Periadolescentní myši ukazují rozšířenou úpravu ΔFosB v reakci na kokain a amfetamin (2002)

J Neurosci. 2002 Nov 1;22(21):9155-9.
 

Zdroj

Institut Nathan Kline, Orangeburg, New York, 10962, USA. [chráněno e-mailem]

Abstraktní

Děti a mladiství jsou stále častěji vystaveni psychostimulancům, ať už nelegálně, nebo k léčbě běžných neuropsychiatrických stavů, jako je porucha pozornosti s hyperaktivitou a bez hyperaktivity. Navzdory rozšířenému používání psychomotorických stimulantů v mladších věkových skupinách je málo známo, že jde o chronické molekulární neuroadaptivní odpovědi na tyto látky v nezralém mozku. Zde dokládáme, že po chronickém podání psychostimulantů kokain a amfetamin, transkripční faktor DeltaFosB je upregulován v nucleus accumbens periadolescentní myši ale nikoliv v post-odstavení nebo dospělé myši. Indukce DeltaFosB také se vyskytuje výhradně v caudate putamen of periadolescentní myši po amfetamin správa. Tyto výsledky demonstrují jedinečnou plasticitu adolescentního mozku kritické molekuly, která reguluje psychostimulační účinky a naznačují, že tyto neuroadaptivní změny se mohou podílet na zprostředkování rozšířené návykové návyky u dospívajících ve vztahu k dospělému.

Úvod

Psychostimulanty se používají při léčbě běžných dětských poruch, jako je porucha pozornosti s hyperaktivitou. Navíc zneužívání stimulantů, včetně amfetaminu a kokainu, je běžné u dospívajících, což je věk, kdy existují důkazy pro zvýšené návykové návyky vůči dospělým osobám (Estroff a kol., 1989; Myers a Anderson, 1991). Navzdory datům naznačujícím vývojově regulované behaviorální účinky je málo známo, že jde o molekulární neuroadaptivní odpovědi u nezralého mozku, které se vyskytují během podávání těchto látek. Kokain a amfetamin mohou způsobit dlouhodobé změny chování částečně prostřednictvím stimulace dopaminu D1receptorů a zvýšení hladin transkripčních faktorů, včetně ΔFosB, v dorzální striatum (tj. kaudate putamen) a ventrální striatum (tj. nucleus accumbens) (Chen a kol., 1997). Zvýšení hladin ΔFosB, snad prostřednictvím stabilizace proteinových produktů, trvá několik týdnů po chronické expozici kokainu nebo amfetaminu a je alespoň částečně regulováno přenosovou cestou signálního signálu dopaminu (Chen a kol., 1997; Nestler a kol., 2001).

Centrální dopaminergní systém mladých zvířat je velmi v tahu v důsledku měnících se úrovní kritických molekul během normálního vývoje včetně dopaminu D1receptor DARPP-32 (dopaminový a cAMP regulovaný fosfoprotein;r 32 kDa) a cAMP (Ehrlich a kol., 1990;Teicher a kol., 1993; Perrone-Capano a kol., 1996; Tarazi a kol., 1999;Andersen, 2002). Expozice psychostimulantů během tohoto období, které zvyšují dopaminergní neurotransmisi, může tedy mít za následek kvantitativní a / nebo kvalitativně odlišné molekulární odpovědi včetně změn exprese ΔFosB. Abychom mohli testovat hypotézu, že při chronické expozici psychostimulantům existují vědně závislý neuroadaptivní odpovědi, byly v sériových experimentech analyzovány tři skupiny myší: dospělí (60 d starý při nástupu injekcí), periadolescentní (33 d starý při nástupu injekcí) a po odstavení (24 d starý při nástupu injekce). Jedná se o první přímé srovnání molekulárních neuroadaptivních odpovědí na chronickou psychostimulantovou expozici u těchto tří věkových skupin. Zjistili jsme, že po identických léčebných paradigmech myši periadolescentní vykazují zvýšenou regulaci ΔFosB v reakci jak na kokain, tak na amfetamin.

MATERIÁLY A METODY

Zvířata a podávání léků. Samice CD-1 myší (Charles River Laboratories, Kingston, NY) byly umístěny v cyklu 12 hr světlo / tma (6: 00 AM na 6: 00 PM) s podle libostipřístup k jídlu a vodě. Zvířatům bylo umožněno, aby se do zvěřiny ubytovali minimálně 10 d před zahájením injekcí. Zvířata byla zpracována dvěma vyšetřovateli, kteří provedli všechny injekce ve stejné místnosti, ve které byla zvířata umístěna. Všechna zvířata byla odstavena ve věku 21 d. Injekce byly zahájeny u 24 (post-weanling), 33 (periadolescentní) nebo 60 (dospělého) d věku. Zvířata dostávali 20 mg / kg kokainu (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetaminu (Sigma) nebo stejný objem fyziologického roztoku intraperitoneálně mezi 4: 00 a 5: 00 PM denně pro 7 d. Zvířata byla usmrcena dekapitací po krátké expozici CO2 v 10: 00 AM v den po poslední injekci. Mozky byly okamžitě odstraněny z lebky a kaudat putamen a nucleus accumbens byly rychle rozřezány na led. Všechny disekce byly provedeny z koronálních mozkových řezů jediným výzkumníkem a proteinové extrakty byly připraveny z čerstvých tkání bez zmrazení. Všechny postupy na zvířatech byly schváleny Institutem pro péči o zvířata a používány a byly v souladu s Národními ústavy zdravotnictví Průvodce pro péči a používání laboratorních zvířat.

Western blot analýza. Pro analýzy Western blot byly z každého vzorku naneseny stejné hodnoty proteinu (40 μg pro caudate putamen a 20 μg pro nucleus accumbens) z každého vzorku gelu 10% SDS-polyakrylamidu po měření koncentrace proteinu pomocí BCA testu (Pierce, Rockford, IL). Rovnoměrné nakládání s proteinem bylo také ověřeno vizualizací celkového proteinu Ponceau Red po přenosu na nitrocelulózu a / nebo blotování s protilátkami proti aktinu (1: 500, Sigma). Antisérum proti Fos související antigen (FRA), které rozpozná izoforiem ΔFosB, bylo velkoryse poskytnuto Dr. M. Iadarolem (National Institutes of Health, Bethesda, MD) a použito v koncentraci 1: 4000. Předchozí studie (Chen a kol., 1997; Hiroi a kol., 1997), včetně předadsorpce FRA antiséra s M-peptidovým imunogenem, prokázala specifičnost tohoto antiséra. Monoklonální protilátka DARPP-32 5a, použitá u přípravku 1: 10,000, byla velkoryse poskytnuta Drs. Hugh Hemmings a Paul Greengard (Rockefellerova univerzita, New York, NY). Dopravní látka dopaminového transportéru (DAT) pochází z Chemicon (Temecula, CA). Bloty reagovaly s chemiluminiscenčním systémem NEN-DuPont (Boston, MA) a byly vystaveny filmu. Denzitometrické hodnoty pro imunoreaktivitu vůči DFosB byly získány pomocí ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistická významnost byla stanovena pomocí jednocestné ANOVA, následované post hoc Tukeyův vícenásobný srovnávací test nebo nepárový, dvoustranný Studentův test t test, jak je uvedeno v legendách na obrázku. Pro experimenty s léčbou léčiva byla analýza každé věkové skupiny provedena na samostatném blotu, a proto byla každé skupině s fyziologickým roztokem libovolně přiřazena hodnota 100% pro porovnání mezi věkovými skupinami. Pro ontogenetické studie byly vzorky ze všech věkových skupin analyzovány společně na jediném blotu.

VÝSLEDKY

Indukce ΔFosB po kokainu a amfetaminu se vyskytuje v nucleus accumbens pouze periadolescentních myší

Exprese ΔFosB byla měřena v nucleus accumbens a caudate putamen u post-weanling, periadolescent a dospělých myší po 7 d podávání amfetaminu nebo kokainu. Jádro accumbens je oblast mozku, která je považována za nejkritičtější pro zprostředkování odměřujících účinků psychostimulantů. Imunoreaktivita ΔFosB (35 kDa) byla selektivně indukována v nucleus accumbens periadolescentních zvířat po chronickém podání amfetaminu (obr. 1 A) nebo kokain (obr. 1 B). Naproti tomu hladiny ΔFosB (35 kDa) nebyly významně pozměněny v nukleárních kmenů dospělých nebo dospělých zvířat (obr.1 A,B). V kaudatém putamenu byly hladiny ΔFosB (35 kDa) také významně zvýšeny po chronickém podání amfetaminu pouze u periadolescentních zvířat (obr.2 A). Všechny tři věkové skupiny vykazovaly významné zvýšení exprese ΔFosB (35 kDa) v caudate putamen po chronickém podání kokainu (obr.2 B). Velikost indukce však byla největší u periadolescentních zvířat, zvláště ve srovnání s post-odstavčím (obr. 2 B). Jiné izoformy FRA a Fos byly nezměněny ve všech věkových skupinách (údaje nejsou uvedeny).

Obr. 1.

ΔFosB imunoreaktivita v nucleus accumbens po chronickém podání psychostimulantu. CD-1 myši byly jednou denně injektovány fyziologickým roztokem, amfetaminem nebo kokainem pro 7 d počátkem dne 24 (P24; post-weanling), den 33 (P33; periadolescentní) nebo den 60 (Dospělý). Hladiny imunoreaktivity ΔFosB (35 kDa) v nucleus accumbens jsou ukázány po chronickém amfetaminu (A) nebo kokainu (B). Reprezentativní imunobloty z fyziologického roztoku (S), amfetamin (A) a kokainu (C) injekcí po odstavení (P24), periadolescentní (P33) a dospělé myši jsou zobrazeny v souboru horní panely. Dolní panely ukazují střední ± SEM procento bazální exprese ΔFosB. n hodnoty pro každou skupinu jsou uvedeny v bary. Významné zvýšení hodnoty ΔFosB bylo zjištěno v nucleus accumbens pouze periadolescentních myší. * *p <0.05; **p <0.01 (studentské t test; fyziologický roztok vs léčivo).

Obr. 2.

ΔFosB imunoreaktivita v caudate putamen po chronické psychostimulantní aplikaci. CD-1 myši byly jednou denně injektovány fyziologickým roztokem, amfetaminem nebo kokainem pro 7 d počátkem dne 24 (P24; post-weanling), den 33 (P33; periadolescentní) nebo den 60 (Dospělý). Hladiny imunoreaktivity ΔFosB (35 kDa) v kaudate putamen jsou uvedeny po chronickém amfetaminu (A) nebo kokainu (B). Reprezentativní imunobloty z fyziologického roztoku (S), amfetamin (A) a kokainu (C) injektovaných periadolescentních myší (P33) jsou zobrazeny vhorní panely. Dolní panely ukazují střední ± SEM procento bazální exprese ΔFosB. n hodnoty pro každou skupinu jsou uvedeny v bary. Významné zvýšení amfetaminu indukované imunoreaktivitou proti dFosB bylo zjištěno v kaudate putamen pouze periadolescentních myší (A). Chronické podávání kokainu způsobilo zvýšení hodnoty ΔFosB ve všech třech věkových skupinách (B). * *p <0.05; **p <0.01 (studentské t test; fyziologický roztok vs léčivo).

Hodnoty DAT a DARPP-32 se nemění po chronickém kokainu nebo amfetaminu

Několik klíčových molekul vyjádřených dopaminergními a / nebo dopaminoceptivními neurony, včetně DARPP-32, D1 dopaminu a DAT přispívají k akutním a chronickým reakcím na psychostimulanty (Moratalla a kol., 1996; Fienberg a kol., 1998; Sora a kol., 1998; Gainetdinov a kol., 2001). Data z DARPP-32, D1 receptor a DAT nulové a DAT knock-down myši naznačují komplikovaný vztah mezi jejich hladinami, regulaci dopaminergní aktivity a reakce na psychostimulanty. Ve skutečnosti se indukce ΔFosB nevyskytuje u nulových myší DARPP-32, které dostávají chronický kokain (Fienberg a kol., 1998). U dospělých myší však 7 d expozice 20 mg / kg kokainu nemění celkové hladiny DARPP-32 (Fienberg a kol., 1998). Regulace DAT proteinu nebyla dříve popsána u myší, které byly chronicky vystaveny psychostimulancům, přestože u některých druhů byla hlášena změna v radioligandové vazbě na dopaminový transportér po expozici psychostimulanci (Letchworth a kol., 2001). Zde jsme změřili hladiny proteinů DARPP-32 a DAT, abychom zjistili, zda je exprese těchto proteinů změněna po chronickém podání psychostimulantu v jednom ze tří věkových skupin myší. Naše nálezy naznačují, že nebyly zaznamenány žádné významné změny hladin celkového DARPP-32 nebo DAT v celém kaudate putamen nebo nucleus accumbens po chronickém podání buď kokainu nebo amfetaminu v některé ze tří věkových skupin (Tabulka 1).

Zobrazit tuto tabulku:

Tabulka 1.

Relativní denzitometrické hodnoty pro DARPP-32 a DAT u P24, P33 a dospělých myší léčených amfetaminem a kokainem vzhledem k kontrolním hodnotám, hodnotám fyziologického roztoku, libovolně nastavenému na 100%

Základní úrovně ΔFosB jsou vývojově regulovány

Vyšetřili jsme ontogeny ΔFosB, protože dospělé myši s geneticky upravenou expresí ΔFosB v striatu měly zvýšenou odezvu na psychostimulanty (Kelz a kol., 1999). Zjistili jsme, že výchozí hladiny ΔFosB byly u mladších zvířat významně nižší než u dospělých, a to jak v kaudate putamen, tak v nucleus accumbens (obr.3 A). Úrovně funkčních markerů dopaminového systému, včetně DARPP-32 (Ehrlich a kol., 1990), DAT (Perrone-Capano a kol., 1996) a dopaminové receptory (Teicher a kol., 1993; Tarazi a kol., 1999) jsou také vývojově regulovány. Předchozí zprávy u myší CD-1 naznačují vrchol v striatálním DARPP-32 v den postnatálního dne 28 (P28) (Ehrlich a kol., 1990). V krysích kavatech putamen a nucleus accumbens, D1receptorů z P28 na P40 (Teicher a kol., 1993; Tarazi a kol., 1999), ale podobné studie nebyly provedeny u myší. Naproti tomu jsme zjistili, že hladiny DAT proteinů v kaudate putamen a nucleus accumbens byly konstantní mezi postnatálním dnem 24 a dospělostí (obr. 3 B). Relativní poměry mezi D1 receptory, DAT, DARPP-32 a ΔFosB se liší mezi věkovými skupinami, což může mít za následek rozdíly v D1 která by mohla ovlivnit stupeň indukce ΔFosB.

Obr. 3.

Vývojová exprese ΔFosB a DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) imunoreaktivity v caudate putamen a nucleus accumbens naivních myší CD-1 jako funkce věku. Reprezentativní imunobloty jsou uvedeny v tabulce horní panely.Dolní panely ukazují prostředky ± SEM tří myší na skupinu. * *p <0.05, dospělí versus P24; #p <0.05, dospělí versus P36 (Tukeyův vícenásobný srovnávací test po ANOVA). B, Densitometrické hodnoty imunoreaktivity DAT v caudate putamen a nucleus accumbens u naivních CD-1 myší jako funkce věku. Úrovně DAT se mezi třemi věkovými skupinami nelišily.

DISKUSE

Behaviorální účinky psychomotorických stimulantů jsou závislé na věku. Návykové návyky jsou nejvyšší v dospívání, když eskaluje používání nezákonných látek (Estroff a kol., 1989; Myers a Anderson, 1991). Ve skutečnosti se mladší děti často stávají dysforickými, když jsou vystaveny psychostimulancům, zatímco dospívající a dospělí mají zkušenosti s euforií (Rapoport a kol., 1980). V modelech hlodavců některé studie naznačují, že periadolescentní zvířata mají vyšší výchozí hladiny aktivity (Oštěp a brzda, 1983) a změnily odpovědi na psychostimulanty ve vztahu k mladším a starším zvířatům. Proto vykazují méně lokomotorickou stimulaci a hledá novotu v reakci na akutní podávání psychostimulantů s nízkými dávkami ve vztahu k odstavčím a dospělým zvířatům, ale zvýšená hyperaktivita po léčbě vysokými dávkami. Při chronickém podávání je senzitizace k lokalizaci vyvolané kokainem vyšší u periadolescentních potkanů ​​ve srovnání s dospělými, zatímco senzibilizace ke stereotypům je nižší. Údaje o mikrodialýze také odhalily rozdíly mezi periadolescentními a dospělými potkany, pokud jde o senzibilizaci uvolňování dopaminu indukovaného amfetaminem (Laviola a kol., 1995; Adriani a kol., 1998; Adriani a Laviola, 2000;Laviola a kol., 2001). Existují však konfliktní studie ohledně dlouhodobé reaktivity kokainu po podání methylfenidátu u dospívajících potkanů ​​(Brandon a kol., 2001; Andersen a kol., 2002). Tyto dva zprávy poukazují na obtížnost porovnávání studií při použití různých experimentálních paradigmat. Pokusy porovnat behaviorální studie u mladších zvířat jsou dále potlačeny použitím různých druhů a kmenů.

Myš se stává stále důležitějším zvířecím modelem ve studiu užití a zneužívání psychostimulantů a jedná se o první systematickou analýzu molekulárních neuroadaptivních odpovědí ve třech různých stádiích vývoje u myší nebo jakýchkoli jiných jedinců. Předchozí studie, z nichž jsme odvodili naše paradigmy léčby, prokázaly zvýšení hodnoty ΔFosB v izolovaném dorzálním a ventrálním striatu dospělých potkanů ​​divokého typu po chronickém podávání kokainu a amfetaminu (Hope a kol., 1994; Nye a kol., 1995; Turgeon a kol., 1997), ale pouze v kombinaci dorzálního a ventrálního striatu nebo izolovaného dorzálního striatu dospělých myší divokého typu po chronickém kokainu (Fienberg a kol., 1998; Zachariou a kol., 2001).

Nyní demonstrujeme prostorový a kvantitativní rozdíl psychostimulant-indukovaného ΔFosB u myší po porážce, periadolescentních a dospělých myší. Pozorování zvýšené odezvy u periadolescentních zvířat ve srovnání s dospělými a potomky je posíleno skutečností, že reakce je podobná u myší léčených kokainem a amfetaminem. Psychostimulanty kokain a amfetamin zvyšují jak synaptický dopamin, tak i serotonin a norepinefrin, ale různými mechanismy. Kokain se váže na transportéry plazma-lemmy pro dopamin, serotonin a norepinefrin a inhibuje jejich opětovné zachycení do presynaptických terminálů. Naproti tomu amfetamin podporuje uvolňování těchto vysílačů. Selektivní indukce ΔFosB v nucleus accumbens pouze periadolescentní věkové skupiny po 7 d stimulačního podávání a relativně zvýšená indukce ΔFosB v caudate putamen může být neurobiologickou reprezentací nebo příčinou dříve poznamenané zvýšené tendence zneužívat psychostimulanty v tomto věková skupina (Estroff a kol., 1989; Myers a Anderson, 1991) a další dlouhodobé změny exprese genu, které se liší mezi věkovými skupinami (Andersen a kol., 2002). Navíc tyto rozdíly mohou být vnitřně regulovány vývojovými změnami úrovní klíčových molekul, včetně samotného ΔFosB. Potenciální důsledky rozdílů ve výchozích hodnotách ΔFosB mezi věkovými skupinami jsou analogické s navrhovanými rozdíly mezi kmeny krys (Haile et al., 2001). Ve skutečnosti předpokládáme, že podobné kmenové rozdíly budou nalezeny u inbredních myší. Je také možné, že myši různého věku budou vykazovat rozdílné molekulární adaptace v oblastech mozku, které nejsou jádro akumbens. Dodatečná analýza pomocí periadolescentních myší s geneticky modifikovanými změnami v hladinách klíčových molekul a souběžných pozorovacích chování bude dále testovat tyto hypotézy.

Poznámky pod čarou

    • Přijaté Duben 8, 2002.
    • Revize byla přijata Srpen 6, 2002.
    • Přijato Srpen 8, 2002.
  • Tato práce byla podpořena National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders a Stroke Grant NS41871 (MEE a EMU) a Národním institutem pro zneužívání drog Grant P30-DA13429 (EMU).

  • Korespondence by měla být adresována Dr. Michelle E. Ehrlichovi, Univerzitě Thomas Jeffersona, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mailem: [chráněno e-mailem].

REFERENCE

Články citující tento článek