Zdroj
Skupina buněčné a molekulární farmakologie, Ústav farmakologie, University School of Medicine, Murcia, Španělsko.
Abstraktní
Chronické užívání návykových látek zásadně mění systém reagující na stres. Opakovaná expozice morfinu vede k akumulaci transkripčního faktoru ΔFosB, zejména v oblastech mozku spojených s odměnou a stresem. Přetrvávající účinky ΔFosB na cílové geny mohou hrát důležitou roli v plasticitě vyvolané drogami. Nedávné důkazy naznačují, že hormony související se stresem (např. glukokortikoidy, GC) mohou indukovat adaptace v mozkovém stresovém systému, který pravděpodobně zahrnuje změnu genové exprese a transkripčních faktorů. Tato studie zkoumala roli GC v regulaci FosB/ΔFosB v hypotalamických i extrahypotalamických mozkových stresových systémech během závislosti na morfinu. Za tímto účelem byla měřena exprese FosB/AFosB u kontrolních (falešně operovaných) a adrenalektomizovaných (ADX) potkanů, které se staly závislými na opiátech po deseti dnech léčby morfinem. U falešně operovaných potkanů byl FosB/ΔFosB indukován po chronickém podávání morfinu ve všech zkoumaných oblastech stresu mozku: nucleus accumbens (shell) (NAc), lůžkové jádro stria terminalis (BNST), centrální amygdala (CeA), hypotalamické paraventrikulární jádro (buňka solitirenergie PVN) (NTS-A(2)). Adrenalektomie zmírnila zvýšenou produkci FosB/ΔFosB pozorovanou po chronické expozici morfinu u NAc, CeA a NTS. Kromě toho ADX snížil expresi FosB/ΔFosB v CRH-pozitivních neuronech BNST, PVN a CeA. Podobné výsledky byly získány u NTS-A(2) TH-pozitivních neuronů a NAc pro-dynorfin-pozitivních neuronů. Tato data naznačují, že neuroadaptace (odhadovaná jako akumulace FosB/ΔFosB) na opiáty v oblastech mozku spojených se stresem je modulována GC, což podporuje důkaz o spojení mezi mozkovými stresovými hormony a závislostí.
Úvod
Opiátové léky, jako je morfin, jsou účinná analgetická činidla, která se používají k léčbě mnoha forem akutní a chronické bolesti. Závažné nežádoucí účinky, jako je tolerance a abstinenční příznaky, však přispívají k závislosti na opiátech a omezují jejich užívání. Dále se v posledních letech zvýšilo nelékařské užívání opiátů (heroin, morfin). Rostoucí důkazy implikují různé mechanismy genové regulace (včetně epigenetických, molekulárních, buněčných a okruhových účinků) ve změnách, které zneužívané drogy vyvolávají v mozku, což ukazuje na potenciální terapeutickou strategii pro léčbu závislosti. - .
Ústřední otázkou v oblasti zneužívání drog bylo identifikovat proteiny, které zprostředkovávají přechod od akutních k dlouhodobým účinkům těchto léků. Zvláštní zájem o studium závislosti má rodina transkripčních faktorů Fos. Tato rodina zahrnuje c-Fos, Fra-1 a Fra-2, FosB a ΔFosB, variantu zkráceného spoje plné délky FosB . Na rozdíl od jiných členů rodiny Fos je ΔFosB mírně indukován v mozku po akutním podání léku, ale kvůli svému neobvykle dlouhému poločasu přetrvává týdny, dokonce měsíce po ukončení užívání drogy. v důsledku toho Hladiny ΔFosB se postupně hromadí při opakované expozici léčivu , , což naznačuje, že ΔFosB by mohl představovat mechanismus, kterým zneužívané drogy vyvolávají trvalé změny ve vzorci genové exprese dlouho po vysazení drogy .
Bylo hlášeno, že opakovaná expozice kokainu, amfetaminu, kanabinoidům nebo morfinu vede ke zvýšení ΔFosB v oblastech mozku souvisejících s pozitivními posilujícími účinky drog, jako je nucleus accumbens (NAc), prefrontální kortex a dorzální striatum. Tento nárůst byl navržen jako neuroadaptace, která vede ke zvýšené citlivosti na zneužívání drog a zranitelnosti vyvinout charakteristické chování závislosti. - . Nedávno jsme ukázali, že tlZvýšení hladin FosB/ΔFosB po chronickém podávání morfinu se neomezuje pouze na systém odměn, ale vyskytuje se také v systému stresu mozku (který souvisí s negativními posilujícími účinky drog), stejně jako v jádře osamělého traktu-A2 noradrenergní buněčná skupina (NTS-A2, hlavní noradrenergní systém inervující stresovou neurocirkulaci) . V souladu s těmito zjištěními několik forem chronického stresu také indukuje ΔFosB v NAc a dalších oblastech mozku , .
Závislost je komplexní porucha, protože k rozvoji a udržení této neurologické poruchy přispívá mnoho faktorů. Jedním z faktorů je stres, který se podílí na specifických aspektech drogové závislosti - . Jak osa hypotalamus-hypofýza-nadledviny (HPA, primární endokrinní stresová dráha), tak extrahypotalamický stresový systém (který zahrnuje rozšířenou amygdalu a NTS-A2) jsou dysregulovány chronickým podáváním léků s potenciálem závislosti , . Kromě toho je reakce osy HPA podobná jak po stresových stimulech, tak po akutní expozici drogám , , se zvýšeným uvolňováním hormonu uvolňujícího kortikotropin (CRH), adrenokortikotropního hormonu (ACTH) a glukokortikoidů (GC). Tjeho reakce usnadňuje adaptaci na akutní změny prostředí, ale také může vést k patologiím chování během chronických stresových stavů, jako je závislost a deprese . Studie dosud nezkoumaly vztah mezi GC a indukcí FosB/ΔFosB indukovanou závislostí na morfinu v mozkovém stresovém systému. Hodnotili jsme proto vliv GC na expresi FosB/ΔFosB po kontinuálním podávání morfinu v oblastech souvisejících se stresem mozku. Abychom tuto otázku vyřešili, nejprve jsme zkoumali účinky bilaterální adrenalektomie (ADX) na imunoreaktivitu FosB/ΔFosB (IR) v hlavních jádrech stresového systému u potkanů závislých na morfinu.
Činnost mozkového stresového systému je zprostředkována řadou neurotransmiterů/neuromodulátorů. CRH je hlavním neuropeptidem regulujícím aktivitu stresového systému a předpokládá se, že přispívá jak k již existující náchylnosti k návykovému užívání drog, tak pozdější náchylnosti k relapsu. . JáKromě toho hojná práce podporuje důležitost NTS-A2 inervace mozkového stresového systému při drogové závislosti a stěžejní role noradrenalinu (NA) jako neurotransmiteru modulujícího tuto neurocirkulaci . Konečně, podstatné důkazy naznačují, že exprese dynorfinu je aktivována ve striatu a amygdale během akutního a chronického podávání léků . Vzhledem k těmto skutečnostem bylo následujícím cílem této studie identifikovat roli GC na expresi FosB/ΔFosB ve specifických populacích mozkového stresového systému během závislosti na morfinu.
výsledky
Účinky adrenalektomie na přírůstek tělesné hmotnosti a plazmatický ACTH a koncentraci kortikosteronu u potkanů závislých na morfinu
Před provedením imunodetekčních testů jsme hodnotili účinnost chronické léčby morfinem. Pro tento účel byla zaznamenávána hmotnost zvířat v den implantace pelet a v den usmrcení (den 10). Dvoucestná ANOVA odhalila významné hlavní účinky na zvýšení tělesné hmotnosti při adrenalektomii [F(1,47)
=13.24, str=0.0007), léčba morfinem [F(1,47)=281.05, str<0.0001] a interakce mezi ADX a léčbou morfinem [F(1,47)=4.13, str=0.0479]. V souladu s předchozími zjištěními , , post hoc analýza ukázala, že jak simulované, tak ADX skupiny, které se staly závislými na morfinu, vykazovaly významně (str<0.001) nižší přírůstek hmotnosti (-13.75±5.0 g, n=12; 3.84 ± 2.45 g, n=13, v tomto pořadí), než u zvířat ve slepé a ADX skupině, která dostávala placebo pelety (44.58±1.7 g, n=12; 49.57 ± 2.4 g, n=12), což bylo přičítáno sníženému příjmu potravy pozorovanému u těchto zvířat .
Pro kontrolu účinnosti adrenalektomie byly měřeny koncentrace hormonů v plazmě. Dvoucestná ANOVA zkoumající účinky adrenalektomie a morfinu na ACTH a plazmatickou koncentraci kortikosteronu prokázala významné hlavní účinky adrenalektomie [ACTH: F(1,18)=68.12, str<0.0001; kortikosteron: F(1,45)=10.42, str=0.0023). Jak se očekávalo, Newman's post hoc test ukázal (Obr. S1), že v placebu (n=6)- a morfin (č=4) Plazmatická koncentrace ACTH u potkanů ADX byla vyšší (str<0.001) ve srovnání s falešně operovanými zvířaty pro dvě hodnocené léčby (placebo, n=6; a morfin, n=6). Nebyly pozorovány žádné změny v plazmatické koncentraci kortikosteronu mezi ADX-placebem (n=14) a ADX-morfin (č=13) ošetřené krysy. Koncentrace kortikosteronu u potkanů léčených ADX-morfinem byla významně (str<0.01) nižší než hodnoty pozorované u falešného morfinu (n=10) ošetřené krysy. Nebyly pozorovány žádné významné změny ve skupině s předstíraným podáváním morfinu ve srovnání s předstíranou léčbou placebem (n=12).
Adrenalektomie rozdílně zeslabuje fosB/ΔFosB indukovanou závislostí na morfinu v dílčích oblastech mozkového stresového systému
U kontrolních zvířat (krysy s implantovaným placebem) byla identifikována slabá konstitutivní exprese FosB/AFosB-IR ve všech oblastech mozkového systému souvisejícího se stresem. Chronická léčba morfinem vedla k výskytu FosB/AFosB ve všech zkoumaných oblastech mozku. V NAc(shell) ukázala dvoucestná ANOVA významné hlavní účinky adrenalektomie [F(1,16)=6.44, str=0.0220] a chronická léčba morfinem [F(1,16)=19.98, str=0.0004]. Newman-Keulsův post hoc test ukázal (Obr. 2A–E), že u potkanů léčených morfinem došlo k významnému (p<0.01) zvýšení exprese FosB/AFosB. U potkanů ADX závislých na morfinu došlo k významnému (p<0.05) snížení exprese proteinu FosB/AFosB v NAc. Dvoucestná ANOVA pro BNST ukázala významný hlavní účinek chronické léčby morfinem [F(1,16)=48.92, str<0.0001]. Post hoc analýza odhalila nárůst (str<0.001) ve FosB/ΔFosB u zvířat závislých na morfinu i na ADX, což naznačuje, že regulace FosB/ΔFosB souvisela s chronickou expozicí morfinu bez ohledu na koncentraci GC (Obr. 2F–J). Dvoucestná ANOVA pro FosB/ΔFosB v CeA ukázala významné účinky adrenalektomie [F(1,15)=20.51, str=0.0004] a předléčení morfinem [F(1,15)=27.52, str<0.0001]. Post hoc test ukázal signifikantní zvýšení (p<0.01) hladin FosB/ΔFosB u potkanů se simulovaným morfinem oproti potkanům s falešným placebem, které bylo oslabeno (p<0.01) ve skupině ADX závislé na morfinu (Obr. 2K–O). Kromě toho potkani peletovaní placebem ADX vykazovali nižší hladiny (p<0.01) FosB/AFosB než skupina s falešným placebem.
Dvoucestná ANOVA zkoumající účinky adrenalektomie a morfinu na expresi FosB/ΔFosB v PVN (parvocelulární subdivize) odhalila významný účinek léčby morfinem [F(1,16)=16.31, str<0.0001]. Post hoc analýza ukázala významný (Obr. 3A–E) zvýšit (str<0.05) ve FosB/AFosB-IR v PVN od simulovaně i ADX-morfinem ošetřených potkanů. V NTS-A2 skupina katecholaminergních buněk, dvoucestná ANOVA odhalila hlavní účinek léčby morfinem [F(1,11)=76.33, str<0.0001]. Post hoc analýza ukázala významný (Obr. 3F–J) zvýšení FosB/ΔFosB-IR u potkanů s falešným morfinem ve srovnání se skupinou s falešným placebem (p<0.001), která byla oslabena (p<0.05) ve skupině ADX závislé na morfinu.
Chronická expozice morfinu indukuje expresi FosB/ΔFosB do neuronů CRH u PVN, BNST a CeA. Vliv glukokortikoidů
Dvoucestná ANOVA pro FosB/ΔFosB-pozitivní/CRH-pozitivní neurony v BNST ukázala hlavní účinek adrenalektomie [F(1,20)=64.43, str<0.0001] a signifikantní interakce mezi adrenalektomií a léčbou morfinem [F(1,20)=6.80, str=0.0169]. V PVN odhalila dvoucestná ANOVA významný hlavní účinek adrenalektomie [F(1,19)=11.35, str=0.0032]. Dvoucestná ANOVA pro FosB/ΔFosB-pozitivní/CRH-pozitivní neurony v CeA ukázala významný hlavní účinek adrenalektomie [F(1,20)=106.85, str<0.0001], léčba morfinem [F(1,20)=7.33, str=0.0136] a signifikantní interakce mezi adrenalektomií a předléčbou [F(1,20)=7.07, str=0.0151]. Čísla 4, , 5,5, ,66 ukažte reprezentativní snímky řezů BNST, PVN a CeA z falešných nebo ADX-kontrol a potkanů závislých na morfinu. Post hoc analýza odhalila, že bylo zjištěno, že významný počet FosB/ΔFosB-pozitivních neuronů koexprimuje CRH v BNST (p<0.01; Obr. 4E), PVN (str<0.05; Obr. 6E) a CeA (str<0.01; Obr. 6E) u krys s falešným morfinem ve srovnání se skupinou s falešným placebem. Kromě toho byl počet FosB/ΔFosB-pozitivních neuronů společně exprimujících CRH u potkanů peletovaných na placebu ADX au potkanů závislých na morfinu významně nižší ve třech jádrech ve srovnání s odpovídající léčbou u falešných zvířat, jak je ukázáno na Čísla 4, , 5,5, ,66 (BNST: str<0.01 vs. simulace plus placebo; p<0.001 vs. simulace plus morfin; PVN: p<0.05 vs. simulace plus placebo; p<0.001 vs. simulace plus morfin; CeA: p<0.001 vs. simulace plus placebo a vs. simulace plus morfin).
Na úrovni BNST dvoucestná ANOVA pro počet CRH-pozitivních neuronů ukázala, že zde byl hlavní účinek ADX [F(1,20)=103.92, p<0.0001] a také chronický morfin [F(1,20)=4.35, p<0.05]. Jak je uvedeno v Tabulka 1, Newman-Keuls post hoc test odhalil, že potkani s peletou ADX s placebem a morfinem vykazovali nižší neurony CRH (p<0.001) než skupiny závislé na falešném placebu nebo morfinu. Na PVN prokázala dvoucestná ANOVA významný účinek adrenalektomie [F(1,19)=11.35, str=0.0032]. Dvoucestná ANOVA pro celkové neurony CRH na úrovni CeA odhalila významné účinky ADX [F(1,20)=240.09, p<0.0001] a hlavní interakce mezi ADX a chronickým morfinem [F(1,20)=4.49, str=0.0467]. Tabulka 1 ukazuje, že došlo k významnému poklesu CRH neuronů na CeA u potkanů léčených ADX placebem nebo morfinem. Tabulka 1 také ukazuje, že chronická expozice morfinu indukuje elevaci (p<0.05) CRH-pozitivních neuronů na hladinách BNST a CeA.
Účinky adrenalektomie na FosB/ΔFosB do DYN-pozitivních neuronů v NAc(Shell)
Nepozorovali jsme žádné významné změny v počtu pro-DYN-pozitivních buněk, které koexprimují FosB/ΔFosB v NAc(shell) po chronické expozici morfinu (Obr. 7) týkající se skupiny s placebem. Dvoucestná ANOVA pro FosB/ΔFosB-pozitivní/pro-DYN-pozitivní neurony v NAc(shell) ukázala hlavní účinek ADX [F(1,19)=10.11, str=0.0049]. Jak je uvedeno v Obr. 7C, počet FosB/ΔFosB-pozitivních neuronů, které koexprimují pro-DYN u ADX morfin-dependentních potkanů, byl významně (p<0.05) nižší s ohledem na odpovídající léčbu u falešných zvířat. Jak je uvedeno v Tabulka 1ADX neindukoval žádné změny v celkových pro-DYN buňkách z NAc(shell).
Adrenalektomie inhibuje fosB/ΔFosB indukovanou závislostí na morfinu do TH-pozitivních neuronů v NTS-A2 Noradrenergní buněčná skupina
Dvoucestná ANOVA pro FosB/ΔFosB-pozitivní/TH-pozitivní neurony v NTS-A2 ukázal hlavní účinek ADX [F(1,15)=64.86, str<0.0001], léčba morfinem [F(1,15)=29.62, str<0.0001] a signifikantní interakce mezi adrenalektomií a léčbou morfinem [F(1,15)=19.24, str=0.0005]. Newman-Keuls post hoc test ukazuje, že bylo zjištěno, že významný počet FosB/ΔFosB-pozitivních neuronů koexprimuje TH v NTS (p<0.001; Obr. 7F) u krys s falešným morfinem. Kromě toho byl počet FosB/ΔFosB-pozitivních neuronů koexprimujících TH u ADX morfin-dependentních potkanů významně nižší (p<0.001) ve srovnání s odpovídající léčbou u falešných zvířat, jak je uvedeno v Obr. 7F. Na druhou stranu, jak je ukázáno v Tabulka 1ADX neindukoval žádné změny v celkových TH-pozitivních neuronech v NTS.
Diskuse
Současné výsledky poprvé ukázaly, že mozková GC signalizace modulovala chronickým podáváním morfinu indukovanou expresi FosB/AFosB v mozkovém stresovém systému regionálně specifickým způsobem.
Konvergované linie důkazů naznačují, že stres zvyšuje riziko návykového chování . Přetrvávající stresové podněty mění syntézu, expresi a signalizaci v drahách souvisejících se stresem (např. CRH, GC, NA atd.). Kromě toho zneužívané drogy ovlivňují stresové dráhy, což vede ke změně genové exprese se signálními účinky na odměnu a molekuly související se stresem. . Stres a zneužívané drogy sdílejí schopnost spouštět překrývající se vzorce neuronální aktivace v centrálním nervovém systému, což vede k aktivaci okamžité genové exprese.
Bylo rozsáhle popsáno, že návykové látky a chronické stresové podněty zvyšují expresi transkripčního faktoru ΔFosB v hlavních jádrech podílejících se na jejich pozitivních posilujících účincích , , , a bylo navrženo, že přetrvávající účinky ΔFosB na cílové geny mohou hrát důležitou roli ve vývoji adaptací, které charakterizují závislost , . Málo je však známo buď o expresi ΔFosB v mozkovém stresovém systému po chronickém podávání zneužívaných drog, ani o molekulárních mechanismech akumulace ΔFosB vyvolané morfinem v oblastech souvisejících se stresem.
V této studii jsme zkoumali zapojení GC na morfinem indukovanou expresi FosB/ΔFosB v hormonálním stresovém systému (osa HPA), který je řízen CRH v PVN, a také v extrahypotalamických stresových systémech (které zahrnují rozšířenou amygdalu; ), zprostředkované CRH a dalšími systémy souvisejícími se stresem (včetně NA a dynorfinu; ).
Nedávno jsme prokázali, že chronické podávání morfinu po dobu sedmi dnů zvýšilo expresi FosB/ΔFosB v rozšířené amygdale, PVN a NTS-A2 . V souladu s těmito údaji současné výsledky ukazují, že chronické podávání morfinu vyvolalo zvýšení FosB/ΔFosB v CeA, BNST a NAc(shell), stejně jako v PVN a NTS-A2. Rozšířená amygdala byla spojována s odměnou za drogu. Ve skutečnosti všechny hlavní zneužívané drogy aktivují dopaminergní přenos z VTA do NAc(shell) a CeA. Ukázalo se, že tato aktivace a následné pozitivní posilující účinky zneužívaných látek souvisí s působením GC na GR umístěný ve VTA . Na podporu této hypotézy naše výsledky ukazují, že FosB/ΔFosB-IR v NAc(shell) a CeA byl u zvířat ADX oslaben, což by mohlo naznačovat křížovou komunikaci mezi transkripčními faktory AP-1 a GR během závislosti na morfinu. . Na rozdíl od pozorovaných účinků ADX na expresi FosB v NAc a CeA současné výsledky naznačují, že chronický morfin zvýšil expresi Fos/ΔFosB v PVN a BNST způsobem nezávislým na GC.
Několik neurotransmiterů mozkového stresového systému, jako je CRH, NA a DYN, bylo spojeno s averzivními stavy charakteristickými pro proces závislosti. , - . Současné nálezy ukázaly, že chronická expozice morfinu vyvolala významné zvýšení exprese Fos/ΔFosB v neuronech obsahujících CRH v BNST, CeA a PVN. Rodina transkripčních faktorů Fos může působit v místech cyklického AMP-response elementu (CRE). . Značné důkazy naznačují, že ΔFosB může působit buď jako transkripční represor nebo aktivátor , . Gi když gen CRH má ve své promotorové sekvenci motiv CRE, mohlo by se navrhnout, že akumulace FosB/ΔFosB v neuronech CRH může zprostředkovat morfinem vyvolané změny hladin CRH, jak se uvádí u účinků kokainu , zejména v CeA a BNST, kde jsme poprvé zaznamenali zvýšení počtu CRH-pozitivních neuronů během závislosti na morfinu. Na podporu této hypotézy bylo v CeA popsáno zvýšení hladin CRH mRNA po chronickém podávání morfinu . Počet CRH-pozitivních neuronů se však v PVN po chronické léčbě morfinem nezměnil. Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími zjištěními, která ukazují, že chronická expozice morfinu nevyvolává změny v PVN CRH hnRNA . Protože exprese PVN CRH je down-regulována pomocí GC , a vzhledem k této práci a další , ukázaly, že chronická expozice opiátům nemodifikovala uvolňování kortikosteronu, zdá se logické, že chronické podávání morfinu nezměnilo počet CRH buněk.
Periferní podávání kortikosteronu zvyšuje expresi CRH mRNA v CeA a BNST , . Navíc ADX snížil expresi CRH v CeA , . V souladu s tím jsme pozorovali, že zvýšení počtu neuronů CRH v BNST a CeA během závislosti na morfinu bylo po adrenalektomii zrušeno. Vzhledem k tomu, že zvýšení Fos/ΔFosB v neuronech CRH během závislosti na morfinu bylo u ADX zvířat zeslabeno, lze naznačit roli Fos/AFosB v regulaci exprese CRH pomocí GC v rozšířené amygdale. Na druhé straně je dobře známo, že GC negativně reguluje expresi genu CRH v PVN . Ve shodě, současné údaje jasně ukázaly, že adrenalektomie zrušila nárůst Fos/AFosB-IR v neuronech obsahujících CRH během závislosti na morfinu v tomto jádře.
V této studii imunochemická data odhalila, že chronická léčba morfinem významně zvýšila barvení na Fos/ΔFosB v NTS-A2, který byl po ADX snížen. Když jsme zkoumali specifické neurální populace, které exprimovaly FosB/AFosB, našli jsme robustní zvýšení Fos/AFosB-IR v TH (enzym omezující rychlost syntézy katecholaminů)-pozitivních neuronech. Ukázalo se, že NA hraje hlavní roli v závislosti . V předchozí práci chronická expozice morfinu vyvolala zvýšení hladin TH v NTS-A2 , . Je známo, že gen TH má ve svém promotoru místo AP-1 . Naše výsledky by mohly naznačovat, že FosB/ΔFosB se podílí na zvýšení hladin TH vyvolaném opiáty v NTS-A2. Skupina noradrenergních buněk mozkového kmene exprimuje vysoké hladiny GC receptorů (GR). Bylo prokázáno, že GC mají permisivní roli v noradrenergní neurotransmisi , , . V souladu s tím podávání antagonistů GR ovlivnilo několik aspektů aktivity NA, včetně aktivace TH a neuronální aktivity . Současné výsledky ukázaly, že po ADX došlo k poklesu TH-pozitivních buněk exprimujících FosB/ΔFosB v NTS-A2. Vzato v úvahu, že adrenalektomie zablokovala zvýšení hladin TH proteinu v NTS-A2 při závislosti na morfinu a že v promotoru genu TH bylo popsáno místo GRE/AP-1 , naše data by mohla poukázat na ΔFosB jako zprostředkovatele účinků GC na noradrenergní aktivitu v NTS-A2 při závislosti na opiátech.
DYN byl postulován jako možný cílový gen ΔFosB , . Naše výsledky ukazují, že chronická expozice morfinu významně nezměnila expresi FosB/ΔFosB v neuronech exprimujících pro-DYN v NAc(shell). Co se týče ΔFosB regulace exprese DYN, Zachariou et al ohlásili malý, ale významný pokles hladin DYN mRNA v NAc z myší s nadměrnou expresí ΔFosB, což předpokládá, že tento transkripční faktor inhibuje expresi DYN. Z našich dat nelze vyvodit závěr, že chronický morfin modifikuje expresi DYN prostřednictvím aktivity FosB/ΔFosB, vzhledem k tomu, že naše výsledky byly získány na úrovni proteinu.
Bylo postulováno, že opioidní systém DYN/kappa zřejmě vyvolává pro-depresivní stavy, které zahrnují prvky averze. Tato averzivní reakce může zahrnovat reciproční interakce s NAc, DA a extrahypotalamickým systémem CRH . Nicméně je málo známo o možné GC regulaci exprese DYN v NAc. Bylo navrženo, že ΔFosB v NAc, částečně prostřednictvím represe exprese DYN, zvyšuje citlivost na odměňující účinky morfinu a kokainu a vede k odolnosti vůči stresu , . Naše data podporují roli GC při regulaci pozitivních posilujících účinků morfinu zprostředkovaných mezokortikolimbickým DA systémem, vzhledem k tomu, že počet FosB/ΔFosB/pro-DYN-pozitivních neuronů klesá v NAc od ADX potkanů. Tyto účinky by mohly být zprostředkovány přímo GR, které jsou přítomny v mezolimbické cestě odměny, nebo nepřímo prostřednictvím projekcí CRH vycházejících z CeA a/nebo BNST do VTA a NAc, které jsou nedostatečně aktivované během závislosti na morfinu u potkanů ADX.
Stručně řečeno, tato studie poskytuje důkaz, že GC se kriticky podílejí na akumulaci FosB/ΔFosB v mozkových stresových systémech po chronické expozici morfinu, což může vést k trvalým změnám vzorce genové exprese v oblastech souvisejících se stresem. Současná zjištění také naznačují, že FosB/ΔFosB může přispívat ke změnám plasticity mozkového stresového systému během závislosti na opiátech závislých na GC. Další studie jsou nezbytné k určení intracelulárních mechanismů, kterými chronické opiáty indukují FosB/ΔFosB ve vybraných oblastech souvisejících se stresem, a také mechanismu, který je zodpovědný za potlačení exprese FosB/AFosB vyvolané morfinem pomocí GC.
Metody
Materiály
Kortikosteron a cholesterol byly zakoupeny od Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA). Pelety kortikosteronu byly vyrobeny Dr. Mártonem Vajnou, (Department of Pharmacy Administration, University of Pharmacy, Semmelweis University, Budapešť, Maďarsko). Pelety morfinové báze (Alcaliber Laboratories, Madrid, Španělsko) nebo laktózy (kontrola) byly připraveny na katedře farmacie a farmaceutické technologie (School of Pharmacy, Granada, Španělsko). Pentobarbital byl zakoupen od společnosti Hospira (Hoofddorp, Nizozemsko). Ketamin chlorhydrát a xylazin byly zakoupeny od Labs. Merial (Lyon, Francie) a Labs. Calier (Barcelona, Španělsko), resp.
Zvířata
Samci potkanů Sprague-Dawley (220–240 g na začátku experimentu; Harlan, Barcelona, Španělsko) byli po příjezdu umístěni po párech v klecích (délka 45 cm; šířka 24 cm; výška 20 cm) v místnosti s kontrolovanou teplotou (22 ± 2 °C) a vlhkostí (50 ± 10 %), se standardním přístupem Harlan k vodě a krmivu Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, Španělsko). Zvířata byla adaptována na standardní 12hodinový cyklus světlo-tma (zapnutá světla: 08 h 00 min – 20 h 00 min) po dobu 7 dnů před začátkem experimentů. Všechny chirurgické a experimentální postupy byly provedeny v souladu se směrnicí Rady Evropských společenství ze dne 24. listopadu 1986 (86/609/EHS) a byly schváleny místními výbory pro výzkum na zvířatech (REGA ES300305440012). Studie byla schválena bioetickým výborem University of Murcia (RD 1201/2005) a Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF/FEDER 2009-07178), Španělsko.
Adrenalektomie
Potkani byli bilaterálně adrenalektomizováni a byla jim implantována kortikosteronová peleta, aby byla zajištěna nízká, ale stabilní hladina GC . Potkani byli bilaterálně adrenalektomizováni (ADX) dorzálním přístupem pod anestezií 90 mg/kg ketamin chlorhydrátu a 8 mg/kg xylazinem (ip) a při operaci jim byly subkutánně (sc) implantovány pelety s pomalým uvolňováním kortikosteronu. Složení steroidních pelet (25 mg kortikosteronu plus 75 mg cholesterolu) bylo zvoleno tak, aby poskytovalo stabilní koncentraci kortikosteronu odpovídající cirkadiánnímu nadiru až 20 d po implantaci . Potkani ADX s náhradou kortikosteronu (ADX plus kortikosteron) nevykazují zvýšení plazmatického kortikosteronu vyvolané výzvou . Po operaci měli potkani ADX plus kortikosteron možnost pít izotonický fyziologický roztok (0.9 % NaCl), aby nahradili vyčerpaný sodík v důsledku ztráty aldosteronu v důsledku adrenalektomie. Kontrolní krysy byly podrobeny stejnému chirurgickému zákroku (sham) bez exstirpace nadledvin. Potkani Sham a ADX plus kortikosteron se nechali zotavit po operaci po dobu 5 dnů před procedurou závislosti na morfinu. Úspěšná bilaterální adrenalektomie byla potvrzena plazmatickou koncentrací kortikosteronu a ACTH a posmrtným vyšetřením ADX zvířat.
Léčba drogami a experimentální postup
Pět dnů po chirurgickém zákroku byly krysám subkutánně implantovány dvě 75mg morfinové pelety v lehké etherové narkóze. Kontrolní potkani dostávali placebo pelety obsahující laktózu. Ukázalo se, že tento postup poskytuje konzistentní koncentrace morfinu v plazmě začínající několik hodin po implantaci pelet a úplný abstinenční syndrom po akutní injekci opioidních antagonistů . Závislost na morfinu je dosažena 24 hodin po implantaci pelet a zůstává konstantní po dobu 15 dnů . Deset dní po implantaci morfinových nebo placebových pelet byly krysy usmrceny. Čtyři experimentální podmínky zkoumané pro aktivitu osy HPA (plazmatická koncentrace kortikosteronu a ACTH), expresi FosB/AFosB, expresi CRH, expresi DYN, expresi TH a expresi FosB/ΔFosB do CRH-, DYN- a TH-pozitivních neuronů byly: (i) falešné placebo; (ii) falešný morfin; (iii) ADX-placebo; (iv) ADX-morfin. Během léčby byl kontrolován přírůstek hmotnosti potkanů, aby se zajistilo správné uvolňování morfinu z pelet, protože je známo, že dlouhodobá léčba morfinem vyvolává snížení přírůstku tělesné hmotnosti způsobené nižším kalorickým příjmem .
Perfuze mozku a dělení
Krysy byly hluboce anestetizovány předávkováním pentobarbitalem (100 mg/kg ip) a transkardiálně perfundovány fyziologickým roztokem s následným fixačním prostředkem obsahujícím paraformaldehyd (4% paraformaldehyd v 0.1 M borátovém pufru, pH 9.5). Po odstranění perfundovaných mozků byly následně fixovány ve stejném fixativu po dobu 3 hodin a skladovány při 4 °C v PBS obsahujícím 10 % sacharózy, dokud nebyly na zmrazovacím mikrotomu rostrokaudálně nařezány koronální řezy (30 um tloušťka) (Leica, Nussloch, Německo). Atlas Paxinos a Watsona (2007) byl použit k identifikaci různých oblastí mozku potkanů: NAc (shell), BNST, PVN, CeA a NTS-A2 (Obrázek 1). Řezy byly kryoprotekovány a skladovány při -20 °C až do použití.
Imunohistochemie FosB/ΔFosB
Řezy byly zpracovány pro imunohistochemii, jak je popsáno v Núñez et al . Krátce, po blokování 0.3% H2O2 a 2% normální kozí sérum (Sigma, USA) tkáňové řezy byly inkubovány v primárním anti-FosB/AFosB antiséru (králičí polyklonální, #sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1![[poměr]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1000). Primární protilátka použitá v této studii nerozlišuje mezi FosB a její stabilní sestřihovou variantou ΔFosB. Ukázalo se, že opakovaná expozice stimulům indukujícím FosB znecitlivuje akutní indukovatelnost FosB , , . Proto lze rozdíly mezi barvením FosB/AFosB u potkanů předem ošetřených a nepředléčených morfinem interpretovat tak, že primárně odrážejí rozdíly v akumulaci AFosB. Antigeny byly vizualizovány běžným protokolem avidin-biotin-imunoperoxidáza (Vectastain ABC Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Reakce 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochloridu (DAB; Sigma, USA) byla zesílena síranem nikl-amonným. Řezy byly upevněny na podložní sklíčka potažená chrom-alumovou želatinou, dehydratována a překryta krycím sklíčkem.
Imunohistochemie s dvojitým značením FosB/ΔFosB-imunoreaktivních jader a CRH-, TH- a DYN-pozitivních neuronů
Pro dvojité značení FosB/AFosB-TH byly tkáňové řezy od každého potkana v každé léčebné skupině zpracovány na imunoreaktivitu FosB/AFosB pomocí intenzifikace DAB niklem a poté byl TH odhalen pouze pomocí DAB chromogenu. Imunobarvení FosB/AFosB bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve. Po barvení FosB/AFosB byly řezy opláchnuty v PBS, ošetřeny 2% normálním kozím sérem a poté inkubovány přes noc s králičí polyklonální anti-TH protilátkou (AB152, Chemicon, USA; 16000) při pokojové teplotě. Byly použity stejné imunohistochemické postupy popsané výše. Komplex TH protilátka-peroxidáza byl vyvinut v DAB. Řezy byly upevněny na podložní sklíčka potažená chrom-alumovou želatinou a překryty krycím sklíčkem.
Pro dvojité značení FosB/AFosB-CRH a FosB/AFosB-pro-DYN byl proces stejný jako dříve popsaný pro FosB/AFosB-TH. Pro detekci neuronů exprimujících DYN v NAc byl aplikován postup získávání antigenu inkubací mozkových řezů v citrátovém pufru (10 mM kyselina citrónová, 0.05 % Tween 20, pH 6.0) při 60 °C po dobu 20 minut před blokační procedurou. Primární anti-CRH králičí antisérum laskavě poskytl Wylie W. Vale (The Salk Institute, La Jolla, CA, USA) a bylo použito v 1.500 ul ředění po dobu 72 h při 4 °C. Primární protilátka pro-DYN byla zakoupena od Neuromics (# GP10110, Neuromics, Edina, MN, USA) a naředěna 12000 (72 h, 4 °C).
Analýza obrazu
Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Leica (DM 4000B; Leica) připojeného k videokameře (DFC290, Leica). FosB/AFosB-pozitivní buněčná jádra byla počítána pomocí počítačově podporovaného systému analýzy obrazu (QWIN, Leica). Hranice NTS-A2, BNST, CeA, NAc(shell) a parvocelulární pododdělení PVN a byl zaznamenán počet pozitivních profilů. Počet nukleárních profilů FosB/AFosB v mezích zájmových buněčných skupin byl spočítán bilaterálně ve čtyřech až pěti řezech od každého potkana a zprůměrován, aby se získala jediná hodnota pro každého potkana. Aby se zabránilo zaujatosti pozorovatele, byly všechny řezy kvantifikovány zaslepeným vyšetřovatelem. Celkové počty pro různé oblasti mozku jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM.
Kvantifikace TH-, CRH- a DYN-pozitivních buněk a dvojitě zbarvených profilů FosB/ΔFosB
Pozitivní jádra na imunoreaktivitu FosB/AFosB byla detekována pomocí stejné konvenční světelné mikroskopie popsané výše a počítána při 40x zvětšení. FosB/ΔFosB–pozitivní CRH, TH nebo DYN buňky byly identifikovány jako buňky s hnědými cytosolickými depozity pro CRH-pozitivní, TH-pozitivní a DYN-pozitivní barvení a modré/tmavé jaderné barvení pro FosB/ΔFosB. Čtvercové pole (195 um) bylo superponováno na zachycený snímek a použito jako referenční plocha. Počet dvakrát značených neuronů pozorovaných bilaterálně byl spočítán ve čtyřech až pěti řezech od každého zvířete v PVN, BNST a CeA pro neurony CRH, NTS pro neurony TH a NAc pro neurony DYN. Do analýzy byly také zahrnuty CRH, TH a DYN pozitivní buňky bez viditelného jádra (FosB/AFosB-negativní CRH, TH nebo DYN buňky).
Radioimunoassay
Krev byla odebrána do ledem chlazených zkumavek obsahujících 5% EDTA a poté byla odstředěna (500 g; 4 °C; 15 minut). Plazma byla oddělena, rozdělena na dva alikvoty a skladována při -80 °C, dokud nebyla testována na kortikosteron nebo ACTH. Plazmatické koncentrace kortikosteronu a ACTH byly kvantifikovány pomocí specifických protilátek proti kortikosteronu a ACTH pro potkany ([125I]-CORT a [125I]-ACTH RIA; MP Biomedicals, Orangeburg, NY, USA). Citlivost testu byla 7.7 ng/ml pro kortikosteron a 5.7 pg/ml pro ACTH.
Statistická analýza
Data jsou prezentována jako průměr ± SEM a byla analyzována pomocí statistického balíčku GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Data byla analyzována dvoucestnou analýzou rozptylu (ANOVA) s léčbou (placebo, morfin) a chirurgickým zákrokem (sham, ADX) jako nezávislými proměnnými. The Newman-Keuls post hoc test byl použit pro srovnání jednotlivých skupin. Rozdíly s p<0.05 byly považovány za významné.
Podpůrné informace
Obrázek S1
Účinky adrenalektomie (ADX) na plazmatické koncentrace ACTH (A) a kortikosteronu (B) u kontrol au zvířat léčených morfinem. Chirurgický ADX zvýšil hladiny ACTH jak u potkanů léčených placebem, tak u potkanů léčených morfinem, zatímco u potkanů léčených morfinem snížil koncentraci kortikosteronu v plazmě. Data představují průměr ± SEM plazmatických hladin ACTH a kortikosteronu u potkanů předem léčených placebem nebo morfinem po dobu 10 dnů. ***p<0.001 oproti falešnému placebu; ++p<0.01, + + +p<0.001 versus falešný morfin.
(TIF)
Poděkování
Děkujeme Dr. Mártonovi Vajnovi a Anně Földes z univerzity Semmelweis (Budapešť, Maďarsko) za přípravu kortikosteronových pelet.