PSMC5, 19S proteasomální ATPáza, reguluje činnost kokainu v nucleus acumbbens (2015)

PLoS One. 2015 11 května; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Nikdy8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstraktní

ΔFosB je stabilní transkripční faktor, který se hromadí v nucleus accumbens (NAc), klíčové součásti obvodů odměňování mozku, v reakci na chronickou expozici kokainu nebo jiným drogám. I když je známo, že ΔFosB se s členem rodiny Jun heterodimerizuje za vzniku komplexu aktivního transkripčního faktoru, dosud nedošlo k otevřenému průzkumu dalších možných vazebných partnerů pro ΔFosB v mozku. Zde pomocí kvasinkových dvouhybridních testů identifikujeme PSMC5 - také známý jako SUG1, podjednotku proteasomálního komplexu 19S obsahující ATPázu - jako nový interagující protein s AFosB. Ověřujeme takové interakce mezi endogenními ΔFosB a PSMC5 v NAc a demonstrujeme, že oba proteiny také tvoří komplexy s jinými regulačními proteiny chromatinu spojenými s aktivací genu. Dále ukážeme, že chronický kokain zvyšuje jaderné, ale nikoli cytoplazmatické hladiny PSMC5 v NAc a že nadměrná exprese PSMC5 v této oblasti mozku podporuje pohybové odpovědi na kokain. Tato zjištění společně popisují nový mechanismus, který přispívá k působení ΔFosB a poprvé implikuje PSMC5 v molekulární a behaviorální plasticitě vyvolané kokainem.

Citace: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, proteazomální ATPáza 19S, reguluje působení kokainu v Nucleus Accumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademický redaktor: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, SPOJENÉ KRÁLOVSTVÍ

obdržel: Prosinec 10, 2014; Přijato: 7, 2015; Publikováno: 11

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný podle podmínek Licence Creative Commons Attribution, který umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci v jakémkoliv médiu za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány

Dostupnost dat: Veškeré relevantní údaje jsou v příspěvku.

Financování: Tato práce byla podporována granty od Národních ústavů zdraví, Národního institutu pro zneužívání drog a Nadace Ishibashi a Japonské společnosti na podporu vědy (čísla KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Poskytovatelé financí neměli žádnou roli při návrhu studie, sběru a analýze dat, rozhodnutí o zveřejnění nebo přípravě rukopisu.

Konkurenční zájmy: Autoři prohlásili, že neexistují žádné konkurenční zájmy.

Úvod

FOSB, zkrácený produkt FosB gen, patří do rodiny transkripčních faktorů Fos, které také zahrnují c-Fos, FosB plné délky, Fra-1 a Fra-2. ΔFosB, stejně jako jiné Fos proteiny, heterodimerizuje s proteinem Jun rodiny - c-Jun, JunB nebo JunD - za vytvoření aktivního komplexu transkripčního faktoru AP-1 (aktivátorový protein-1), který indukuje nebo potlačuje expresi specifických cílových genů [1,2].

Ukázalo se, že FosB hraje klíčovou roli v drogové závislosti [2]. Jedinečně mezi bílkovinami rodiny Fos se po opakovaném podání léčiva kvůli vysoké stabilitě hromadí v nucleus accumbens (NAc) a dalších mozkových oblastech souvisejících s odměnou [3,4], který je zprostředkován nedostatkem C-terminálních degron domén a fosforylací několika proteinkinázami [5-7]. Taková indukce AFos v NAc zprostředkuje zvýšené behaviorální reakce na drogy zneužívání. Nadměrná exprese AFosB v této oblasti mozku dospělých zvířat, ať už pomocí virových vektorů nebo indukovatelných bitransgenních myší, zvyšuje citlivost zvířete na lokomotoricky aktivující a odměňující účinky kokainu a opiátů a také motivaci zvířete k vlastnímu podávání. kokain [7-11]. Naopak, nadměrná exprese dominantních negativních antagonistů AFosB způsobuje opačné behaviorální fenotypy [10-12].

My a další jsme dříve potvrdili pomocí testů gelového posunu, že JunD a možná i další proteiny Jun rodiny jsou hlavními vazebnými partnery AFosB v mozku in vivo [13-15]. Dosud však nedošlo k otevřenému, nezaujatému vyhodnocení vazebných partnerů AFOSB v mozku. Zde jsme se snažili identifikovat nové vazebné partnery pro AFosB pomocí kvasinkového dvouhybridního testu [16,17]. Naše data odhalila, že PSMC5, také známý jako SUG1, je robustním partnerem AFOSB jak in vitro, tak v NAc in vivo, kde se připojuje k FOSB jako součást kokainem indukovaného transkripčního aktivačního komplexu, který také obsahuje CBP (CREB vázající protein) ) a p300 - histon acetyltransferázy (HAT) - stejně jako BRG1 (chromatinový remodelační protein). Dále ukážeme, že chronická expozice kokainu mění jaderné hladiny PSMC5, podjednotky proteasomálního komplexu 19S obsahující ATPázu, v NAc a že PSMC5 zase řídí behaviorální reakce na kokain.

Materiál a metody

Kvasinkový dvouhybridní screening

Kvasinkové buňky MaV203 (Invitrogen Life Technologies) byly kotransfekovány pomocí pDBLeu pohánějícím různé fragmenty AFOS proteinu a knihovna mozku myši byla subklonována do pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformované buňky byly pěstovány na SC-médiu bez leucinu, tryptofanu a histidinu a obsahujících 10 mM 3-aminotriazolu. Vazba mezi fragmenty FosB a kandidátním partnerem indukuje tři reportérové ​​geny (His3, Ura3, a LacZ) a indukce umožňuje transformantům přežít za použitých kultivovaných podmínek. Pozitivní klony byly znovu testovány s čerstvými fragmenty pDBLeu-AFOS pomocí retransformačních testů v buňkách MaV203.

Buněčné linie

Myší neurolastové buňky 2A (ATCC) byly udržovány v minimálním esenciálním médiu Eagle (EMEM) (ATCC), doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS) při 37 ° C a 5% CO2. Buňky krysy 1A byly darem od Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japonsko) [18] a udržované v Dulbeccově MEM (DMEM) (Life Technologies), doplněné o 10% FBS při 37 ° C a 5% CO2. Transfekce buněk plazmidovou DNA byla provedena pomocí Effectene (Qiagen) podle pokynů výrobce.

PSMC5 a AFos konstrukty

Několik mutantních forem PSMC5, každá FLAG-značená na svém N-konci, bylo vygenerováno pro použití v imunoprecipitačních nebo virově zprostředkovaných experimentech přenosu genů. Patřily mezi ně: PSMC5-K196M, PSMC5-Acoiled-coil doména (PSMC5-ACC, chybějící aminokyseliny 27 – 68), PSMC5-NT (sestávající z N-koncového fragmentu proteinu, aminokyseliny 1 – 151) a PSMC5 -CT (sestávající z C-terminálního fragmentu proteinu, 172 aminokyselin) (viz Obr 1). Také jsme použili N-terminální MYC-značené formy divokého typu ΔFosB a ΔFosB s mutací v jeho doméně leucinového zipu (mutace aminokyselin 182 na 205, o které je známo, že vylučuje heterodimerizaci proteiny Jun rodiny [6].

thumbnail
Obr. 1. FOSB se váže na PSMC5 in vitro.

 

A. Schéma AFOSB, AFOSB-LZM, ve kterém je doména leucinového zipu mutována, aby odstranila heterodimerizaci AFOSB s Jun proteiny, a A2AFosB, které postrádají první 78 aminokyseliny AFosB N-konce. B. Schéma PSMC5, PSMC5-NT, který obsahuje první 151 aminokyseliny PSMC5, PSMC5-CT, který postrádá první 235 aminokyseliny PSMC5, a PSMC5-ACC, který postrádá stočenou cívkovou doménu (aminokyseliny 28 – XNUM) . AAA doména odpovídá motivu, ATPasům spojeným s různými buněčnými aktivitami, přítomných v mnoha ATPázách. C. 68 μg pcDNA2.4-ΔFosB (dráhy 3.1 – 1) nebo ΔFosB-LZM (dráha 4) byl ko-transfekován 5 μg FLAG-značených PSMC2.4 nebo různých delečních mutantů do Neuro5a buněk. Dva dny po transfekci byly buňky lyžovány a podrobeny imunoprecipitaci s anti-FLAG protilátkou a poté Western bloty s anti-AFosB nebo anti-FLAG protilátkou. Všimněte si, že AFOSB, ale ne AFosB-LZM, se silně váže na PSMC2 nebo PSMC5-NT, ale ne na PSMC5-CT nebo PSMC5-ACC. Data uvedená na obrázku byla replikována trojmo v každém ze tří samostatných experimentů.

dva: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Zvířata

Pro všechny experimenty byly použity samce myší C11BL / 57J staré devět až 6 týdnů (The Jackson Laboratory). Zvířata byla chována v cyklu 12-h světlo-tma s přístupem k potravě a vodě podle libosti a byli zvyklí 1 týden před experimentováním. Byly použity dva režimy léčby kokainem. Ke studiu biochemických účinků kokainu byla zvířatům podána 7 denní dávka kokainu (20 mg / kg) nebo fyziologický roztok a usmrcena dekapitací 24 hodinu po poslední injekci. Toto je standardní protokol, který prokázal četné molekulární a buněčné reakce na léčivo [7]. Ke studiu vlivu PSMC5 v nucleus accumbens na behaviorální odpovědi na kokain jsme použili podprahovou dávku léku (7.5 mg / kg; viz Locomotorská senzibilizace níže) na základě hypotézy, že PSMC5 by stejně jako ΔFosB zvýšil citlivost zvířete na kokain [8]. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro ústavní péči o zvířata a jejich použití v Mount Sinai.

Imunoprecipitace a westernový přenos

Buňky Neuro 2A byly transfekovány divokým typem nebo mutantní formou PSMC5. Dva dny po transfekci byly buňky promyty v PBS, lyžovány v pufru RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% deoxycholát sodný, 10 mM butyrát sodný, koktejl inhibitoru proteázy) . Lyzáty byly rozděleny a inkubovány s neimunními IgG (Sigma) nebo anti-FLAG protilátkami (Sigma) po dobu 3 h při 4 ° C. Imunoprecipitace byla prováděna s perličkami proteinu G (Invitrogen), jak je popsáno [19]. Imunoprecipitované proteiny byly podrobeny SDS-PAGE a analyzovány westernovým přenosem s použitím anti-FosB / AFOS protilátky (Cell Signaling Technology) na základě publikovaných protokolů [7]. Pro testy vazby na proteiny in vivo jsme použili purifikované nukleární frakce z punčem disekovaných NAc myší po chronickém ošetření kokainem (20 mg / kg IP denně po 7 dny, u myší se 24 použilo po poslední injekci). Koimunoprecipitace z jaderných frakcí byla provedena pomocí soupravy Co-IP Nuclear Complex (Active Motif) podle pokynů výrobce. Byly použity následující protilátky: MYC nebo ß-aktin, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 a histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 a BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) a FLAG M2, Sigma.

Imunohistochemie

Imunohistochemie byla prováděna podle publikovaných postupů [20]. Myši byly anestetizovány a perfundovány intrakardiálně 4% paraformaldehydem v PBS. Mozek byl kryokonzervován 30% sacharózou a poté zmražen a uložen při -80 ° C do použití. Koronální řezy (40 μm) byly nařezány na kryostatu a zpracovány pro imunohistochemii. Volně plovoucí řezy byly preinkubovány v blokovacím pufru obsahujícím 0.3% Triton a 3% normální oslí sérum. FosB byl detekován pomocí kozí polyklonální protilátky vytvořené proti N-terminální části proteinu (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 byl detekován pomocí králičí polyklonální protilátky (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Snímky byly pořízeny konfokálním mikroskopem (zvětšení 60x; Zeiss).

Lokomotorická senzibilizace

Všechny myši dostávaly denně IP injekce fyziologického roztoku po dobu 3 dní, aby je navykly na stres injekcí. Následující den byly myším injikovány IP fyziologickým roztokem nebo podlimitní dávka kokainu (7.5 mg / kg; viz bod Zvířata výše) a okamžitě umístěny do nových lokomotorických boxů. Lokomotorická aktivita myší byla zaznamenána za použití systému fotobeamů jako přestávky ambulantního paprsku po dobu 30 min. Tato ošetření byla opakována denně po dobu 3 dnů.

Virově zprostředkovaný přenos genů

Pro přenos genů pomocí virů jsme použili rozsáhle publikované metody [7,8,11,19]. Stručně, expresní plazmidy pro PSMC5 nebo pro několik jeho mutantů (viz konstrukty PSMC5 a AFOSB výše) byly subklonovány do bicistronického p1005 (+) HSV plazmidu exprimujícího GFP pod kontrolou promotoru CMV a PSMC5 nebo jeho mutanty pod mutací Promotor IE4 / 5. Pod anestézií ketaminem (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) byly myši umístěny do stereotaxického přístroje pro malé zvířata a byl vystaven kraniální povrch. Třicet tři kalibrační jehly byly použity k bilaterální infuzi 0.5 μl HSV vektoru do NAc v úhlu 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) rychlostí 0.1 μl / min. Zvířata dostávající injekce HSV se nechala zotavit po 2 dní po operaci před experimentováním.

Statistika

Byly použity ANOVA a t-testy studentů, korigované na více srovnání, s významností nastavenou na p <0.05.

výsledky

PSMC5: nový vazebný partner AFosB

Provedli jsme předběžné experimenty k identifikaci vhodného fragmentu AFosB, který sloužil jako návnada v kvasinkovém dvouhybridním testu bez autoaktivace systému. Holo-ΔFosB indukoval aktivitu reportérového genu sám o sobě, stejně jako N-koncový 1 – 78 aminokyselinový fragment proteinu. N-terminál však zkrátil ΔFosB (Obr. 1A), nazvaný A2AFosB, který postrádá první 78 aminokyseliny proteinu, neměl tento účinek. Proto jsme jako návnadový protein použili A2AFosB.

Pro screening potenciálních vazebných partnerů jsme použili knihovnu mozku myši subklonovanou v pPC86. Identifikovali jsme kandidáty na 11 pro závazné partnery. Ačkoli tyto proteiny zahrnovaly osFosB známé heterodimerizační partnery, c-Jun a JunD (Tabulka 1), nejvíce převládajícím kandidátem zdaleka byl PSMC5. I když to bylo překvapivé, bylo to zajímavé zjištění, protože PSMC5 se v jedné zprávě před lety ukázal jako vazba na c-Fos in vitro [21]. Neexistují však žádné předchozí zprávy o účasti PSMC5 na akci kokainu. Nicméně kvůli síle signálu PSMC5 v kvasinkovém dvouhybridním testu jsme se rozhodli dále studovat možné interakce ΔFosB-PSMC5.

thumbnail
Tabulka 1. Výsledky kvasinkového dvouhybridního screeningu s A2AFosB.

dva: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Nejprve jsme potvrdili fyzikální interakci mezi AFOS a PSMC5, provedli jsme in vitro koimunoprecipitační experimenty. Zjistili jsme, že PSMC5 se značkou FLAG (Obr. 1B), transfekovaný do buněk Neuro 2A, účinně stažený ΔFosB (Obr. 1C). Za druhé, pro identifikaci oblasti v PSMC5, která je zodpovědná za její vazbu na AFOSB, jsme vygenerovali několik mutantů PSMC5 označených FLAG (Obr. 1B) a opakoval koimunoprecipitační experiment. ΔFosB byl účinně stažen N-koncovými 151 aminokyselinami PSMC5 (PSMC5-NT), ale nikoli C-koncovými 172 aminokyselinovými fragmenty proteinu (PSMC5-CT) (Obr. 1C). PSMC5 postrádající svou stočenou cívkovou doménu (PSMC5-ACC) byl také neúčinný při vysrážení AFos. Tato zjištění naznačují, že PSMC5 váže ΔFosB prostřednictvím své domény stočené vinutí (aminokyseliny 27 – 68). Navíc PSMC5 s tagem FLAG nevysrážel mutantní formu AFosB s mutovanou doménou leucinového zipu (AFB-LZM) (Obr. 1C), což naznačuje, že AFosB se buď váže na PSMC5 prostřednictvím této domény, nebo je pravděpodobnější, že pro vazbu PSMC5 je vyžadována heterodimerizace AFosB.

Vazba PSMC5-AFOS v NAc po chronickém podání kokainu

Na základě těchto zjištění in vitro jsme studovali, zda se hladiny PSMC5 v NAc mění v reakci na chronické podávání kokainu. Subcelulární frakcionací a westernovým přenosem jsme zjistili, že chronický kokain zvyšuje jaderné hladiny PSMC5 v této oblasti mozku beze změny cytoplazmatických hladin (Obr. 2A). Tento účinek nebyl pozorován po jednorázových dávkách kokainu (data nejsou uvedena). Dále jsme zkoumali lokalizaci PSMC5 a AFOS v NAc konfokální imunofluorescenční mikroskopií. Analyzovali jsme myši 24 h po poslední opakované dávce kokainu, což je časový bod, kdy je jediným detekovatelným ΔFosB FosB genový produkt (viz Nestler 2008). Našli jsme silnou imunoreaktivitu PSMC5 v NAc, včetně silného jaderného signálu. ~ 85% AFOSB + jader obarvených na PSMC5 (Obr. 2B). Kromě toho jsme provedli koimunoprecipitační experimenty na extraktech NAc a zjistili jsme, že po chronické léčbě kokainem byl ΔFosB účinně stažen anti-PSMC5 protilátkou (Obr. 2C). Naproti tomu analýza NAc naivní na léčivo (po opakovaných injekcích fyziologického roztoku) neodhalila žádný detekovatelný tah FosB dolů (data nejsou uvedena). Tato data jsou v souladu s našimi nálezy v buněčné kultuře a potvrzují, že AFosB a PSMC5 interagují v NAc in vivo.

thumbnail
Obr. 2. Regulace PSMC5 v myší NAc.

 

A. Western blot jaderných a cytosolických frakcí NAc myší léčených denně fyziologickým roztokem nebo kokainem (20 mg / kg) po dobu 7 dnů, se zvířaty analyzovanými 24 hodin po poslední injekci. Kokain zvyšuje hladinu PSMC5 v jádře, ale nikoli v cytosolu. Jako kontroly plnění byly použity histon H3 a ß-aktin, které nebyly ovlivněny kokainem. Data jsou průměrná ± SEM (n = 8–10 / skupina, * p <0.05). B. Společná lokalizace endogenního PSMC5 (zelená) a ΔFosB (modrá) v NAc myší chronicky léčených kokainem jako v AC Jaderné lyzáty myší NAc po chronické léčbě kokainem byly podrobeny imunoprecipitaci s anti-PSMC5 protilátkou nebo myší IgG jako kontrolou , a poté Western blotovány s anti-FosB / AFOSB protilátkou. Obrázek ukazuje interakce PSMC5-ΔFosB v NAc in vivo. Data v B a C byla replikována trojmo v každém ze tří samostatných experimentů.

dva: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 zvyšuje expresi AFosB in vitro

Protože je PSMC5 známým členem proteazomového komplexu, testovali jsme, zda reguluje hladiny AFosB pomocí buněk Rat 1A. Nadměrná exprese PSMC5 neměla žádný vliv na bazální hladiny AFosB, ale způsobila malé, ale významné zvýšení indukce AFosB po stimulaci buněk v séru (Obr. 3A). Podobný trend byl pozorován u FosB s plnou délkou, ale účinek nedosáhl statistické významnosti. Naopak suprese endogenní exprese PSMC5 v krysích 1A buňkách, dosažená použitím siRNA, které cílí na PSMC5, neovlivnila bazální hladiny ΔFosB, ale silně inhibovala indukci ΔFosB sérovou stimulací (Obr. 3B). Podobné účinky byly pozorovány u plné délky FosB. Tato data naznačují, že PSMC5 nepodporuje proteazomální degradaci AFosB, jak by se dalo očekávat jako základní podjednotka proteazomu, ale místo toho je vyžadována pro maximální akumulaci FosB genové produkty in vitro, snad stabilizací proteinů.

thumbnail
Obr. 3. PSMC5 regulace exprese FosB / AFosB v krysích 1A buňkách.

 

A. Buňky krysy 1A byly transfekovány 4 ug PSMC5 nebo kontrolní DNA. Nadměrná exprese PSMC5 neměla žádný účinek na bazální hladiny exprese FosB nebo ΔFosB proteinu, jak bylo stanoveno metodou Western blotting, ale vyvolala malé, ale významné zvýšení indukce ΔFosB stimulací v séru (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Buňky krysy 1A byly transfekovány 5 pmol buď ze dvou siRNA, nebo míchané RNA (kontrola). Obě siRNA účinně snížily hladiny proteinu PSMC5 ve srovnání s kontrolními podmínkami (siRNA # 1, 23 ± 5% kontroly; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Knockdown PSMC5 neměl žádný účinek na bazální hladiny FosB nebo ΔFosB, ale zesílil indukci jak FosB, tak ΔFosB stimulací séra (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

dva: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB a PSMC5 tvoří komplexy s CBP, p300 a BRG1 v NAc

Abychom lépe porozuměli transkripčním mechanismům, kterými by PSMC5 mohl ovlivnit funkci FosB, zkoumali jsme možné další vazebné partnery pro dva proteiny v NAc v podmínkách chronického kokainu. Existuje jedna zpráva, že se PSMC5 váže na CBP - HAT - a zvyšuje acetylaci histonu H3 na proximálním promotoru MHC-II v HeLa buňkách [22]. Navíc myši, které mají nedostatek CBP, vykazují sníženou citlivost na chování vůči kokainu a sníženou acetylaci histonu na FosB promotér [23]. Testovali jsme tedy, zda se PSMC5 může vázat s ΔFosB jako součást komplexů, které také obsahují CBP a možná i další transkripční aktivátory.

Nejprve jsme prokázali, že ΔFosB účinně stáhl jak CBP, tak p300, související HAT, v buňkách Neuro2A (Obr. 4A). Naopak mutantní forma AFOSB leucinového zipu nevykazovala tuto aktivitu. Podobně PSMC5 efektivně stáhl CBP a p300 (Obr. 4B). Je zajímavé, že tento účinek byl také pozorován u PSMC5-ACC, který netáhl AOSF, což naznačuje, že PSMC5 interaguje s CBP a p300 prostřednictvím jiných domén proteinu a nezávisle na jeho vazbě na AFOS.

thumbnail
Obr. 4. FOSB a PSMC5 interagují s CBP, p300 a BRG1 in vitro a in vivo.

 

A. Neuro2A buňky byly transfekovány 2.4 μg MYC-značeného AfosB nebo MYC-značeného AfosB-LZM. Buněčné extrakty byly imunoprecipitovány s anti-CBP nebo anti-p300 protilátkou a precipitáty byly Western bloty se stejnou protilátkou nebo s anti-MYC protilátkou. CBP i p300 interagují s AFOSB a takové interakce vyžadují intaktní leucinový zip. B. Neuro2A buňky byly transfekovány 2.4 μg FLAG-značeného PSMC5 nebo FLAG-značeného PSMC5-ACC. Buněčné extrakty byly imunoprecipitovány s anti-CBP nebo anti-p300 protilátkou a precipitáty byly Western bloty se stejnou protilátkou nebo s anti-FLAG protilátkou. CBP i p300 interagují s PSMC5 a takové interakce nevyžadují doménu CC. C. Jaderné lyzáty myší NAc po chronickém ošetření kokainem byly podrobeny imunoprecipitaci s anti-CBP nebo anti-p300 protilátkou. Následné westernové přenosy výsledných sraženin s anti-FosB / AFosB protilátkou ukázaly endogenní interakce mezi AFOS a CBP / p300. D. Alikvoty stejných jaderných lyzátů byly podrobeny imunoprecipitaci s anti-BRG1 nebo anti-PSMC5 protilátkou, následovalo Western blotování sraženin s anti-FosB / AFOS nebo anti-BRG1 protilátkou. Výsledky ukazují endogenní interakce mezi AFOS a BRG1 a BRG1 a PSMC5. E. Schematické znázornění transkripčního aktivačního komplexu složeného z AfosB: JunD heterodimery interagujících s CBP / p300, BRG1 a PSMC5.

dva: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Aby se potvrdilo, že k těmto interakcím dochází také in vivo, podávali jsme kokain chronicky za účelem indukce hladin AFOS a jaderných PSMC5, poté imunoprecipitovaných NAc extrakty s anti-CBP nebo anti-p300 protilátkami. V souladu s našimi údaji o buněčné kultuře imunoprecipitace CBP nebo p300 účinně stáhla ΔFosB (Obr. 4C). Testovali jsme, zda se BRG1, základní podjednotka remodelačního komplexu SWI-SNF chromatinu, může také vázat na ΔFosB a PSMC5, na základě našeho dřívějšího zjištění, že BRG1 je rekrutován k určitým ΔFosB cílovým genům ve shodě s jejich aktivací v NAc po chronickém kokainu [24]. Zjistili jsme, že imunoprecipitace BRG1 strhla ΔFosB v extraktech NAc a že imunoprecipitace PSMC5 podobně koprecipitovala endogenní BRG1 (Obr. 4D). Dohromady tyto výsledky naznačují, že AFosB-PSMC5 tvoří komplexy v NAc, které také zahrnují CBP / p300 a BRG1 (Obr. 4E).

Nadměrná exprese PSMC5 zvyšuje lokomotorické reakce na kokain

Prominentní vazba PSMC5 s AFOSB v NAc nás vedla k prozkoumání, zda zvyšování hladin PSMC5 v této oblasti mozku reguluje behaviorální reakce na kokain. Vytvořili jsme vektor viru herpes simplex (HSV), který nadměrně exprimuje buď divoký typ PSMC5 nebo jeden z jeho mutantů a validoval vektory v NAc in vivo (Obr. 5A). Virově zprostředkovaná exprese PSMC5 převládá v buněčném jádře (Obr. 5B). Myši nadměrně exprimující divoký typ PSMC5 nevykazovaly změněné odpovědi na počáteční dávky kokainu, ale vykazovaly zvýšenou lokomotorickou aktivaci v reakci na opakované dávky kokainu ve srovnání s kontrolními myšmi exprimujícími GFP. Naproti tomu myši, které nadměrně exprimují mutantní formu PSMC5, která postrádá svou stočenou cívkovou doménu (PSMC5-ACC), tento účinek nevykazovaly (Obr. 5B). Zajímavé je, že nadměrná exprese PSMC5-K196M, která postrádá ATPázovou aktivitu proteinu divokého typu, také zesílila lokomotorické reakce kokainu.

thumbnail
Obr. 5. Nadměrná exprese PSMC5 v NAc zvyšuje lokomotorické reakce na kokain.

 

A. Reprezentativní transgenní exprese zprostředkovaná HSV v mediální NAc. AC, přední komisura. NAc jádrové a skořepinové podoblasti jsou uvedeny na obrázku. B. Reprezentativní vyšší zvětšení (60x) imunohistochemického barvení PSMC5 v neuronech NAc po injekci HSV-PSMC5, což ukazuje, že protein je převážně jaderný, jak je značeno barvením DAPI. C. Myši dostaly dvoustranné injekce HSV do NAc následované denními IP injekcemi podprahových dávek kokainu (7.5 mg / kg). Lokomotorické odpovědi jsou uvedeny v reakci na první a poslední ze 3 denních dávek léku. Nadměrná exprese PSMC5 nebo PSMC5-K196M zvyšuje lokomoční odpovědi na opakovaný kokain, což není účinek, který se u PSMC5-ACC nepozoruje. Nebyl zaznamenán žádný významný účinek transgenů na pohybové odpovědi na počáteční dávky kokainu. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 podle Dunnettova posthoc testu.

dva: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskuse

Výsledky této studie odhalují nový mechanismus, kterým AFOSB zprostředkovává jeho účinky na mozek, a nový mechanismus zapojený do účinku kokainu. Pomocí nezaujatého přístupu, kvasinkového dvouhybridního testu, jsme identifikovali PSMC5 jako nového vazebného partnera pro FosB. Tento nález jsme ověřili jak v kultivovaných buňkách in vitro, tak v NAc in vivo demonstrací robustní vazby PSMC5-AFOSB. Důležité je, že jaderné hladiny PSMC5 jsou indukovány v NAc chronickým podáváním kokainu. Dále jsme ukázali, že k vazbě PSMC5-AFOSB dochází ve shodě s několika dalšími transkripčními aktivačními proteiny, jmenovitě CBP a p300 (dva HAT) a BRG1 (klíčová složka remodelačních komplexů SWI-SNF chromatinu). Naše zjištění společně podporují hypotézu, že PSMC5 je součástí transkripčního aktivačního komplexu, který je rekrutován k alespoň určitým FOSB indukovaným genům v průběhu chronického podávání kokainu (Obr. 4E). V souladu s touto hypotézou je další zjištění, že nadměrná exprese PSMC5 v NAc, stejně jako nadexprese samotného AFosB, podporuje behaviorální reakce na kokain. V budoucích studiích by bylo zajímavé sledovat tato in vivo pozorování charakterizací interakcí PSMC5-AFOSB-HAT-BRG1 pomocí reportérových testů in vitro.

Zapojení PSMC5 do kokainového působení je zcela nové. PSMC5, identifikovaný zpočátku jako člen velké rodiny ATPáz, které obsahují proteazom, prokázal v průběhu let interakce s několika transkripčními faktory, včetně c-Fos, p53, jaderných hormonálních receptorů a složek bazálního transkripčního komplexu [25], v průběhu let však bylo provedeno několik funkčních studií [26]. Jeho nejlépe zavedeným účinkem je podpora aktivity transkripčních faktorů MYC v kultivovaných buňkách [27]. Důsledek PSMC5 v transkripčních mechanismech naznačil potenciální roli pro ubikvitinační-proteazomální aktivitu při regulaci genové transkripce, ale zapojení PSMC5 do takové regulace zůstává doposud prakticky netestováno [28,29].

O funkci PSMC5 v mozku je známo jen velmi málo. Dřívější studie prokázala rozšířenou expresi mRNA PSMC5 v mozku [30], ale jeho funkční aktivita zůstala bez prozkoumání. Naše zjištění nyní podněcují další zkoumání tohoto zajímavého proteinu k lepšímu pochopení jeho úlohy při regulaci transkripce genu a jeho vztahu k ubikvitinační-proteazomální funkci v mozku. Vazba PSMC5 na AFOSB je zprostředkována doménou PSMC5 s coiled-coil. Kromě toho schopnost PSMC5 podporovat lokomotorické odpovědi na kokain, zatímco vyžaduje doménu spirálově vinuté, nevyžaduje aktivitu ATPázy, která je vlastní proteinu. Tyto výsledky zvyšují možnost, že alespoň v našem systému by hlavní aktivita PSMC5 mohla být zprostředkována prostřednictvím vazby na AFos a jiné transkripční regulační proteiny, a nikoli prostřednictvím své proteazomální aktivity jako takové. K přímému testování této a alternativních možností je zapotřebí další práce. Hypotéza, že virově zprostředkovaná nadměrná exprese PSMC5 zvýšila lokomotorické odpovědi na kokain prostřednictvím interakcí s AFOSB, je pravděpodobná, navzdory použití denního režimu léčby kokainem 3, protože je známo, že se v tomto časovém rámci akumulují značné hladiny AFOSB v mozku [3].

Tato zjištění dále zdůvodňují užitečnost použití nezaujatých, otevřených experimentálních přístupů při studiu molekulární podstaty regulace mozku. Naše počáteční pozornost na PSMC5 byla založena pouze na jeho prominentní vazbě na AFosB v kvasinkovém dvouhybridním testu, přesto se zdá, že je důležitou součástí transkripčních změn, které jsou rekrutovány v NAc opakovaným podáváním kokainu. Cílem současného výzkumu je lepší pochopení podrobných mechanismů, kterými jsou kokainem indukovány jaderné hladiny PSMC5 a následně PSMC5 pak přispívá k kokainem indukovaným komplexům transkripční aktivace. Mezitím náš kvasinkový dvouhybridní test odhalil několik dalších domnělých vazebných partnerů AFosB (Tabulka 1), které nyní zaručují přímé zkoumání v modelech kokainu. Tato práce společně přispívá k rostoucímu porozumění komplexním molekulárním mechanismům, kterými kokain mění funkci NAc.

Poděkování

Tato práce byla podpořena granty Národního institutu pro zneužívání drog a Nadace Ishibashi a Japonské společnosti pro propagaci vědy (čísla KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Autorské příspěvky

Koncipovány a navrženy experimenty: YHO YNO EJN. Provedené experimenty: YHO YNO PJK RN. Analyzované údaje: YHO YNO EJN. Přidaná činidla / materiály / analytické nástroje: TN MO OY AN RN TT. Napsal článek: YHO EJN.

Reference

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Okamžité geny: o deset let později. Trendy Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkripční mechanismy závislosti: role deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Zobrazit článek
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Zobrazit článek
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Zobrazit článek
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Zobrazit článek
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Zobrazit článek
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Zobrazit článek
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Zobrazit článek
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Zobrazit článek
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Zobrazit článek
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Zobrazit článek
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Zobrazit článek
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Zobrazit článek
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Zobrazit článek
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Zobrazit článek
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Zobrazit článek
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Zobrazit článek
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Zobrazit článek
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Zobrazit článek
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Zobrazit článek
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Zobrazit článek
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Zobrazit článek
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Zobrazit článek
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Zobrazit článek
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Zobrazit článek
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Zobrazit článek
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Zobrazit článek
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Zobrazit článek
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Zobrazit článek
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Zobrazit článek
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Naděje BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Indukce dlouhodobého komplexu AP-1 složeného ze změněných proteinů typu Fos v mozku chronickým kokainem a jinými chronickými léčbami. Neuron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutantní myši: Ztráta chronické kokainové indukce proteinů souvisejících s Fos a zvýšená citlivost na psychomotorické a odměňující účinky kokainu. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulace stability ΔFosB fosforylací. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Absence konzervované degronové domény C-terminálu přispívá k jedinečné stabilitě AFosB. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Behaviorální a strukturální reakce na chronický kokain vyžadují dopřednou smyčku zahrnující FosB a CaMKII ve skořápce nucleus accumbens. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Exprese transkripčního faktoru FosB v mozku řídí citlivost na kokain. Příroda 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB zvyšuje motivaci k kokainu. J Neurosci 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulace genové exprese a kokainové odměny pomocí CREB a DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Zásadní úloha ΔFosB v jádru accumbens při působení morfinů. Nature Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Indukovatelná exprese dominantního negativního mutanta c-Jun v mozkové oblasti u transgenních myší snižuje citlivost na kokain. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Regulace delta FosB a proteinů podobných FosB pomocí elektrokonvulzivního ošetření záchvatů a kokainu. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Základní úloha genu fosB v molekulárních, buněčných a behaviorálních akcích elektrokonvulzivních záchvatů. J Neurosci 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15. Parkinsonismus MPTP Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) je doprovázen perzistentní expresí proteinu podobného D-FosB v dopaminergních drahách. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Převod eukaryotického transkripčního inhibitoru na aktivátor. Buňka 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, pole S (1991) Dvouhybridní systém: metoda identifikace a klonování genů pro proteiny, které interagují s proteinem, který je předmětem zájmu. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferativní aktivace klidových buněk Rat-1A pomocí delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Zásadní úloha poly (ADP-ribosyl) ation v kokainovém působení. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Odlišné vzorce indukce AFosB v mozku drogami zneužívání. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Savčí Sug1 a c-Fos v jaderném proteazomu 26S. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Regulace acetylace na hlavním histokompatibilním komplexu proximálního promotoru třídy II pomocí proteazomální ATPázy 19S Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) Protein vázající CREB kontroluje odpověď na kokain acetylací histonů na promotoru fosB v myším striatu. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Remodelace chromatinu je klíčovým mechanismem, který je základem plasticity vyvolané kokainem ve striatu. Neuron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Duální funkce pro transkripční regulátory: mýtus nebo realita. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Interakce regulačních podjednotek proteazomu 26S, komplexní problém. Trendy Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implikace systému ubiquitin / proteazomu v myc-regulované transkripci. Buněčný cyklus 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin a proteazomy v transkripci. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteazom: nástroj pro transkripci? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identifikace fylogeneticky konzervovaného člena rodiny Sug1 CAD, který je odlišně exprimován v myším nervovém systému. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5