(HUMAN) Behaviorální a strukturní reakce na chronický kokain vyžadují napájecí smyčku zahrnující Î "FosB a vápník / kalmodulinem závislou proteinovou kinázu II v jádře Nucleus Accumbens Shell (2013)

J Neurosci. 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, Wee S, Koob G, Turecki G, Nikdy, Thomas M, Nestler EJ.

Zdroj

Fishberg Department of Neuroscience a Friedman Brain Institute, Lékařská škola Mount Sinai, New York, New York, 10029, Oddělení neurovědy a psychologie, Ústav genetiky člověka, Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455, Výbor pro neurobiologii návykových nemocí , Výzkumný ústav Scripps, La Jolla, Kalifornie 92037 Depresivní poruchy Program, Douglas Mental Health University Institute a McGill University, Montréal, Québec, Kanada, H4H 1R3 a Katedra mozkových a kognitivních věd, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts 02139 .

Abstraktní

Transkripční faktor ΔFosB a protein kinasa II (CaMKIIa) obohacená o mozog / kalmodulin (CaMKIIa) jsou indukovány v jádře accumbens (NAc) chronickým vystavením kokainu nebo jiným psychostimulantním lékům, ve kterých tyto dva proteiny zprostředkovávají senzibilizované reakce léků . Přestože ΔFosB a CaMKIIα regulují expresi a funkci AMPA glutamátového receptoru v NAc, tvoření dendritické páteře na středních špinavých neuronech (MSN) NAC a lokomotorická senzibilizace kokainu, nebyla dosud prozkoumána žádná přímá vazba mezi těmito molekulami. Zde demonstrujeme, že ΔFosB je fosforylován CaMKIIa u proteinu stabilizujícího Ser27 a že CaMKII je požadované pro kokainem zprostředkovanou akumulaci ΔFosB v potkaní NAc.

Naopak jsme ukázali, že ΔFosB je nezbytný a dostatečný pro indukci kokainu exprese genu CaMKIIa in vivo, což je účinek selektivní pro D1typu MSN v subregiónu NAc shellu.

Navíc indukce dendritických trnů na NAc MSNs a zvýšená reakce na chování kokainu po nadměrné expresi NAc nad ΔFosB jsou závislé na CaMKII.

Důležité je, že poprvé demonstrujeme indukci ΔFosB a CaMKII v NAc lidských závislých na kokainu, což naznačuje možné cíle pro budoucí terapeutické intervence. Tyto údaje potvrzují, že ΔFosB a CaMKII se účastní buněčného a mozku-specifické pozitivní dopředné smyčky jako klíčového mechanismu pro regulaci odměňování mozku jako odpověď na chronický kokain.

Úvod

Zvyšující se důkazy podporují názor, že změny exprese genů přispívají k mechanismům závislosti na drogách (Robison a Nestler, 2011). Jedním z důležitých mediátorů těchto změn je ΔFosB, faktor transkripce rodiny Fos (Nestler, 2008). Chronické podávání prakticky libovolného zneužívajícího léku vyvolává dlouhodobou akumulaci ΔFosB v nucleus accumbens (NAc), limbickou oblast nezbytnou pro odměňování. Sindukce se vyskytuje specificky ve třídě NAc středně špinavého neuronu (MSN), který exprimuje dopaminové receptory D1. Inducibilní nadměrná exprese ΔFosB u těchto Nac MSN D1 zvyšuje lokomotorické a odměňující se reakce na kokain a morfin (Kelz a kol., 1999; Zachariou a kol., 2006), včetně zvýšené samoregulace kokainu (Colby a kol., 2003). Dále genetická nebo virová blokáda transkripční aktivity ΔFosB snižuje odměňující účinky těchto léků (Zachariou a kol., 2006), což naznačuje, že tato trvalá indukce ΔFosB je kritickým prostředníkem trvalých změn indukovaných v NAc chronickým podáním léků.

Neobvyklá stabilita ΔFosB (ve vztahu ke všem ostatním rodinným proteinům Fos) je jak vlastní vlastností molekuly, tak i kvůli zkrácení degron domén přítomných v plné délce FosB (Carle a kol., 2007) a regulovaný proces. ΔFosB je fosforylován in vitro a in vivo u Ser27 a tato reakce dále stabilizuje ΔFosB, 10-fold v buněčné kultuře a NAc in vivo (Ulery-Reynolds a kol., 2009). Přestože se ukázalo, že Ser27-ΔFosB je substrát pro kasein kinázu-2 in vitro (Ulery a kol., 2006), jeho mechanismus in vivo fosforylace zůstává neznámá.

Protein kináza II (CaMKII) závislá na kalcium / calmodulin je vysoce exprimovaná serin / threonin kináza, jejíž α a β izoformy tvoří dodekamerické homo- a hetero-holoenzymy in vivo, a jsou nezbytné pro mnohočetné formy neuroplasticity (Lisman a kol., 2002; Colbran a Brown, 2004). CaMKIIa je selektivně indukován v NAc skořápce chronickým amfetaminem (Loweth a kol., 2010) a farmakologická blokáda aktivity CaMKII v shellu NAc snižuje senzibilizaci chování na amfetamin (Loweth a kol., 2008) a kokain (Pierce a kol., 1998), zatímco virovou nadměrnou expresí CaMKIIα v tomto subregionu NAc zvyšuje lokomotorickou senzibilizaci a samoadministraci amfetaminu (Loweth a kol., 2010). CaMKIIa může ovlivnit chování odměňování prostřednictvím modulace podjednotek AMPA glutamátového receptoru (Pierce a kol., 1998), neboť aktivita CaMKIIa je již dlouho spojena s funkcí receptoru AMPA a synaptickým zaměřováním v několika formách neuroplasticity (Malinow a Malenka, 2002).

Tato literatura ukazuje několik paralel mezi ΔFosB a CaMKII: oba jsou potřebné a dostatečné pro více behaviorálních účinků zneužívání drog, oba upregulují dendritické trny v různých typech neuronálních buněk in vivo (Jourdain a kol., 2003; Maze a kol., 2010) a oba vykazují alespoň některé z jejich behaviorálních účinků modulací AMPA receptorů (Kelz a kol., 1999; Malinow a Malenka, 2002; Vialou a kol., 2010). Přes tyto paralely není známo žádné funkční spojení mezi ΔFosB a CaMKII. Zde vytváříme reciproční regulaci mezi ΔFosB a CaMKII a prokazujeme, že tyto dva proteiny tvoří slučovací kroužek pro specifické MSN specifické pro D1 v NAc shellu, který je indukován kokainem a reguluje rozsah kokainových odpovědí in vivo.

Přejít na:

Materiály a metody

Experiment 1: iTRAQ Proteomická analýza NAc Shell a jádra po léčbě kokainem (Obr. 1A)

U dospělých potkanů ​​dospělých (8 týdnů) bylo podáno 20 mg / kg kokainu nebo vehikula s obsahem fosfátu v séru jednou denně po dobu sedmi dnů. 24 hod. Po poslední injekci, byly NAc skořepina a jádro mikrodiskytovány (Obr. 1A) a zamrzl. iTRAQ analýzy byly prováděny tak, jak bylo popsáno výše (Ross et al., 2004; Davalos a kol., 2010).

Obrázek 1

Obrázek 1

Shell-specifická indukce CaMKII v NAc pomocí kokainu

Experiment 2: Kvantifikace změn bílkovin v potkaních NAc jádrech a Shell po léčbě kokainem (Obr. 1B-D)

U dospělých potkanů ​​dospělých (8 týdnů) bylo podáno 10 mg / kg kokainu nebo vehikula s obsahem fosfátů jednou denně po dobu sedmi dnů v pohybových záznamových komorách. Lokomotorické odpovědi na jednu injekci kokainu (5 mg / kg IP) byly zaznamenány u zvířat, které byly dříve léčeny kokainem (nazývané "chronické") a části těch, kteří byli léčeni fyziologickým roztokem (nazvaný "akutní"), a lokomotorické odpovědi na fyziologický roztok samotný byl zaznamenán u zbývajících chronických zvířat ošetřených solným roztokem (tzv. "fyziologický roztok"). Testy lokomotorické aktivity byly provedeny podle popisu (Hiroi a kol., 1997). Stručně, dospělé samčí potkany byly umístěny do 18 "X 24" PAS otevřených záznamových boxů (San Diego Instruments) pro 30 min, aby obývali, dostali jediný IP injekci fyziologického roztoku a sledovali další 30min a dostali jednorázová IP injekce 5 mg / kg kokainu a sledována pro 30 min.

24 hod. Po této poslední injekci byly krysy dekapitovány bez anestezie, aby se zabránilo účinkům anestetik na hladiny proteinů neuronů a fosfo-stavy. Mozky byly sériově krájeny v matrici 1.2 mm (Braintree Scientific) a cílová tkáň byla odstraněna ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím inhibitory proteázy (Roche) a fosfatázy (Sigma Aldrich) s použitím kalibru 14 pro jádro NAc a kalibru 12 zbývajícího tkáň pro NAc shell (viz Obr. 1A) a okamžitě zmrazené na suchém ledu. Vzorky byly homogenizovány lehkou sonikací v modifikovaném RIPA pufru: 10 mM Tris báze, 150 mM chlorid sodný, 1 mM EDTA, 0.1% dodecylsulfát sodný, 1% Triton X-100, 1% deoxycholát sodný, pH 7.4, inhibitory proteázy a fosfatázy jak je uvedeno výše. Po přidání Laemmliho pufru byly proteiny separovány na gradientech 4-15% polyakrylamaidových gradientech (Criterion System, BioRad) a Western blot byl prováděn za použití systému Odyssey (Li-Cor) podle výrobních protokolů.

Experiment 3: Kvantifikace změn bílkovin v potkaních jádrech NAc a Shell po stažení kokainu (Obr. 1E)

U dospělých potkanů ​​dospělých (8 týdnů) bylo podáno 10 mg / kg kokainu nebo vehikula s obsahem fosfátu v séru jednou denně po dobu sedmi dnů. 14 dnů po poslední injekci byly zvířatům ošetřeným fyziologickým roztokem podána další injekce fyziologického roztoku (nazývaná "fyziologický roztok) a zvířatům léčeným kokainem byla podána další injekce solného roztoku (nazývaná 14 denní léčba nebo" 14d WD ") nebo jedna injekce kokainu nazvaný "14d WD Chal" pro výzvu). Jedna hodina po poslední injekci byla zvířata dekapitována a Western blot proveden jako v experiment 2.

Experiment 4: Kvantifikace změn bílkovin v potkaních NAc jádrech a Shell po kokainové samosprávě (Obr. 2A-C)

Potkani byli trénováni k samostatnému podání 0.5 mg / kg / infuze kokainu v jednostupňových relacích v rozvrhu 1 s pevným poměrem po dobu devíti dnů. Po devíti základních schůzkách byly krysy rozděleny do dvou skupin vyvážených příjmem kokainu v posledních dvou zasedáních. Jedna skupina krys byla ponechána sama podat kokain (0.5 mg / kg / infuze) v jedné hodinové relaci (krátký přístup, ShA), zatímco druhá skupina krys sama podávala kokain v šestihodinových relacích (dlouhý přístup, LgA ) po dalších deset dní (eskalační sezení).

Sekce mozku byly zpracovány pro imunohistochemii, jak je popsáno (Perrotti a kol., 2004). Mozgy byly perfundovány 18-24 hr po poslední expozici léčivu, což vedlo k degradaci jakéhokoliv reziduálního FosB bílkoviny s plnou délkou, takže veškerá zbývající imunoreaktivita odráží ΔFosB. Tato degradace byla potvrzena Western blottingem, který neprokázal žádné významné barvení protilátkou namířenou proti C-konci FosB s plnou délkou, která nerozpoznává ΔFosB (údaje nejsou uvedeny). Po krájení do sekcí 35 μm byl počet imunopozitivních buněk ΔFosB kvantifikován zaslepeným pozorovatelem ve dvou sekcích přes NAc každého potkana a průměrné hodnoty na 40 × pole pak byly vypočteny podle oblasti pro každé zvíře. Každé zvíře bylo považováno za individuální pozorování pro statistickou analýzu. Regiony zájmu byly identifikovány pomocí Paxinos a Watson (Paxinos a Watson, 2007).

Kvantifikace imunoreaktivity CaMKIIa byla provedena za použití systému Licor, jak je popsáno (Covington a kol., 2009). Integrované intenzity CaMKII a GAPDH byly určeny pomocí softwaru Odyssey. Výsledky jsou uvedeny jako integrované hodnoty intenzity na mm2 a jsou prezentovány jako prostředky ± sem (n = 4-10 v každé skupině). Hodnoty pro GAPDH byly použity jako reference na normalizaci intenzity CaMKII pro tloušťku a podmínky řezu.

Obrázek 2

Obrázek 2

Indukce CaMKII v NAc skořápce samotných podaných krys a lidských závislých na kokainu

Experiment 5: Kvantifikace hladin bílkovin u osob závislých na kokainu (Obr. 2D)

Postup

Postmortem lidské mozkové tkáně byly získány z Quebec Suicide Brain Bank (Douglasův duševní zdravotní ústav, Montreal, Quebec, Kanada). Zachování tkáně probíhalo v podstatě tak, jak bylo popsáno (Quirion a kol., 1987). Krátce poté, co byl extrahován, je mozok umístěn na mokrý led v krabičce z polystyrenu a ponořil se do zařízení Quebec Suicide Brain Bank. Hemisphery jsou okamžitě odděleny sagitálním řezem uprostřed mozku, mozku a cerebellum. Krevní cévy, epifýza, choroidní plexus, poločas mozku a polovina mozkového kmene se obvykle oddělují z levé hemisféry, která se před zmrznutím koronálně rozřezá na plátky o tloušťce 1 cm. Druhý poločas mozku je před zmrznutím řezán sagittálně na plátky o tloušťce 1cm. Tkáně se mrazí v 2-methylbutanu při -40 ° C po dobu ~ 60 sec. Všechny zmrazené tkáně se uchovávají odděleně v plastových sáčcích při teplotě -80 ° C pro dlouhodobé skladování. Specifické oblasti mozku jsou odříznuty od mražených koronálních řezů na desce z nerezové oceli se slaným ledem všude kolem pro kontrolu teploty prostředí. Western blot byl prováděn tak, jak je popsáno v experiment 2.

Kohorta

Kohorta byla složena z mužů 37 a 3, ve věku mezi roky 15-66. Všechny subjekty náhle zemřely bez prodlouženého agonálního stavu nebo s prodlouženým onemocněním. V každém případě byla příčinou úmrtí zjištěna správní kanceláří v Quebeku a byla provedena toxikologická prohlídka s tkáňovými vzorky pro získání informací o lécích a užívání nelegálních látek v době smrti. Skupina subjektů se skládala z osob s 20, kteří splňovali kritéria SCID-I pro závislost na kokainu. Kontrolní skupina byla tvořena subjekty 20 bez anamnézy závislostí na kokainu a bez významných psychiatrických diagnóz. Všechny subjekty náhle zemřely z příčin, které neměly přímý vliv na mozkovou tkáň. Skupiny byly shodné pro průměrný věk pacienta, zpoždění chlazení a pH. Pro všechny subjekty byly psychologické pitvy prováděny tak, jak bylo popsáno výše (Dumais a kol., 2005), což nám umožňuje přístup k podrobným informacím o případu z psychiatrické a anamnézy, stejně jako další relevantní klinické a sociodemografické údaje. Stručně řečeno, vedl zkušený tazatel Strukturovaný klinický rozhovor pro DSM-IV Psychiatrické poruchy (SCID-I) s jedním nebo více informátory zesnulého. Skupina lékařů posuzovala hodnocení SCID-I, případové zprávy, koronární poznámky a lékařské záznamy, aby získaly konsenzuální psychiatrické diagnózy.

Experiment 6: Chromatinová imunoprecipitace pro krysí NAc (Obr. 3A-C)

U dospělých potkanů ​​dospělých (8 týdnů) bylo podáno 10 mg / kg kokainu nebo vehikula s obsahem fosfátu v séru jednou denně po dobu sedmi dnů. 24 hod. Po poslední injekci, byla NAc skořápka a jádro mikrodiskurována. Chromatinová imunoprecipitace (ChIP) byla provedena sdružováním dvoustranných NAc děr skořepiny nebo jádra ze sedmi potkanů ​​na skupinu v celkových skupinách 14 (celkem 98 zvířata, bazény 7 kokainu, bazény fyziologického roztoku 7). Tkáně byly zesíťovány, promyty a uchovávány při -80 ° C, dokud se chromatinové štěpení pomocí sonikace. Nakrájený chromatin byl inkubován přes noc s protilátkami dříve vázanými na magnetické kuličky (Dynabeads M-280, Invitrogen). Neimunní IgG byl použit jako kontrola. Po reverzním zesítění a purifikaci DNA byla qPCR použita k měření hladin promotorové DNA CaMKIIa. Primery byly navrženy tak, aby amplifikovaly oblast obsahující shodnou sekvenci AP-1 umístěnou ~ 450 bp před začátkem transkripce (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Obrázek 3

Obrázek 3

Buněčná indukce CaMKIIa specifická pro buněčné typy a oblasti ΔFosB in vivo

Experiment 7: Měření transkriptu CaMKII a exprese proteinu s nadměrnou expresí ΔFosB specifickou pro buňku (Obr. 3D)

Mužské bitransgenní myši pocházející z NSE-tTA (řádek A) × TetOp-ΔfosB (řádek 11) a NSE-tTA (řádek B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (řada 11) myší (Chen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999; Werme a kol., 2002; Zachariou a kol., 2006) byly koncipovány a zvýšeny na 100 μg / ml doxycyklin, aby potlačily expresi ΔFosB během vývoje. Podvádění bylo rozděleno při odstavu: polovina zůstala na doxycyklině a polovina byla převedena na vodu a zvířata byla použita 8 až 11 týdny později, když byly transkripční účinky ΔFosB maximální (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003). Pro transkripční analýzy byly myši rychle decapitovány a mozky byly odstraněny a umístěny na led. Disekce NAc byly odebrány pomocí jehlicového děrovače 14 a rychle zmrazeny na suchém ledu, dokud nebyla extrahována RNA. Izolace RNA, qPCR a analýza dat byly provedeny jak bylo popsáno výše (LaPlant a kol., 2009). Stručně řečeno, RNA byla izolována s TriZolovým činidlem (Invitrogen), dále purifikována mikrořadivem RNAeasy od firmy Qiagen a zkontrolována na kvalitu s Bio-analyzátorem Agilent. Reverzní transkripce byla provedena pomocí iScript (BioRad). qPCR se provádí systémem Applied Biosystems 7900HT RT PCR s následujícími parametry cyklu: 10 min při 95 ° C; 40 cykly 95 ° C pro 1 min, 60 ° C pro 30 sec, 72 ° C pro 30 sec; tříděného zahřívání na teplotu 95 ° C za účelem vytvoření disociačních křivek pro potvrzení jednotlivých produktů PCR. Imunohistochemické analýzy exprese proteinu ΔFosB a CaMKIIa byly prováděny tak, jak je popsáno v experiment 4.

Experiment 8: Účinky intra-NAc D1 a D2 antagonistů receptoru dopaminu na změny proteinu zprostředkované kokainem (Obr. 3H)

U dospělých potkanů ​​dospělých (8 týdnů) bylo podáno 10 mg / kg kokainu nebo vehikulum (skupina "vehikulum") IP jednou denně po dobu sedmi dnů. 30 min před každým podáním kokainu byly potkanům podáván buď antagonista receptoru D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, skupina "D1 Ant") nebo antagonista D2 receptoru etikloprid (0.5 mg / kg, skupina "D2 Ant" , nebo injekční kontrola fyziologického roztoku ("kokain"). 24 hod. Po poslední injekci byly zvířata dekapitována a bílkoviny byly kvantifikovány Western blotováním experiment 2.

Experiment 9: Účinky nadměrné exprese ΔFosB mediované AAV na expresi proteinu (Obr. 4 A-C)

Stereotaxická chirurgie byla provedena na dospělých samcích potkanů ​​(týdny 8) k injekci AAV-GFP (zelený fluorescenční protein) nebo AAV-GFP-ΔFosB (Maze a kol., 2010). Na všechny operace byly použity jehly měřidla 33 (Hamilton), během kterých bylo 0.5 μl vyčištěného vírusu s vysokým titrem oboustranně infundováno po dobu minuty 5 a následovalo další období 5 min po infuzi. Všechny vzdálenosti jsou měřeny ve vztahu k Bregma: 10 ° úhel, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. Po 14 dnech po chirurgickém zákroku byla zvířatům podána jednorázová IP injekce 10 mg / kg kokainu v lokomotivních monitorovacích komorách za účelem posouzení behaviorálních účinků nadměrné exprese ΔFosB. 24 hod. Po této poslední injekci byly krysy dekapitovány v procentech experiment 2a tkáňová mikrodisce byla provedena pod fluorescenčním mikroskopickým naváděním pro získání GFP-pozitivního NAc tkáně. Western blot byl potom proveden podle Experiment 2.

Obrázek 4

Obrázek 4

ΔFosB je nezbytný a dostatečný pro indukci CaMKIIa závislou na receptoru D1 zprostředkovanou kokainem v NAc shellu

Experiment 10: Účinky nadměrné exprese DJunD zprostředkované AAV na expresi proteinu závislého na kokainu (Obr. 4 D-F)

Stereotaktická injekce AAV-GFP nebo AAV-GFP-ΔJunD byla provedena jako Experiment 8. Po 14 dnech po operaci byla zvířatům podávána 10 mg / kg IP kokainu nebo slaného vehikula jednou denně po dobu sedmi dnů v lokomotorických záznamových komorách. Byly zaznamenány lokomotorické reakce na jednu injekci kokainu (5 mg / kg IP) nebo fyziologický roztok. 24 hod. Po této poslední injekci byly krysy dekapitovány, odebrány tkáně a prováděny Western bloty jako v Experiment 9.

Experiment 11: In vitro Testy protein kinázy (Obr. 5A-D)

Rekombinantní CaMKIIa a ΔFosB byly purifikovány z buněk hmyzu (Brickey a kol., 1990; Jorissen a kol., 2007) a testy protein kinázy byly provedeny (Colbran, 1993), jak bylo popsáno výše. Stručně, CaMKII byl předem inkubován na ledu s 2.5 μM (nebo indikovanou koncentrací) ΔFosB, 1 mM Ca2+, 40 mM Mg2+, 15 μM kalmodulinu a 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforylace byla zahájena přidáním 200 uM ATP s nebo bez [y-32P] ATP a nechá se pokračovat 10 min při pokojové teplotě (Obr. 5A a B.) nebo 2 min na ledu (Obr. 5C a D). Produkty byly rozštěpeny pomocí Western blottingu (Obr. 5A a B.) nebo autoradiogramem a scintilačním počítáním (obr. B-D).

Obrázek 5

Obrázek 5

ΔFosB je silný substrát pro CaMKIIα

Experiment 12: identifikace fosforylace SerFNUMX ΔFosB (Obr. 5E)

In vitro kinázové testy byly provedeny podle experiment 11, proteiny byly separovány pomocí SDS-PAGE a pásy odpovídající DFosB byly vyříznuty a podrobeny tandemové hmotnostní spektrometrii. Přiřazení m / z odpovídajících iontových fragmentů ve všech panelech je označeno na vrcholu iontových píků. Ne všechny fragmenty iontů jsou označeny kvůli omezeným prostorům. Obecně platí, že text pro fragmenty iontových značek je barevně černý, s výjimkou případů, kdy přímo potvrzují nebo přidávají důkazy o přítomnosti fosforylačních míst, které jsou předmětem zájmu, v takovém případě jsou označeny červeně. Důkazy pro produkty fragmentace páteře jsou uvedeny v sekvenčním zobrazení fosfopeptidu s detekovaným místem fosforylačního zbytku označeným červeně označením písmen jedné aminokyseliny. Číselný popis pozorovaných fragmentových iontů je také označen na peptidové sekvenci jako ionty b a y. Faktory zvětšení pro části osy m / z, které ukazují ionty s nižší intenzitou fragmentu, jsou vyznačeny na vrcholu hmotnostních spekterů každého fragmentu. Fragmenty iontů ukázané v panelu H potvrzují přítomnost fosforylované izoformy Ser27, nicméně ve směsi jiných fosforylovaných izomerů v místech Ser28, Ser31, Ser34 a Thr37. Přítomnost iontů pa5, pa5-P, pb5 a pb5-P jednoznačně potvrzuje fosforylaci zbytku Ser27.

Experiment 13: Kvantifikace fosforylace Ser27 (Obr. 5F)

Standardní peptidy byly navrženy tak, aby napodobovaly fosfo a non-fosfo formy Ser27 ΔFosB. Po syntéze a čištění byl každý "těžký" idiotypický peptid rozpuštěn v pufru acetonitrilu / vody 50 / 50 a poslán na analýzu aminokyselin pro stanovení absolutní koncentrace v zásobním roztoku syntetických peptidů. Každý "těžký" peptid byl potom přímo infundován do hmotnostního spektrometru 4000 QTRAP (MS), aby se určila nejlepší kolizní energie pro fragmentaci MS / MS a dva až čtyři přechody MRM. Dále, čisté "těžké" peptidy byly podrobeny LCMS na 4000 QTRAP, aby se zajistilo oddělení peptidů. Přístroj byl spuštěn v trojitém kvadrupolovém módu, Q1 nastaven na konkrétní hodnotu prekursoru m / z (Q1 není skenování) a Q3 nastaven na specifickou hodnotu m / z odpovídající určitému fragmentu tohoto peptidu. V režimu MRM byla postupně měřena řada jednotlivých reakcí (přechody iontů prekurzorů / fragmentů iontů, při kterých byla účinnost kolize vyladěna tak, aby optimalizovala intenzitu fragmentů požadovaných iontů) a cyklus (typicky 1-2 sec) byl smyčkový po celou dobu separace HPLC. MRM přechody byly stanoveny z MS / MS spektra stávajících peptidů. Byly pak vybrány dva přechody na peptid odpovídající iontům fragmentů s vysokou intenzitou a optimalizovaná kolizní energie pro maximalizaci síly signálu přechodů MRM pomocí automatizačního softwaru. Píky získané ze standardních peptidů a vzorků ΔFosB vystavených působení CaMKII nebo kontrolního vzorku byly potom porovnány, aby se stanovila absolutní abundance každé peptidové formy v reakci. Analýza údajů o datách LC-MRM se provádí pomocí softwaru AB Multiquant 1.1.

Experiment 14: Indukce ΔFosB u myší s nadměrnou expresí CaMKII (Obr. 5G & H)

Transgenní myši s nadměrnou expresí T286D CaMKII (Mayford a kol., 1996; Kourrich a kol., 2012) a divoký typ vrstevnic se zvýšil v nepřítomnosti doxycykinu, aby umožnil expresi transgenu. U dospělých myší bylo podáno 20 mg / kg kokainu nebo fyziologického roztoku jednou denně v den 14. 24 hod. Po poslední injekci byly zvířata dekapitována a byla provedena imunohistochemie a kvantifikace exprese ΔFosB jako v experiment 4.

Experiment 15: Účinky HSV-mediované nadměrné exprese ΔFosB a inhibice CaMKII na dendritické trny NAc (Obr. 6A-E)

Dospělé samce myší (8 týdny) byly stereotaxicky injikovány do NAc pomocí HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson a kol., 2006), HSV-GFPAC3I nebo HSV-GFPAC3I-ΔFosB. V těchto konstruktech je AC3I, inhibitor aktivity CaMKII na bázi peptidu, fúzován s C-koncem GFP. GFPAC3I byl klonován pomocí PCR za použití pMM400-vektoru obsahujícího GFPAC3I jako templátu s následujícími primery: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT3' (clampBspEIstop). Výsledný PCR produkt byl vložen do vektorů p1005 + a p1005 + -Δ FosB za použití Nhel a BspEI míst. Konstrukt byl potvrzen sekvencováním. Stereotaxické souřadnice byly: 10 ° úhel, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfuze a dělení mozku byly provedeny podle experiment 4.

Analýza páteře byla provedena podle popisu (Christoffel a kol., 2011). Stručně, dendritické segmenty 50-150 pm od soma byly náhodně vybrány z buněk infikovaných HSV, které exprimují GFP. Obrázky byly získány na confocal LSM 710 (Carl Zeiss) pro morfologickou analýzu pomocí NeuronStudio s algoritmem rayburst. NeuronStudio klasifikuje trny jako tenké, houbovité nebo stonkové na základě následujících hodnot: poměr stran (1), poměr hlavy k krku (2) a průměr hlavy hlavy (3). Trhliny s krkem mohou být klasifikovány jako tenké nebo houby, a ty bez výrazného krku jsou klasifikovány jako trnité. Trápky s krkem jsou označeny jako tenké nebo houby založené na průměru hlavy.

Obrázek 6

Obrázek 6

Blokace aktivity CaMKII zabraňuje morfologickým a behaviorálním účinkům ΔFosB v NAc

Experiment 16: Účinky nadměrné exprese ΔFosB zprostředkované HSV a inhibice CaMKII na odpovědi na kokain (Obr. 6F)

Dospělí samci myši byli injikováni viry podle experiment 15, a lokomotorická odezva na jednu 5 mg / kg injekci kokainu byla měřena v procentech Experiment 9. Lokomotorická data jsou vyjádřena jako celková přerušení svazku po 30 min po injekci kokainu.

dodatečné informace

Bydlení zvířat

Samci potkanů ​​Sprague Dawley (250-275 g, Charles River Laboratories) byli umístěni ve dvojicích. Osmi týdnů staré myši C57BL / 6J (laboratoř společnosti Jackson) byly seskupeny s maximálně pěti zvířaty na klec. Všechna zvířata byla před pokusem manipulována s živočichovým zařízením v týdnu ≥ 1 a umístěna v místnostech s kontrolou klimatu (23-25 ° C) v cyklu 12 hr světlo / tma (světla zapnuta na 7: 00 AM) s přístupem k jídlu a vody podle libosti. Pokusy byly prováděny v souladu s pokyny Společnosti pro neurovědy a institucionální výbor pro péči o zvířata a použití (IACUC) na hoře Sinaj.

Drogy

Léčiva byla podávána IP a rozpuštěna v sterilním solném roztoku, včetně kokainu (5-20 mg / kg na 10 μl u myší, 1 ml u potkanů, NIDA) a SCH 23390 nebo hydrochlorid etiklopidu (0.5 mg / kg na 1 ml, Tocris) . Při stereotaktické operaci byly myši anestetizovány "koktejlem" ketaminu (100 mg / kg) a xylazinu (10 mg / kg) (Henry Schein) v sterilním fyziologickém roztoku.

Protilátky

CaMKIIα (celkem): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (celkem): Buněčné signalizace 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: fosfosoluční roztoky, 1: 500

GluA1 (celkem): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemikon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistické analýzy

Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru Prism 6 (GraphPad). Studentské t-testy byly použity pro všechny dvojice srovnávání (uvedené ve výsledcích, kde je hodnota t udávána) a jednosměrné ANOVA byly použity pro všechna vícenásobná srovnání (uvedené ve výsledkové sekci, kde je hodnota F udána).

Přejít na:

výsledky

Chronický kokain indukuje CaMKII v NAc Shell

Mnoho studií ukázalo, že MSN v shellu a jádře NAc mají různé biochemické a fyziologické reakce na chronickou expozici zneužívání drog (Kourrich a Thomas, 2009; Loweth a kol., 2010) a že obě subregiony diferencovaně regulují chování při hledání drog (Ito a kol., 2004). Pro stanovení diferenciálních účinků kokainu na bílkovinné složky NAc shellu vs jádro, používáme multiplexní izobarické značení (iTRAQ) a tandemovou hmotnostní spektroskopii (MS / MS). Dospělí samci potkanů ​​byli injekčně aplikováni kokain (20 mg / kg) nebo fyziologický roztok denně pro 7 dny; 24 hod. Po poslední injekci, byly NAc skořepina a jádro mikrodiskytovány (Obr. 1A) a zamrzl. Proteiny v těchto vzorcích byly pak kvantifikovány za použití iTRAQ. Všechny čtyři izoformy CaMKII vykazovaly velké zvýšení exprese po léčbě kokainem, které byly specifické pro NAc shell ve srovnání s jádrem. Několik proteinových fosfatáz, včetně katalytických a regulačních podjednotek PP1 a PP2A, které byly dříve spojeny s různými CaMKII substráty v jiných systémechColbran, 2004), následoval podobný vzorec. Tyto nálezy poskytly nové, nezkreslené důkazy, že CaMKII signalizační dráha je prominentně regulována kokainem v NAc ve skořepinovém způsobu.

Pro potvrzení tohoto nálezu více kvantitativně jsme ošetřili krysy jako výše s kokainem (v různých dávkách) nebo fyziologickým roztokem a měřili lokomotorickou odezvu na dávku kokainu (5 mg / kg) nebo výplach ve fyziologickém roztoku. Opakovaná expozice přípravku 10 mg / kg kokainu vedla k typickému modelu lokomotorické senzitizace (Obr. 1B). Další studie s tímto dávkovacím režimem odhalily pomocí Western blotu, že opakovaný kokain indukuje selektivně CaMKIIa v NAc skořápce 24 hr po poslední injekci kokainu (Obr. 1C a D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Navíc fosforylace kanonického CaMKII substrátu Ser831 podjednotky GluA1 receptoru AMPA byla signifikantně zvýšena v NAc skořápce a nikoli v jádru (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), zatímco autofosforylace CaMKIIa Thr286 měla silnou, ale ne významný trend k indukci pouze ve skořápce (Obr. 1D). Několik dalších glutamátových receptorů nebylo ovlivněno. Na rozdíl od těchto měření CaMKII, stejné vzorky tkáně vykazovaly indukci ΔFosB v obou skořápkách (p = 0.0260, F = 4.189; df = 29) a jádra (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) (Obr. 1C a D), v souladu s předchozími zjištěními (Perrotti a kol., 2008).

Protože několik předcházejících studií o regulaci kokainu u AMPA receptorů analyzovalo po 14 dnech odchodu z chronického kokainu (viz Diskuse) tyto biochemické analýzy v tomto časovém bodě. Zjistili jsme, že po 14 dnech po poslední injekci kokainu zůstává ΔFosB zvýšená v NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), zatímco CaMKII ani fosforylace GluA1 Ser831 zůstávají zvýšenéObr. 1E). Avšak 1 hr po jednorázové dávce kokainu 10 mg / kg kokainu, hladiny celkového CaMKII (p = 0.0330, F = 3.947; df = 26) a GluA1 Ser831 (p = 0.0213, F = 4.509; fosforylace jsou zvýšeny na stupeň podobný tomu, který byl nalezen po počáteční expozici chronického kokainu (Obr. 1E). Tato data naznačují, že NAc skořápkové neurony jsou primární pro indukci CaMKII během prodloužených období abstinence, možná přímým primingm promotoru genu CaMKII (viz diskuse). Kromě toho skutečnost, že indukce ΔFosB je perzistentnější než indukce CaMKII, naznačuje existenci dalších mechanismů, ať už na bázi chromatinu nebo jiných, které působí jako "brzda" na regulaci CaMKII, jak je uvedeno v diskusi.

Pro další posílení těchto zjištění jsme zkoumali modely samo-administrace kokainu, které zahrnují volitivní užívání drog. Dospělí samci potkanů ​​dostali krátký nebo dlouhý přístup k kokainu; podle očekávání (Ahmed a Koob, 1998), pouze dlouhé podmínky přístupu vedly k eskalaci samo-podávání léku (Obr. 2A). ΔFosB byl indukován ve větší míře dlouhou dobu vs krátký přístup ke kokainu v obalech NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) a jádro (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Naproti tomu CaMKIIα byl indukován v NAc shellu pouze dlouhým přístupem ke kokainu (Obr. 2B a C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Je zajímavé porovnat průměrný denní příjem kokainu u zvířat s krátkým přístupem (~ 12 mg / kg IV), zvířat s dlouhodobým přístupem (~ 70 mg / kg IV) a zvířatům podávaným v experimentu (10 mg / kg) zeptat se, proč tento způsob vyvolá silnou indukci ΔFosB a CaMKII, zatímco krátký přístup ne. Tato odchylka je pravděpodobně způsobena rozdíly v maximálních hladinách kokainu (kokain podávaný jako experimentátor je podáván jako jednorázová bolusová IP, zatímco samotný podávaný kokain je podáván opakovanými dávkami IV) nebo rozdíly v délce expozice léku (7 dny pro experimentátora podávání, 19 dny pro vlastní podání).

Navzdory rozsáhlé literatuře o účincích kokainu na přípravcích ΔFosB a CaMKII neexistují studie o těchto bílkovinách u uživatelů humánního kokainu. Zde uvádíme první důkaz, že v NAc lidí závislém na kokainu jsou zvýšeny hladiny jak ΔFosB (p = 0.0316, t = 1.921, df = 34), tak CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32)Obr. 2D, Tabulka 1). Tyto údaje naznačují, že naše vyšetření indukce DFosB a CaMKII kokainem v NAc hlodavců je klinicky relevantní pro lidskou závislosti na kokainu.

Tabulka 1

Tabulka 1

Charakterizace vzorků lidských závislých na kokainu a odpovídající kontrolní skupina

ΔFosB reguluje selekci CaMKII selektivně v MSN typu D1 NAc Shell

Zjištění, že jak CaMKII tak ΔFosB jsou regulovány kokainem v hlodavce NAc, nás vedlo k určení, zda ΔFosB může regulovat transkripci genu CaMKII. Předtím jsme zaznamenali CaMKIIα jako možný cíl pro ΔFosB v nezaujaté mikroskopické analýze NAc (McClung a Nestler, 2003), ale toto zjištění nebylo v této studii dále potvrzeno. Nejprve jsme použili kvantitativní ChIP (qChIP-ChIP s následnou kvantitativní PCR), abychom zjistili, zda se ΔFosB váže na promotor genu CaMKIIa v NAc dospělých samců potkanů, a zjistil, že tato vazba je významně zvýšena chronickým podáním kokainu v skořápce ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), ale ne jádro, subregion (Obr. 3A). Pro další porozumění mechanismům souvisejícím s tímto subregionem specifickým rozdílem v vazbě ΔFosB na promotor CaMKIIa jsme použili qChIP k charakterizaci stavu histonových modifikací v této genomové oblasti. Předchozí studie prokázaly indukci kokainu acetylace H3 na promotoru CaMKIIa v celkovém myším NAc (Wang a kol., 2010). Naopak jsme zjistili, že kokain snižuje acetylaci H3 na promotoru CaMKIIa selektivně v jádře NAc (Obr. 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), bez zjevných změn ve skořápce, v souladu se změnami chromatinu specifických pro subregiony nad vazbou ΔFosB. qChIP pro represivní značku, dimetylovaný H3 lysin 9 (H3K9me2), odhalil trendy ke snížení jak v oblasti skořápky, tak ve jádrech (Obr. 3C).

Určit, zda ΔFosB reguluje transkripci CaMKIIα in vivo, jsme použili dvě bitransgenní myší linie, které indukovatelně nadměrně exprimovaly ΔFosB specificky v D1 vs MSN typu D2 způsobem řízeným podáním doxycyklinu v pitné vodě (Chen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999; Werme a kol., 2002). Dospělé samce myší nadměrně exprimující ΔFosB výhradně v MSNs typu D1 měly významně zvýšené hladiny CaMKIIa mRNA v NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), což není účinek pozorovaný u myší nadměrně exprimujících ΔFosB převážně v MSNs typu D2Obr. 3D). Zvýšení CaMKIIa mRNA indukované expresí ΔFosB v MSNs typu D1 bylo doprovázeno souběžným zvýšením CaMKIIa proteinu v oba NAc skořápce (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) a jádrem (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Obr. 3E a F). Tato data ukazují, že ΔFosB je schopen řídit expresi genu CaMKIIa v MSN typu D1 v obou podoblastech, ačkoli Obrázek 3B naznačuje, že kokain-zprostředkovaný chromatin se mění na CaMKIIa promotoru (např. redukovaná acetylace) brání tomu, aby ΔFosB z upřednostňování CaMKII v jádrovém subregionu po kokainu.

Protože naše údaje o transgenních myších naznačovaly, že indukce ΔFosB exprese genu CaMKII je specifická pro MSN typu D1 v NAc, snažili jsme se dále zjistit, zda upregulace CaMKII závislá na kokainu vyžaduje aktivaci dopaminového receptoru D1. Dospělým krysím samcům byl podáván chronický kokain nebo solný roztok jako dříve, ale 30 minut před každou injekcí byla krysám ve skupině s kokainem podána IP injekce solného roztoku, antagonista D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg) nebo antagonista receptoru D2 etikloprid (0.5 mg / kg). Zvířata byla analyzována 24 hodin po poslední injekci kokainu. Western blot ukázal, že antagonista D1, ale nikoli D2, zcela blokoval kokainem zprostředkované zvýšení ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), jak bylo dříve uvedeno (Nye a kol., 1995), stejně jako v CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Obr. 3G a H). Tato data podporují hypotézu, že kokain se angažuje s růstem exprese genu CaMKII zprostředkovaným ΔFosB specificky v MSNs typu NX z Nc shell D1. V budoucích studiích by bylo důležité prokázat přímo tento specifický účinek kokainu na expresi CaMKII uvnitř této oblasti mozku.

ΔFosB je nezbytný a dostatečný pro indukci kokainu CaMKII v NAc Shell

K doplnění použití bitransgenních myší jsme dále studovali úlohu ΔFosB při zprostředkování indukce kokainu CaMKIIα pomocí virového zprostředkovaného přenosu genů u potkanů. Dvojstranně injikované adeno-asociované virové částice (AAV) do skořápky NAc dospělých samců krys (kde může být selektivně cílená skořepina) nadměrně exprimovat ΔFosB plus GFP nebo samotný GFP. Zvířatům byla podána jediná IP injekce 10 mg / kg kokainu. Zvířata s nadměrnou expresí ΔFosB / GFP vykazovaly zvýšenou lokomotorickou odpověď ve srovnání se zvířaty, které nadměrně exprimují samotný GFP (Obr. 4A). 24 hod. Po injekci jednoho kokainu byla GFP-pozitivní NAc tkáň vyříznuta z těchto zvířat disekcí pod fluorescenčním světelným zdrojem. Western blotting této tkáně (Obr. 4B a C) odhalila silnou nadměrnou expresi ΔFosB stejně jako signifikantní zvýšení celkového CaMKIIa proteinu ve srovnání s GFP zvířaty (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), podobně jako indukce pozorovaná u chronického podávání kokainu. Kromě toho CaMKIIa autofosforylace na Thr286 (indikující enzymatickou aktivaci) byla zvýšena nadměrnou expresí ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), stejně jako fosforylace substrátu CaMKII, Ser831 GluA1 (p = 0.0540; df = 2.012), opět napodobující účinky chronického kokainu (Obr. 1C a D). Tspolečně tyto údaje poskytují další důkaz, že exprese ΔFosB v NAc skořápce je dostatečná pro lokomotorickou senzibilizaci kokainu a pro indukci a aktivaci CaMKII v této podoblasti.

Použili jsme podobný přístup k určení, zda je ΔFosB také nezbytný pro indukci kokainu zprostředkovanou CaMKIIα v shellu NAc. AAV byla použita k nadměrnému expresi zkráceného JunD proteinu, nazvaného ΔJunD, který je negativním regulátorem aktivace transkripce pomocí DFosB (Winstanley a kol., 2007) plus GFP nebo GFP samostatně. O dva týdny později, kdy byla exprese transgenu maximální, byla zvířatům podávána kokain (10 mg / kg) nebo fyziologický roztok denně pro 7 dny a testována na lokomotorické odpovědi na výskyt kokainu (5 mg / kg) 24 hr po poslední chronické injekciObr. 4D). Nadměrná exprese ΔJunD zabránila lokomotorické senzibilizaci kokainu a také zabránila indukci a aktivaci CaMKIIa v shellu NAc (Obr. 4E a F; p = 0.0437; F = 2.997; celkem df = 38), což naznačuje, že transkripční aktivita ΔFosB je nezbytná pro indukci kokainu zprostředkovanou CaMKIIα v této podoblasti. Je zajímavé, že ΔJunD snížil hladiny ΔFosB v podmínkách léčených fyziologickým roztokem a kokainem (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), čímž vznikla nová možnost, že ΔFosB závisí na aktivitě AP-1 pro vlastní hladiny exprese.

CaMKII fosforyluje ΔFosB v Ser27

Použití in vitro protein kinázových testů jsme stanovili, že purifikovaný ΔFosB je robustní substrát pro CaMKIIa. Inkubace jeho6-ΔFosB s CaMKIIα a ATP způsobily posun směrem vzhůru elektroforetickou pohyblivostí ΔFosB (Obr. 5A); několik výsledných pásem naznačilo několik fosforylačních míst. Podobný in vitro kinázových testů za použití [y-32P] ATP ukázala začlenění radioaktivně značeného fosfátu do posunutých pásem ΔFosB (Obr. 5B), což demonstruje přímou fosforylaci proteinu. Vygenerovali jsme fosfo-specifickou protilátku k dříve charakterizovanému Ser27 z ΔFosB (Ulery a kol., 2006). Zatímco tato protilátka nevytváří signál proti extraktům mozku, které obsahují Ser27-fosforylovaný ΔFosB (údaje nejsou uvedeny), jsme schopni detekovat fosforylaci Ser27 v in vitro kinázového testu s použitím CaMKII (Obr. 5B). Kinetické analýzy CaMKII fosforylace ΔFosB naznačují, že je silným substrátem kinázy (Obr. 5C), se zřejmým KM 5.7 ± 2.0μM a KKOČKA 2.3 ± 0.3min-1. Tyto výsledky jsou srovnatelné s mnoha dobře charakterizovanými in vivo substrátů CaMKII (Colbran a Brown, 2004). Dále jsme zjistili, že CaMKII fosforyluje ΔFosB se stechiometrií 2.27 ± 0.07 mol / mol (Obr. 5D), což naznačuje, že existují alespoň tři místa fosforylování CaMKII v His6-ΔFosB protein, ve shodě s Obr. 5A.

Pro zkoumání jednotlivých míst fosforylace jsme použili MS analýzu vzorků z našeho in vitro kinázových testů. Obr. 5E demonstruje fosforylaci ΔFosB u dříve charakterizovaného Ser27 a na několika dalších místech (údaje nejsou uvedeny). Vzhledem k předchozí funkční charakterizaci Ser27 jsme se zaměřili na toto místo generováním značených syntetických peptidů napodobujících fosfo- a non-fosfo-stavy Ser27 a poté použili známé množství těchto peptidů jako standardy MRM analýz ΔFosB před a po in vitro fosforylace CaMKII. Následné kvantifikace (Obr. 5F) potvrzuje, že Ser27 je silným substrátem pro CaMKII. Tyto výsledky naznačují, že mezi více fosforylovanými zbytky v rámci ΔFosB je Ser27 zvláště účinným substrátem pro CaMKII.

CaMKII zprostředkovává kokain akumulování ΔFosB v NAc Shell

Protože CaMKII může fosforylovat ΔFosB in vitro na místě, které dramaticky zvyšuje jeho stabilitu in vitro a in vivo (Ulery a kol., 2006; Ulery-Reynolds a kol., 2009) jsme stanovili, zda aktivita CaMKII kontroluje hladiny ΔFosB v NAc in vivo. Abychom řešili tuto otázku, nejprve jsme použili myší řadu, která nadměrně exprimuje mutant CaMKIIa (T286D) nezávislý na vápníku v různých oblastech mozku, včetně NAc (Mayford a kol., 1996; Kourrich a kol., 2012). Do 20 dnů jsme injekčně podali dospělé mužské mutanty a divoké kočky s dávkou 14 mg / kg kokainu nebo fyziologického roztoku jednou denně, poté jsme analyzovali zvířata jeden den po poslední injekci. Zjistili jsme, že bazální hladiny ΔFosB byly zvýšeny u mutantních zvířat v shellu NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), ale nikoliv jádroObr. 5G a H). Bylo překvapivé, že indukce DFosB závislá na kokainu byla blokována u mutantních zvířat jak v skořápce, tak v jádru, což naznačuje, že i když CaMKII může přímo regulovat stabilitu ΔFosB v skořápce NAc, může také ležet proti směru proudění proti ΔFosB v kokainem aktivovaných cestách v obou subregionech NAc .

CaMKII aktivita je vyžadována pro ΔFosB-zprostředkovanou strukturální a behaviorální plasticitu

Kokainová indukce dendritických trnů na NAc MSNs je jednou z nejlépe zavedených léků indukovaných adaptací v této oblasti mozku a taková indukce páteře byla korelována se senzitizovanými behaviorálními odezvami na léčivo (Robinson a Kolb, 2004; Russo a kol., 2010) a bylo hlášeno, že jsou selektivní pro MSN typu D1 (Lee et al., 2006). Nedávno jsme prokázali, že kokainová indukce dendritických trnů v NAc závisí na ΔFosB a jeho následném transkripčním programu (Maze a kol., 2010). Ačkoli existuje rozsáhlá literatura týkající se zapojení CaMKII do morfologie dendritické páteře a indukce v jiných oblastech mozku a experimentálních systémech (Jourdain a kol., 2003; Penzes a kol., 2008; Okamoto a kol., 2009), její úloha při tvorbě páteře NAc MSN nebyla studována. Bylo proto stanoveno, zda je pro indukci MSF dendritických páteří vyžadována aktivita CaMKII, a to za použití nadměrné exprese inhibitoru CaMKII peptidu AC3I fúzovaného s GFP, což je předtím ukázaný konstrukt, který inhibuje aktivitu CaMKII in vivo (Zhang a kol., 2005; Klug a kol., 2012). Virová nadměrná exprese ΔFosB v NAc plášti dospělých myší vyvolala významné zvýšení hustoty dendritické páteře MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Obr. 6A a B), jak bylo dříve uvedeno (Maze a kol., 2010) a tento nárůst byl způsoben především tenkými páteřími (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59; F = 0.0378; df = 2.988;Obr. 6C-E). Žádný efekt nebyl pozorován na vyspělých hřibech ve tvaru hub. Nicméně, když byl GFP-AC3I koexprimován, byla indukce ΔFosB trnů zcela zrušena (Obr. 6A-E), což naznačuje, že CaMKII aktivita je zapotřebí pro indukci dFriB dendritických hřbetů v shellu NAc.

Dále jsme použili stejné virové nástroje k určení, zda je pro účinky ΔFosB na citlivost na chování kokainu požadována aktivita CaMKII. 72 hod po injekci viru do pláště NAc byly zvířatům podávána jedna injekce 5 mg / kg kokainu a zaznamenávána jejich lokomotorická aktivita. Jak již bylo uvedeno, při prodloužené AAV nadměrné expresi ΔFosB (Obr. 4A), HSV-zprostředkovaná nadměrná exprese ΔFosB zvýšila lokomotorickou citlivost na kokain (p = 0.0002, F = 8.823, df = 37; Obr. 6F). Stejně jako při indukci dendritických trnů inhibice aktivity CaMKII koexpresí GFP-AC3I úplně blokovala růst citlivosti kokainu zprostředkovaný ΔFosB, což naznačuje, že aktivita CaMKII je zapotřebí pro změny indukované působením ΔFosB v chování kokainu.

Přejít na:

Diskuse

Předkládaná studie popisuje nový mechanismus dopředného posunu, kde kokain indukuje ΔFosB v NAc, který upreguluje transkripci genu CaMKIIa selektivně v NAc skořápce. CaMKIIa následně fosforyluje a stabilizuje ΔFosB, což vede k větší akumulaci ΔFosB ak další indukci CaMKIIa (Obr. 6G). Kolapsující hladiny těchto dvou proteinů během chronické expozice kokainu přispívají zásadními způsoby k citlivým reakcím na léčivý účinek. To je obzvláště příznivá hypotéza, protože jak ΔFosB tak CaMKII byly předtím prokázány, že byly požadovány pro zvýšení reakce na chování kokainu (Pierce a kol., 1998; Peakman a spol., 2003) a tento nález replikujeme pro ΔFosB v shellu NAc specificky za použití virového přístupu (Obr. 4 a A66).

Přestože transgenní nadměrná exprese ΔFosB v MSNs typu D1 může způsobovat indukci CaMKII jak v skořápce NAc, tak v jádru zvířat dosud neléčených kokainem, v souvislosti s kokainem akumulace endogenního ΔFosB, která se vyskytuje v obou subregionech, vede k indukci CaMKII specificky v NAc skořápce . Tento rozdíl by se mohl vztahovat k vyšším hladinám ΔFosB indukovaným v našem bitransgenním modelu, nicméně by mohl také odrážet schopnost kokainu diferenciálně měnit promotor CaMKIIa ve skořápce vs jádrové MSN buď podporovat vazbu ΔFosB v první nebo ji vyloučit ve druhém subregionu. Ve skutečnosti naše údaje ChIP, které odhalují kaceinem zprostředkovanou deacetylaci histonů na promotoru genu CaMKIIa v jádře NAc, podporují možné zapojení chromatinového mechanismu. V souladu s touto hypotézou byla nadměrná exprese ΔFosB u MSN typu D1 schopna indukovat indukci CaMKIIa v jádře NAc za nepřítomnosti kokainuObr. 3F), což naznačuje, že existují aktivní modifikace promotoru CaMKIIa, které brání této indukci během chronické expozice kokainu. Regulace povrchu chromatinu na CaMKII promotoru může také vysvětlovat, proč je CaMKII indukován provokační dávkou kokainu v NAc skořápce chronických krys odebírajících kokain (Obr. 1E), ale nikoli zvířat dosud neléčených (Obr. 1D). To by mohlo představovat epigenetický účinek genu primingu ΔFosB (Robison a Nestler, 2011) a mohl by tedy být jedním molekulárním mechanismem inkubace touhy po kokainu (Pickens a kol., 2011). Nicméně pro to, aby změna chromatinu byla kauzálně spojena s inkubací chuti, bude se časem muset zvyšovat. Bude zajímavé zjistit, zda se jedná o tento případ, a zjistit, zda jiné geny ukazují, že kokain je závislá na specifické subregionální oblasti podle ΔFosB. Důležité je také poznamenat, že popisovaná předávací smyčka nevede k nekonečné akumulaci CaMKII nebo ΔFosB (Obr. 1E); odhalování molekulární "brzdy" zodpovědné za toto je důležitým cílem budoucích studií.

Známé funkce ΔFosB a CaMKII v několika experimentálních systémech a oblastech mozku se sbíhají na mnoha úrovních (Obr. 6F). Obě molekuly jsou úzce spojeny s růstem dendritické páteře: CaMKII interaguje s cytoskeletem aktinu (Okamoto a kol., 2009), reguluje velikost hlavy hřbetu (Matsuzaki a kol., 2004) a je nezbytný a dostatečný pro růst filopodie a synapsí vyvolaný plastickostí v kulturách hippocampálních organotypických řezů (Jourdain a kol., 2003), wHFIL je nezbytný a dostatečný pro tvorbu dendritické páteře indukovanou kokainem v NAc MSNs (Maze a kol., 2010). Navíc obě molekuly byly spojeny s regulací AMPA glutamátových receptorů. CaMKII nereguluje celkové hladiny AMPA receptorových podjednotek, ale vede k zavedení AMPA receptorů do synaps a zvyšuje vodivost AMPA kanálů fosforylací GluA1 u Ser831 v hipokampálních pyramidových neuronech v kultuře a in vivo (přezkoumáno v (Malinow a Malenka, 2002; Colbran a Brown, 2004)). Takovéto zvýšené obchodování s GluA1 se synapsou bylo zapleteno také do chronického působení kokainu (Boudreau a Wolf, 2005). Navíc behaviorální reakce na aktivaci AMPA receptoru v NAc jsou zvýšeny nadměrnou expresí CaMKIIa v závislosti na dopaminovém receptoru D1 (Singer a kol., 2010). Dlouhodobé nadměrné exprese DFosB specifické pro D1 indukuje transkripci GluA2 v NAc (Kelz a kol., 1999), což tlumí odpovědi AMPA zprostředkované prostřednictvím GluA1, zatímco zde ukazujeme, že krátkodobá nadměrná exprese ΔFosB - stejně jako kratší doba expozice kokainem - nemá na tuto podjednotku žádný účinek (Obr 1). Nicméně jsme nedávno zjistili, že krátkodobá nadměrná exprese ΔFosB snižuje odpovědi AMPA u MSN typu D1 v NAc (Grueter a kol., 2013). Tyto údaje naznačují časově odlišné mechanismy, které by mohly představovat časově závislou řadu neuroadaptací na kokain, které jsou základem pro různé aspekty progrese závislosti, které ještě nejsou dobře známy. Na úrovni chování jsou vyžadovány jak CaMKII, tak ΔFosB pro lokomotorickou senzibilizaci kokainu (viz výše) a oba jsou vyžadovány pro trvalé kokainové sebeadministraci u hlodavců (Colby a kol., 2003; Wang a kol., 2010), což naznačuje, že tyto dva proteiny jsou důležité jak pro krátkodobé, tak i dlouhodobé adaptace chování k expozici léčiva, ačkoli pomocí částečně odlišných základních mechanismů. Předpokládá se, že ΔFosB a CaMKII regulují taková komplexní adaptace chování prostřednictvím změn v synaptické funkci NAc, i když je zapotřebí mnohem další práce k přímému propojení synaptických jevů s změnou chování.

Holoenzym CaMKII současně interaguje s řadou proteinů souvisejících se synapsou (Robison a kol., 2005), o kterých se předpokládá, že regulují jejich zacílení na postsynaptickou hustotu (PSD), což je fenomén, který je považován za důležitý pro synaptickou plasticitu. Zejména bylo prokázáno, že interakce CaMKII s podjednotkou GluN2B receptoru typu glutamát typu NMDA nedávno dokázala regulovat jak synaptickou plasticitu, tak učení (Halt a kol., 2012). Zatímco peptid AC3I napodobuje autoinhibiční doménu CaMKII a tím inhibuje enzymovou katalytickou aktivitu, blokuje také několik interakcí protein-protein (Strack a kol., 2000; Robison a kol., 2005). Takže behaviorální a morfologické účinky HSV-GFP-AC3I zde popsané by se mohly objevit sníženou fosforylací cílových proteinů CaMKII, změnami cílení CaMKII nebo změnou navržené struktury CaMKII u synapsí (Lisman a kol., 2002).

Omezení navrhované smyčky ΔFosB-CaMKII na shell NAc je zvláštní poznámkou, protože nedávná práce prokázala několik fyziologických rozdílů mezi pláštěm NAc a jádrem v reakci na podávání kokainu, což je pojem potvrzený našimi nezajímavými údaji iTRAQ (tabulka S1) . MSN v shellu NAc vykazují depresi ve vypalovací kapacitě po chronickém kokainu, který trvá několik týdnů, zatímco jádra MSN ze stejných zvířat vykazují přechodný (1-3 denní) zvýšení vypalovací kapacity, která se vrací během týdnů 2 (Kourrich a Thomas, 2009). Kromě toho je řada synaptických proteinů diferencovaně regulována v shellu NAc vs jádro zvířat vystavených chronickému kokainu, včetně GluA2 (Knackstedt a kol., 2010). Chronický amfetamin indukuje CaMKIIα specificky v NAc skořápce (Loweth a kol., 2010), není divu, že bychom našli podobný účinek s kokainem. Nicméně, jelikož ΔFosB je indukován v jádře a jádře NAc chronickým kokainem (Perrotti a kol., 2008) a protože jsme ukázali, že indukce CaMKIIa ve skořápce je závislá na ΔFosB, naše nálezy poskytují nové důkazy pro odlišné transkripční mechanismy na promotoru CaMKIIa mezi těmito dvěma subregiony, které jsou odpovědné za selektivní indukci CaMKIIa ve skořápce.

Velké množství nedávných prací se soustředilo na vymezení rozdílů mezi MSN D1 a D2 typu NAc. Přestože se D1 i D2 receptory podílejí na odměňování kokainu (Vlastní, 2010), nedávná práce demonstruje, že optogenetická aktivace MSN typu D1 zvyšuje reakce na chování kokainu, zatímco aktivace MSN typu D2 má opačný účinek (Lobo a kol., 2010). V souladu s těmito nálezy jsou myši s vyřazenými D1-receptory nedostatečné při získávání kokainového samoadministrace (Caine a kol., 2007), zatímco knoflíky D2 nejsou (Caine a kol., 2002). D1 podávání agonistů přímo do NAc spouští chování kokainu v paradigmech obnovení (Vlastní, 2010). Je zajímavé, že tento účinek vyžaduje zvýšení aktivity CaMKII závislé na D1-receptoru v NAc shellu, ale nikoli jádro (Anderson a kol., 2008), což je výsledek, který se dobře hodí ke smyčce DFosB-CaMKII specifické pro D1 a shell.

Předtím jsme uvedli, že Ser27 v ΔFosB může být fosforylován kasein kinázou-2 (Ulery a kol., 2006), nicméně zde stanovujeme, že CaMKII fosforyluje ΔFosB na tomto a dalších místech s mnohem větší kinetikou a stechiometrií a může replikovat vyšší zdánlivé Mr pozorováno u ΔFosB (Obr. 5A) s expozicí kokainu in vivo (Nestler, 2008). Již víme, že fosforylace Ser27 zvyšuje stabilitu ΔFosB a transkripční aktivitu (Ulery a kol., 2006; Ulery a Nestler, 2007; Ulery-Reynolds a kol., 2009). Budoucí práce se nyní zaměří na identifikaci a funkční důsledky nových míst fosforylace ΔFosB, které jsou uvedeny v této studii.

Tu popsaná feed-forwardová smyčka poskytuje věrohodný nový mechanismus, kterým opakované podávání kokainu vede v NAc k progresivním abnormalitám. Jako taková může tato biochemická cesta poskytnout důležitý cíl pro budoucí terapeutický zásah do návykových poruch. Vzhledem k tomu, že CaMKII je všudypřítomný a vyžadován pro mnoho bazálních neuronálních a behaviorálních funkcí, bylo vyloučeno přímé použití inhibitorů CaMKII jako léčba závislostí. Naše data naznačují, že jemnější zacílení mechanismu indukce CaMKII, které je specifické pro jednotlivý buněčný typ a subregion odměřovacího obvodu mozku, by mohlo poskytnout terapeutický cíl, který by vyloučil komplikace systémové inhibice CaMKII.

Přejít na:

Poděkování

Tato práce byla podpořena granty Národního ústavu pro zneužívání drog (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR a EJN) a Hartwell Foundation (AJR). Autoři by rádi poděkovali Gabbymu Rundenkovi za velkorysý dar vyčištěného ΔFosB a Rogera Colbrana za velkorysý dar vyčištěného CaMKIIα.

Přejít na:

Reference

  1. Ahmed SH, Koob GF. Přechod od mírného až nadměrného užívání drog: změna hedonického bodu. Věda. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
  2. Anderson SM, slavný KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biochemický můstek spojující adumbaminové dopaminové a glutamátové systémy při hledání kokainu. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
  3. Boudreau AC, Wolf ME. Behaviorální senzitizace na kokain je spojena se zvýšenou expresí povrchu AMPA receptoru v nucleus accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
  4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Exprese a charakterizaci alfa-podjednotky Ca2 + / calmodulin-dependentní proteinkinázy II za použití bakulovirového expresního systému. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
  5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L., Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Role dopaminových D2 podobných receptorů při samo-podávání kokainu: studie s mutantními myší D2 receptorem a novým D2 receptorem antagonisty. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
  6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Nedostatečné podávání kokainu v dopaminu D1 receptoru knock-out myši. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasomálně závislý a nezávislý mechanismus pro destabilizaci FosB: identifikace FosB degron domén a důsledky pro stabilitu DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgenní zvířata s indukovatelnou cílenou expresí genu v mozku. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Christoffel DJ, Zlatá SA, Dumitriu D, Robinson AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kináza reguluje synaptickou a behaviorální plasticitu vyvolanou společenskou poruchou. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  10. Colbran RJ. Inaktivace proteinové kinázy II závislé na Ca2 + / kalmodulinu bazální autofosforylací. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
  11. Colbran RJ. Proteinové fosfatázy a synaptická plasticita závislá na protein-kinase II závislá na kalcium / calmodulin. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
  12. Colbran RJ, Brown AM. Protein kinasa II závislá na vápníku / calmodulin a synaptická plasticita. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
  13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadměrná exprese DeltaFosB specifického pro typ buňky zvyšuje motivaci kokainu. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
  14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepresivní účinky inhibitorů histon-deacetylázy. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitativní proteomika proteinů regulovaných caveolin-1: charakterizace polymerázového i transkriptového uvolňovacího faktoru / CAVIN-1 IN endoteliálních buněk. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Rizikové faktory pro dokončení sebevraždy při závažné depresi: případová kontrola impulsivního a agresivního chování muži. Am J Psychiatrie. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
  17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB diferenciálně moduluje funkci přímých a nepřímých cest jádra accumbens. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 v tisku. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojčík S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII vazba na GluN2B je kritická během konsolidace paměti. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB mutantní myši: ztráta chronické kokainové indukce proteinů souvisejících s Fos a zvýšená citlivost na psychomotorické a odměňující účinky kokainu. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Diferenciální kontrola chování kokainu jádrem a sluchem nucleus accumbens. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
  21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizační a DNA vazebné vlastnosti transkripčního faktoru DeltaFosB. Biochemie. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
  22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Proteinová kináza II vápník / kalmodulin přispívá k růstu a tvorbě páteře závislé na aktivitě. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
  23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Exprese transkripčního faktoru deltaFosB v mozku řídí citlivost na kokain. Příroda. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
  24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetická inhibice CaMKII v dorsálních středních spinoidních neuronech snižuje funkční excitační synapse a zlepšuje vnitřní záchvaty. PLoS One. 2012; 7: e45323. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Excinační trénink po samo-podávání kokainu vyvolává glutamatergickou plasticitu, která brání hledání kokainu. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  26. Kourrich S, Thomas MJ. Podobné neurony, opačné adaptace: psychostimulantní zkušenost odlišně mění vlastnosti spalování v jádře accumbens versus shell. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M., Thomas MJ. AMPAR-nezávislý účinek Striatal alphaCaMKII podporuje senzitizaci odměny kokainu. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Úloha jaderného faktoru kappaB při hypersenzitivitě stresu způsobené vaječníkovým hormonem u samičích myší. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874-880. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  29. Lee KW, Kim Y, Kim Am, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokain-indukovaná dendritická tvorba páteře v D1 a D2 dopaminovém receptoru obsahujících středních spiny neuronů v nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Molekulární základ funkce CaMKII v synaptické a behaviorální paměti. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
  31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Typová ztráta signalizace BDNF specifické pro buňky napodobuje optogenetickou kontrolu odměny kokainu. Věda. 2010; 330: 385-390. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibice CaMKII ve skořápce nucleus accumbens snižuje zvýšený příjem amfetaminu u senzitizovaných krys. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  33. Lethith JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamin H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Přechodná nadměrná exprese alfa-Ca2 + / calmodulin- zlepšuje chování respondentů na amfetamin. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  34. Malinow R, Malenka RC. Přenosu AMPA receptoru a synaptické plasticity. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
  35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturální základ dlouhodobé potenciace v dendritických spinech. Příroda. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
  36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Řízení tvorby paměti prostřednictvím regulované exprese transgenu CaMKII. Věda. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
  37. Bloky I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Podstatná role histon-methyltransferázy G9a v plasticitě indukované kokainem. Věda. 2010; 327: 213-216. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  38. McClung CA, Nestler EJ. Regulace genové exprese a odměny kokainu CREB a DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Posouzení. Transkripční mechanismy závislosti: role DeltaFosB. Philos Trans R. Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologické studie regulace chronické indukce antigenu FOS souvisejícího s kokainem v striatu a nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
  41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Role CaMKII a F-aktinu ve strukturální plasticitě dendritických trnů: potenciální molekulární identita synaptické značky? Fyziologie (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
  42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB v nucleus accumbens reguluje instrumentální chování a motivaci. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
  43. Paxinos G, Watson C. Mozg potkana ve stereotaxických souřadnicích. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
  44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibilní exprese dominantního negativního mutantu c-Jun u transgenních myší specifickou pro oblast mozku snižuje citlivost na kokain. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
  45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Convergentní signály CaMK a RacGEF řídí dendritickou strukturu a funkci. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
  46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukce deltaFosB v mozkových strukturách souvisejících s odměnou po chronickém stresu. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
  47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Rozlišující vzory indukce DeltaFosB v mozku drogami zneužívání. Synapse. 2008; 62: 358-369. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Naděje BT, Shaham Y. Neurobiologie inkubace touhy po drogách. Trendy Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Druhé poselce zprostředkované kalciem modulují expresi behaviorální senzitizace na kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
  50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autorádiografie lidského mozkového receptoru pomocí sekcí celé hemisféry: obecná metoda, která minimalizuje tkáňové artefakty. Synapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
  51. Robinson TE, Kolb B. Strukturální plasticita spojená s expozicí zneužívání drog. Neurofarmakologie. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
  52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripční a epigenetické mechanismy závislosti. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalentní interakce protein-kinázy II vápník / calmodulin dependentní s proteiny postsynaptické hustoty NR2B, densin-180 a alfa-aktinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
  54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Kvantifikace multiplexovaných proteinů u Saccharomyces cerevisiae za použití reaktivních reakčních činidel izobarových značek reagujících s aminem. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
  55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Závislost synapse: mechanismy synaptické a strukturální plasticity v nucleus accumbens. Trendy Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  56. Vlastní DW. In: Dopaminové receptory. Neve KA, redaktor. New York: Humana Press; 2010. str. 479-524.
  57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Přechodná nadměrná exprese protein-kinázy II závislá na alfa-vápník / kalmodulinu zprostředkovaná v jádře jádra Accumbens vede k dlouhodobé funkční upregulaci alfa-amino-3-hydroxyl-5 -methyl-4-isoxazol-propionátové receptory: receptor dopaminového typu-1 a proteinová kinasa A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mechanismus a regulace proteinové kinázy II závislé na vápníku / kalmodulinu zaměřené na podjednotku NR2B N-methyl-D-aspartátového receptoru. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
  59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforylace DeltaFosB zprostředkovává jeho stabilitu in vivo. Neurovědy. 2009; 158: 369-372. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulace transkripční aktivity DeltaFosB fosforylací Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
  61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulace stability DeltaFosB fosforylací. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
  62. Vialou V, et al. DeltaFosB v obvodech odměňování mozku zprostředkovává odolnost vůči stresu a antidepresivním reakcím. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Chronická acetylace H3 indukovaná kokainem a transkripční aktivace CaMKIIalfa v nucleus accumbens je kritická pro motivaci pro zpevnění léčiv. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reguluje běh kola. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
  65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Indukce DeltaFosB v orbitofronální kůře zprostředkovává toleranci k kokainem indukované kognitivní dysfunkci. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
  66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Podstatná role DeltaFosB v nucleus accumbens při morfinovém působení. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
  67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Cena EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Inhibice kalmodulin kinázy II chrání před strukturálními srdečními chorobami. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]