Prefrontální akumbalový katecholaminový systém určuje motivační povahu výnosu jak pro odměny, tak pro stimuly související s averzí. (2007)

Proc Natl Acad Sci US A. 2007 Mar 20; 104 (12): 5181-6. Epub 2007 Mar 9.

Ventura R, Morrone C, Puglisi-Allegra S.

Zdroj

Nadace Santa Lucia, Evropské centrum pro výzkum mozku (CERC), Via del Fosso di Fiorano 65, Řím 00143, Itálie. [chráněno e-mailem]

Abstraktní

Nedávné důkazy naznačují, že odměňující a averzivní podněty ovlivňují stejné oblasti mozku, včetně mediální prefrontální kůry a jádra. Přestože je známo, že nucleus accumbens reaguje na výrazné podněty, bez ohledu na hedonickou valenci a selektivně zvýšeným uvolněním dopaminu, je málo známo o úloze prefrontální kůry v motivaci související s odměnou a odmítáním nebo o neurotransmiterů, kterých se to týká. Zjistili jsme, že selektivní deplece norepinefrinu v mediálním prefrontálním kortexu myší zrušila zvýšení uvolňování norepinefrinu v prefrontální kůře a dopaminu jádrem accumbens, které je vyvoláno potravou, kokainem nebo chloridem lithným, a narušilo kondicionování místa indukované jak lithiem chlorid (averze) a potraviny nebo kokain (přednost). To je důkazem toho, že přenos prefrontalového kortikálního norepinefrinu je nezbytný pro motivační příznaky, které se vztahují k stimulaci odměňování a aversionů prostřednictvím modulace dopaminu v nucleus accumbens, což je oblast mozku zapojená do všech motivovaných chování.

Zvířata i lidé mají tendenci hledat odměny a vyhýbat se trestům. Toto jasně adaptivní chování zahrnuje schopnost reprezentovat hodnotu odměňování a potrestání podnětů, stanovit předpovědi o nich a použít tyto předpovědi k vedení chování (1). Pokud emoce mohou být definovány jako "státy vyvolané posilujícími (odměny a punishers)" (2), pochopení oblastí mozku, které se podílejí na zpracování motivačně významných odměňujících nebo averzních podnětů, může být relevantní pro pochopení četných emočních deficitů u lidí.

Nedávné údaje naznačují, že jádro accumbens (NAc) a prefrontální kůra (pFC) tvoří společný substrát pro zpracování jak odměřujících, tak i averzních podnětů (3-7). Ventrální striatum (nebo NAc) se podílí na zpracování informací, které jsou základem motivační kontroly cílového chování, a studie na lidských a zvířecích studiích podporují obecnou úlohu v oblasti mozku při zpracování obohacujících a averzních podnětů bez ohledu na valence (3-8 ).

Navíc, velké množství důkazů naznačuje, že pFC je přímo zapojen do chování zaměřeného na cíle, stejně jako k afektivnímu zpracování (1, 9). Avšak i když dopaminový přenos v NAc byl navržen k tomu, aby zprostředkoval sdílený proces "motivačního výpadku" v pozitivní a negativní valence (3, 6), úloha pFC v tomto procesu a příslušný neurochemický substrát jsou dosud neznámé.

Přenos norepinefrinu v pFC je aktivován averzními podněty (10, 11) a averzními a podmíněnými apetitivními podněty (12, 13). Kromě toho byl nedávno prokázán, že norepinefrin v mediálním pFC (mpFC) se podílí na odměňování účinku některých běžně užívaných léků prostřednictvím modulačního účinku na uvolňování dopaminu v NAc (14, 15). To naznačuje, že prefrontální přenos kortikálního norepinefrinu se zabývá akumulačním dopaminem, který zpracovává motivačně výrazné podněty.

Zde jsme použili myši, abychom posoudili, zda je dopaminový systém prefrontálního kortikálního norepinefrinu / mezoakkumbeny běžným nervovým substrátem, který se podílí na zpracování pozitivně a negativních stimulů. Konkrétně jsme zkoumali, zda je norepinefrin v MPFC, jeho modulačním účinkem na dopaminergní mezolimbický systém, nezbytný k tomu, aby byl motivační náchylnost připisován stimulům souvisejícím s odměnou a averzí.
Vzhledem k tomu, že zkušenost je hlavním faktorem motivačního dopadu jakéhokoli daného podnětu (7), posoudili účinky první expozice na odměňující přírodní (chutné potraviny, mléčnou čokoládu) a farmakologické (kokainové) stimuly a na averzivní farmakologické podněty [chlorid lithný (LiCl)] na prefrontální kortikální norepinefrin a akumulaci uvolňování dopaminu intracerebrální mikrodialýzou. Kromě toho, abychom zjistili, zda přenos norepinefrinu v prefrontálním řízení ovlivňuje nárůst akumulačního dopaminového výtoku indukovaného prvním vystavením těmto motivačně významným podnětům, hodnotili jsme také účinky selektivní deplece norepinefrinu v MPFC na uvolňování dopaminu v NAc a na uvolňování norepinefrinu v MPFC vyvolané první expozicí k těmto podnětům.

Nakonec jsme zkoumali účinky selektivní noradrenergní prefrontální deplece na kondici podmíněného místa (CPP) indukovanou čokoládou a kokainem a na podmíněnou averzi místa (CPA) indukovanou LiCl. Pro tuto studii byla zvolena procedura pro úpravu místa, protože umožnila posoudit získávání podmíněných apetitivních a averzních vlastností na podněty spárované s primárními odměnami a odvrácenými událostmi a protože velké množství důkazů ukazuje, že jde o spolehlivou míru procesů, motivační příznaky na stimuly (3, 16).

VÝSLEDKY

Experiment 1.
Aby bylo možné zhodnotit, zda první expozice odměnlivých a averzivních vylučujících podnětů ovlivňuje prefrontalní norepinefrin a nahromaděný odtok dopaminu, jsme pomocí intracerebrální mikrodialýzy hodnotili účinky systémového kokainu nebo spotřeby LiCl a čokolády na uvolňování norepinefrinu v MPFC a výtoku dopaminu v NAc. Navíc, abychom zjistili, zda je kortikální noradrenergní přenos nezbytný pro akumulační dopaminový výtok indukovaný prvním vystavením těmto motivačně výrazným podnětům, jsme posoudili účinky selektivní noradrenergní deplece na akumulační dopaminovou odpověď vyvolanou kokainem, čokoládou a LiCl. Kokain, čokoláda a LiCl způsobily časově závislý nárůst odtoku norepinefrinu v mpFC u léčených skupin, dosáhl maximální nárůst ≈200% při 40 min, ≈70% při 120 min a ≈100% při 60 min, (obr. 1a). Ačkoli se zvýšilo uvolňování norepinefrinu v pFC v reakci na kokain, je podle našeho názoru první zprávou zvýšený výtok norepinefrinu vyvolaný prvním vystavením čokoládě nebo systémovému LiCl v rámci MPFC. Tyto podněty také vedly k paralelnímu časově závislému zvýšení odtoku dopaminu v NAc zvířat léčených fíky (obr. 1b) v souladu s názorem, že tato oblast hraje významnou roli při zpracování vylučujících podnětů bez ohledu na jejich valenci (3 , 6). Byly rovněž hodnoceny účinky této deplece na uvolňování norepinefrinu v MPFC. Prefrontalní deplece norepinefrinu byla získána selektivní neurotoxickou deplecí afroteinů prefrontálního kortikálního norepinefrinu (skupiny zbavené norepinefrinu) v MPFC po ochraně dopaminu selektivním inhibitorem vychytávání. Tato metoda způsobila hluboké vyčerpání hladin norepinefrinu v tkáni (≈90%), takže hladiny dopaminu v tkáních byly prakticky neovlivněny. Kontrolní zvířata (sham-ošetřené skupiny) byly podrobeny stejnému ošetření jako myši s deplecí norepinefrinu, ale dostaly intracerebrální vehikulum. (Hladina norepinefrinového tkáně byla následující: skupina s léčbou falešně, 698 ± 26 ng / g mokré tkáně, skupina s deplecí norepinefrinu, 63 ± 17 ng / g vlhké tkáně, hladiny dopamínového tkáně byly následující: 203 ng / g mokré tkáně, skupina s deplecí norepinefrinu, 18 ± 189 ng / g vlhké tkáně.)

Obr. 1.
Prefrontální kortikální odstranění noradrenalinu na extracelulárním norepinefrinu v mpFC a dopaminu v NAc. Extracelulární norepinefrin (NE) v mpFC (a) a dopamin (DA) v NAc (b) falešně ošetřených nebo norepinefrinem ochuzených zvířat, kterým byl injekčně podán fyziologický roztok, (více…)

Selektivní deplece norepinefrinu v MPFC zhoršila nárůst akumulačního dopaminu a uvolňování prefrontalového kortikálního norepinefrinu indukovaného jak léčivy, tak čokoládou (obr. 1), i když významně neovlivnil bazální extracelulární dopamin v NAc (skupina léčená falešně, 1.35 ± 0.15 pg na 20 ± 1.29 pg na 0.18 ± 20 pg na 1.31 μl) nebo bazální extracelulární norepinefrin v mpFC (falešně léčená skupina, 0.18 ± 20 pg na 1.26 μl, skupina s deplení norepinefrinu, 0.17 ± 20 pg na 20 μl). Průměrné bazální hodnoty dopaminu v NAc a norepinefrinu v MPFC pro každou skupinu [fyziologický roztok, kokain (3 mg / kg), LiCl (XNUMX meq / kg) a čokoláda] se významně nelišily

Naše výsledky naznačují, že intaktní noradrenergní přenos v rámci MPFC je nezbytnou podmínkou pro stimulaci uvolňování dopaminu indukovanou obohacujícími a averzními podněty v rámci NAc, a tak silně naznačuje jeho hlavní roli v motivační náladě.

Experiment 2.
Abychom zjistili, zda je prefrontalní přenos norepinefrinu nezbytný pro získání podmíněných apetitivních a averzních vlastností na podněty spárované s primárními odměnami a averzními příhodami, zhodnotili jsme účinky selektivního vylučování norepinefrinu selektivní na kondicionování místa.

Prefrontální noradrenergní deplece zrušila jak CPP indukovanou kokainem, tak i čokoládu, stejně jako CPA indukovanou LiCl. Takže i když zvířata podléhající falešnému vykrvení vykazovala významnou preferenci pro oddělení s párem kokainu nebo čokolády a významnou averzi k oddělení s párem LiCl (obr. 2a), zvířata s deplecí norepinefrinu nevykazovala žádnou preferenci pro obě komory (obr. 2b ).

Obr. 2.
Prefrontální kortikální vyčerpání noradrenalinu při úpravě místa. Účinky konzumace potravin (1 g mléčné čokolády; skupina s falešnou léčbou, n = 8; skupina s deplecí norepinefrinu, n = 8) a systémová injekce (ip) fyziologického roztoku (Sal) (skupina s falešnou léčbou, (více…)

V předběžných experimentech jsme poznamenali, že jak CPP, tak CPA zvířat, kterým bylo podáváno sham, byly nerozeznatelné od zvířat naivních zvířat. Zvířata, u kterých došlo k párování slaným roztokem v obou komorách, nevykazovaly žádnou preferenci pro žádný oddíl bez ohledu na stav léze (falešně ošetřený nebo norepinefrin vyčerpaný). Chování zvířat ochuzených o norepinefrin léčených kokainem, čokoládou nebo LiCl bylo podobné chování zvířat, které během tréninku zažily pouze roztoky ve vozidle; tj. nevykazovali žádnou preferenci ani pro jeden oddíl.

DISKUSE

Zde uváděme důkaz, že prefrontální přenos kortikálního norepinefrinu prostřednictvím modulace dopaminu v NAc je nezbytnou podmínkou pro motivační příznaky, které jsou přiřazeny oběma stimulům souvisejícím s odměnou a averzí.

Za prvé, vzhledem k tomu, že předchozí zkušenost je hlavním determinantem motivačního dopadu jakéhokoli daného podnětu (7), vyhodnotili jsme pomocí intracerebrální mikrodialýzy účinky prvního vystavení systémovému kokainu nebo LiCl, jakož i účinkům konzumace čokolády na norepinefrin nebo dopamin uvolnění v mpFC a NAc. Kokain, čokoláda a LiCl vedly k časově závislému zvýšení nahromaděného dopaminu, stejně jako v předfrontalickém výtoku norepinefrinu skupin léčených falešně. Značný nárůst přetečení norepinefrinu byl patrný u MPFC zvířat, které byly ošetřeny v rámci 20 min po přijetí čokolády; přetečení se následně vrátilo na základní úroveň a následovalo velké prodloužené zvýšení. Ačkoli tento bifázický nárůst norepinefrinu vyvolaný čokoládou v MPFC nevedl souběžně s nárůstem dopaminu v NAc, počáteční nárůst pravděpodobně souvisel s dopadem chutného jídla a zvýšením dopaminu v NAc. Na druhou stranu by druhý velký nárůst mohl představovat neurochemický korelát kortikálního vzrušení potřebného pro zpracování prostorových informací souvisejících s vyhledáváním a vyhledáváním odměny za potravu (17). Ve skutečnosti bylo navrženo, že zvýšený odtok norepinefrinu slouží k signalizaci přítomnosti podnětů s vysokou motivačními projevy (17). Tento zvýšený výtok norepinefrinu by tak mohl umožnit selektivní pozornost vyžadovanou pro hledání další chutné potravy a mohla by pomoci při získávání kondicionovaných chuťových vlastností podnětů spárovaných s potravinami. Postingestivní účinky příjmu potravy na norepinefrin však nelze vyloučit.

Přestože bylo v širokém rozsahu uváděno zvýšení uvolňování dopaminu v NAc vyvolané odměňováním nebo averzními podněty a zvýšením uvolňování norepinefrinu v pFC v reakci na kokain, je podle našeho názoru první zprávou o zvýšení výtoku norepinefrinu vyvolaného čokoládovou expozicí nebo LiCl v rámci MPFC. A co je nejdůležitější, ukážeme zde, že prefrontální kortikální noradrenergní přenos je nezbytný pro akumulační dopaminový odtok vyvolaný prvním vystavením těmto motivovaně vylučujícím stimulům. Ve skutečnosti žádné zřetelné zvýšení jak prefrontálního norepinefrinu, tak i nahromaděného dopaminu odtoku, vyvolaného těmito podněty, bylo patrné u myší s deplecí norepinefrinu. Norepinefrin v MPFC by mohl aktivovat uvolňování dopaminu mezoakkumbeny prostřednictvím excitační prefrontální kortikální projekce na dopaminové buňky ventrální tegmentové oblasti (18, 19) a / nebo prostřednictvím kortikoakumálních glutamatergických projekcí (20). Navíc může být předpokládána role projekcí pFC lokusu coeruleus při působení excitačního vlivu, protože bylo prokázáno, že toto jádro aktivuje dopaminové neurony ventrální tegmentové oblasti (21-23), což by mohlo vést ke zvýšení uvolňování dopaminu v NAc.

Naše výsledky v souladu s předchozími zprávami ukazují, že jak bezpodmínečné odměňování, tak i averzní podněty zvyšují výtok norepinefrinu v MPFC (10-15), stejně jako uvolňování dopaminu v NAc (3, 24). Nejdůležitější je však to, že intaktní noradrenergní přenos v rámci MPFC je nezbytnou podmínkou pro stimulaci uvolňování dopaminu indukovanou oba odměňujícími se a averzními farmakologickými a přirozenými podněty v rámci NAc. Proto poukazují na prefrontální norepinefrin a akumulační dopaminový přenos jako nervový systém, jehož aktivace nepodmíněnými odměňujícími a averzními podněty je pravděpodobně substrátem pro motivační projev. Tento názor je podpořen výsledky behaviorálních experimentů s účinkem prefrontální deplece norepinefrinu na kokainovou, čokoládovou nebo LiCI-indukovanou úpravu místa.

Druhým důležitým zjištěním této studie je tedy to, že deplece prefrontálního kortikálního norepinefrinu narušuje CPP indukovanou kokainem nebo potravou a CPA indukovanou LiCl. Přestože zvířata podléhající simulaci vykazovala významnou preferenci pro oddělení s párem kokainu nebo čokolády a významnou averzi ke spárovanému prostoru s LiCl, zvířata s norepinefrinem nevykazovala žádnou preferenci pro obě komory, což dokazuje, že je nutný intaktní přenos prefrontalového kortikálního norepinefrinu pro získání podmíněných vlastností podnětů spárovaných s primárně odměňujícími nebo averzními událostmi v postupech kondicionování.

Dosavadní výsledky ukazují, že u myší s deplecí norepinefrinu prefrontální kůry nedostatek uvolňování norepinefrinu vyvolaného vystavením odměnlivých a averzivních podnětů (kokain, potravina nebo LiCl, nepodmíněný stimul) zabránil motivačnímu přívlastku k podmíněnému stimu (prostorovému vzoru) během zasedání párování. Poznamenejme také, že prefrontální deplece norepinefrinu neinterferovala ani s asociativními nebo mnemonickými procesy, protože, jak bylo dříve ukázáno, zvířata se sníženou norepinefrinem se ukázala být schopna učit se pasivnímu únikovému úkolu (15) a spojit kontext s účinky léku (14). Nicméně další vyšetřování je nezbytné k pochopení přesné povahy poškození zvířat, které jsou ochuzeny o prefrontální kortikální norepinefrin.

Dopaminergní přenos v rámci NAc se považuje za zprostředkování hedonického dopadu odměny nebo některých aspektů odměňování (viz oddíl 25 k přezkoumání). Naše výsledky, v souladu s jiným výhledem (3), ukazují, že přenos dopaminu v NAc hraje roli v pozitivním i averzně motivovaném chování; co je nejdůležitější, však ukazují, že tento motivační proces je řízen prefrontálním kortikálním norepinefrinem. Ve skutečnosti selektivní prefrontalní deplece norepinefrinu produkuje blok CPA a CPC indukované kokainem nebo čokoládou a zhoršení uvolňování dopaminu v NAc indukované těmito podrážděnými podněty u kontrolních myší, což ukazuje, že noradrenergní prefrontální přenos přes modulaci uvolnění dopaminu v rámci NAc, je nezbytnou podmínkou pro motivační zpracování obou stimulů souvisejících s odměnou a averzí.

Souhrnem předložené výsledky z behaviorálních a mikrodialýzových experimentů demonstrují, že prefrontalní přenos norepinefrinu nejen zprostředkovává obohacující vlastnosti běžně užívaných léků, jak je naznačeno v předchozích studiích (14, 15), ale je nezbytné k motivačnímu odlišení jak na odměňování, tak na odměňování podněty související s averzí, dále ukazující, že návykové drogy a rovněž averzní farmakologické podněty využívají stejný neurobiologický mechanismus jako přirozené podněty.

Na závěr naše data rozšiřují předchozí poznatky, které poukazují na mezolimbický dopaminergní systém jako "systém výživy", který se podílí na veškerém motivovaném chování (3, 6, 26). Ukazují také, že tento systém je pod norepinefrinem prefrontální kortikální kontrola, čímž podporuje názor, že odměňující a averzní podněty ovlivňují podobné cesty v CNS (7).

Naše výsledky poskytují poznatky o neurobiologii odměny a averze, protože ukazují, že zpracování obojživelných a averzivních charakteristických podnětů zahrnuje stejné oblasti mozku; tj. ukazují na prefrontální noradrenergní a akumulační dopaminergní přenos jako společný nervový systém. Pochopení systémů neurotransmiterů aktivovaných affectively rewarding nebo aversive podněty a jejich molekulární mechanismy pomůže poskytnout základ pro objasnění fungování nervových systémů zapojených do pozitivních i negativních emocí.

MATERIÁLY A METODY

Zvířata.
Na pokusy byly umístěny samci myší inbredního kmene C57BL / 6JIco (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), které se běžně používají při neurobehaviorálních fenotypích, 8-9 týdnů staré v době pokusů, jak bylo popsáno výše (14, 15). Každá experimentální skupina sestávala ze šesti až osmi zvířat. Všechny pokusy byly prováděny v souladu s italským vnitrostátním právem (zákonem č. 116, 1992) upravujícím používání zvířat pro výzkum.

Drogy.
Chloralhydrát, 6-hydroxydopamin (6-OHDA), GBR 12909, kokainhydrochlorid a LiCl byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kokain (20 mg / kg), LiCl (3.0 meq / kg), chloralhydrát (350-450 mg / kg) a GBR 12909 (15 mg / kg) byly rozpuštěny ve fyziologickém roztoku (0.9% objem 10 ml / kg. 6-OHDA byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku obsahujícím disiřičitan sodný (0.1 M). Pro experimenty s potravinami byla odměna mléčnou čokoládou (1 g, Nestlé, Vevey, Švýcarsko).

Mikrodialýza.
Zvířata byla anestetizována chloralhydrátem (450 mg / kg) umístěným ve stereotaktickém rámu (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) vybavený adaptérem pro myši a jednostranně implantován vodicí kanyla (nerezová ocel, vnější průměr hřídele 0.38 mm , Metalant AB, Stockholm, Švédsko) v mpFC nebo v NAc (14, 15). Délka vodící kanyly byla 1 mm pro mpFC a 4.5 mm pro NAc. Vodící kanyla byla fixována epoxidovým lepidlem a k další stabilizaci byl přidán zubní cement. Souřadnice z bregma [naměřené podle metod Franklin a Paxinos (27)] byly následující: + 2.52 anteroposterior a 0.6 laterální pro mpFC a + 1.60 anteroposterior a 0.6 lateral pro NAc [většinou včetně subdivize shellu (27)]. Sonda (délka dialýzní membrány 2 mm pro mpFC a 1 mm pro NAc a vnější průměr 0.24 mm, MAB 4 měďová mikrodialyzační sonda, Metalant AB) byla zavedena 24 h před mikrobiálními experimenty. Zvířata byla lehce anestetizována chloralhydrátem (350 mg / kg), aby se usnadnilo manuální vkládání mikrodialyzační sondy do vodící kanyly. Zvířata byla vrácena do svých klecí. Výstupní a přívodní sonda byla chráněna lokálně aplikovaným parafilmem. Membrány byly testovány na in vitro zotavení dopaminu a norepinefrinu (relativní výtěžnost byla následující den: dopamin, 10.7 ± 0.82%, norepinefrin, 12.2 ± 0.75%, n = 20) v den před použitím k ověření zotavení.

Mikrodialyzační sonda byla připojena k čerpadlu CMA / 100 (Carnegie Medicine, Stockholm, Švédsko) pomocí trubek PE 20 (Metalant AB) a dvoukanálového kapalinového otočného prvku s velmi nízkým točivým momentem (model 375 / D / 22QM; Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA) umožňující volný pohyb. Umělá mozkomíšní tekutina (147 mM NaCl / 1 mM MgCl / 1.2 mM CaCl2 / 4 mM KCl) byla čerpána přes dialýzovou sondu při konstantním průtoku 2 μl / min. Pokusy byly prováděny 22–24 hodin po umístění sondy. Každé zvíře bylo umístěno do kruhové klece vybavené mikrodialyzačním zařízením (Instech Laboratories) a podestýlkou ​​v domácí kleci na podlaze. Perfuze dialýzy byla zahájena o 1 hodinu později. Po zahájení perfúze dialýzy byly myši ponechány nerušeně po dobu ~ 2 hodin před odběrem základních vzorků. Průměrná koncentrace tří vzorků odebraných bezprostředně před zpracováním (<10% variace) byla brána jako bazální koncentrace. Před zahájením experimentů s mikrodialýzou byly myši přiděleny k jedné z různých ošetření (fyziologický roztok, kokain, čokoláda nebo LiCl) v každé skupině (simulovaná léčba nebo vyčerpání norepinefrinu). Pro experimenty s jídlem byla zvířata 28 dny před zahájením experimentů umístěna do režimu potravinového deprivace (4).

Dialyzát byl shromážděn každých 20 min pro 120 (pro skupiny kokainu a LiCl) nebo 160 (pro skupiny potravin) min. Zaznamenávají se pouze údaje z myší s správně umístěnou kanyla. Umístění byla posuzována barvením na methylenové modři. Dvacet mikrolitrů vzorků dialyzátu bylo analyzováno metodou HPLC. Zbývající 20 μl byla uchovávána pro případnou následnou analýzu. Koncentrace (pg na 20 μl) nebyly opraveny pro obnovení sondy. HPLC systém sestával z Alliance HPLC systému (Waters, Milford, MA) a coulometrického detektoru (model 5200A, Coulochem II, ESA, Chelmsford, MA) opatřeného kondicionační buňkou (M 5021) a analytickou buňkou (M 5011) . Kondicionační buňka byla nastavena na 400 mV, elektroda 1 byla nastavena na 200 mV a elektroda 2 byla nastavena na -250 mV. Byl použit kolon Nova-Pack C18 (3.9 × 150 mm; Waters) udržovaný na teplotě 33 ° C. Průtok byl 1.1 ml / min. Mobilní fáze byla popsána výše (14, 15). Limit detekce testu byl 0.1 str.

Úbytek norepinefrinu v MPFC.
Anestezie a chirurgická sada jsou popsány výše. Zvířata byla injekčně podána injekcí GBN 12909 (15 mg / kg) 30 min před mikroinjekcí 6-OHDA k ochraně dopaminergních neuronů. Bilaterální injekce 6-OHDA (1.5 μg na 0.1 μl pro 2 min pro každou stranu) byla provedena do mpFC [souřadnice byly + 2.52 anteroposterior, ± 0.6 lateral a -2.0 ventral vzhledem k bregma (27)] přes nerezovou ocel kanyla (vnější průměr 0.15 mm, Unimed, Lausanne, Švýcarsko) připojena k injekční stříkačce 1-μl polyethylenovou trubicí a poháněna čerpadlem CMA / 100. Kanyla byla ponechána na místě po dobu dalších 2 min po ukončení infuze. Podobně léčená zvířata byla podrobena stejnému ošetření, ale dostávala intracerebrální vehikulum. Zvířata byla použita k mikrobiální analýze nebo k experimentům v chování 7 dní po operaci.
Hladiny norepinefrinu a dopaminového tkáně v MPFC byly vyhodnoceny tak, jak bylo popsáno dříve (14, 15), aby se vyhodnotil rozsah vyčerpání.

Místo kondicionování.
Behaviorální experimenty byly prováděny za použití zařízení pro úpravu místa (14, 15, 29). Přístroj sestával ze dvou šedých plexisklových komor (15 × 15 × 20 cm) a středové dráhy (15 × 5 × 20 cm). Dvě posuvné dveře (4 × 20 cm) spojily dráhu s komorami. V každé komoře byly jako podmíněné podněty použity dva trojúhelníkové rovnoběžky (5 × 5 × 20 cm) vyrobené z černého plexiskla a uspořádané v různých vzorcích (vždy pokrývajících stejný povrch komory). Zvířata byla použita pro behaviorální experimenty 7 dní po operaci. Před kondicionací byly myši zařazeny do jedné z různých léčebných režimů (fyziologický roztok, kokain, čokoláda nebo LiCl) v každé skupině (vyloučeno nebo norepinefrinem vyčerpáno).
Postup školení pro úpravu místa byl popsán dříve (14, 15). Stručně, v den 1 (předběžná zkouška), myši mohli volně prozkoumat celý přístroj pro 20 min. Během následujících dnů 8 (fáze kondicionování) se myši denně střídaly pro 40 min střídavě v jedné ze dvou komor. Pro kondicionování místa s farmakologickými podněty byl jeden z modelů konzistentně spárován s fyziologickým roztokem a druhý s kokainem (20 mg / kg ip, CPP) nebo LiCl (3.0 meq / kg ip, CPA) během fáze kondicionování. Tyto dávky byly vybrány na základě předchozích studií, které ukazují, že myši C57BL / 6JIco vykazují silnější CPP při dávce kokainu 20 mg / kg (30, 31) a trend k averzii v testu CPA při dávce LiCl 3.0 meq / kg (32). Pro zvířata v kontrolní skupině byla obě komory spárována s fyziologickým roztokem. U CPP s jídlem byl jeden ze vzorů důsledně spárován se standardním jídlem (1 g standardní stravy na myši) a druhý s chutným jídlem (1 g mléčné čokolády). Zvířata byla před zahájením kondicionování umístěna na program pro omezení potravin (28) 4. Tento plán trval celý stav.
U všech experimentů s podmíněností bylo párování vyváženo tak, že u poloviny každé experimentální skupiny byl nepodmíněný stimul (kokain, čokoláda nebo LiCl) spárován s jedním ze dvou vzorů; pro druhou polovinu každé skupiny byl nepodmíněný stimul spárován s druhým vzorem. Testování na expresi CPP nebo CPA bylo prováděno 10. den pomocí postupu předběžného testu. Údaje o chování byly shromážděny a analyzovány plně automatizovaným systémem sledování videa EthoVision (Noldus, Wageningen, Nizozemsko). Stručně, experimentální systém je zaznamenán CCD videokamerou. Signál je poté digitalizován (hardwarovým zařízením zvaným grab grab) a předán do paměti počítače. Později jsou digitální data analyzována pomocí softwaru EthoVision, aby se získal „čas strávený“ (v sekundách), který se použije jako nezpracovaná data pro skóre preferencí v každém sektoru přístroje každým subjektem.

Statistiky.
Místo kondicionování.
Pro experimenty s kondicionováním byly provedeny statistické analýzy výpočtem času (v sekundách) stráveného ve středu (střed), ve spárách s lékem / čokoládou (spárovaný) a salinem / standardním spárovaným oddělením (nepárový) v den testu. V případě zvířat, které dostávaly páru solanku s oběma odděleními, byla spárovaná oddělení identifikována jako první, na kterou byli vystaveni.

Účinky selektivní deplece prefrontálního kortikálního norepinefrinu na kondicionování místa.
Údaje z pokusů na stanovení místa byly analyzovány opakovanými měřeními ANOVA s jedním faktorem (před léčbou, dvěma úrovněmi: falešně ošetřenými a norepinefrinem vyčerpanými) a jedním faktorem (párování, tři úrovně: střed, spárován a nepárový) solný roztok / fyziologický roztok, fyziologický roztok / kokain (20 mg / kg), fyziologický roztok / LiCl (3 meq / kg) a standardní potraviny / čokoláda. Jelikož jsou důležitá srovnání mezi oddělenými a nepárovými odděleními, průměrná porovnání času stráveného v těchto komorách byla provedena opakovanými měřeními ANOVA v každé skupině.

Obousměrná ANOVA odhalila významnou interakci před léčbou × párování pro kokain [F (2, 28) = 3.47; P <0.05], LiCl [F (2, 28) = 4.55; P <0.05] a čokoláda [F (2, 28) = 3.5; P <0.05].
Opakovaná měření ANOVA v každé skupině odhalila významný účinek párovacího faktoru pouze u simulovaných zvířat, kterým byl injekčně podán kokain [F (1, 14) = 24.3; P <0.0005], LiCl [F (1) = 14; P <10.3] nebo čokoláda [F (0.01, 1) = 14; P <7.31].

Úbytek norepinefrinu v MPFC.
Účinky prefrontální deplece norepinefrinu na tkáňové hladiny dopaminu a norepinefrinu v mpFC byly analyzovány pomocí obousměrné analýzy ANOVA. Faktory byly následující: léze (dvě úrovně: simulovaná léčba a vyčerpání norepinefrinu) a experiment (dvě úrovně: experiment chování a experimenty s mikrodialýzou). V případě potřeby byla provedena individuální srovnání mezi skupinami post hoc testem, Duncanovým testem s více rozsahy. Statistické analýzy byly provedeny na datech z experimentů chování a mikrodialýzy. Obousměrná ANOVA pro účinky prefrontální deplece noradrenalinu na hladiny dopaminu a noradrenalinu ve tkáních v mpFC vykázala významný lézní účinek pouze pro norepinefrin [F (1, 188) = 2.02; P <0.0005], ale žádné experimentální účinky.

Mikrodialýza.
Statistické analýzy byly provedeny na surových datech (koncentrace pg na 20 μl). Účinky prefrontální deplece norepinefrinu na uvolňování norepinefrinu v mpFC nebo na odtok dopaminu v NAc zvířat napadených kokainem (20 mg / kg) nebo LiCl (3 mekv./kg) byly analyzovány opakovaným měřením ANOVA se dvěma faktory (před léčbou, dvě úrovně, simulovaná léčba a vyčerpání norepinefrinu; a léčba, tři úrovně, fyziologický roztok, kokain a LiCl) a jedna v rámci faktoru (čas, sedm úrovní, 0, 20, 40, 60, 80, 100 a 120). Účinky prefrontální deplece norepinefrinu na uvolňování norepinefrinu v mpFC nebo na odtok dopaminu v NAc zvířat vystavených čokoládě byly analyzovány opakovaným měřením ANOVA s jedním mezi faktorem (předúprava, dvě úrovně, simulovaná léčba a vyčerpání norepinefrinu) a jedním v rámci faktoru ( čas, devět úrovní, 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 a 160). Jednoduché účinky byly hodnoceny jednosměrnou ANOVA pro každý časový bod. Individuální srovnání mezi skupinami byla provedena, pokud to bylo vhodné, post hoc testem, Duncanovým testem s více rozsahy.

Statistické analýzy účinků farmakologických stimulů na prefrontální odtok norepinefrinu odhalily významnou předléčbu × léčení × časovou interakci [F (12, 180) = 4.98; P <0.005]. Statistické analýzy účinků konzumace čokolády na uvolňování norepinefrinu odhalily interakci před ošetřením × čas [F (8, 80) = 7.77; P <0.005]. Jednoduché analýzy účinků odhalily významný časový efekt pouze pro skupinu s falešnou léčbou a významný rozdíl mezi skupinou s falešnou léčbou a skupinou s deplecí noradrenalinu po injekci kokainu nebo LiCl a po konzumaci čokolády.

Statistické analýzy účinků farmakologických stimulů na odtok dopaminu z accumbalu odhalily významnou předléčbu × léčení × časovou interakci [F (12, 180) = 10.02; P <0.0005]. Statistické analýzy údajů o čokoládě odhalily významnou interakci před ošetřením × čas [F (8, 80) = 2.12; P <0.05]. Jednoduché analýzy účinků odhalily významný časový efekt pouze u skupin s falešnou léčbou a významný rozdíl mezi skupinami s falešnou léčbou a skupinou s deplecí noradrenalinu po injekci drogy (kokainu nebo LiCl) a po konzumaci čokolády.

Poděkování

Děkujeme Dr. E. Catalfamovi za obratnou pomoc. Tento výzkum byl podpořen Ministero della Ricerca Scientifica e Tecnologica (PRIN 2005), Univerzitou "La Sapienza" Ateneo (2004 / 2005) a Ministero della Salute (Progetto Finalizzato RF03.182P).

ZKRATKY

NAc nucleus accumbens

pFC prefrontální kortex

mpFC mediální pFC

CPP podmíněné místo

CPA podmíněná averze místa

6-OHDA 6-hydroxydopamin.

FOTOGRAFIE
Autoři neuvádějí žádný střet zájmů.
Tento článek je PNAS přímý podání.

REFERENCE

1. O'Doherthy J. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 769–776. [PubMed]
2. Rolls ET. Behav Brain Sci. 2000; 23: 177-191. [PubMed]
3. Berridge KC, Robinson TE. Brain Res Rev. 1998; 28: 309-369. [PubMed]
4. Becerra L, Breiter HC, Wise R, González RG, Borsook D. Neuron. 2001; 32: 927-946. [PubMed]
5. Gottfried JA, O'Doherthy J, Dolan RJ. J. Neurosci. 2002; 22: 10829–10837. [PubMed]
6. Jensen J, Mcintosh AR, Crawley AP, Mikulis DJ, Remington GR, Kapur S. Neuron. 2003; 40: 1251-1257. [PubMed]
7. Borsook D, Becerra L, Carlezon WA, Jr, Shaw M, Renshaw P, Elman I, Levine J. Eur J Pain. 2007; 11: 7-20. [PubMed]
8. Wise R. Nat Rev Neurosci. 2004; 5: 483-494. [PubMed]
9. Bechara A, Tranel D, Damasio H. Brain. 2000; 123: 2189-2202. [PubMed]
10. McQuade R, Creton D, Stanford SC. Psychopharmacology. 1999; 145: 393-400. [PubMed]
11. Dazzi L, Seu E, Cherchi G, Biggio G. Eur J Pharmacol. 2003; 476: 55-61. [PubMed]
12. Feenstra MGP, Teske G, Botterblom MHA, de Bruin JP. Neurosci Lett. 1999; 272: 179-182. [PubMed]
13. Mingote S, de Bruin JPC, Feenstra MGP. J Neurosci. 2004; 24: 2475-2480. [PubMed]
14. Ventura R, Cabib S, Alcaro A, Orsini C, Puglisi-Allegra S. J Neurosci. 2003; 23: 1879-1885. [PubMed]
15. Ventura R, Alcaro A, Puglisi-Allegra S. Cereb Cortex. 2005; 15: 1877-1886. [PubMed]
16. Di Chiara G, Bassareo V, Fenu S, De Luca MA, Spina L, Cadoni C, Acquas E, Carboni E, Valentini V, Lecca D. Neuropharmacology. 2004; 47: 227-241. [PubMed]
17. Aston-Jones G, Rajkowski J., Cohen J. Biol Psychiatry. 1999; 46: 1309-1320. [PubMed]
18. Shi WX, Pun CL, Zhang XX, Jones MD, Bunney BS. J Neurosci. 2000; 20: 3504-3511. [PubMed]
19. Sesack SR, Pickel VM. J Comp Neurol. 1992; 320: 145-160. [PubMed]
20. Darracq L, Drouin C, Blanc G, Glowinski J, Tassin JP. Neurovědy. 2001; 103: 395-403. [PubMed]
21. Jodo E, Chiang C, Aston-Jones G. Neuroscience. 1998; 83: 63-79. [PubMed]
22. Grenhoff J, Nisell M, Ferre S, Aston-Jones G, Svensson TH. J Neural Transm. 1993; 93: 11-25.
23. Liprando LA, Miner LH, Blakely RD, Lewis DA, Sesack SR. Synapse. 2004; 52: 233-244. [PubMed]
24. Salamone JD, Correa M, Mingote S, Weber SM. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 305: 1-8. [PubMed]
25. Everitt BJ, Robbins TW. Nat Neurosci. 2005; 11: 1481-1487. [PubMed]
26. Horvitz JC. Behav Brain Res. 2002; 137: 65-74. [PubMed]
27. Franklin KBJ, Paxinos G. Brain myš: ve stereotaktických souřadnicích. San Diego: akademický; 1997.
28. Ventura R, Puglisi-Allegra S. Synapse. 2005; 58: 211-214. [PubMed]
29. Cabib S, Orsini C, Le Moal M, Piazza PV. Věda. 2000; 289: 463-465. [PubMed]
30. Romieu P, Phan VL, Martin-Fardon R, Maurice T. Neuropsychopharmacology. 2002; 4: 444-455. [PubMed]
31. Orsini C, Bonito-Oliva A, Conversi D, Cabib S. Psychopharmacology. 2005; 181: 327-336. [PubMed]
32. Risinger FO, Cunningham CL. Pharmacol Biochem Behav. 2000; 1: 17-24. [PubMed]