Cdk5 fosforyluje dopaminový receptor D2 a zeslabuje signalizaci v proudu (2013)

Citace: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y a kol. (2013) Cdk5 fosforyluje dopaminový receptor D2 a zeslabuje signalizaci v proudu. PLoS ONE 8 (12): e84482. dva: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, University of North Dakota, Spojené státy americké

obdržel: Květen 20, 2013; Přijato: Listopad 14, 2013; Publikováno: 31. prosince 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Jedná se o článek s otevřeným přístupem distribuovaný podle podmínek Licence Creative Commons Attribution, který umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci v jakémkoliv médiu za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány.

Financování: Tato práce byla podpořena granty (NRF-2012R1A2A2A01012923 a NRF-2012R1A4A1028200) od korejské vlády (MSIP) a také byla podpořena v rámci programu mezinárodní spolupráce řízeného NRF Koreje (2012K2A1A2033117) a Korejského výzkumného institutu (KBRI) Základní výzkumný program MSIP (2031-415). Společnost SKP byla příjemcem ocenění Young Investigator Awards 2004 a 2006 National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD). Poskytovatelé financování neměli žádnou roli v návrhu studia, sběru a analýze dat, rozhodnutí o publikování nebo přípravě rukopisu.

Konkurenční zájmy: Autoři prohlásili, že neexistují žádné konkurenční zájmy.

Úvod

Dopaminová signalizace je zapojena do různých funkcí mozku, včetně koordinace motorů, kontroly nálady a mechanismů odměňování [1]. Hlavní součást signalizace dopaminů u obratlovců je vyvíjena striatálními středními špinavými neurony (MSN), které selektivně exprimují podskupinu dopaminových receptorů a dostávají dopaminergní vstupy hlavně z ventrální tegmentální oblasti (VTA) a substantia nigra (SN) [2]. Dopaminové receptory jsou receptory spřažené s G proteinem (GPCR) se sedmi transmembránovými doménami a sestávají ze dvou podtypů, Receptory typu D1 a D2, které zprostředkovávají reciproční působení při signalizaci dopaminu [1]. Například dopaminové receptory podobné D1 (D1, D5) aktivují adenylylcyklázu přes G_αs a zvyšují intracelulární hladinu cAMP, ale dopaminové receptory podobné D2 (D2, D3, D4) inhibují adenylylcyklázu prostřednictvím G_αi a sníží intracelulární hladinu cAMP [1], [3].

Mezi receptory dopaminu se receptor D2 (DRD2) podílí na patofyziologii několika významných psychiatrických poruch, včetně schizofrenie a závislosti na drogách [4], takže mnoho antipsychotických léků alespoň částečně cílí na DRD2. Je také známo, že aktivita DRD2 dobře koreluje s důsledky užívání drog ve zvířecích modelech [5]. Účinnost antidepresiv a stabilizátoru nálady byla také spojena se změnami v expresi DRD2 na povrchu buňky nebo intracelulární signalizací navazujícími na PKA, ERK a GSK3 [1], [4], [6]. Navzdory těmto kritickým úlohám pro DRD2 v mozku nejsou podrobně popsány regulační mechanismy, které přinášejí heterogenitu a složitost vlastností DRD2.

Konverzační důkazy naznačují, že při jemném ladění aktivity DRD2 se podílejí více posttranslačních modifikací. Rozsáhlá glykosylace DRD2 byla odhalena v počátečních studiích fotoafinitních značení [7], a tvorba disulfidové vazby v DRD2 byla rovněž identifikována jako důležitá modifikace vazby ligandu [8]. Kromě toho fosforylační místa DRD2 byla nejprve identifikována pomocí in vitro test s radioizotopy, poskytující cesty pro různé regulační cesty zprostředkované různými kinázami [9]. Protein kináza C (PKC) skutečně reguluje mobilizaci intracelulárního vápníku zprostředkovanou DRD2 a moduluje interakce DRD2 s cytoskeletálními proteiny [10]. Fosforylace pomocí GPCR kinázy 2 (GRK2) reguluje agonistově indukované modely resensitizace DRD2 [11].

Cyklin-dependentní kináza 5 (Cdk5) je prolinem řízená serin / threonin kináza, která má preferenční aktivitu v důsledku exprese jeho esenciálních aktivátorů specifických pro mozku, p35 a p39 [12]. Cdk5 se podílí na různých neuronálních procesech, včetně migrace neuronů a vedení axonu, a nulové myši Cdk5 a p35 vykazují defekty v kortikálním rozvrstvení [13]. Nedávno bylo prokázáno, že fosforylace WAVE1 a ephexinu Cdk5 reguluje morfogenezi dendritické páteře [14]. Kromě toho Cdk5 také reguluje hladiny exprese povrchu NMDA proudů zprostředkovaných NMDA, NR2B a NR2A [15], [16]. Je pozoruhodné, že několik důkazů naznačuje důvěrný vztah mezi Cdk5 a dopaminovým systémem. Cdk5 fosforyluje tyrosinhydroxylázu (TH), reguluje její stabilitu a tím udržuje dopaminergní homeostázu [17]. V postsynaptických neuronech, je-li T75 zbytek dopaminu a cyklický-AMP regulovaný fosfoprotein-32kD (DARPP-32) fosforylován pomocí Cdk5, může inhibovat aktivitu PKA a tak antagonizovat dopaminový DRD1 zprostředkovaný PKA signalizaci [18]. Je zajímavé, že když se kokain, nepřímý agonista dopaminových receptorů, podává chronicky u potkanů, zvyšují hladiny mRNA a proteinu Cdk5 ve středních spiny neuronech [19]. Souhrnně se zdá, že Cdk5 se podílí na synaptických adaptacích indukovaných léčivem. V této studii ukazujeme funkční interakce DRD2 a Cdk5, která dále rozšiřuje úlohu Cdk5 v dopaminové signalizaci.

Materiály a metody

Protilátky

Anti-králičí sérum bylo vyvoláno proti peptidům obsahujícím fosfo-serin 321 (pS321) třetí intracelulární smyčky DRD2 (D2i3). Fosfo-peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON) byl použit k vytvoření peptidově konjugované kolony pro afinitní purifikaci (20401, PIERCE). Anti-pS321 protilátka byla obohacena afinitním čisticím systémem podle pokynů výrobce. Purifikovaná fosfo-protilátka byla uložena v PBS s 0.1% azidem sodným a 0.1% želatinou. Pro Western blot a imunocytochemii Cdk5 / p249 byla použita protilátka proti myším anti-Cdk35 protilátka (sc-820) a anti-králičí anti-p5 protilátka (sc-35). Pro imunoprecipitace a Western blotting DRD9996-GFP byla použita protilátka proti myším anti-GFP (sc-2). Anti-králičí anti-FLAG protilátka (sc-807), anti-králičí anti-HA protilátka (sc-805), anti-myší anti-GST protilátka (sc-138) 32293) byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnologies.

Zvířata

Knockout myš p35 byla laskavým darem od Dr. Katsuhiko Mikoshiba v RIKEN Brain Science Institute v Japonsku a používána pro primární kulturu neuronů. Sady primerů pro genotypizaci byly 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC a 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT, jak bylo popsáno výše [20]. ICR myši a krysy Sprague Dawley byly použity pro přípravu lyzátu mozku. Všechny postupy na zvířatech byly schváleny Výborem pro vědeckou a technickou péči o instituce pro péči o zvířata a technologie v Pohangu.

Plazmidové konstrukty

Byla použita lidská dlouhá isoforma DRD2 v plazmidovém vektoru EGFP-N1 a třetí intracelulární smyčka DRD2 (aminokyselinové zbytky 212-373 včetně dalších aminokyselinových zbytků 29 jedinečných pro dlouhou isoformu DRD2) v plazmidovém vektoru pFLAG-CMV-2. Lidský Cdk5 byl vložen do plazmidového vektoru pCMV-HA a lidský p35 byl vložen do plasmidového vektoru pcDNA 3.1. Lidský Cdk5 byl vložen pod promotor cytomegaloviru (CMV) společně s lidským p35 ve vektoru pcDNA 3.1, aby se vytvořil duální expresní konstrukt (Cdk5 / p35) pro imunocytochemii, test internalizace receptoru,³⁵S] -GTP_γS vazebného testu, radioligandového vazebného testu a enzymového imunoanalýzy cAMP.

In vitro Kinázový test

IP-linked in vitro kinázový test byl proveden následujícím způsobem. Jeden celý mozkový mozek byl lyžován v lyzátovém pufru 3 ml erytrocytů (ELISA) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) pomocí 20 míchání homogenizátoru Dounce za vzniku homogenizovaných mozkových lyzátů . Lyzáty byly inkubovány na ledu na 30 min, sonikovány a centrifugovány při 16,000X g pro 10 min. Supernatanty byly imunoprecipitovány anti-králičí protilátkou proti p35, aby se získal aktivní komplex Cdk5 / p35. Cdk5 / p35 komplexní a purifikovaný fúzní protein GST byl smíchán s adenosinem 5'-triposfátem, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) a inkubovány v kinázovém pufru (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) pro 1 h při pokojové teplotě [18], [21]. Čištěný komplex Cdk5 / p25 (14-516, Millipore) byl také použit pro in vitro kinázového testu, jak je popsáno výše. Do reakční směsi byl přidán nástřikový pufr 2 × pro naplnění vzorku a směs byla vařena při teplotě 100 ° C. Vzorky byly potom podrobeny SDS-PAGE a vysušený gel byl hodnocen autorádiografií.

Tekutá chromatografie (LC) - hmotnostní spektrometrie (MS) / MS analýza

Rekombinantní protein GST-D2i3 byl analyzován pomocí LC-MS / MS po IP-vazbě in vitro kinázového testu. Provedli jsme peptidovou identifikaci dat LC-MS / MS pomocí X !! Tandem (verze Dec-01-2008). Každý RAW datový soubor byl nejprve převeden na mzXML pomocí trans-proteomického potrubí (TPP, verze 4.3). MS / MS skenování v převedených mzXML byly poté podrobeny zkoumání na databázi UniProt myších proteinových sekvencí (uvolnění 2010_07) včetně sekvence GST-D2i3 za použití X !! Tandemu. Tolerance byla nastavena na 3 Da pro prekurzorové ionty a 2 Da pro ionty fragmentů. Byl použit specifický enzym pro trypsin. Pro karbamidomethylaci cysteinu (57.021 Da), oxidaci methioninu (15.995 Da), hydrolýzu asparaginu (0.987 Da) a fosforylaci serinu (79.966 Da) byla použita variabilní modifikace.

Imunoprecipitace

Imunoprecipitace byla provedena na buněčných lyzátech v lyzačním pufru ELB. Do lyzátů byla přidána protilátka proti GFP a inkubována při 3 h při 4 ° C. Imunokomplexy byly purifikovány za použití agarózy s proteinem-A. Sraženiny byly inkubovány s naplňovacím pufrem pro vzorek SDS pro 30 min při 37 ° C a podrobeny SDS-PAGE a Western blotům.

GST Pull-down Assay

10 μg purifikovaného GST a GST-D2i3 bylo inkubováno s krysím mozkovým lyzátem pro 1.5 h při 4 ° C. Bylo přidáno 30 μl perliček Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare) konjugovaných s glutathionem (GSH), ekvilibrovaných lyzačním pufrem a inkubovány další 1 h. Perličky byly shromážděny centrifugací při 2,000xg a promyty lýzovým pufrem 4 krát [22], [23]. Sraženiny byly analyzovány metodou Western blot za použití protilátek anti-Cdk5 a anti-p35.

Imunocytochemie

Transfekované HEK 293 buňky a striatální neurony kultivované na krycích sklíčkách byly jednou promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a fixovány ponořením do studeného 4% paraformaldehydu / PBS pro 30 min. Primární protilátka byla zředěna v blokovacím roztoku (2% koňského séra a 1% Triton X-100 v PBS). Jako sekundární protilátky byly použity konjugované anti-myší protilátky konjugované s Alexafluorem-647 (A20990, Invitrogen) a protilátka proti králičím konjugovaná s Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen). Hoechst byl použit pro barvení jádra. Snímky byly získány konfokální mikroskopií (Olympus, FluoView-1000).

Test internalizace receptoru

Po transfekci 24 h byly buňky ošetřeny 1 μM chinpirolem (Q102, Sigma) pro 30 min a 90 min při 37 ° C. Buňky byly resuspendovány v 2 ml studeného PBS a pro každou reakci byly použity alikvoty 200. Léčba léčiva byla prováděna při pokojové teplotě pro 3 h v následujících koncentracích; 3 nM [³H] -spiperonu (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpirid (895, TOCRIS), 10 μM haloperidolu (H1512, Sigma). Hydrofobní [³H] -spiperon byl použit pro označení celkově exprimovaných receptorů a hydrofilní sulpirid byl použit pro nahrazení membránového receptoru vázaného [³H] -spiperonových signálů. Recepční signály spojené s membránou byly vypočteny odečtením hodnot intracelulárních receptorů z hodnot celkových exprimovaných receptorů. Buňky byly filtrovány na filtru GF / B (Millipore) a promyty 3 časy promývacím pufrem (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtry byly vysušeny a zbytková radioaktivita byla měřena za použití kapalinového scintilačního čítače [24].

Příprava buněčné membrány

Souvislé buňky v kultivačních miskách 100 mm po transfekci byly promyty ledově chladným PBS a sklizeny v pufru 1 ml HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Homogenizované lyzáty byly centrifugovány s 500 x g pro 15 min a supernatanty byly následně centrifugovány s 36,000 x g pro 30 min. Pelety resuspendované v pufru HME byly použity pro testy.

[³⁵S] -GTP_γS testu vazby

Frakce buněčné membrány byly předinkubovány s 1 uM chinpirolem (Q102, Sigma) v testovacím pufru (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA a 0.01 mM GDP) pro 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) byl přidán do konečné koncentrace 3 nM v 30 uL a dále inkubován pro 90 min. 170 uL ledově chladného pufru (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂a 0.1 mM GTP), aby se reakce zastavila. Membrány byly filtrovány na filtru GF / B (Millipore) a promyty 3 časy promývacím pufrem (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtry byly vysušeny a radioaktivita byla měřena s použitím scintilačního čítače [25], [26].

Test vazby radioligandů

Připravené buněčné membrány byly inkubovány s 0.01 nM [³H] -spiperonu (NET-565, PerkinElmer) a zvyšující se koncentrace quinpirole (Q102, Sigma) pro 30 min v testovacím pufru (25 mM HEPES (pH 7.5)₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membrány byly filtrovány na filtru GF / B (Millipore) a promyty 3 časy promývacím pufrem (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reakce byla ukončena rychlou filtrací přes filtry GF / C. Zbytková radioaktivita byla měřena za použití kapalinového scintilačního čítače [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Transfekované buňky HEK 293 byly předem ošetřeny pomocí 10 μM rolipramu (R6520, Sigma) pro 1 h a poté ošetřeny 0.1 μM forskolinem (F6886, Sigma) a rostoucími koncentracemi quinpirole (Q102, Sigma) pro 30 min. Primární kultivované striatální neurony byly ošetřeny 10 μM rolipramem pro 1 h a potom 1 μM dopaminem pro 1 h [22]. Buněčné lyzáty byly připraveny pomocí 0.1 M HCl a hladiny cAMP byly detekovány pomocí cAMP enzýmového imunoanalýzovací soupravy (Sapphire Bioscience) podle pokynů výrobce.

Primární kultivovaný neuron

Striatální oblast byla izolována z myšího embryonálního mozku (E15). Rozptýlená tkáň se disociovala v minimálním základním médiu (MEM) (11095, Invitrogen) obsahujícím 0.25% trypsinu (T4549-100, Sigma) a 0.1% DNázu I pro 6 min při 37 ° C. Buňky byly opětovně suspendují v plating media (MEM s 0.01 M HEPES (pH 7.4) a 10% (obj. / Obj.) Konského séra (16050-122, GIBCO)). Neurony byly kultivovány pro 7 dny in vitro (DIV 7) v přípravku MEM s doplňkem B27 (17504-044, Invitrogen) před aplikací na enzymové imunoanalýzy cAMP.

výsledky

Cdk5 fosforyluje serin 321 ve třetí intracelulární smyčce DRD2 in vitro

K identifikaci nových substrátů Cdk5 jsme provedli systematické vyhledávání pomocí (S / T) PX (K / H / R) jako sekvence Cdk5 rozpoznávání konsenzu [30] a identifikoval DRD2 jako kandidátský substrát. Konsenzuální sekvence, včetně serinu 321, je umístěna ve třetí intracelulární smyčce DRD2 (D2i3), kde byly implicovány různé regulační mechanismy [3], [10], [11]. Sekvence je evolučně konzervována u DRD2 u obratlovců, což znamená funkční význam zbytku (Obr. 1A).

Stáhnout:   

• PPT

  Powerpointový snímek

• PNG

  větší obrázek (2.08MB)

• TIFF

  původní obrázek (4.36MB)

Obrázek 1. Cdk5 fosforyluje serin 321 ve třetí intracelulární smyčce DRD2 in vitro.

(A) Zarovnání sekvence aminokyselin ukazující konzervované oblasti DRD2 z různých druhů (stínované). Potenciální fosforylační místo Cdk5 je označeno hvězdičkou. (B) IP-linked in vitro kinázového testu s rekombinantními mutantními proteiny GST-D2i3 a GST-D2i3. Komplex Cdk5 / p35 obohacený extraktem myšího mozku pomocí imunoprecipitace proti p35 byl použit pro kinázové reakce. Autorádio fosforylovaných proteinů je ukázáno spolu s barvením Coomassie brilantní modrou barvou stejného gelu. Šířka šipky indikuje radioaktivní signál odpovídající GST-D2i3s a otevřená šipka ukazuje radioaktivní signály z p35. (C) MS / MS spektrum fosforylovaného peptidového fragmentu D2i3. Teoretické fragmentační vzorce jsou uvedeny pod spektrem. Ze všech fragmentových iontů jsou detekovány y- a b-ionty v spektru. Oni₆ a y₇ ionty silně indikují fosforylaci serinu 321. (D) In vitro kinázového testu s purifikovaným komplexem Cdk5 / GST-p25 za použití mutantních proteinů GST-D2i3 a GST-D2i3. Fosforylované proteiny byly ukázány v autoradiografu společně s barvením Coomassie brilantní modrou. Šířka šipky označuje rádioaktivní signál odpovídající GST-D2i3 a otevřená šipka ukazuje radioaktivní signály z GST-p25.

dva: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Za účelem posuzování kapacity Cdk5 k fosforylaci D2i3 jsme provedli IP-spojení in vitro kinázových testů za použití aktivního komplexu Cdk5 / p35 obohaceného z myšího mozkového lyzátu imunoprecipitací p35 s purifikovanými rekombinantními proteiny GST-D2i3 (aminokyselinové zbytky 212-373) jako substráty. Pozorovali jsme fosforylační signály v purifikovaných proteinech GST-D2i3 a GST-D2i3 S297A, ale signál byl významně snížen použitím GST-D2i3 S321AObr. 1B). Pro další ověření fosforylace serinu 321 v GST-D2i3 jsme provedli LC-MS / MS analýzu vzorků z IP-spojených in vitro kinázových testů s použitím LTQ XL hmotnostní spektrometrie. Konzistentně byly získány fosfo-peptidy odpovídající hmotnosti fosfo-serinových 321 peptidů (Obr. 1C). Vezmeme-li v úvahu, že datově závislé získávání během analýzy LC-MS / MS má tendenci detekovat bohaté proteiny ve vzorku [31], tyto údaje naznačují, že serin 321 zbytek je dominantním fosforylačním místem Cdk5 v oblasti D2i3. Prokázat přímou fosforylaci serinu 321 v GST-D2i3 pomocí Cdk5, in vitro kinázového testu s použitím purifikovaného komplexu Cdk5 / GST-p25 s purifikovanými rekombinantními proteiny GST-D2i3. Identifikovali jsme významný fosforylační signál v GST-D2i3, který chyběl v GST-D2i3 S321A (Obr. 1D). Společně tyto výsledky naznačují, že zbytek D2i3 S321 je preferenčním cílem pro fosforylaci zprostředkovanou Cdk5.

Cdk5 fosforyluje serin 321 ve třetí intracelulární smyčce DRD2 v buňkách

K identifikaci fosforylace serinu 321 jsme vyvinuli protilátku specifickou pro fosfo-serin 321 (pS321). Vzorky z připojení IP in vitro kinázového testu byly analyzovány Western blot za použití protilátek proti pS321. Bloty vykazovaly v kinázové reakci odlišné pásmo, které bylo závislé na GST-D2i3 (Obr. 2A). Pro ověření potenciální fosforylace serinu 321 v DRD2 pomocí Cdk5 v buňkách byly analyzovány imunoprecipitáty anti-GFP z buněk HEK 293 exprimujících DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s nebo bez HA-Cdk5 a p35 pomocí Western blot za použití anti-GFP a protilátek proti pS321. Charakteristické rozmazané pásové signály protilátek proti GFP, o nichž je známo, že jsou způsobeny nadměrnou glykosylací DRD2, jsou pozorovány pouze za přítomnosti DRD2-GFP a anti-pS321 protilátka detekovala podobné signály DRD2 pouze s expresí Cdk5 / p35 coObr. 2B) [7]. Pro další ověření fosforylace serinu 321 pomocí Cdk5 byly vytvořeny D2i3 (FLAG-D2i3) a mutantní forma D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 a FLAG-D2i3 S321A exprimované s nebo bez HA-Cdk5 a p35 v buňkách HEK 293 byly analyzovány pomocí SDS-gel mobility shift assay. Pro FLAG-D5i2 byl pozorován významný posun mobility závislá na Cdk3, ale ne pro FLAG-D2i3 S321A (Obr. 2C). Také jsme hodnotili hladinu fosforylace DRD2 u Ser321 po stimulaci agonisty. Buňky HEK 293 exprimující komplex DRD2-GFP a Cdk5 / p35 byly stimulovány chinpirolem a imunoprecipitáty anti-GFP z buněčných lyzátů byly analyzovány Western blot za použití protilátek anti-GFP a anti-pS321. Bylo zjištěno, že fosforylace DRD5 zprostředkovaná Cdk2 u Ser321 nebyla ovlivněna stimulací agonisty, která se jeví odlišná od fosforylace zprostředkované GRK a PKC (Obr. 2D) [32], [33]. Společně tyto výsledky naznačují, že Cdk5 může fosforylovat serin 321 zbytek DRD2 v buněčném prostředí.

Stáhnout:   

• PPT

  Powerpointový snímek

• PNG

  větší obrázek (1.92MB)

• TIFF

  původní obrázek (3.5MB)

Obrázek 2. Cdk5 fosforyluje serin 321 ve třetí intracelulární smyčce DRD2 v buňkách.

Cdk5-zprostředkovaná fosforylace serinu 321 byla analyzována za použití protilátek proti pS321. (A) Vzorky z připojení IP in vitro kinázového testu s použitím proteinů GST-D2i3 byly analyzovány Western blotting (WB) s indikovanými protilátkami. Šipky označují GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP byly exprimovány s nebo bez HA-Cdk5 a p35 v buňkách HEK 293. Anti-GFP imunoprecipitáty byly analyzovány Western blot za použití protilátek anti-GFP a anti-pS321. Konzola označuje signály DRD2 a otevřená šipka ukazuje nešpecifické signály z anti-GFP imunoprecipitátů. '% vstup' je% objemu celkového lyzátu pro IP reakci. Slabé endogenní signály Cdk5 byly označeny hvězdičkami. (C) Posouzení pohyblivosti gelu. Buněčné buňky HEK 293 transfektované, jak bylo naznačeno, byly analyzovány metodou Western blot. (D) Transfekované buňky HEK 293 byly ošetřeny chinpirolem a imunoprecipitáty anti-GFP byly analyzovány Western blotováním s protilátkami anti-GFP a anti-pS321. Otevřená šipka ukazuje nešpecifické signály z anti-GFP imunoprecipitátů.

dva: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex a DRD2 jsou fyzicky sdružené

Zkoumali jsme možnou fyzickou interakci mezi komplexem Cdk5 / p35 a DRD2, protože je známo, že mnoho substrátů Cdk5 je fyzicky spojeno s komplexem Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Nejprve byl proveden experiment GST. Purifikovaný rekombinantní protein GST-D2i3 byl inkubován s krysím mozkovým lyzátem a sraženiny GST sraženiny byly analyzovány pro Western blot. Jak je uvedeno v Obr. 3A, endogenní Cdk5 a p35 byly identifikovány ve sraženinách, což naznačuje fyzickou interakci mezi DRD2 a komplexem Cdk5 / p35 (Obr. 3A). Navíc HA-Cdk5 a p35 byly detekovány v anti-GFP imunoprecipitátech z buněčných lyzátů HEK 293 exprimujících DRD2-GFP a Cdk5 / p35 (Obr. 3B). Kromě toho jsme provedli imunocytochemické analýzy a pozorovali, že DRD2-GFP, HA-Cdk5 a p35 vykazují významné lokalizační signály v membránové oblasti buněk HEK 293 (Obr. 3C, horní panely). Také jsme zkoumali společnou lokalizaci DRD2 a Cdk5 / p35 v neuronovém kontextu. DRD2-GFP také důsledně prokázal významnou lokalizaci s endogenními Cdk5 a p35 v kultivovaných striatálních neuronech (DIV7), dále podporující funkční vazby mezi DRD2 a Cdk5 / p35 (Obr. 3C, spodní panely). Výsledky naznačují, že DRD2 a Cdk5 / p35 mohou tvořit komplex, a tak podporují myšlenku, že DRD2 je fyziologickým substrátem Cdk5.

Stáhnout:   

• PPT

  Powerpointový snímek

• PNG

  větší obrázek (3.91MB)

• TIFF

  původní obrázek (5.35MB)

Obrázek 3. Cdk5 / p35 může vytvářet komplex s DRD2.

(A) test GST s využitím purifikovaného rekombinantního proteinu GST-D2i3 s extraktem mozku krys. Sraženiny GST shluku byly podrobeny analýzám Western blotting. "Bead" označuje srážecí sraženinu bez proteinů GST. (B) Imunoprecipitace komplexu DRD2 a Cdk5 / p35. Anti-GFP IP z lyzátů z transfekovaných buněk byly podrobeny Western blottingovým analýzám. Konzola označuje signály DRD2 a otevřená šipka ukazuje nešpecifické signály z anti-GFP imunoprecipitátů. Přeexponovaná skvrna pro vstupy je také zobrazena vpravo. (C) Imunocytochemické analýzy DRD2 a Cdk5 / p35. HEK 293 buňky exprimující DRD2-GFP a Cdk5 / p35 byly zafarbené protilátkami anti-Cdk5 a anti-p35 (horní panely). DRD2-GFP byl exprimován samotný v kultivovaných striatálních neuronech a barven protilátkami anti-Cdk5 a anti-p35 (spodní panely). Hoechst byl použit pro barvení jádra. Bar měřítka je 5 μm. Všechny snímky byly získány pomocí konfokální mikroskopie (Olympus, FluoView-1000).

dva: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-zprostředkovaná fosforylace DRD2 zeslabuje aktivitu receptoru

Bylo zjištěno, že fosforylace moduluje kritické vlastnosti GPCR, jako je vazba G proteinů, internalizace receptorů, intracelulární lokalizace a souvislost s modulačními proteiny [9], [11], [24]. internalizace receptorů indukovaných gonisty je kritickým regulačním procesem signální transdukce. Vyšetřili jsme Cdk5 zprostředkovanou modulaci internalizace DRD2. HEK 293 buňky exprimující DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s nebo bez Cdk5 / p35 byly inkubovány s 1 μM chinpirolem za účelem indukce agonisty stimulované internalizace DRD2Obr. 4A). [³H] -spiperonové signály buněk exprimujících DRD2-GFP byly výrazně sníženy při léčbě 30 min chinpirole a byly získány při min. 90. Je zajímavé, že [³H] -spiperonové signály buněk exprimujících DRD2-GFP a Cdk5 / p35 byly rovněž sníženy při léčbě 30 min quinpirole, ale nebyly získány při 90 min (Obr. 4A, druhá část). Na druhou stranu, [³H] -spiperonové signály buněk exprimujících DRD2 S321A-GFP byly sníženy na minuty 30 a byly získány v 90 min, bez ohledu na koexpresi s Cdk5 / p35. Předchozí studie ukázaly, že internalizovaný DRD2 se recykluje zpět na plazmatickou membránu po prodloužené stimulaci agonisty [11]. Tzdá se, že Cdk5-zprostředkovaná fosforylace DRD2 je zapojena do procesů resensitizace po internalizaci DRD2 indukovanou agonistou.

Stáhnout:   

• PPT

  Powerpointový snímek

• PNG

  větší obrázek (387KB)

• TIFF

  původní obrázek (1.31MB)

Obrázek 4. Cdk5-zprostředkovaná fosforylace zmírňuje povrchovou expresi DRD2 a následnou signalizaci.

(A) DRD2 povrchový výraz měřený [³H] -spiperonu. Transfekované buňky HEK293 byly stimulovány 1 μM chinpirolem pro stanovený čas a odebrány, následované 3 nM [³H] -spiperonové ošetření po dobu 3 hodin. Byla měřena radioaktivita a byly počítány povrchové signály. Chybové sloupce představují průměr ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; jednosměrná ANOVA s postnetovým testem Dunnett: porovnat všechny sloupce vs. kontrolní sloupec). (B) [³⁵S] -GTP_γS vazebného testu. Buněčné membrány byly připraveny z buněk transfekovaných, jak je uvedeno. Membránové preparáty byly inkubovány s 1MM chinpirolem a poté s 3 nM [³⁵S] -GTP_γS po dobu 90 minut. Chybové sloupce představují průměr ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; jednosměrná ANOVA s postferickým testem Bonferroni: porovnejte všechny páry sloupců). (C) Chinpirol konkurující [³H] -spiperonu. Membránové preparáty z transfekovaných buněk byly inkubovány s 0.01 nM [³H] -spiperon a zvyšující se koncentrace chinpirolu po dobu 30 minut. Nelineární regrese byla získána GraphPad. Chybové pruhy označují průměr ± SE (n = 3). (D) cAMP enzymové imunotesty v transfekovaných buňkách HEK 293. Transfekované buňky byly předem ošetřeny 10 uM rolipramu po dobu 1 hodiny a následně společně ošetřeny 0.1 uM forskolinu a zvyšujícími se koncentracemi chinpirolu po dobu 30 minut. Nelineární regrese byla získána GraphPad. Chybové pruhy představují průměr ± SE (n = 4; ** p <0.01; dvoustranný) t-testy). (E) Kultivované striatální neurony z divokého typu a embryí knockout p35 (DIV 7) byly ošetřeny 10 μM rolipramem pro 1 h a následně 1 μM dopaminem pro 1 h. Chybové čárky představují střední ± SE (n = 4; **p<0.01; dvoustranný t-testy).

dva: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Dále jsme vyhodnotili potenciální změnu agonisticky stimulované G proteinové vazby na DRD2 spojenou s fosforylací zprostředkovanou Cdk5 použitím [³⁵S] -GTP_γS vazebného testu [25], [26]. DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s nebo bez Cdk5 / p35 byly exprimovány v buňkách HEK 293. Membrány byly připraveny a stimulovány 1 μM chinpirolem a dále umožněny [³⁵S] -GTP_γS začlenění. DRD2-GFP a Cdk5 / p35 exprimující buněčnou membránu vykazovaly významně sníženou [³⁵S] -GTP_γS ve srovnání se všemi ostatními buněčnými membránami (Obr. 4B). Tyto výsledky ukazují, že fosforylace zprostředkovaná Cdk5 down-reguluje vazbu G-proteinu stimulovaného agonisty u DRD2.

Navíc, quinpirole-konkurenční [³H] -spiperonové vazebné testy, aby se zjistila jakákoliv potenciální změna agonistické afinity na DRD2 pomocí fosforylace zprostředkované Cdk5. Konkurenční vazba [³H] -spiperonu při ošetření zvyšujících se koncentrací chinpirolu na membránovém přípravku z transfekované látky. Konkurenční vazba quinpirolu a [³H] -spiperonu u DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP provedl podobný záznam_i (-9.789 pro DRD2-GFP; -9.691 pro DRD2 S321A-GFP), což naznačuje, že afinita ligandu k DRD2 není významně ovlivněna fosforylací zprostředkovanou Cdk5 u DRD2 (Obr. 4C).

Cdk5-zprostředkovaná fosforylace dolů reguluje signalizační dráhu DRD2-cAMP

Dále jsme zkoumali, zda modifikace DRD2 pomocí Cdk5 ovlivňuje downstream signalizační cesty. Monitorovali jsme DRD2-zprostředkovanou inhibici produkce cAMP vyvolané forskolinem pomocí adenylylcyklázy v buňkách exprimujících DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP za použití cAMP enzýmové imunoanalýzy. Buňky exprimující DRD2 vykazovaly snížené hladiny cAMP v odezvě na chinpirole způsobem závislým na dávce. Pozoruhodně, koexprese Cdk5 / p35 významně snížila maximální inhibici tvorby cAMP (Obrázek 4D, levý panel). Na druhé straně v buňkách exprimujících DRD2 S321A-GFP byly formace cAMP účinně inhibovány jako odpověď na léčbu chinpirolem bez ohledu na expresi Cdk5 / p35 (Obrázek 4D, pravý panel). Tyto výsledky ukazují, že fosforylace DRD5 zprostředkovaná Cdk2 zeslabuje inhibiční aktivitu DRD2 na downstream cAMP signalizační dráze. Pro další potvrzení těchto jevů ve fyziologicky relevantnějším prostředí jsme využili primárně kultivovaných neuronů z vyřazených embryí s nedostatkem p35, což je základní aktivátor Cdk5. Primární kultivované striatální neurony byly ošetřeny dávkou 1 μM dopaminu a analyzovány pomocí enzymového imunoanalýzy cAMP. Neurony od myší s p35 knockout vykazovaly sníženou hladinu cAMP ve srovnání s divokými neurony, když byly stimulovány dopaminem (Obr. 4E). Tspolečně jsme dospěli k závěru, že Cdk5-zprostředkovaná fosforylace DRD2 vede ke snížení inhibičního tónu na cAMP dráze vyvinuté DRD2.

Diskuse

Identifikovali jsme DRD2 jako nový substrát Cdk5. Zdá se, že fosforylace omezuje povrchovou expresi DRD2 tím, že ovlivňuje osud DRD2 po internalizaci receptoru, čímž se snižuje DRD2 G_ikondenzace a downstream cAMP dráhy. Protože fosforylační zbytek S321 existuje jak v dlouhých, tak krátkých izoformách DRD2, mechanizmus navržený v této studii může být obecným způsobem regulace v DRD2-zprostředkované signalizaci.

DRD2 ve středních spiny neuronech byl nejen považován za hlavní podtyp receptoru dopaminu, ale byl také uznán za svou citlivost na změny dostupnosti v reakci na environmentální podněty. Agonistově indukovaná desenzitizace a resensitizace DRD2 byla rozsáhle studována [11], [24]. Konkrétně řada studií ukázala, že účinky chronické psychostimulantové expozice, jako je kokain a amfetamin, které zvyšují extracelulární hladinu dopaminu v striatální synapsi, jsou doprovázeny dynamickými změnami DRD2 postsynapticky [36]. Chronickým uživatelům kokainu je známo, že mají snížené hladiny DRD2 v striatální oblasti a dostupnost DRD2 v nucleus accumbens (NAcc) vykazuje negativní korelaci s chováním léku a zesilováním u myší a primátů [37]-[39]. Tato zjištění ukazují, že funkčnost DRD2 je vysoce náchylná k adaptivní nebo kompenzační regulaci v reakci na různé podněty včetně chronické expozice léku. Naše výsledky ukazují, že zbytek S321 ve třetí intracelulární smyčce DRD2 může být fosforylován Cdk5, což vede k poklesu inhibičního vlivu DRD2 na cAMP dráhu. Tato interakce navrhuje nový regulační mechanismus spojený s Cdk5 u dopaminoceptivních neuronů, který by mohl být spojen s dynamickou povahou DRD2 povrchové dostupnosti.

Je třeba poznamenat, že Cdk5 je známo, že je klíčovou složkou při zprostředkování adaptivních změn neuronového prostředí. Například strukturální a funkční změny dendritických trnů v neuronech v limbickém okruhu jsou jedním z důsledků opakované expozice psychostimulantu [40]. Tyto změny jsou doprovázeny různými molekulárními změnami zahrnujícími indukci proteinu vázajícího element cAMP odpovědi (CREB) a ΔFosB, transkripčních faktorů, které vykazují trvalou regulaci v reakci na chronické podávání kokainu [41], [42]. Důležité je, že Cdk5 je cílem objektu ΔFosB [19], a mnoho kritických složek podílejících se na dynamice dendritické páteře, jako je PSD-95, p21 aktivovaná kináza (PAK), β-katenin a spinofilin, byly hlášeny jako substráty Cdk5 [43]-[46]. Konzistentně, genetická nebo farmakologická manipulace aktivity Cdk5 vyvolává změny morfologie dendritické páteře a reakce na chování kokainu, což znamená kritické role pro Cdk5 v molekulárních a morfologických změnách mezolimbických dopamínových okruhů [47], [48]. Naše výsledky, které ukazují, že DRD2 je novým cílem Cdk5u, poskytuje další náhled na adaptivní změny dopaminového systému v reakci na chronickou expozici léčiva z důvodu následné zvýšené regulace Cdk5 zprostředkované ΔFosB, může indukovat tonické zvýšení fosforylace DRD2 . Kromě toho je známo, že DRD2 ovlivňuje četné buněčné procesy, včetně regulace cest cAMP a MAP kinázy a downstreamových transkripčních událostí [42], [49]. Zjištění v této studii tedy nemusí představovat pouze přímou regulaci DRD2 pomocí Cdk5, ale také poskytnout nový pohled na adaptivní reakce dopaminového systému na chronickou expozici léčiva.

Autorské příspěvky

Koncipoval a navrhl experimenty: JJ YUP DH SKP. Provedly experimenty: JJ YUP DKK YK. Data byla analyzována: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Přidané činidla / materiály / analytické nástroje: YHS. Napsal papír: JJ SKP.