinu u dospívajících dochází pouze u adolescentů LLA, naznačuje, že adolescenti LLA jsou „dospělejší“ než jejich protějšky HLA. Ve skutečnosti bylo u dospělých zvířat opakovaně prokázáno prodloužené zvýšení AFOSB po podání léčiva [31, 33, 34].

Očekávalo se, že HLA zvířata vystavená nikotinu během adolescence budou vykazovat jak CPP indukovaný ethanolem v dospělosti, tak trvalé zvýšení AFosB, které pravděpodobně senzibilizovalo dráhy odměny. Výsledky však ukazují, že přetrvávající zvýšení ΔFosB po expozici nikotinu u dospívajících není ani nezbytné, ani dostatečné pro stanovení CPP v ethanolu v dospělosti. Protože předpojaté paradigma CPP použité v této studii je citlivé na anxiolytické účinky ethanolu [54, 55], ethanolem indukovaný CPP pozorovaný po expozici dospívajícím nikotinu může být zprostředkován spíše změnami citlivosti na anxiolytické účinky ethanolu než výsledkem senzibilizované cesty odměny. Dospělá zvířata vystavená nikotinu během dospívání vykazují v dospělosti zvýšenou citlivost na stres a úzkost, o čemž svědčí zvýšený kortikosteron [28], snížený průzkum nového otevřeného pole a zkrácený čas v otevřených ramenech zvýšené plus bludiště [29, 30]. Zdá se tedy pravděpodobné, že dospělá zvířata vystavená nikotinu jako adolescentům mohou vykazovat CPP v ethanolu ve zkresleném paradigmatu v důsledku anxiolytických vlastností ethanolu. Je zajímavé, že zvířata vykazující zvýšenou expresi AFosB mohou být méně citlivá na stres a úzkost, jak ukazuje zvýšený čas strávený v otevřených ramenech zvýšené plus bludiště [56], prodloužte dobu plavání v testu nuceného plavání Porsolt [56], zvýšená odolnost po stresu v sociální porážce [57] a snížená odpověď kortikosteronu na zátěžový stres [58]. Zvířata LLA vystavená nikotinu, která vykazují trvalou expresi AFosB jako dospělí, proto nemusí najít anxiolytické účinky ethanolu, a v důsledku toho nemusí vykazovat CPP ve zkresleném paradigmatu. Ve skutečnosti zvířata s LLA injektovaná etanolem vykazovala velkou redukci (D = 0.80) v čase stráveném na straně párované s ethanolem ve srovnání se zvířaty LLA s injektovaným fyziologickým roztokem, což svědčí o averzi na podmíněnou averzi k místu vyvolané ethanolem. Jsou nutné další studie, aby se potvrdily rozdíly mezi zvířaty HLA a LLA v úzkostném chování a citlivosti na stres po expozici nikotinu u dospívajících.

Ačkoli nebyly pozorovány žádné statisticky významné rozdíly mezi samci a samicemi, vyskytly se určité mírné až velké účinky na pohlaví. Měření FOSB v PFC byla přibližně o 25% nižší u adolescentů mužů než jejich ženské protějšky po injekcích fyziologického roztoku 4 a asi o 19% vyšší u adolescentů po injekcích nikotinu 4 po podání 15, což naznačuje, že adolescentní muži mohou vykazovat zvýšení AOSos po méně expozicích na nikotin než dospívající ženy. Kromě toho byla měření ΔFosB o 17 – 15% vyšší u vStr a PFC dospělých samců, než bylo pozorováno u dospělých žen bez ohledu na to, zda byla tato zvířata vystavena fyziologickému roztoku nebo nikotinu jako dospívající. Toto zjištění je v souladu se zprávou, která prokazuje, že dospělí samci vykazují mírně vyšší hladiny AFosB v jádrových a skořápkových oblastech jádra accumbens než jejich ženské protějšky, a že tento rozdíl je přítomen u zvířat, kterým byl podán fyziologický roztok nebo kokain (2 mg / kg). po dobu XNUMX týdnů, což naznačuje, že tento rozdíl je nezávislý na expozici lékům [45]. Pokud je nám známo, žádné studie na dospívajících nebo dospělých zvířatech nesledovaly rozdíly v expresi AFOSB po expozici nikotinu; tato zjištění vyžadují další šetření.

Stručně řečeno, dospívající zvířata vykazující rozdíly v reaktivitě chování na nové prostředí také vykazují rozdíly v: 1) dlouhodobých důsledcích expozice nikotinu na citlivost na účinky ethanolu v dospělosti; 2) indukce ΔFosB během opakované expozice nikotinu; a 3) perzistence ΔFosB po opakované expozici nikotinu. Tato zjištění poskytují základ pro zkoumání rozdílů v inherentní zranitelnosti dospívajících zvířat, charakteristik, které lze skrínovat pomocí relativně jednoduchých behaviorálních opatření.

Highlights

  • Expozice mladistvého nikotinu vede u CPP k alkoholu u dospělých hledajících vysoké senzace
  • Expozice nikotinu u dospívajících zvyšuje expresi AFosB
  • Exprese FosB po adolescentním nikotinu přetrvává v dospělosti u hledačů s nízkým citem

Poděkování

Výzkum byl podporován státem Florida a NIAAA Národních zdravotních ústavů pod číslem F32AA016449. Za obsah nesou výlučnou odpovědnost autoři a nemusí nutně představovat oficiální názory státu Florida nebo National Institutes of Health.

Poznámky pod čarou

Zřeknutí se odpovědnosti vydavatele: Jedná se o soubor PDF s neupraveným rukopisem, který byl přijat k publikaci. Jako službu pro naše zákazníky poskytujeme tuto ranní verzi rukopisu. Rukopis podstoupí kopírování, sázení a přezkoumání výsledného důkazu před jeho zveřejněním ve své konečné podobě. Vezměte prosím na vědomí, že během výrobního procesu mohou být objeveny chyby, které by mohly ovlivnit obsah, a veškeré právní odmítnutí týkající se časopisu.

Reference

[1] Dellu F, Piazza PV, Mayo W, Le Moal M, Simon H. Hledání novosti u potkanů ​​- biobehaviorální charakteristiky a možný vztah s rysem hledajícím senzaci u člověka. Neuropsychobiologie. 1996; 34: 136–45. [PubMed]
[2] Deminiere JM, Piazza PV, Le Moal M, Simon H. Experimentální přístup k individuální zranitelnosti vůči psychostimulační závislosti. Neurosci Biobehav Rev. 1989; 13: 141 – 7. [PubMed]
[3] Klebaur JE, Bardo MT. Jednotlivé rozdíly v hledání novinek na hřišti bludiště předpovídají amfetaminové podmíněné místo. Pharmacol Biochem Behav. 1999; 63: 131 – 6. [PubMed]
[4] Klebaur JE, Bevins RA, Segar TM, Bardo MT. Individuální rozdíly v behaviorálních reakcích na novinky a samopodávání amfetaminu u samců a samic potkanů. Behav Pharmacol. 2001; 12: 267 – 75. [PubMed]
[5] Nadal R, Armario A, Janak PH. Pozitivní vztah mezi aktivitou v novém prostředí a operativním vlastním podáním ethanolu u potkanů. Psychofarmakologie (Berl) 2002; 162: 333 – 8. [PubMed]
[6] Piazza PV, Deminiere JM, Le Moal M, Simon H. Faktory, které předpovídají individuální zranitelnost vůči amfetaminové samosprávě. Věda. 1989; 245: 1511 – 3. [PubMed]
[7] Zheng X, Ke X, Tan B, Luo X, Xu W, Yang X, et al. Citlivost na podmíněné morfinové místo: vztah k stresem vyvolané lokomoce a chování při hledání novosti u juvenilních a dospělých potkanů. Pharmacol Biochem Behav. 2003; 75: 929 – 35. [PubMed]
[8] Zheng XG, Tan BP, Luo XJ, Xu W, Yang XY, Sui N. Chování novosti a lokomoce vyvolaná stresem u potkanů ​​juvenilní periody odlišně související s kondicionováním morfinového místa v dospělosti. Behav procesy. 2004; 65: 15 – 23. [PubMed]
[9] Crawford AM, Pentz MA, Chou CP, Li C, Dwyer JH. Paralelní vývojové trajektorie hledání smyslů a pravidelné užívání návykových látek u dospívajících. Psychol Addict Behav. 2003; 17: 179 – 92. [PubMed]
[10] Philpot RM, Wecker L. Závislost adolescentního chování při hledání novinek na fenotypu odezvy a účinky škálování aparátů. Behav Neurosci. 2008; 122: 861 – 75. [PubMed]
[11] Spear LP. Dospívající mozek a projevy chování související s věkem. Neurosci Biobehav Rev. 2000; 24: 417 – 63. [PubMed]
[12] Anthony JC, Petronis KR. Předčasné užívání drog a riziko pozdějších problémů s drogami. Závisí na drogovém alkoholu. 1995; 40: 9 – 15. [PubMed]
[13] Bonomo YA, Bowes G, Coffey C, Carlin JB, Patton GC. Pití dospívajících a nástup závislosti na alkoholu: kohortová studie trvající sedm let. Závislost. 2004; 99: 1520 – 8. [PubMed]
[14] Grant BF, Stinson FS, Harford TC. Věk při nástupu alkoholu a zneužívání alkoholu a závislost na alkoholu DSM-IV: následná kontrola po 12u. J Zneužití látky. 2001; 13: 493 – 504. [PubMed]
[15] Kandel DB, Yamaguchi K, Chen K. Etapy vývoje drogové závislosti od dospívání do dospělosti: další důkaz pro teorii brány. J Stud Alkohol. 1992; 53: 447 – 57. [PubMed]
[16] Lynskey MT, Heath AC, Bucholz KK, Slutske WS, Madden PA, Nelson EC, et al. Eskalace užívání drog u uživatelů konopí s časným nástupem versus kontroly dvojčat. Jama. 2003; 289: 427 – 33. [PubMed]
[17] Patton GC, McMorris BJ, Toumbourou JW, Hemphill SA, Donath S, Catalano RF. Puberta a nástup užívání a zneužívání návykových látek. Pediatrie. 2004; 114: e300 – 6. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[18] Taioli E, Wynder EL. Vliv věku, ve kterém kouření začíná, na frekvenci kouření v dospělosti. N Engl J Med. 1991; 325: 968 – 9. [PubMed]
[19] Johnston LD, O'Malley PM, Bachman JG, Schulenberg JE. Národní výsledky týkající se užívání drog dospívajícími: Přehled klíčových zjištění, 2008. NIH Publication; Bethesda, MD: 2009.
[20] Johnston LD, O'Malley PM, Bachman JG, Schulenberg JE. Monitorování budoucích národních výsledků o užívání drog dospívajícími: Přehled klíčových zjištění, 2011. Institute for Social Research, The University of Michigan; Ann Arbor: 2012.
[21] Johnson KA, Jennison KM. Syndrom pití a kouření a sociální kontext. Int J Addict. 1992; 27: 749 – 92. [PubMed]
[22] Grant BF. Věk při nástupu kouření a jeho souvislost s konzumací alkoholu a zneužíváním alkoholu a závislostí na alkoholu DSM-IV: výsledky národního longitudinálního epidemiologického průzkumu alkoholu. J Zneužití látky. 1998; 10: 59 – 73. [PubMed]
[23] Adriani W, Spijker S, Deroche-Gamonet V, Laviola G, Le Moal M, Smit AB, et al. Důkaz zvýšené neurobehaviorální zranitelnosti vůči nikotinu během periadolescence u potkanů. J Neurosci. 2003; 23: 4712 – 6. [PubMed]
[24] James-Walke NL, Williams HL, Taylor DA, McMillen BA. Periadolescentní expozice nikotinu vyvolává u potkanů ​​senzibilizaci vůči diazepamu. Neurotoxikol teratol. 2007; 29: 31 – 6. [PubMed]
[25] McMillen BA, Davis BJ, Williams HL, Soderstrom K. Expozice nikotinu periadolescentem způsobuje heterologní senzibilizaci na posílení kokainu. Eur J Pharmacol. 2005; 509: 161 – 4. [PubMed]
[26] McQuown SC, Belluzzi JD, Leslie FM. Léčení nízkou dávkou nikotinu během časné adolescence zvyšuje následnou odměnu za kokain. Neurotoxikol teratol. 2007; 29: 66 – 73. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[27] Riley HH, Zalud AW, Diaz-Granados JL. Vliv chronické expozice nikotinu adolescentům na závažnost abstinenčního etanolu během dospělosti u myší C3H. Alkohol. 2010; 44: 81 – 7. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[28] Klein LC. Účinky expozice nikotinu u dospívajících na spotřebu opioidů a neuroendokrinní odpovědi u dospělých samců a samic potkanů. Exp Clin Psychopharmacol. 2001; 9: 251 – 61. [PubMed]
[29] Slawecki CJ, Gilder A, Roth J, Ehlers CL. Zvýšené chování podobné úzkosti u dospělých potkanů ​​vystavených nikotinu jako adolescentům. Pharmacol Biochem Behav. 2003; 75: 355 – 61. [PubMed]
[30] Slawecki CJ, Thorsell AK, El Khoury A, Mathe AA, Ehlers CL. Zvýšená imunoreaktivita podobná CRF a NPY u dospělých potkanů ​​vystavených nikotinu během dospívání: vztah k chování podobnému úzkosti a depresi. Neuropeptidy. 2005; 39: 369 – 77. [PubMed]
[31] Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: molekulární mediátor dlouhodobé nervové a behaviorální plasticity. Brain Res. 1999; 835: 10 – 7. [PubMed]
[32] Nestler EJ. Molekulární neurobiologie závislosti. Am J Addict. 2001; 10: 201 – 17. [PubMed]
[33] Nestler EJ. Molekulární podstata závislosti na dlouhodobé plasticitě. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119 – 28. [PubMed]
[34] Doufám, BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. Indukce dlouhodobého komplexu AP-1 složeného ze změněných Fos-like proteinů v mozku chronickým kokainem a jinými chronickými léčbami. Neuron. 1994; 13: 1235 – 44. [PubMed]
[35] Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadměrná exprese DeltaFosB specifická pro striatální buněčné typy zvyšuje motivaci ke kokainu. J Neurosci. 2003; 23: 2488 – 93. [PubMed]
[36] Ehrlich ME, Sommer J, Canas E, Unterwald EM. Periadolescentní myši vykazují zvýšenou regulaci DeltaFosB v reakci na kokain a amfetamin. J Neurosci. 2002; 22: 9155 – 9. [PubMed]
[37] Pascual MM, pastor V, Bernabeu RO. Nikotinem podmíněné místo preferovalo indukovanou CREB fosforylaci a expresi Fos v mozku dospělého potkana. Psychofarmakologie (Berl) 2009; 207: 57 – 71. [PubMed]
[38] Philpot RM, Engberg ME, Wecker L. Účinky expozice nikotinu na lokomotorickou aktivitu a hladiny pCREB ve ventrálním striatu dospívajících krys. Behav Brain Res. 2012; 230: 62 – 8. [PubMed]
[39] Raiff BR, Dallery J. Účinky akutního a chronického nikotinu na odpovědi udržované primárními a kondicionovanými zesilovači u potkanů. Exp Clin Psychopharmacol. 2006; 14: 296 – 305. [PubMed]
[40] Raiff BR, Dallery J. Obecnost nikotinu jako zesilovače zesilovače u potkanů: účinky na odpověď udržované primárními a kondicionovanými zesilovači a rezistence k vyhynutí. Psychofarmakologie (Berl) 2008; 201: 305 – 14. [PubMed]
[41] Popke EJ, Mayorga AJ, Fogle CM, Paule MG. Účinky akutního nikotinu na několik operativních chování u potkanů. Pharmacol Biochem Behav. 2000; 65: 247 – 54. [PubMed]
[42] Philpot RM, Badanich KA, Kirstein CL. Kondicionování místa: změny v odměňování a averzivní účinky alkoholu související s věkem. Alcohol Clin Exp Res. 2003; 27: 593 – 9. [PubMed]
[43] Philpot R, Kirstein C. Vývojové rozdíly v akumbální dopaminergní reakci na opakovanou expozici ethanolu. Ann NY Acad Sci. 2004; 1021: 422 – 6. [PubMed]
[44] Philpot RM, Wecker L, Kirstein CL. Opakovaná expozice ethanolu během dospívání mění vývojovou trajektorii dopaminergní produkce z jádra accumbens septi. Int J Dev Neurosci. 2009; 27: 805 – 15. [PubMed]
[45] Sato SM, Wissman AM, McCollum AF, Woolley CS. Kvantitativní mapování exprese DeltaFosB indukované kokainem ve striatu samců a samic potkanů. PLoS One. 2011; 6: e21783. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[46] Asin KE, Wirtshafter D, Tabakoff B. Nepodařilo se u potkanů ​​stanovit preferované místo s ethanolem. Pharmacol Biochem Behav. 1985; 22: 169 – 73. [PubMed]
[47] Huston JP, Silva MA, téma B, Muller CP. Co je podmíněno preferovaným podmíněným místem? Trends Pharmacol Sci. 2013; 34: 162–6. [PubMed]
[48] Smith AM, Kelly RB, Chen WJ. Chronická kontinuální expozice nikotinu během periadolescence nezvyšuje příjem ethanolu během dospělosti u potkanů. Alcohol Clin Exp Res. 2002; 26: 976 – 9. [PubMed]
[49] Adriani W, Laviola G. Windows zranitelnosti vůči psychopatologii a terapeutické strategii v modelu dospívajícího hlodavce. Behav Pharmacol. 2004; 15: 341 – 52. [PubMed]
[50] Chambers RA, Taylor JR, Potenza MN. Vývojová neurocircuitry motivace v dospívání: kritické období zranitelnosti závislosti. Am J Psychiatry. 2003; 160: 1041 – 52. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[51] Crews F, He J, Hodge C. Vývoj kortikálního vývoje u dospívajících: kritické období zranitelnosti pro závislost. Pharmacol Biochem Behav. 2007; 86: 189 – 99. [PubMed]
[52] Quinn PD, Harden KP. Diferenciální změny v hledání impulzivity a senzace a eskalace užívání návykových látek od dospívání do rané dospělosti. Dev Psychopathol. 2012: 1 – 17. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[53] Soderstrom K, Qin W, Williams H, Taylor DA, McMillen BA. Nikotin zvyšuje expresi FosB v podskupině mozkových oblastí souvisejících s odměnou a pamětí během peri- a post-adolescence. Psychofarmakologie (Berl) 2007; 191: 891 – 7. [PubMed]
[54] Tzschentke TM. Měření odměny s paradigmatem upřednostňovaného místa: komplexní přehled účinků drog, nedávného pokroku a nových problémů. Prog Neurobiol. 1998; 56: 613 – 72. [PubMed]
[55] Tzschentke TM. Měření odměny s paradigmatem upřednostňovaného místa (CPP): aktualizace za poslední desetiletí. Addict Biol. 2007; 12: 227 – 462. [PubMed]
[56] Ohnishi YN, Ohnishi YH, Hokama M, Nomaru H, Yamazaki K, Tominaga Y, et al. FosB je nezbytný pro zvýšení tolerance vůči stresu a antagonizuje lokomotorickou senzibilizaci pomocí DeltaFosB. Biol Psychiatry. 2011; 70: 487 – 95. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[57] Vialou V, Robison AJ, Laplant QC, Covington HE, 3rd, Dietz DM, Ohnishi YN, et al. DeltaFosB v mozkových odměňovacích obvodech zprostředkovává odolnost vůči stresovým a antidepresivním reakcím. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 52. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
[58] Christiansen AM, Dekloet AD, Ulrich-Lai YM, Herman JP. „Snacking“ způsobuje dlouhodobé zmírnění stresových reakcí na ose HPA a zvýšení exprese mozku FosB / deltaFosB u potkanů. Physiol Behav. 2011; 103: 111 – 6. [PMC bezplatný článek] [PubMed]