PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Zdroj
Laboratoř behaviorální fyziologie, postgraduální škola věd o lidském zdraví, Tokio Metropolitan University, Tokio, Japonsko.
Abstraktní
Tělesné cvičení zlepšuje několik aspektů hippocampální funkce. V souladu s představou, že neuronální aktivita je klíčem k podpoře neuronálních funkcí, předchozí literatura soustavně prokázala, že akutní záchvaty cvičení vyvolávají neuronální aktivaci v hippocampu. Opakované aktivační stimuly vedou k akumulaci transkripčního faktoru FosB, který zprostředkovává dlouhodobou nervovou plasticitu.
V této studii jsme testovali hypotézu, že dlouhodobý dobrovolný provoz kola indukuje expresi AFosB v hippocampu, a zkoumali jsme jakékoli potenciální účinky specifické pro region uvnitř hippocampálních podpolí podél dorso ventrální osy. Samci myší C57BL / 6 byli po dobu 4 týdnů chováni s nebo bez pojezdového kola. Dlouhodobý provoz kola významně zvýšil imunoreaktivitu FosB / AOSF ve všech měřených hipokampálních oblastech (tj. v podpolí DG, CA1 a CA3 dorzálního i ventrálního hippocampu). Výsledky potvrdily, že běh kola indukoval regionálně specifickou expresi imunoreaktivity FosB / AFOSB v kůře, což naznačuje, že jednotné zvýšení FosB / AFosB v hippocampu není nespecifickým důsledkem běhu. Data westernového přenosu ukázala, že zvýšená hipokampální FosB / AFOSB imunoreaktivita byla primárně způsobena zvýšenou AFOS. Tyto výsledky naznačují, že dlouhodobé fyzické cvičení je silným spouštěčem indukce AFosB v celém hipokampu, což by vysvětlovalo, proč by cvičení mohlo zlepšit funkce závislé na dorzálním i ventrálním hippocampu. Zajímavé je, že jsme zjistili, že exprese FosB / AFosB v DG byla pozitivně korelována s počtem neuroků imunoreaktivních (tj. Nezralých) dvojitého kortinu.
Ačkoli mechanismy, kterými AFB zprostředkovává cvičení indukovanou neurogenezi, jsou stále nejisté, tato data naznačují, že cvičení indukovaná neurogeneze je alespoň závislá na aktivitě. Celkově lze říci, že naše současné výsledky naznačují, že AFosB je nový molekulární cíl zapojený do regulace zátěže vyvolané hipokampální plasticity.
Úvod
Cvičení poskytuje různé výhody molekulárním, strukturálním a funkčním aspektům hippocampu u hlodavců [1,2], z nichž některé byly podpořeny lidskými studiemi [3,4]. Mechanismy, které jsou základem cvičení vyvolaných změn v hippocampální plasticitě, však nejsou dostatečně pochopeny. Předchozí literatura soustavně prokázala, že cvičení u hlodavců vyvolává hipokampální neuronální aktivaci. Imunohistochemické studie s použitím c-Fos, markeru přechodné neuronální aktivace, prokázaly, že jak nucený, tak i dobrovolný běh zvýšil exprese c-Fos v dentálních gyrus (DG), CA1 a CA3 subpolí hlodavců hippocampu [5-7]. Kromě toho předchozí studie využívající laserovou Dopplerovu průtokovou metodu (LDF) prokázala, že mírný běžecký pás provozuje zvýšený regionální průtok mozkové krve (rCBF), alternativní marker aktivace neuronů, v podpole CA1 u potkanů [8]. Imunohistochemické studie umožňují podrobné analýzy specifické pro region po ukončení cvičení, zatímco LDF umožňuje sledování rCBF v reálném čase v lokalizované oblasti během cvičení. Přes výhody a omezení každé studie tyto studie podobně prokázaly účinek akutních záchvatů cvičení na hipokampální neuronální aktivitu. Tyto výsledky naznačují mechanismus, kterým dlouhodobé pravidelné cvičení podporuje plasticitu hipokampu opakovaným spuštěním neuronální aktivace [9].
Transkripční faktor ΔFosB, zkrácená sestřihová izoforma plné délky FosB, je indukována různými typy opakovaných podnětů v konkrétních oblastech mozku, kde se postupně akumuluje kvůli své jedinečné stabilitě (poločas rozpadu) [10-12]. Rostoucí množství důkazů ukazuje, že zvýšené hladiny AFosB zprostředkovávají dlouhodobou nervovou a behaviorální plasticitu spojenou s konkrétními stimuly [11,13]. Například chronické podávání drog zneužívání, jako je kokain a morfin, obvykle zvyšuje expresi AFosB v nucleus accumbens, což představuje jeden z molekulárních mechanismů, které jsou základem zvýšené citlivosti na tyto léky [11,14,15]. Spodobně jako jiné odměny, včetně stravování s vysokým obsahem tuků a sexuální zkušenosti [16,17], long-term dobrovolný běh kola také zvýšil FosB / osFosB imunoreaktivitu v krysím jádru accumbens, což naznačuje, že dobrovolný běh je přirozenou odměnou pro hlodavce [18,19]. Podle našich nejlepších znalostí však žádná literatura nezkoumala, zda opakované vystavení fyzickému cvičení indukuje exprese FosB v hippocampu. Protože cvičení spouští aktivaci neuronů v hippocampu, předpokládali jsme, že dlouhodobé dobrovolné běh kola by také vyvolalo expresi AFosB v hippocampu. I když přesné mechanismy, kterými ΔFosB reguluje plasticitu hipokampu, zůstávají nejisté, studie prokázaly, že myši postrádající fosB gen vykazuje zhoršenou hippocampální neurogenezi a zvýšené chování podobné depresím [20,21]. IJe známo, že cvičení zvyšuje neurogenezi a má antidepresivní vlastnosti [22-25]. If Naše hypotéza je správná, ΔFosB by byla nová potenciální molekulárním cílem zprostředkující hippocampální plasticitu indukovanou cvičením.
Hippocampus má anatomický a funkční gradient podél své podélné (dorso – ventrální) osy [26]. Dorsální hippocampus hraje klíčovou roli v prostorovém učení a paměti [27,28], zatímco ventrální hippocampus se přednostně podílí na regulaci emočního chování [29,30]. Studie dále prokázaly, že fyziologické podněty vyvolávají různé vzorce exprese c-Fos v dorzálních a ventrálních částech hippocampu [31-33]. Protože cvičení zlepšuje jak hřbetní [34-37] a ventrální funkce hippocampu [24,25,38], je důležité prozkoumat, zda dlouhodobý dobrovolný běh způsobuje regionálně specifickou expresi AFosB v hippocampu.
Primární hypotéza této studie spočívala v tom, že dlouhodobý dobrovolný provoz kola by indukoval expresi AFosB v hippocampu myši. Tato hypotéza byla zkoumána imunohistochemií FosB / AFOSB v dorzálních a ventrálních hippocampálních podpolích, DG, CA1 a CA3, se zvláštním důrazem na identifikaci regionálně specifické indukce. Výsledky byly potvrzeny westernovým přenosem, který byl použit k identifikaci isoformy fosB genové produkty indukované v hippocampu. Rovněž jsme zkoumali kortex na regionálně specifickou indukci FosB / AFosB, abychom vyloučili možnost, že dlouhodobé cvičení nespecificky zvyšuje imunoreaktivitu FosB / AFOSB v mozku. Nakonec byla zkoumána korelační asociace mezi expresí FosB / AFosB a neurogenezí jako prvním krokem při hledání funkčních důsledků indukce indukce AFosB indukované cvičením při regulaci plasticity hipokampu.
Materiály a metody
1: Zvíře a etika
Dvacet samců myší C57BL / 6 (ve věku 8 týdnů) bylo zakoupeno od komerčního chovatele (SLC, Shizuoka, Japonsko). Deset myší bylo použito pro experiment 1 a dalších deset pro experiment 2. Myši byly chovány za kontrolovaných podmínek teploty (22 – 24 ° C) a světla (12 / 12-h cyklus světlo / tma, světlo na 0500) a byla jim poskytnuta potrava a voda podle libosti. Všechny experimentální postupy byly schváleny Výborem pro experimentální etiku zvířat na Tokijské metropolitní univerzitě.
V každém experimentu byly myši po příjezdu náhodně přiřazeny k kontrolní skupině (kontrola, n = 5) nebo k běžící skupině (Runner, n = 5). Během prvního týdne byly všechny myši umístěny ve standardních plastových klecích ve skupinách (5 myši / klec) pro počáteční aklimatizaci. Poté byly myši Runner přemístěny do klece vybavené pojezdovým kolem (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Protože je známo, že sociální izolace potlačuje námahou indukovanou neurogenezi v hippocampu [39], Runner myši byly umístěny jako skupina (5 myši / klec) po dobu dalších 4 týdnů. Každé ráno se zaznamenával počet otáček kol a každý týden se měřila tělesná hmotnost (g).
2: Experimentujte 1. Imunohistochemické vyšetření exprese FosB / AFosB a hippocampální neurogeneze
2.1: Perfúze a zpracování tkání
Ráno (0900 – 1100) po posledním dni běhového období byly myši hluboce anestetizovány pentobarbitalem sodným a transkardiálně perfundovány studeným solným roztokem. Mozek byl rychle odstraněn a dodatečně fixován v 4% paraformaldehydu v 0.1 M fosfátovém pufru (PBS, pH 7.4) přes noc. Mozek byl poté kryokonzervován v 30% sacharóze v PBS a zmrazen do dalšího zpracování. Koronální mozkové řezy (40 μm) hemisféry byly získány pomocí mrazivého mikrotomu a shromážděny v PBS s 0.01% azidem sodným.
2.2: Imunohistochemie
Pro imunofarbení FosB / AFOSB byla náhodně vybrána jedna ze šesti sérií řezů. Sousední série byla použita pro značení doublecortinu (DCX), což je marker nezralých neuronů validovaných pro hodnocení neurogeneze [40,41]. Po ukončení reakce endogenní peroxidázová aktivita 1% H2O2 v PBS byly volně plovoucí řezy preinkubovány blokovacím roztokem obsahujícím 10% normální koňské sérum v PBS po dobu 2 h. Po opláchnutí v PBS byly řezy inkubovány s králičí polyklonální protilátkou pan-FosB (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) zředěné v PBS s 0.5% Triton X-100 a 0.5% BSA (PBST) -BSA) pro 24 h při 4 ° C. Další série řezů byla inkubována s kozí polyklonální anti-DCX protilátkou (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) v PBST-BSA po dobu 48 h při 4 ° C. Řezy byly dále inkubovány s vhodnou biotinylovanou sekundární protilátkou (anti-králičí IgG, 1: 1000, AP182B; anti-kozí IgG, 1: 1000, AP180B, obě protilátky od EMD Millipore, Billerica, MA, USA) v PBST-BSA pro 2 h při pokojové teplotě. Řezy byly poté ošetřeny komplexem avidin-biotin-peroxidáza (kit Vectastain ABC peroxidázy, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) po dobu 90 min podle pokynů výrobce. Antigeny byly nakonec vizualizovány pomocí 0.02% 3,3-diaminobenzidinu (DAB) v 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) obsahujícím 0.01% H2O2. Pro imunofarbení FosB / AFOSB byla reakce zesílena síranem amonným a niklem. Pro barvení DCX byla buněčná jádra kontrastně barvena Nissl barvením. Řezy byly připevněny na želatinu potažená sklíčka a byly umístěny krycí sklíčka.
2.3: Kvantifikace imunoreaktivity FosB / AFOSB pomocí prahování obrazu
Protilátka pan-FosB použitá v této studii byla zvýšena proti vnitřní oblasti sdílené s N-terminální oblastí FosB a AFosB, takže nelze rozlišovat mezi dvěma izoformami. Proto byly imunoznačené struktury popsány jako FosB / AOSF imunoreaktivní jádra (FosB / AOSF-ir). Pro nezaujatou slepou kvantifikaci byla sklíčka před analýzou kódována. Atlas mozku myši [42] byl použit k identifikaci umístění následujících zájmových oblastí (ROI): granulární buněčná vrstva (GCL) DG (řezy 3), pyramidální buněčná vrstva CA1 (řezy 3) a CA3 (řezy 2 – 3) v dorzálním hippocampu (uzavřeno do -2.2 mm od bregmy); DG (řezy 2), CA1 (řezy 2) a CA3 (řezy 2) ve ventrálním hippocampu (uzavřené do -3.4 mm od bregmy) (Obrázek 4, vlevo, odjet). Kaudální sekce obsahují jak hřbetní, tak ventrální část hippocampu, ale ventrální část byla zaměřena. V DG byly zvlášť analyzovány suprapyramidové (DGsp) a infrapyramidové (DGip) listy. Motorická kůra (řezy 2 – 3, uzavřené do -0.6 mm od bregma), somatosenzorická válcová kůra (řezy 2 – 3, uzavřené do -0.6 mm od bregma), vizuální kůra (řezy 3, uzavřené do -2.9 mm od bregma), sluchová kůra (řezy 3, uzavřené do -2.9 mm od bregma) a čichová žárovka (řezy 3, uzavřené na + 4.3 mm od bregma) byly také analyzovány (Obrázek 6, vlevo, odjet).
Digitální snímky (2070 × 1548 pixelů) každé ROI byly pořízeny pomocí optického mikroskopu (BX-51, Olympus, Tokio, Japonsko) vybaveného CCD kamerou (DP-73, Olympus) a zobrazovacím softwarem (cellSens, Olympus). zvětšení objektivu bylo 10 × pro hippocampové ROI a 4 × pro kortikální ROI. Za účelem identifikace středně silné až silné FosB / ΔFosB imunoreaktivity (Obrázek 1D – G), s použitím několika sekcí předem, byla optimalizována jak nastavení snímání obrazu (intenzita světla, velikost pole, doba expozice a vyvážení bílé), tak prahové úrovně pro každou ze složek RGB pro hippocampální a kortikální ROI. Následující analýza byla poté provedena za optimalizovaných podmínek (1). ROI byly vybrány nepravidelně tvarovaným mnohoúhelníkem (Obrázek 1A, B) (2). Obrázek byl prahován, což převádělo jádra FosB / AFosB-ir na červenou barvu (Obrázek 1C-G) (3). % ROI bylo poté automaticky vypočteno takto:% ROI = (převedená oblast (červeně) / celková oblast návratnosti investic) × 100.
Pro ověření této analýzy prahování obrazu byly oblasti 20 náhodně vybrány z různých oblastí mozku s různými velikostmi oblastí. Kromě kvantifikace prahování obrazu byl počet jader FosB / AFosB-ir ve zvolených oblastech počítán ručně a hustota jader FosB / AFosB-ir byla získána vydělením počtu jader FosB / AFosB-ir měřeným měřením plocha (mm2).
2.4: Kvantifikace nezralých neuronů DCX-ir v gyrusu dentátu
Nezralé neurony DCX-ir v DG Runner myší byly hojné a překrývají se, takže je obtížné přesně spočítat diskrétní počet DCX-ir soma pomocí optického mikroskopu. V předchozí studii však Shollova analýza pro morfologické hodnocení ukázala, že každý neuron DCX-ir má v průměru jeden dendrit, pokud se měří v 40 μm soma [43]. Proto byla vyvinuta následující původní analýza, která umožňuje regionálně specifickou kvantifikaci neuronů DCX-ir.
-
(1) Obraz GCL byl promítán na displej počítače pomocí zobrazovacího softwaru a objektivu 40 × objektiv (2). Na živém obrázku byl nakreslen úsečka (150 ± 0.1 μm) podél středu GCL (Obrázek 2) (3). Při změně ohniskové hloubky se spočítal počet, kolikrát úsečka překročila dendrity DCX-ir (4). ROI (hřbetní DGsp, dDGsp; hřbetní DGip, dDGip; ventrální DGsp, vDGsp; ventrální DGip, vDGip) odpovídaly regionům, kde byla analyzována imunoreaktivita FosB / AOSF (5). V každé ROI byly nakresleny úsečky 2 – 3 na řez a počet průchodů byl zprůměrován na průřezy 2 – 3 na myš. Protože tloušťka GCL je přibližně 60 – 80 μm, počet křížení by měl odrážet počet neuronů DCX-ir v analyzované omezené oblasti.
Reprezentativní obraz nezralých neuronů DCX-ir a liniového segmentu (150 ± 0.1 μm) se překrývá pro počítání počtu křížení s dendrity DCX-ir.
3. Experimentujte 2. Identifikace izoformy FosB / ΔFosB vyvolané jízdou kola
3.1: Perfúze a zpracování tkání
Další kohorta myší byla léčena jako výše v experimentu 1. Po 4 týdnech běžící intervence byly myši transkardiálně perfundovány studeným solným roztokem v hluboké anestézii. Hippocampus byl rychle vyříznut a zmražen kapalným dusíkem a uložen při -80 ° C. Hippocampi každé myši byly homogenizovány v RIPA pufru (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI, pH 7.6, 1% NP-40, 1% deoxycholát sodný, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) obsahující proteázu. inhibitory (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Německo). Lyzáty byly odstředěny po dobu 15 min při 5000 rpm při 4 ° C a byly odebrány supernatanty. Koncentrace proteinu byly měřeny pomocí BCA Protein Assay kit (#23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Stejná množství proteinu (30 μg / dráha) byly elektroforézovány na 10% polyakrylamidovém gelu a poté přeneseny na PVDF membránu (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA). Nespecifická vazba byla blokována preinkubací membrány pro 1 h v TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCI pH 7.5, 0.1% Tween-20) obsahující 3% BSA. Membrána byla inkubována s pan-FosB protilátkou (1: 1000), která byla použita výše pro imunohistochemii, rozpuštěnou v TBST obsahujícím 3% BSA. Po promytí TBST byla membrána inkubována s HRP-konjugovanou anti-králičí IgG protilátkou (1: 5000 v TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, Velká Británie) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Po promytí TBST byly proteinové pásy vizualizovány inkubací s Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) a zachyceny pomocí Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, Velká Británie). Membrána byla poté znovu testována s anti-glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázovou (GAPDH) protilátkou (#2275, 1: 5000 v TBS-T, Trevigen, MD, USA) jako kontrola plnění. Optická hustota proteinových pásů byla kvantifikována pomocí Image-J a normalizována na úroveň GAPDH.
4: Statistická analýza
Změny v tělesné hmotnosti myší byly analyzovány dvousměrným opakovaným měřením ANOVA (skupina x čas). Ke stanovení statistických rozdílů mezi skupinami byl použit nepárový t-test (kontrola vs. běžec). Pearsonova korelační analýza byla použita pro validaci analýzy imunoreaktivity FosB / AFOSB (manuální počítání vs. prahování obrazu) a pro zkoumání asociace mezi úrovní exprese FosB / AFOSB a počtem překročení DCX v DG. Data byla prezentována jako průměr ± SEM. Práh pro statistickou významnost byl stanoven na P <0.05.
výsledky
1: tělesná hmotnost a dojezdová vzdálenost v experimentech 1 a 2
Změny tělesné hmotnosti kontrolních i běžných myší v experimentech 1 a 2 jsou spojeny a uvedeny v Obrázek 3. Dvoucestná opakovaná měření ANOVA ukázala významnou interakci (skupina × čas, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) a hlavní účinek skupiny F(1, 18) = 6.07, P <0.05), což naznačuje významně nižší tělesnou hmotnost u myší Runner. Běžecká vzdálenost na klec je uvedena v Tabulka 1. Ačkoli přesná délka běhu každé myši byla nejistá, protože myši byly ustájeny pohromadě, pravidelné pozorování potvrdilo, že všechny myši často prováděly běh kola. Runnerské myši v experimentu 2 běhaly déle než myši v experimentu 1, ale průměrná délka běhu (m / den / klec) byla během každého experimentu konzistentní.
2: Validace kvantifikace imunoreaktivity FosB / AFOSB pomocí prahování obrazu
Byla zjištěna významná korelace mezi oblastí FosB / AFosB-ir získanou prahováním obrazu a hustotou jader FosB / AFosB-ir získaných ručním počítáním (r = 0.941, P <00001, Obrázek 4).
3: FosB / AFosB imunoreaktivita v hippocampu
Reprezentativní snímky imunologického barvení FosB / AFosB v dorzálních a ventrálních hipokampálních podpolích byly ukázány na Obrázek 5. Ve všech analyzovaných ROI imunoreaktivita FosB / AFOSB u Runner myší (Obrázek 5, vpravo) byl kvalitativně vyšší než u kontrolních myší (Obrázek 5, centrum). U myší Runner kvantitativní analýza ukázala významné zvýšení plochy FosB / AFosB-ir v obou hřbetních (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) a ventrální hipokampální podpole (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Obrázek 6).
4: FosB / AFosB imunoreaktivita v kůře
Reprezentativní obrázky imunologického barvení FosB / AFosB v kortikálních oblastech zájmu jsou uvedeny v Obrázek 7. Kvantitativní analýza odhalila regionálně závislé změny imunoreaktivity FosB / AFOSB při dlouhodobém běhu (Obrázek 8). U myší Runner byla plocha FosB / AFosB-ir výrazně vyšší v motorické kůře (P <0.05) a somatosenzorická hlavní kůra (P <0.05), ale ne ve vizuální kůře (P = 0.662) nebo čichová žárovka (P = 0.523). Ve sluchové kůře měla oblast FosB / AFosB-ir tendenci ke zvyšování Runnerových myší (P = 0.105).
5: Neurogeneze
Reprezentativní obrázky imunofarbení DCX jsou uvedeny v Obrázek 9. V dorzálním hippocampu je DCX imunoreaktivita u Runner myší (Obrázek 9, vpravo) byl kvalitativně vyšší ve srovnání s kontrolními myšmi (Obrázek 9, vlevo, odjet). Ve srovnání s dorzálním hippocampem byla imunoreaktivita DCX ve ventrálním hippocampu u kontrolních i runnerových myší slabší. U myší Runner byl počet křížení výrazně vyšší u dDGsp (P <0.01) a dDGip (P <0.01; Obrázek 10). Ve ventrálním hippocampu byl počet křížení u Runnerových myší tendenci se zvyšovat, ale nebyly žádné významné rozdíly mezi skupinami (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Obrázek 10).
6: Korelace mezi expresí FosB / AFosB a neurogenezí
Byla provedena korelační analýza mezi oblastí FosB / AFOSB-ir a počtem křížení DCX (Obrázek 11). Protože každý soubor dat (např. Hřbetní DGsp u kontrolních myší) sestává pouze z párů 5, byla analýza nejprve provedena se všemi páry 40. Je zajímavé, že existuje významná korelace mezi oblastí FosB / ΔFosB-ir a počtem křížení DCX (r = 0.885, P <0.0001). Kromě toho byly identifikovány významné korelace také při dorzální DG (r = 0.762, P <0.05) a ventrální DG (r = 0.816, P <0.01) byly analyzovány samostatně.
7: Identifikace izoformy FosB / FosB indukované dlouhodobým provozem
Nakonec identifikovat izoformu fosB genové produkty indukované v hippocampu v reakci na dlouhodobý běh, byly hippocampi z další kohorty myší podrobeny westernovému přenosu s použitím stejné pan-FosB protilátky. Více pásem 35 – 37 kDa, představujících modifikované isoformy ΔFosB [44], byly významně zvýšeny u myší Runner versus Control (Obrázek 12, P <0.01). Na druhou stranu byla 48 kDa FosB izoforma nedetekovatelná v obou skupinách. Další pás slabě viditelný nad 25 kDa pravděpodobně představuje izoformu Δ2ΔFosB (27 kDa). Byly tam dva další pásy, nad 50 kDa a 37 kDa, které byly s největší pravděpodobností kvůli nespecifické vazbě. Při kvantifikaci nebyly v těchto pásmech jiných než ΔFosB mezi skupinami nalezeny žádné rozdíly (data nejsou uvedena).
Diskuse
Stručně řečeno, tato studie nejprve provedla imunohistochemickou analýzu ke zkoumání 1), zda dlouhodobý dobrovolný chod kola indukuje expresi FosB / AOSF v hippocampu; a 2), zda podél své dorso-ventrální osy existuje reakce specifická pro region.
Čtyři týdny dobrovolného běhu kola vyvolaly významné zvýšení imunoreaktivity FosB / AFOSB ve všech analyzovaných hipokampálních regionech (tj. Podpole DG, CA1 a CA3 obou hřbetních a ventrálních částí hipokampu). Potvrdili jsme, že hlavní izoforma 35 – 37kDa ΔFosB fosB akumulace genového produktu v reakci na dlouhodobý běh. Tyto výsledky jasně podporují hypotézu, že dlouhodobé pravidelné cvičení je silným spouštěčem indukce AFosB v celém hippocampu a že jeho indukce může být novým molekulárním mechanismem, kterým cvičení ovlivňuje různé typy dorsálních a / nebo ventrálních hippocampus-dependentních funkcí.
1: Validace a omezení kvantifikace FosB / BFosB imunoreaktivity pomocí prahování obrazu
Technika prahování obrazu, široce používaná v imunohistochemických studiích pro počítání počtu cílových buněk a pro hodnocení morfologie buněk, byla v této studii přijata pro regionálně specifickou kvantifikaci imunoreaktivity FosB / AFOSB [15,45,46]. Byla prokázána významná korelace mezi hladinami imunoreaktivity FosB / AFOSB kvantifikované prahováním obrazu a ručním počítáním (Obrázek 4). Protože však hustota a překrytí zabránily spočítání počtu jader FosB / ΔFosB-ir ve vysoce hustých oblastech, prokazuje korelace pouze přesnost metody prahování obrazu, když oblasti FosB / ΔFosB-ir představují <~ 40% z celkové ROI plocha. Proto je nutná pečlivá interpretace pro oblasti FosB / ΔFosB-ir> 40% z celkové oblasti ROI.
Zejména v DG Runner myší (Obrázek 4), Exprese FosB / AFosB byla silně indukována chováním kol a většina jader FosB / AFosB-ir se překrývala. V těchto oblastech vede zvýšená indukce exprese FosB / AFosB k většímu podhodnocení úrovně exprese, bez ohledu na použitou metodu kvantifikace (prahování obrazu nebo ruční počítání). Nicméně, navzdory riziku podceňování, je důležité si uvědomit, že tato studie úspěšně prokázala významné zvýšení plochy FosB / AFosB-ir v DG Runner myší. To naznačuje, že metodická omezení naše zjištění neohrožují. Místo toho potenciální podhodnocení zvyšuje spolehlivost zjištění, že dlouhodobý běh zvýšil hiporcampus FosB / AFOSB imunoreaktivitu.
2: Jednotná indukce ΔFosB v hippocampu dlouhodobým chodem
Hippocampus má anatomické a funkční gradienty podél své podélné osy [26], takže pro tuto studii byla samostatně analyzována imunoreaktivita FosB / AFOSB v hřbetní a ventrální části hipokampu. Data ukázala, že dlouhodobý běh rovnoměrně zvýšil expresi FosB / AFosB ve všech měřených hipokampálních ROI. Tato jednotná indukce imunoreaktivity FosB / AFOSB může být nespecificky způsobena systémovými metabolickými změnami spojenými s dlouhodobým chodem. Je však důležité si uvědomit, že v kortexu došlo k regionálně specifickému zvýšení imunoreaktivity FosB / AFOSB. Tento výsledek je podpořen nedávnými zjištěními, která ukazují, že akutní záchvat běžeckého pásu zvyšuje regionální průtok krve mozkem v hippocampu, nikoli však v čichové žárovce [8]. Dále Rhodes a kol. (2003) prokázalo, že dny 7 dobrovolného běhu kola vyvolaly expresi c-Fos v DG a CA2 / 3 hippocampu (CA1 se neměřilo) a ve smyslové kůře, ale nikoli ve vizuální kůře [47]. Dohromady tyto studie naznačují, že jednotná indukce exprese FosB / AFosB v hippocampu není nespecifickým důsledkem dlouhodobého běhu. Je zajímavé, že Hawley a kol. nedávno uvedli, že chronický nepředvídatelný stres zvýšil expresi FosB / AFosB v dorzálním, ale nikoli ve ventrálním, DG hippocampu potkanů [48]. Při dalším zkoumání budou odlišné vzorce indukce FosB / AFosB, jako jsou ty, které jsou vyvolávány cvičením nebo stresem, poskytovat neustálý pohled na dopady závislé na stimulu na hippocampus.
Je známo, že primární pan-FosB protilátka použitá v této studii rozpoznává všechny izoformy FosB proteinů. Při analýze westernovým přenosem jsme zjistili, že jedinými izoformami, které se po dlouhodobém běhu v hippocampu zvýšily, byly modifikované isoformy ΔFosB (35 – 37 kDa), jediné stabilní izoformy mezi proteiny rodiny Fos [11]. Toto zjištění je v souladu s předchozí prací používající protilátku pan-Fos k prokázání, že 35 – 37 kDa ΔFosB je převládající protein rodiny Fos indukovaný v čelní kůře chronickým stresem [44]. Zvýšení hipokampální FosB / AFOSB imunoreaktivity vyvolané dlouhodobým chodem tedy s největší pravděpodobností odráží hladinu AFosB.
Méně je známo o regionálně specifických účincích cvičení na molekulární a strukturální aspekty hippocampu. Četné behaviorální studie však ukazují velký potenciál pro cvičení vyvolaná zlepšení jak u dorzálních, tak i ventrálních hippocampálních funkcí. Bylo prokázáno, že cvičení zlepšuje prostorové učení a paměť [34-38] a prostorové a kontextové zpracování závisí hlavně na dorzálním hippocampu [27,28]. Oproti tomu je také známo, že cvičení má anxiolytické a antidepresivní vlastnosti [24,25,38] a tyto emoční reakce jsou převážně regulovány ventrálním hippocampem [29,30]. Rovnoměrná indukce AFOS dlouhodobým průběhem pozorovaná v této studii naznačuje, že v celém hipokampu došlo k určité formě neuroplastických změn. To by vysvětlovalo, proč cvičení může ovlivnit jak dorsální, tak ventrální funkce hippocampu.
3: Regionálně specifická analýza zátěže indukované neurogeneze
Zvýšená pozornost byla věnována také funkční disociaci neurogeneze mezi dorzálním a ventrálním hippocampem [49]. V této studii s využitím morfologických charakteristik nezralých neuronů DCX-ir [43], spočítali jsme počet průsečíků mezi dendrity DCX-ir a úsečkou nakreslenými uprostřed GCL. Toto měření neposkytlo celkový počet neuronů DCX-ir v DG, ale umožnilo kvantifikaci specifickou pro region nezbytnou pro provedení korelační analýzy s expresními daty FosB / AFosB (viz níže). Po dlouhodobém běhu se počet neuronů DCX-ir signifikantně zvýšil v dorzálním, ale nikoli ventrálním, DG. To naznačuje, že cvičení by mohlo stimulovat neurogenezi výrazněji v dorzálním úseku než ventrální část DG. Předchozí studie však uváděly protichůdné výsledky, ve kterých běh kola zvyšoval neurogenezi v dorzálním i ventrálním DG [50,51]. V této studii měl počet přechodů DCX-ir ve ventrálním DG tendenci se zvyšovat s průběhem, i když malá velikost vzorku (myši 5 na skupinu) mohla mít omezenou schopnost detekovat statisticky významný rozdíl mezi skupinami. Proto je pravděpodobné, že je předčasné vyloučit možnost, že dobrovolný chod kol může stimulovat ventrikulární hippocampální neurogenezi. Jsou nutné další podrobné studie, abychom pochopili regionálně specifickou neurogenezi indukovanou námahou, pokud jde o její vícestupňový proces (buněčná proliferace, diferenciace, migrace a přežití).
4: Funkční důsledky indukce ΔFosB indukované cvičením pro regulaci plasticity hipokampu
Nakonec jsme jako první krok v rozpoznávání funkčních implikací indukované indukce AFOSB v hippocampu zkoumali vztah FosB / AFOSB imunoreaktivity k DCX-ir přechodům v dorzálním i ventrálním DG a zjistili jsme významnou pozitivní korelaci mezi dvě proměnné. Ačkoli přesné mechanismy, kterými ΔFosB reguluje neurogenezi indukovanou cvičením, zůstávají nejisté, nedávná studie to však prokázala fosB- nulové myši, kterým chybí FosB, AFosB a A2AFosB (všechny fosB produkty), vykazovaly deficity v bazální hipokampální neurogenezi, včetně snížené proliferace neuronálních progenitorových buněk, zvýšené ektopické migrace novorozených neuronů a abnormálních struktur DG [20]. Tyto změny však nebyly v roce 2006 pozorovány fosB(d / d) myši, kterým chybí FosB, ale ne AFosB / A2AFosB. Zajímavé je, že fosB- nulové myši, exprese některých genů souvisejících s neurogenezí, včetně Vgf (Indukovatelný nervový růstový faktor VGF) a Gal (Galaninový prepropeptid) byly downregulovány [20]. Protože VGF a GAL jsou sekreční molekuly, jeden návrh, který slibuje, se domnívá, že neurony exprimující AFosB mohou regulovat neurogenezi prostřednictvím autokrinní / parakrinní aktivity [20].
Kromě toho je třeba poznamenat, že oblast, ve které je indukován AFosB, probíhá prostorovým překrýváním s oblastí, kde je vysoká neurogenní aktivita. Toto zjištění naznačuje, že neurogeneze vyvolaná cvičením je na minimální aktivitě závislá. Neuronální aktivace je klíčem k udržení a zlepšení funkce centrálního nervového systému [9], prostřednictvím mechanismů včetně exprese a uvolňování neurotrofního faktoru odvozeného z mozku (BDNF) [52,53], příjem sérového inzulínu podobného růstového faktoru-1 (IGF-1) přes hematoencefalickou bariéru [54,55], potlačení apoptózy [56] a regulace mitochondriální motility [57]. Tato studie tedy naznačuje, že dlouhodobé cvičení vyvolalo opakovanou neuronální aktivaci, což je patrné ve zvýšené expresi AFosB, která přispívá ke zvýšení plasticity hipokampu, potenciálně prostřednictvím výše uvedených vícenásobných mechanismů.
Tato studie hodnotila pouze neurogenézu indukovanou zátěží a její souvislost s expresí FosB / AFosB v DG. Imunoreaktivita FosB / AFOSB však byla indukována také v podpolí CA1 a CA3. I když jsou nutné další studie, aby bylo možné lépe porozumět funkčním rolím exprese ΔFosB indukované cvičením v těchto podpolích, předchozí literatura nabízí slibnou možnost. Guan a kol. (2011) prokázal, že specifická ablace cyklin-dependentní kinázy 5 (Cdk5) v pyramidálních neuronech CA1 nebo CA3 narušila konsolidaci nebo vyhledávání paměti [58]. Je zajímavé, že Cdk5 je cílovým cílem ΔFosB [59] a podílí se na regulaci synaptické plasticity [60]. Exprese AFOSB indukovaná cvičením by proto mohla být zapojena do regulace synaptické plasticity prostřednictvím aktivace Cdk5 v podpolí CA1 a CA3.
Proč investovat do čističky vzduchu?
I když bylo známo, že akutní záchvaty vyvolávají expresi okamžitých časných genových proteinů v hippocampu, tato studie poskytuje první důkaz, že dlouhodobé pravidelné cvičení významně indukuje expresi AFosB v celém hippocampu. Thje jednotná indukce AFos podporuje současné chápání, že cvičení je účinný nefarmakologický zásah schopný zlepšit mnohočetné hippocampální funkce. Spolu s významnou korelací mezi expresí FosB / AFosB a neurogenezí jsou tato data provokativní a naznačují potřebu dalších studií vymezujících roli AFosB při zprostředkování účinků cvičení na hippocampální funkci, včetně neurogeneze.
Prohlášení o financování
Reference