Dekódování neurálních obvodů, které řídí kompulzivní hledání sacharózy (2015) (BINGE MECHANISM)

Za účelem identifikace LH neuronů, které poskytují monosynaptický vstup do VTA in vivo a sledování jejich aktivity během volně se pohybujícího chování, jsme použili strategii dvojitého viru k selektivní expresi kanálu rhodopsinu-2 (ChR2) v LH neuronech poskytujících monosynaptický vstup do VTA (Čísla 1A a S1). Injektovali jsme adeno-asociovaný virový vektor (AAV₅) nesoucí ChR2-eYFP v konstrukci dvojitě obráceného otevřeného čtecího rámce (DIO) závislého na rekombináze do LH k infikování místní somaty a injikoval retrográdně putující virus herpes simplex (HSV) nesoucí Cre-rekombinázu do VTA. Následná rekombinace umožňovala selektivně expresi opsinu a fluoroforu v LH neuronech poskytujících monosynaptický vstup do VTA. Abychom potvrdili náš přístup, provedli jsme ex vivo celobuněčné nahrávky patch-clamp ve vodorovných řezech mozku obsahujících LH a zaznamenané z neuronů exprimujících ChR2-eYFP, stejně jako ze sousedních LH neuronů, které byly negativní na ChR2-eYFP (Obrázek 1B). Latence špiček vyvolané světlem, měřené od nástupu světelného pulzu po vrchol akčního potenciálu, se pohybovaly v rozmezí 3–8 ms (Obrázek 1C). Také jsme zjistili, že žádná ze zaznamenaných neexprimujících (ChR2-negativních) buněk nevykazovala excitační odpovědi na fotostimulaci (n = 14; Obrázek 1C), navzdory jejich blízkosti k buňkám exprimujícím ChR2.

Aby bylo možné provést optogeneticky zprostředkovanou fotoidentifikaci in vivo, byl do LH implantován optrod, který zaznamenal aktivitu neuronů během úlohy hledání sacharózy. Ve stejné relaci záznamu jsme poskytli několik vzorů fotostimulace k identifikaci neuronů LH-VTA exprimujících ChR2 (Čísla 1D a S1). Zkoumali jsme distribuci excitačních fotoreakčních latencí ve všech LH neuronech vykazujících časově uzamčenou změnu rychlosti střelby v reakci na osvětlení a pozorovali jsme bimodální distribuci (Obrázek 1E). Populaci neuronů jsme pozorovali během záznamů in vivo s latencí v rozmezí 3–8 ms. To bylo identické s rozsahem latence nalezeným v LH-VTA neuronech exprimujících ChR2, když jsme zaznamenávali ex vivo. Tyto jednotky jsme nazvali „Typ 1“ (Čísla 1C, 1E a 1F). Kromě toho existovala zřetelná populace buněk s latencí fotoresponze ~ 100 ms (Čísla 1E a 1G) a nazvali jsme tyto jednotky typu 2. Pozorovali jsme také neurony, které byly inhibovány v reakci na fotostimulaci neuronů LH-VTA (Obrázek S2) a nazvali jsme tyto jednotky typu 3. Srovnali jsme trvání akčního potenciálu (měřeno od vrcholu po minimum) a střední rychlost střelby jednotek typu 1 a 2 a těch, které nevykazovaly fotoreakci (Obrázek 1H). Rozložení trvání akčního potenciálu typu 1 (Obrázek 1I) a typu 2 (Obrázek 1J) jednotky ukazují, že většina jednotek typu 1 má dobu akčního potenciálu méně než 500 μs (84%; n = 16/19, binomické rozdělení, p = 0.002).

Ačkoli jednotky typu 1 vyhovují standardním kritériím, které mají být klasifikovány jako ChR2 exprimující (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), nebylo jasné, zda delší fotoresponze jednotek typu 2 s delší latencí svědčí o neuronech exprimujících ChR2 pomaleji k fotostimulaci, nebo zda byl tento efekt způsoben síťovou aktivitou. Vzhledem k tomu, že LH neurony exprimující ChR2 (typ 1) se promítají přímo do VTA, jednou z možností bylo, že neurony typu 2 dostávali zpětnou vazbu od VTA (Obrázek 1K). Další možností bylo, že neurony typu 2 byly aktivovány axonovými kolaterály z neuronů typu 1 (Obrázek 1L). Abychom rozlišili mezi těmito dvěma možnými modely obvodů, inhibovali jsme VTA ve spojení s fotoidentifikací v LH.

Na základě našich modelů s obvody bychom očekávali, že distální inhibice nebude mít žádný vliv na fotoreakci LH neuronů exprimujících ChR2. Pokud jsou však fotoreaktivní, ale neexprimující, LH neurony se spoléhaly na zpětnou vazbu od VTA, aby vyvolaly časově uzamknutou odpověď na osvětlení (Obrázek 1K), očekávali bychom útlum fotoreakcí v těchto neuronech po inhibici VTA. Exprimovali jsme ChR2 v LH-VTA buňkách, jak je uvedeno výše, ale tentokrát také exprimovali zvýšený halorhodopsin 3.0 (NpHR) ve VTA a implantovali optické vlákno do VTA kromě optrody v LH (Obrázek 2A). V LH jsme dodali stejné vzory modrého světla pro všechny tři epochy, ale fotoinhibovali jsme VTA se žlutým světlem ve druhé epochě (Obrázek 2A).

Fotoreakce jednotek typu 1 na osvětlení modrým světlem v LH nebyly ovlivněny fotoinhibicí VTA, což je v souladu s expresí ChR2 v neuronech typu 1 LH-VTA (Obrázek 2B). Naproti tomu většina jednotek typu 2 (87%; n = 13/15, binomická distribuce, p = 0.004) vykázala významné zeslabení fotoodpovědí na pulsy modrého světla dodávané v LH po fotoinhibici neuronů VTA. Odpovědi jednotek typu 1 a typu 2 během VTA fotoinhibice byly významně odlišné (chí-kvadrát = 7.64, p = 0.0057; Čísla 2B a 2C). Tyto rozdíly lze také pozorovat v maximálním skóre Z během jednotlivých epoch (Obrázek 2D) a se žlutou-ON epochou normalizovanou na žlutou-OFF epochu (Obrázek 2E). Tato data naznačují, že neurony typu 2 LH přijímají vstup (přímo nebo nepřímo) z VTA (Obrázek 1K) spíše než prostřednictvím lokálních axonových kolaterálů (Obrázek 1L).

Poté, co jsme identifikovali tyto dva odlišné typy LH neuronů ve smyčce LH-VTA, chtěli jsme prozkoumat přirozeně se vyskytující neurální aktivitu během úkolu samo-administrace sacharózy (Obrázek 3A). Myši byly vycvičeny k provádění nosních reakcí na narážku předpovídající dodávku sacharózy do sousedního portu (jako v Tye et al., 2008). Abychom mohli rozlišit nervové reakce na nosepoke a tágo, byly tágo a sacharóza dodány podle plánu částečného zesílení, přičemž 50% nosních koulí bylo spárováno s podáním a podáním sacharózy.

Jednotky typu 1 vykazovaly fázové reakce na vstup do sacharózového portu, jak je vidět na reprezentativní jednotce typu 1 (Obrázek 3B), jakož i údaje o populaci všech jednotek typu 1 (Obrázek 3C). Fázické reakce jednotek typu 2 však odrážely hlavně reakce na odměnu prediktivní (Čísla 3D a 3E). Normalizované vzorce střelby všech zaznamenaných neuronů (n = 198, rozdělených na jednotky typu 1, 2, 3 a nereagující jednotky) se zobrazují pro každou složku úkolu: nosepoky spárované s tágem, nosepoky v nepřítomnosti tága a vstup do portu sacharózy (Obrázek 3F). Všechny jednotky typu 1, které vykazovaly fázově významné změny aktivity relevantní pro daný úkol (74%; n = 14/19), byly buď fázově vzrušeny, nebo inhibovány vstupem do portu sacharózy, přičemž malý počet také vykazoval fázovou inhibici předpovědi předpovědi (Čísla 3B, 3C a 3G). Naproti tomu jednotky typu 2 byly více heterogenní, s neurony reagujícími na úkoly, které kódují cue selektivně (35%), selektivně vstupem do sacharózy (26%), nebo vstupem do tága a portu (12%; Čísla 3D, 3E a 3H). Pro ilustraci síly odpovědí jednotek typu 1 a typu 2 na události související s úkoly jsme každou buňku vykreslili na trojrozměrném grafu podle skóre Z (Obrázek 3I). Abychom ukázali distribuci fázových změn v palbě na více událostí souvisejících s úkoly na kvalitativní úrovni, vykreslili jsme počet buněk každého typu fotoreakce, které spadaly do dané kategorie (Obrázek 3J).

Vzhledem k dobře definované roli VTA v chybě predikce odměny (např. Fázové snížení střelby DA neuronů v reakci na neočekávané opomenutí odměny a fázová excitace v reakci na neočekávané dodání odměny) (Schultz et al., 1997) jsme zkoumali, zda by neurony LH kódovaly neočekávané opomenutí odměny za sacharózu. Za tímto účelem jsme zaznamenali nervovou aktivitu fotoresponzivních neuronů během stejného úkolu cue-odměna u dobře vycvičených zvířat, ale náhodně jsme vynechali 30% dodávek sacharózy po cue (Obrázek 4A).

Většina jednotek typu 1 (88%; n = 15/17, binomické rozdělení, p = 0.001) byla necitlivá na vynechání odměny (Čísla 4B a 4D), zatímco velká podskupina jednotek typu 2 (67%; n = 12/18) vykázala významně odlišnou odpověď na studie s odměnou a bez odměny (Čísla 4C a 4D). Došli jsme k závěru, že neurony LH-VTA (typ 1) kódovaly akci vstupu do portu, protože tyto odpovědi na vstup do portu byly trvalé i po vynechání odměny (Obrázek 4D), na rozdíl od jednotek typu 2 (chí-kvadrát = 10.9804, p = 0.0009).

Abychom určili, zda odpovědi typu 1 na vstup do portu skutečně kódovaly podmíněnou odpověď (CR), na rozdíl od obecného chování při hledání odměn nebo průzkumného chování, zaznamenali jsme u netrénovaných myší, které úkol dosud nezískaly. U myší naivní úlohy jsme dodali sacharózu do přístavu v případě, že neexistuje prediktivní narážka (nepředvídané doručení odměny) a zjistili jsme, že jednotky typu 1 nevykazovaly fázové reakce na vstup do portu (Čísla 4E, 4F a 4I), v souladu s modelem, který neurony typu 1 kódují CR (Obrázek 4J).

Dále, abychom určili, zda aktivita jednotky typu 2 je konzistentní s profilem reakce podobné předpovědi odměny, zaznamenali jsme také tyto neurony u dobře trénovaných zvířat během předvídaného odměňování (Obrázek 4G). Zjistili jsme, že podmnožina jednotek typu 2 reagovala na nepředvídané dodávky sacharózy (50%; Čísla 4G – 4I). Dohromady jsou podmnožiny jednotek typu 2 citlivé na neočekávané vynechání odměny (Čísla 4C a 4D) a nepředvídané odměny (Čísla 4G – 4I), což je konzistentní s profilem odezvy podobné predikci chyby.

Jak jsme ukázali výše, jednotky typu 1 představují neurální korelaci CR. Důležité je, že zvýšení rychlosti střelby začíná před ČR, stoupá až do dokončení CR (Čísla 3B, 3C a 4B). Abychom určili, zda by aktivace dráhy LH-VTA mohla podpořit CR, chtěli jsme vyzkoušet schopnost aktivace LH-VTA při řízení CR tváří v tvář negativním důsledkům. U myší divokého typu jsme exprimovali ChR2-eYFP nebo eYFP samotný v tělech LH buněk a implantovali optické vlákno přes VTA (Čísla 5A a S4). Naopak, abychom otestovali roli dráhy LH-VTA při zprostředkování chování souvisejícího s CR nebo krmením, jsme bilaterálně exprimovali samotný NpHR-eYFP nebo eYFP v LH buňkách a implantovali optické vlákno nad VTA (Čísla 5A a S4).

Navrhli jsme Pavlovianův kondicionační úkol, ve kterém myši zbavené potravy musely projít šokovou mřížkou, aby získaly sacharosovou odměnu (Obrázek 5B). V první „základní“ epochě (s vypnutou šokovou mřížkou) jsme ověřili, že každá myš získala úlohu Pavlovianova podmíněného přístupu. Ve druhé („šokové“) epochě poskytovala mřížka šoků každou sekundu mírné otřesy nohou. Nakonec ve třetí epochě („Shock + Light“) jsme pokračovali v podávání šoků nohou, ale také jsme osvětlili LH terminály ve VTA modrým světlem (10 Hz) u myší exprimujících ChR2 a odpovídajících kontrol eYFP a žluté světlo (konstantní) pro myši exprimující NpHR a jejich kontroly eYFP (Obrázek 5B).

Během epochy Shock + Light jsme pozorovali výrazně vyšší počet portových vstupů na cue a výrazně vyšší skóre rozdílů (Shock + Light epoch - Epocha pouze s tlumením) u myší ChR2 oproti myším eYFP (Obrázek 5C a Film S1). Naproti tomu fotoinhibice dráhy LH-VTA vedla k významnému snížení vstupů portů na cue a skóre skóre u NpHR myší ve srovnání s eYFP myšmi (Obrázek 5D a Film S2). Experimenty vyhynutí v rámci relací, během nichž nebyly prezentace cue následovány dodávkami sacharózy, vykazovaly ve skutečnosti podobné trendy (Obrázek S4).

Důležité je, abychom chtěli zjistit, zda změny v hledání sacharózy, které jsme získali, byly způsobeny změnami v chování souvisejícím s krmením nebo citlivostí na bolest. Zjistili jsme, že fotoaktivace projekce LH-VTA významně zvýšila dobu strávenou krmením u dobře krmených myší ve skupině ChR2 (Obrázek 5E). Fotoinhibice dráhy LH-VTA však významně nesnížila krmení (Obrázek 5F), i když tato zvířata byla zbavena potravy, aby se zvýšila naše schopnost detekovat snížení vzhledem k základní epochě (ve srovnání se zvířaty nasazenými v Obrázek 5E). Ani v ChR2 (Obrázek 5G) ani skupina NpHR (Obrázek 5H) pozorovali jsme rozdíl v latenci ke stažení ocasu z horké vody (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto a Sulman, 1967), což naznačuje, že manipulace s projekcí LH-VTA nezměnila analgezii.

Ke studiu složení složek rychlého přenosu vstupů LH do VTA, které vyvolávaly tyto účinky, jsme provedli celobuněčné nahrávky patch-clamp z neuronů VTA v přípravě akutního řezu, zatímco jsme opticky aktivovali vstupy LH exprimující ChR2-eYFP (Čísla 6A a S5). Vzhledem k tomu, že ve VTA je dobře zavedená heterogenita, včetně - 65% neuronů DA, - 30% neuronů GABA a - 5% neuronů glutamátu (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et. al., 2007), během záznamu jsme naplnili buňky biocytinem, abychom umožnili identifikaci buněčného typu pomocí post-hoc imunohistochemie pro tyrosinhydroxylázu (TH; Obrázek 6B) kromě záznamu kationtového proudu aktivovaného hyperpolarizací (I_h) a umístění mapovací buňky (Čísla 6B a S5).

Nejprve jsme zaznamenali proudovou svorku během fotostimulace LH vstupů exprimujících ChR2 a pozorovali jsme, že 23 neuronů 27 vykázala časově uzamknutou odpověď na fotostimulaci LH vstupů (Obrázek 6C). Většina DA neuronů odebraných ve VTA obdržela čistý excitační vstup od LH (56%), zatímco jiná podskupina vykázala čistou inhibici (30%; Obrázek 6C). Prostorové rozložení těchto DA neuronů je mapováno na atlas pro horizontální řezy obsahující VTA (Obrázek 6D).

Pro stanovení monosynaptického příspěvku vstupů LH do neuronů VTA DA jsme použili mapování obvodů s podporou ChR2, kde byly prováděny záznamy napěťových kleští v přítomnosti tetrodotoxinu (TTX) a 4-aminopyridinu (4AP; Petreanu et al., 2007) . V souladu s našimi pozorováními ze záznamů proudových svorek jsme zjistili, že většina zaznamenaných neuronů VTA DA dostávala výhradně excitační monosynaptický vstup z LH (67%), ve srovnání s neurony VTA DA, které dostávaly výhradně inhibiční monosynaptický vstup (11%), nebo oba (22%; Čísla 6E a S6).

Neurony VTA GABA jsme identifikovali injekcí fluoroforu závislého na Cre (AAV₅-DIO-mCherry) do VTA myší VGAT :: Cre a využily expresi mCherry k nasměrování záznamu neuronů VTA GABA (n = 24; Obrázek 6F). Čtyřicet šest procent neuronů VTA GABA odpovědělo s čistou excitací, zatímco 54% reagovalo s čistou inhibicí na fotostimulaci LR vstupů exprimujících ChR2 (Obrázek 6G). Prostorové rozložení těchto buněk je uvedeno v Obrázek 6H. Při zkoumání monosynaptického vstupu z LH (jak je popsáno výše) jsme zjistili, že 18% vzorkovaných neuronů GABA dostalo výlučně excitační vstup a 9% dostalo výlučně inhibiční vstup (Obrázek 6Já). Avšak vzhledem k neuronům VTA DA jsme zjistili, že více neuronů VTA GABA dostalo jak excitační AMPAR zprostředkovanou, tak inhibiční GABA_AR-zprostředkovaný monosynaptický vstup z LH (73%; chí-kvadrát = 5.0505, p = 0.0246; Čísla 6Já a S6).

Vzhledem k tomu, že naše nahrávky ex vivo poskytly důkazy podporující robustní vstup projekcí LH jak z GABAergic, tak z glutamatergic na VTA, jsme dále zkoumali roli každé složky nezávisle. K tomu jsme použili transgenní myší linie exprimující Cre-rekombinázu v neuronech, které exprimovaly buď vezikulární glutamátový transportér 2 (VGLUT2) nebo vezikulární GABA transportér (VGAT). Injekčně jsme aplikovali AAV₅-DIO-ChR2-eYFP nebo AAV₅-DIO-eYFP do LH myší VGLUT2 :: Cre a VGAT :: Cre a implantovalo optické vlákno přes VTA (Obrázek S7). Tato zvířata pak byla podrobena každému z behaviorálních testů znázorněných v Obrázek 5.

Nepozorovali jsme žádné zjistitelné rozdíly v počtu vstupů do portu provedených na narážku mezi myšmi exprimujícími ChR2 nebo eYFP v LH^nadbytek-VTA projekce (Obrázek 7A) nebo v LH^GABA-VTA projekce (Obrázek 7B). Při analýze videa jsme však v LH zaznamenali aberantní chování nahlodávání^GABA-VTA: Skupina ChR2 po osvětlení modrým světlem (viz Filmy S3 a S4). V LH^nadbytek-VTA myši, ačkoliv ve fotostimulaci ve skupině ChR2 ve srovnání se skupinou eYFP byl trend ke snížení krmení, nebyl to statisticky významný (Obrázek 7C). Na rozdíl od toho jsme pozorovali výrazné prodloužení doby strávené krmením u sated myší po osvětlení LH^GABA-VTA: skupina ChR2 vzhledem k kontrolám (Obrázek 7D a Film S3). U žádné skupiny zvířat nebyl v testu odtažení ocasu účinek stimulace světla (Čísla 7E a 7F).

Během úkolu krmení, jako jsme to udělali během úkolu hledání sacharózy, jsme znovu zaznamenali aberantní motorické sekvence související s krmením, které nebyly zaměřeny na jídlo. Natáčeli jsme reprezentativní myš v LH^GABA-VTA: Skupina ChR2 v prázdné průhledné komoře a po 20 Hz fotostimulaci jsme pozorovali neobvyklé chutné motorické sekvence, jako je lízání a hlodání podlahy nebo prázdného prostoru (Film S4). Kvantifikovali jsme toto „hlodání“ chování během úkolu krmení v divokém typu LH-VTA (Obrázek 7G), LH^nadbytek-VTA (Obrázek 7H) a LH^GABA-VTA (Obrázek 7I) skupiny a ukázal, že LH^GABA-VTA: myši ChR2 hlodaly více než divoký typ nebo LH^nadbytek-VTA: ChR2 myši, když byly fotostimulovány, ve srovnání s jejich příslušnými skupinami eYFP (Obrázek 7J). Zvažovali jsme, zda by aberantní chování související s krmením mohlo být odděleno od vhodně zaměřeného krmení při nižších frekvencích. Když jsme však testovali LH^GABA-VTA: ChR2 skupina s 5 Hz a 10 Hz sledy modrého světla, pozorovali jsme proporcionální vztah mezi stimulační frekvencí a krmením a hlodáním (Obrázek 7K).

Projekce LH do VTA byla zkoumána pomocí kolizních studií elektrické stimulace (Bielajew a Shizgal, 1986) a dlouhodobě se předpokládá, že bude hrát roli při zpracování odměn (Hoebel a Teitelbaum, 1962, Margules and Olds, 1962), a přesto to upřesňuje. role byla výzvou. Zde poskytujeme podrobnou disekci o tom, jak jednotlivé komponenty smyčky LH-VTA zpracovávají různé aspekty úkolu souvisejícího s odměnou.

Prostřednictvím použití optogeneticky zprostředkovaného fototaggingu (Obrázek 1) jsme identifikovali dvě oddělené populace neuronů LH: buňky, které vysílají projekce na VTA (typ 1), a buňky, které přijímají zpětnou vazbu od VTA (typ 2; Obrázek 2) - ačkoli tyto populace se nemusí vzájemně vylučovat, protože je možné, že LH neurony mohly posílat i přijímat vstupy do a z VTA. Je zajímavé, že jsme zjistili, že relativně málo fotoreaktivních neuronů spadlo mimo bimodální distribuci zapouzdřující tyto dvě populace (Obrázky S2B a 1E). Vzhledem k tomu, v kombinaci s dlouhým zpožděním latence ve fotoodpovědi typu 2 (~ 100 ms), spekulujeme, že může existovat jedna dominantní cesta přispívající k aktivitě neuronů typu 2. Navíc, protože DA váže receptory spojené s G proteinem, kinetika je pomalejší než většina glutamatergických synapsí (Girault a Greengard, 2004) a může vysvětlit tento shluk fotoresponzivních jednotek s latencí 100 ms. Je také možné, že VTA může poskytovat nepřímou zpětnou vazbu přes jiné distální oblasti, přes excitační mezilehlé oblasti, jako je amygdala, nebo s dezinhibicí přes nucleus accumbens (NAc) nebo lůžkové jádro stria terminalis (BNST).

Je zajímavé, že zatímco fotostimulace jednotek typu 1 evokuje excitační reakce v jednotkách typu 2, jednotky typu 1 a 2 vykazují odlišné vlastnosti kódování chování. Například počty jednotek typu 1 a typu 2, které selektivně kódují tágo predikující odměnu, se významně liší (n = 0/19 typ 1 versus n = 12/34 typ 2, chí-kvadrát = 8.67, p = 0.003) . Tento paradoxní vzor odezvy by mohl být způsoben výpočetními procesy na prostředním prvku obvodu, jako je VTA, které mohou hrát aktivní úlohu během úlohy chování, ale neaktivní během fototagování. Způsob zpracování těchto údajů může navíc ovlivnit stav chování zvířete.

Naše experimenty s vynecháním odměny nám umožnily rozlišovat mezi LH neuronovým kódováním ČR a spotřebou nepodmíněného stimulu (US). V těchto experimentech podskupina jednotek typu 2 odpověděla na odměnu prediktivní (CS) a USA a také vykázala snížení rychlosti střelby, když byly vynechány očekávané odměny. Kromě toho podmnožina jednotek typu 2 také vykazuje fázové buzení při neočekávaném odměňování (Čísla 4G a 4H). Tyto údaje připomínají způsob, jakým DA neurony ve VTA kódují chybu predikce odměny (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Spekulujeme, že neurony VTA mohou přenášet chybové chybové signály predikce odměny do podmnožiny LH neuronů, které jsou v dobré pozici pro integraci těchto signálů pro určení vhodného chování. Konkrétně je LH silně propojen s řadou dalších oblastí mozku (Berthoud a Münzberg, 2011) a byl kauzálně spojen s homeostatickými stavy, jako je spánek / vzrušení a hlad / sytost (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Kompulzivní chování při hledání odměny bylo primárně diskutováno v souvislosti s drogovou závislostí, kde klasickým paradigmatem pro kompulzivní hledání drog bylo zkoumání míry, do jaké chování při hledání drog přetrvává tváří v tvář negativním důsledkům, jako je šok nohou (Belin a kol., 2008, Pelloux a kol., 2007, Vanderschuren a Everitt, 2004). Upravili jsme tento úkol pro hledání sacharózy, abychom mohli vyšetřit, zda aktivace dráhy LH-VTA byla dostatečná k podpoře nutkavého hledání sacharózy. Vzhledem k tomu, že zřetelným rozdílem mezi drogou a přirozenou odměnou je, že odměny za užívání drog nejsou nutné k přežití, vedou se spory o tom, jaké chování by představovalo nutkavé chování při hledání sacharózy nebo potravy. Alternativní interpretace našich dat je, že aktivace dráhy LH-VTA jednoduše zvyšuje motivační pohon nebo nutkání hledat apetitivní posilovače. Vzhledem k tomu, že v posledních desetiletích vzrostla míra obezity (Mietus-Snyder a Lustig, 2008), převládající stavy a nutkavá závislost na cukru představují hlavní hrozbu pro lidské zdraví (Avena, 2007). Chování při krmení u nasycených (plně krmených) myší po aktivaci dráhy LH-VTA připomíná stravovací chování pozorované u lidí s diagnostikovanou kompulzivní poruchou přejídání (nebo poruchou příjmu potravy) (DSM-V).

Bylo navrženo, že opakované akce vedou k tvorbě návyků, které samy vedou k nutkavému hledání odměn, které charakterizuje závislost (Everitt a Robbins, 2005). Naše zjištění, že neurony LH-VTA kódují vstup portu pouze po kondicionování, naznačuje, že tato cesta selektivně kóduje podmíněnou odpověď, nejen motivovanou akci. To je v souladu s našimi pozorováními, že optická aktivace této projekce může podpořit hledání kompulzivní odměny tváří v tvář negativním důsledkům (Obrázek 5C), stejně jako v nepřítomnosti (jak je vidět u satedovaných myší, Obrázek 5E). Tato interpretace je dále doložena naším zjištěním, že fotoinhibice dráhy LH-VTA selektivně snižuje nutkavé hledání sacharózy (Obrázek 5D), ale neomezuje krmení u myší s omezeným příjmem potravy (Obrázek 5F). Jednou z největších výzev při léčbě nutkavého přejídání nebo poruch příjmu potravy je riziko poškození chování při krmení obecně. Z translačního hlediska jsme možná identifikovali specifický nervový obvod jako potenciální cíl pro vývoj terapeutických intervencí pro nutkavé přejídání nebo závislost na cukru bez obětování přirozeného stravovacího chování.

Ukazujeme, že kromě glutamatergické složky LH-VTA (Kempadoo et al., 2013) existuje v projekci také významná složka GABAergic (Leinninger et al., 2009) a že LH neurony synapse přímo na DA i GABA neurony ve VTA (Obrázek 6). Existuje však rozdíl v rovnováze excitačního / inhibičního vstupu do neuronů VTA DA a GABA.

I když jsme použili imunohistochemické zpracování k ověření identity neuronů VTA, změřili jsme také I_h, hyperpolarizací aktivovaný dovnitř usměrňující nespecifický kationtový proud (Lacey et al., 1989, Ungless a Grace, 2012). Přítomnost tohoto proudu byla široce používána v elektrofyziologických studiích k identifikaci DA neuronů, ale bylo prokázáno, že je přítomen pouze v subpopulacích DA neuronů, vymezených projekčním cílem (Lammel et al., 2011). Ačkoli již dříve bylo v přehledu Fieldse a kolegů navrženo, že „neurony LH se synchronizují na projekce VTA na PFC, ale ne na ty, které promítají na NAc“ (Fields et al., 2007), naše data naznačují, že je třeba tuto kontroverzi znovu otevřít k dalšímu vyšetřování. I když jsme pozorovali podmnožinu DA neuronů, které dostaly čistou excitaci z LH a vlastnily velmi malé I_h (v souladu s mPFC- nebo NAc mediálními skořepinami DA projektujícími neurony) jsme také pozorovali podskupinu DA neuronů, které získaly čistý excitační vstup a vykazovaly velké I_h (v souladu s charakteristikami DA neuronů promítajících se do laterální skořápky NAc; Obrázek S5; Lammel et al., 2011). Naopak, neurony VTA DA, které dostaly čistý inhibiční vstup, vykazovaly velmi malé I_h nebo postrádal tento proud, což je v souladu s představou, že LH posílá převážně inhibiční vstup na neurony VTA DA vyčnívající do mPFC nebo do mediálního pláště NAc. Ukazujeme také, že vstupy LH lze pozorovat jak v mediální, tak v laterální VTA, což naznačuje, že LH poskytuje vstupy do neuronů VTA s různými projekčními cíli, protože je známo, že projekční cíl VTA do určité míry odpovídá prostorovému umístění podél mediální-laterální osy ( Lammel et al., 2008).

Role dráhy LH-VTA při podpoře odměny byla dříve připisována glutamatergickému přenosu ve VTA (Kempadoo et al., 2013), protože promotor CaMKIIα je často považován za selektivní pro neurony excitační projekce. Naše data však jasně ukazují, že exprese ChR2 pod kontrolou promotoru CaMKIIα se také zaměřuje na neurony GABAergické projekce v LH (Obrázek 6).

Chování vyvolané fotostimulací LH^GABA-VTA cesta byla šílená, špatně zaměřená a maladaptivní (Film S4). Jedna interpretace je ta aktivace LH^GABA-VTA cesta pošle signál myši, která způsobí rozpoznání apetitivního zesilovače. Alternativní interpretace je, že LH^GABA-VTA cesta může vést k motivační význačnosti nebo k intenzivnímu „chtění“, v souladu se signálem podmíněným podmíněným přístupem, ale na nefyziologické úrovni, která vytváří toto aberantní chování související s krmením (Berridge a Robinson, 2003). V souladu s tím je možné, že aktivace LH^GABA-VTA projekce ve skutečnosti vyvolává intenzivní pocity touhy nebo nutí k jídlu. Naše experimenty však ukazují, že aktivace LH^GABA-VTA nevede ke zvýšení kompulzivního hledání sacharózy, ale je to pravděpodobně kvůli nadměrnému hlodání a aberantním chutným chováním zaměřeným na nepotravinové předměty v testovací komoře. Ačkoli je obtížné určit zkušenosti myši během této manipulace, je jasné, že vhodně zaměřené chování související s krmením vyžaduje koordinovanou aktivaci jak GABAergických, tak glutamatergických složek dráhy LH-VTA.

Optogenetické a farmakogenetické manipulace jsou mocnými nástroji pro navazování kauzálních vztahů, ale neodhalují endogenní, fyziologické vlastnosti prvků nervových obvodů. Naše studie sjednocuje informace o synaptické konektivitě, přirozeně se vyskytující endogenní funkci a kauzální roli cesty LH-VTA a poskytuje novou úroveň vhledu do toho, jak jsou informace integrovány do tohoto obvodu. Tyto výsledky zdůrazňují důležitost zkoumání funkční úlohy neuronů pomocí konektivity kromě genetických markerů. Neurony LH-VTA selektivně kódovaly akci hledání odměny, ale nekódovaly podněty prostředí, zatímco odměny stimulů a odměny prediktivní byly kódovány diskrétní populací neuronů LH po proudu od VTA. Kromě toho jsme identifikovali specifickou projekci, která je kauzálně spojena s nutkavým hledáním sacharózy a krmením. Heterogenita v projekci LH-VTA je nezbytná pro zajištění adaptivní rovnováhy mezi motivací k řízení a regulací vhodně zaměřených chutí chování. Tato zjištění poskytují poznatky týkající se patologických stavů, jako je nutkavá porucha přejídání, závislost na cukru a obezita