Inzulín aktivuje receptory inzulínu (InsRs) v hypotalamu, aby signalizoval sytost po jídle. Rostoucí výskyt obezity, který má za následek chronicky zvýšené hladiny inzulínu, však znamená, že inzulín může působit také v mozkových centrech, které regulují motivaci a odměnu. Uvádíme zde, že inzulin může zesílit uvolňování dopaminu (DA) závislého na akčním potenciálu v nucleus accumbens (NAc) a putamen-putamen prostřednictvím nepřímého mechanismu, který zahrnuje striatální cholinergní interneurony, které exprimují InsR. Kromě toho dvě různé chronické stravovací manipulace u potkanů, potravinové omezení (FR) a obezogenní (OB) strava, naopak, mění citlivost striatálního DA uvolňování na inzulin, se zvýšenou reaktivitou u FR, ale ztrátou citlivosti u OB. Behaviorální studie ukazují, že neporušené hladiny inzulínu ve skořápce NAc jsou nezbytné k získání preference pro chuť párového roztoku glukózy. Tato data společně naznačují, že striatální inzulínová signalizace zvyšuje uvolňování DA k ovlivnění volby jídla.

Je dobře známo, že dlouhodobé zvyšování plazmatického inzulínu během a po jídle aktivuje inzulínové receptory (InsRs) v hypotalamu, což poskytuje negativní zpětnou vazbu k chutným obvodům, které snižují další stravování^{1, 2, 3}. Mozkový inzulín je odvozen především z pankreatických β buněk, s aktivním transportem z plazmy do mozku v hematoencefalické bariéře^{4, 5, 6, 7, 8}, ačkoli existuje stále více důkazů o syntéze a uvolňování inzulinu neuronů^{1, 9}. Pozoruhodně, exprese InsRs není omezena na hypotalamus, ačkoli funkce mim hypotalamických InsR zůstává nevyřešena^{1, 2, 3}. Vzhledem k rostoucímu výskytu obezity a diabetu typu II, při kterém jsou neustále zvyšovány cirkulující hladiny inzulínu a snížený transport mozku a citlivost na receptor,^{3, 8, 10, 11}, je důležité porozumět funkci inzulínu v mozkových oblastech, které regulují motivaci a odměnu. Oblasti zvláštního zájmu mozku zahrnují nucleus accumbens (NAc), které zprostředkovává prospěšné účinky potravin i drog^{12, 13}, a caudate – putamen (CPu), který hraje roli v návycích a touze po návycích¹³. InsR jsou vyjádřeny v těchto regionech, s nejvyšší hustotou vyskytující se v NAc^{3, 14}; InsR jsou také vyjádřeny neurony dopaminu (DA) ve středním mozku, včetně neuronů ve ventrální tegmentální oblasti (VTA) a substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Hladiny inzulínu v mozku jsou úměrné koncentrací inzulínu v plazmě a tělesné adipozitě^{6, 7, 8}, což vede k hypotéze, že by inzulín mohl působit v InsR v těchto oblastech mozku a ovlivňovat odměnu za jídlo^{3, 16, 17}.

Předchozí studie striatálních synaptosomů, heterologních buněk, řezů mozku a in vivo prokázali, že inzulínová aktivace InsR vede ke zvýšení absorpce DA transportérem DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Tento proces zahrnuje signální dráhu PI3 kinázy^{19, 20}a vede k zavedení DAT do plazmatické membrány¹⁹. Cirkulační hladiny inzulínu dynamicky modulují striatální aktivitu DAT se sníženou absorpcí DA a povrchovou expresí DAT pozorovanou na zvířecích modelech diabetu a po omezení potravin (FR)^{20, 21}. Bylo prokázáno, že zvýšení aktivity DAT na inzulínu snižuje evokovanou extracelulární koncentraci DA ([DA])_o) ve VTA²³, což odráží posun v rovnováze mezi uvolněním DA a absorpcí. V souladu se zavedenou úlohou inzulínu v sytosti může akutní mikroinjekce inzulínu do VTA snížit odměnu za jídlo^{23, 24}, zatímco myši postrádající InsR v neuronech VTA a SNc DA vykazují zvýšený příjem potravy a jsou obézní²⁵. I když inzulín může vyvolat dlouhodobou depresi excitačního vstupu do neuronů VTA DA²⁴, opět v souladu s úlohou v sytosti, může expozice inzulínu také zvýšit rychlost vypalování DA neuronů, pravděpodobně snížením uvolňování DA a inhibicí zprostředkovanou autoreceptorem²⁵. Čistý účinek inzulínu na uvolňování striatálního DA je proto obtížné předvídat. Výsledky studií vlivu inzulínu na uvolňování striatalu DA ve skutečnosti ex vivo plátky¹⁹ a účinek lokální mikroinjekce inzulínu do NAc na odměnu za jídlo²⁶ zdá se být v rozporu. Abychom to vyřešili, hodnotili jsme uvolňování axonalu DA a absorpci v intaktním mikroprostředí NAc a CPu v ex vivo striatální řezy pomocí rychlé skenovací cyklické voltametrie (FCV) a určovaly účinky inzulinové signalizace v NAc na chování odměňování in vivo.

Naše studie ukazují, že primárním účinkem inzulínu v NAc a CPu je zvýšení uvolňování DA, a to i přes současné zvýšení absorpce DA. Tato dynamická regulace uvolňování DA zahrnuje inzulínově závislé zvýšení excitability striatálních cholinergních interneuronů (ChI), což vede ke zvýšenému uvolňování DA aktivací nikotinových acetylcholinových (ACh) receptorů (nAChRs). Vliv inzulínu na ChI a na uvolňování DA je zprostředkován InsRs. Zejména účinek inzulinu na uvolňování DA je zesílen v plátcích od krys FR, ale u potkanů ​​je otupen na obezogenní (OB) stravě. Tato data ukazují zesílení DA uvolnění v roce 2007 ex vivo plátky inzulínu vedou k předpovědi, že by inzulín mohl fungovat jako odměnový signál in vivo. Ve skutečnosti paralelní behaviorální studie prokazují roli inzulínu ve skořápce NAc v kondici preferované chuti. Tato zjištění společně naznačují novou roli inzulínu jako signálu odměny, který může ovlivnit výběr jídla

Inzulín působící na InsR zvyšuje evokované uvolnění striatálního DA

Počáteční prohlídka místně vyvolaného [DA]_o monitorováno pomocí FCV v roce 2007 ex vivo striatální plátky od krys s podle libosti (AL) přístup k potravě a vodě odhalil neočekávané zjištění, že akutní aplikace inzulínu v celé řadě fyziologicky relevantních koncentrací^{1, 4} zvýšené jednopulsní evokování [DA]_o (Obr. 1a – c), s inzulinem EC₅₀ hodnoty (koncentrace, při které byl účinek poloviční maximální) 2 – 12 nM (Obr. 1b). Zvýšený evokovaný [DA]_o bylo obzvláště překvapivé, vzhledem k tomu, že to bylo doprovázeno významným zvýšením maximální rychlosti (V_max) pro příjem zprostředkovaný DAT v každém subregionu (Tabulka 1), což by vedlo ke konkurenčnímu poklesu evokovaného [DA]_o, jak bylo uvedeno dříve^{22, 23}. Místo toho jsme zjistili, že to vyvolalo [DA]_o byl maximálně amplifikován 20 – 55% pomocí 30 nM inzulínu; region s největším proporcionálním účinkem byl NAc shell, což je striatální podoblast s nejvyšší InsR expresí^{1, 14}. Plátky exponované inzulinu 30 nM za stejných podmínek nevykazovaly žádnou změnu obsahu striatálního DA (Doplňkový obrázek 1a), což znamená, že inzulín mění dynamickou regulaci uvolňování, spíše než jednoduše reguluje DA syntézu. Zejména účinek inzulínu na evokovaný [DA]_o byla ztracena při suprafyziologických koncentracích ≥100 nM (Obr. 1b). Nebyl to výsledek zvýšeného předčasného uvolňování aktivity DAT, jako účinek inzulínu V_max při těchto koncentracích byl také ztracen (Tabulka 1). Celkově tato data ukazují, že v intaktním striatálním mikroprostředí převažoval účinek inzulínu na evokovaný [DA]_o je zvýšení uvolňování, a to i přes současné zvýšení absorpce DA.

  

  

(a) Průměrně vyvolaný jedním impulsem [DA]_o v NAc shell, NAc core a CPu před a po inzulinu (Ins) ilustrovaném pro 30 nM; chybové pruhy vynechány, ale vidět (b); šipky označují čas stimulu. Inzulín zvýšený evokovaný [DA]_o ve skořápce (o 55 ± 10%), jádro (o 37 ± 5%) a CPu (o 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Účinek inzulínu byl závislý na koncentraci ve fyziologickém rozmezí (1 – 30 nM) ve skořápce (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), jádro (n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) a CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), ale ztracena při ≥ 100 nM. (c) Reprezentativní nahrávky vrcholně evokovaného [DA]_o proti času na jednom místě v jádru NAc v nepřítomnosti aplikace léčiva (Con), během aplikace inzulínu (30 nM) nebo když byl inzulin aplikován v přítomnosti inhibitoru InsR HNMPA (5 μM). (d) Průměrně vyvolaný vrchol [DA]_o údaje ukazující prevenci účinku inzulínu (30 nM) pomocí HNMPA, InsR antagonisty S961 (1 μM) a inhibitoru PI3K LY294002 (1 μM), ale ne inhibitorem IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 versus samotný inzulin). Pro Obr. 1a – d, n= počet míst na podoblast od krys 3 – 6 pro každou koncentraci léčiva nebo inzulínu; jednosměrná ANOVA, Tukeyův test upřímnosti (HSD). Vidět Doplňkový obrázek 1b, c pro data NAc shell a CPu.

• Obrázek v plné velikosti (98 KB)

 

 

Protože inzulín může také působit na receptory růstového faktoru typu 1 podobné inzulínu (IGF-1R), i když při koncentracích vyšších než 100 nM (ref. 1), snažili jsme se potvrdit, že zvyšující se účinek inzulínu na vyvolaný [DA]_o byla závislá na InsR. Ukázalo se, že tomu tak je, protože tomuto účinku zabránil intracelulární inhibitor InsR, kyselina hydroxy-2-naftalenylmethylfosfonová (HNMPA) a antagonista InsR, S961, ale nikoli selektivní inhibitor IGF-1R, picropodophyllin.²⁴ (PPP; Obr. 1c, d a Doplňkový obrázek 1b, c). Poté jsme zkoumali zapojení PI3 kinázy, která iniciuje signální dráhu zodpovědnou za inzulínově závislou regulaci DAT¹⁹. Při koncentraci 1 μM neměl samotný inhibitor P13K LY249002 žádný účinek na vrchol vyvolaný [DA]_o or V_max (n= 29 – 76 místa (jádro NAc) na lék, P> 0.05, jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA); data nejsou zobrazena), přesto zabránila účinku inzulínu na vyvolanou [DA]_o ve všech striatálních podoblastech (Obr. 1d a Doplňkový obrázek 1b, c).

Lokalizace InsR na DA axonech a ChI

Zjištěný nárůst v% V_max pro vychytávání DA s fyziologickými hladinami inzulínu vyplývá přítomnost InsR na DA axonech, stejně jako předchozí výsledky v různých striatálních přípravcích^{18, 19, 20, 21, 22}. Přestože byla prokázána funkční exprese InsR na DA neuronech midbrain^{15, 23, 24, 25}, Exprese InsR na striatálních DA axonech nebyla uvedena. Řešili jsme to pomocí imunohistochemie. Hustá imunoreaktivita InsR během striata omezené kvantitativní hodnocení lokalizace InsR na DA axonech, které byly identifikovány imunoreaktivitou pro enzym syntetizující DA, tyrosinhydroxylázu (TH). Proto jsme přijali dříve ohlášený protokol²⁷, což zahrnovalo počítání InsR puncta, které se překrývalo s profily TH + v normálním zobrazení obrazu, a počítání znovu poté, co byl snímek InsR otočen pouze o 90 °. Pokud zjevné překrývání profilů InsR a TH + bylo nespecifické, měl by tento postup poskytnout statisticky podobné počty, ať už normální nebo 90 ° mimo fázi. Tato analýza však ukázala snížení překrývání InsR puncta s profily TH + 14 ± 9% (n= Pole 42, P<0.01, spárovaný dvoustranný t-test; data nejsou zobrazena), potvrzující přítomnost InsR na DA axonech. Ještě zajímavější je však, že InsR imunoznačení striata odhalilo výraznou expresi InsR na velkých buněčných tělech, která byla identifikována jako striatální ChI společným imunoznačením cholin acetyltransferázy (ChAT), primárního enzymu vyžadovaného pro syntézu ACh. Využití elektrofyziologických kritérií²⁸ pro identifikaci ChI v předběžných studiích o celých buňkách bylo několik neuronů naplněno biocytinem a poté zpracováno pro imunohistochemii; všechny tyto (4 / 4) byly imunopozitivní jak pro InsR, tak pro ChAT (Obr. 2a). Následné vyhodnocení ko-lokalizace InsR a ChAT v NAc potvrdilo, že prakticky všechny neurony ChAT + exprimovaly InsR (96%; n= Neurony 27 / 28 ve čtyřech řezech od dvou krys).

  

  

(a) ChI naplněné biocytinem, poté imunoznačené pro ChAT, a InsR (zástupce CHI vyplněných biocytinem 4 / 4); sloučený obrázek ukazuje ko-lokalizaci; měřítko, 10 μm. (b-e) Reakce striatálních ChI na řadu depolarizačních proudových impulsů (doba trvání 3; 200, 300 a 400 pA; intervaly 120) před a po inzulínu (30 nM). (b) Adaptace špičkové frekvence v ChI (horní) je patrná ve ztrátě akčního potenciálu (AP) při současném vstřikování, zatímco špičkování přetrvává po celý aktuální pulz v inzulínu (nižší); kompletní soubor dat zobrazený v d, (c) Reprezentativní časový průběh inzulínem indukovaného zvýšení počtu AP s každým aktuálním krokem pro ChI v b, (d) Shrnutí čísla AP během aktuálních pulzů dodaných před a při maximálním účinku expozice inzulínu (n= Stimulace spárované 21, neurony 7, krysy 5) (e) Průměrné odpovědi ukazující účinek inzulínu (+ Ins) za kontrolních podmínek (Con; n= Stimulace spárované 21, neurony 7, ***P<0.001, spárovaný dvoustranný t-test), v přítomnosti HNMPA (5 μM) (n= Stimulace spárované 12, neurony 4, krysy 4, P>0.05, spárovaný s dvěma ocasy t-test) a v přítomnosti PPP (1 μM) (n= Stimulace spárované 18, neurony 6, krysy 6, **P<0.01, Wilcoxon porovnal pár podepsaný test pozice). (f) Průměrně vyvolaný jedním impulsem [DA]_o v jádru NAc před a po inzulínu (30 nM) v mecamylaminu (Mec; 5 μM) nebo DHβE (1 μM) normalizovaném na 100% kontrolu maxima (n= 20 – 40 místa na podoblast a podmínku od krys 3 – 4, P> 0.05 proti kontrole, nepárové t-test). (g) Průměrně vyvolaný jedním impulsem [DA]_o v řezech předního mozku z heterozygotní kontroly (Het) a Povídat si KO myši před a po inzulínu (30 nM), normalizované na 100% kontrolu maxima. Inzulín zvýšený evokovaný [DA]_o u heterozygotních myší 190 ± 23% v NAc shell, 140 ± 8% v NAc jádru a 137 ± 12% v CPu (n= 15 – 25 místa na podoblast od 3 – 4 myší na genotyp, **P<0.01, ***P<0.001 versus kontrola nepárová t-test), ale neměl žádný účinek na evokované [DA]_o ve všech striatálních podoblastech Povídat si Myši KO (P> 0.1).

• Obrázek v plné velikosti (167 KB)

 

 

Inzulín zvyšuje ChI excitabilitu

Abychom otestovali funkčnost InsRs na striatálních ChI, zkoumali jsme vliv inzulínu na excitabilitu ChI pomocí celobuněčného záznamu se svorkami proudu. ChI excitabilita byla hodnocena pomocí série 3ových depolarizačních proudových impulsů k vyvolání řady akčních potenciálů, které spolehlivě vykazovaly přizpůsobení frekvencí špiček (Obr. 2b), často se ztrátou špičky na konci aktuálního pulzu. Je zajímavé, že inzulín (30 nM) zeslabil adaptační frekvenci špiček, což vedlo k postupnému zvyšování počtu akčního potenciálu v čase (Obr. 2c), s maximálním zvýšením (Obr. 2d, e. Obr) obvykle pozorované mezi 20 a 50 min. expozice inzulínu. V nepřítomnosti inzulínu nevykazovaly kontrolní ChI žádnou změnu v počtu vyvolaných akčních potenciálů (P> 0.05, spárovaný dvoustranný t-test; data nejsou zobrazena); ve srovnání s kontrolními neurony sledovanými ve stejném časovém intervalu, neurony vystavené inzulínu vykázaly významně větší změnu v počtu vyvolaných akčních potenciálů (kontrola n= 12 stimulační páry ze čtyř neuronů, inzulín n= 21 stimulační páry ze sedmi neuronů, F_1,25= 5.63, P<0.05, obousměrná ANOVA se smíšenými opatřeními; data nejsou zobrazena). Účinku inzulínu na zvýšení počtu akčních potenciálů zabránila HNMPA, ale nikoli selektivní inhibitor IGF-1R PPP (Obr. 2e), což ukazuje, že zvýšená ChI excitabilita inzulínem byla zprostředkována InsR.

Inzulinové vylepšení vyvolané [DA]_o vyžaduje nAChRs a ACh

Předchozí studie ukázaly, že ChI a ACh silně regulují uvolňování striatálního DA prostřednictvím nAChR na DA axonech^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Bohatá exprese InsR na ChI a zvýšení ChI excitability pozorované při akutní expozici inzulínu naznačují, že tyto neurony by mohly být novými cíli pro inzulín, což by mohlo vést ke zvýšenému uvolňování DA. Abychom to otestovali, zkoumali jsme účinek inzulínu v přítomnosti mecamylaminu, neselektivního nAChR antagonisty nebo dihydro-β-erythroidinu (DHβE), selektivního antagonisty pro nAChR obsahující β2 (β2 *), které jsou obohaceny o nAChR DA axony³⁵. Evokováno [DA]_o byl snadno detekován v přítomnosti těchto antagonistů, i když obě léčiva snížila amplitudu jediného pulsu vyvolaného [DA]_o (například o 13 – 26% v jádru NAc), jak bylo uvedeno dříve^{29, 30, 31, 32}. Na podporu role ACh a nAChR je účinek inzulínu na evokovaný [DA]_o bylo zabráněno buď mecamylaminem nebo DHβE (Obr. 2f). Abychom potvrdili zapojení striatální ACh signalizace do uvolňování DA zvýšeného inzulínem, zkoumali jsme účinek inzulínu v ex vivo striatální plátky z myší, u nichž byla exprese ChAT geneticky odstraněna ve strukturách předního mozku (předního mozku) Povídat si Myši KO), včetně striata³². Ačkoli jsou tyto myši u těchto myší intaktní, syntéza ACh je zrušena, což vede ke snížení, ale stále snadno detekovatelnému jedinému pulsu vyvolanému [DA]_o, jak bylo popsáno výše³². U kontrolních heterozygotních vrhů se inzulin (30 nM) zvýšil evokovaný [DA]_o ve skořápce a jádru NAc a v CPu o 37 – 90% (Obr. 2g), překračující amplifikaci pozorovanou u striata potkana (například Obr. 1). Účinek inzulínu na vyvolaný [DA]_o chyběl v celém striatálním komplexu v předním mozku Povídat si Myši KO, prokazující, že inzulinem zprostředkované zvýšení uvolňování DA vyžaduje striatální ACh, ale nikoli současně uvolňované vysílače z ChI, jako je glutamát³⁶.

Vliv inzulínu na vyvolaný [DA]_o je závislý na stravě

Koncentrace inzulínu v plasmě a mozku jsou úměrné adipozitě těla^{6, 7, 8}a může vést k kompenzačním změnám citlivosti mozku na inzulín. Proto jsme testovali hypotézu, že strava ovlivňuje schopnost inzulínu podporovat uvolňování DA, pomocí striatálních plátků od potkanů ​​udržovaných buď u chronické FR nebo OB stravy oproti AL kontrolám. Jak se očekávalo, hladiny plazmatického inzulínu korelovaly s tělesnou hmotností, s nižším inzulinem u FR než u AL nebo OB krys (Obr. 3a a Tabulka 2). Navzdory těmto rozdílům v cirkulujícím inzulínu, vrcholil [DA]_o ve skořápce a jádru NAc a CPu byl v roce 2007 výrazně nižší ex vivo striatální plátky z obou skupin stravy ve srovnání s AL (Obr. 3b a Doplňkový obrázek 2 a, b), z čehož plyne, že kromě inzulínu regulují absolutně evokované faktory [DA]_o. Striatální obsah DA se nelišil mezi skupinami stravy, což naznačuje změnu regulace uvolňování spíše než v syntéze DA (Doplňkový obrázek 2c). V souladu se změnou dynamické regulace byla citlivost striatálního DA uvolňování na inzulin výrazně závislá na stravě. U FR potkanů ​​koncentrace inzulínu ≤ 1 nM, které neměly žádný účinek na AL (Obr. 1b), zvýšené evokované [DA]_o (Obr. 3c), což odráží zvýšenou citlivost na inzulín, s EC₅₀ hodnoty ve FR striatu (0.4 – 0.6 nM), které byly přibližně o řád nižší než v AL (porovnat Obrázky 1b a 3c). V pozoruhodném kontrastu byl účinek inzulínu ztracen v OB striatum; dokonce 30 nM inzulín, který měl maximální účinek na AL striatum (Obr. 1b), neměl žádný účinek v OB (Obr. 3c).

  

  

(a) Koncentrace inzulínu v plazmě pozitivně koreluje s tělesnou hmotností napříč skupinami krmení (R= 0.76). (b) Průměrně vyvolaný jedním impulsem [DA]_o v jádru NAc (viz Doplňkový obrázek 2a, b pro NAc shell a CPu) byl nižší ve FR (38 ± 4%) a OB (25 ± 4%) oproti AL (n= Weby 50 – 60 od krys 5 – 6 na dietní skupinu, F_2,156= 23.337, jednosměrná ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB versus FR (P<0.08). (c) Citlivost vyvolaného [DA]_o na inzulín byl zvýšen u FR, ale ztracen v OB (n= 21 – 49 místa na subregion na koncentraci z krys 2 – 4 na dietní skupinu, jednosměrná ANOVA, Tukey HSD), s větší citlivostí u FR oproti AL potkanům ve všech podoblastech (P<0.001 pro každou oblast; obousměrná ANOVA; Procesor: F_{(konc. strava; 3,286)}= 10.253; jádro: F_{(konc. strava; 3,353)}= 6.166; skořápka: F_{(konc. strava; 3,195)}= 10.735).

• Obrázek v plné velikosti (124 KB)

 

 

Tato data naznačují inverzní vztah mezi striatální citlivostí InsR a tělesnou adipozitou. Alternativně však tyto rozdíly závislé na stravě mohou odrážet změněnou citlivost nAChR. Proto jsme stanovili koncentrační odpověď na nikotin v jádru NAc z každé dietní skupiny. Nikotin způsobuje desenzibilizaci nAChR, kterou lze kvantifikovat porovnáním poměru [DA]_o vyvolané krátkým sledem pěti pulzů při 100 Hz na jednopulsní vyvolané [DA]_o (Poměr 5 p: 1 p) jako index aktivace / znecitlivění nAChR^{30, 31}. Pomocí tohoto přístupu jsme nezjistili žádné rozdíly mezi skupinami stravy v citlivosti nAChR v jádru NAc (Doplňkový obrázek 3a – c). Navíc poměr kontrolních 5 p: 1 p se nelišil mezi skupinami stravy v jádru NAc (Doplňkový obrázek 3d) nebo CPu (není znázorněno), což znamená, že strava nemění regulaci uvolňování DA v závislosti na nAChR. Zdá se tedy, že striatální InsR senzitivita je zvýšena u FR oproti AL potkanům, ale u OB potkanů ​​chybí, se ztrátou regulace striatálního DA uvolňování ve fyziologických koncentracích inzulínu.

Inzulín NAc shell moduluje preferovanou chuťovou chuť

Potravinové preference se vytvářejí jak před, tak po požití; mechanismy pro každý nejsou úplně vyřešeny, ale současný důkaz implikuje NAc DA signalizaci v obou^{37, 38}. Vzhledem k tomu, že hladiny inzulínu v plazmě a mozkomíšním moku (CSF) rychle stoupají po zvýšení periferní glukózy⁶a že zvýšení inzulínu ve striatu lze detekovat během 5 min po zvýšení plazmatického inzulínu⁷, je logické předpokládat, že uvolňování periferního inzulínu během jídla by mohlo zvýšit uvolňování NAc DA a přispět k mechanismům odměňování po požití. Přizpůsobili jsme dříve popsaný protokol preferencí chuti³⁷ s roztokem glukózy slazeným sacharinem u potkanů, aby se testovala hypotéza, že blokování účinku endogenního inzulínu lokální aplikací inzulínové protilátky (InsAb) v NAc by snížilo preferenci pro párovanou chuť. Účinnost InsAb při blokování účinků inzulínu byla testována na in vitro stanovení vychytávání DA do striatálních synaptosomů. Inzulín (30 nM) způsobil významné zvýšení V_max v synaptosomech od NAc nebo CPu (Doplňkový obrázek 4), v souladu s našimi V_max data ze striatálních řezů (Tabulka 1) a s předchozími studiemi^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. V nepřítomnosti inzulínu nezměnil ani InsAb ani kontrolní protilátka imunoglobulin G (IgG) V_max pro vychytávání DA versus kontrola. V přítomnosti IgG inzulín stále způsoboval významné zvýšení V_max; nicméně účinek inzulínu na V_max byl ztracen v přítomnosti InsAb (Doplňkový obrázek 4).

Aby se minimalizovalo poškození tkáně a zachovala se citlivost tkáňového cíle, byly testovány dvě skupiny subjektů, ve kterých jsme střídali intra-NAc mikroinjekci s falešným mikroinjekčním postupem, namísto použití jedné skupiny subjektů a spárování jednoho ochuceného roztoku s InsAb a jiného s vozidlo. V důsledku toho v průběhu relací s přípravou jedné láhve experimentální skupina obdržela mikroinjekce InsAb spárované s jednou ze dvou příchutí a na střídavých sezeních simulované mikroinjekce spárované s druhou příchutí (Obr. 4a, vlevo, odjet). Kontrolní skupina obdržela falešné mikroinjekce střídané s mikroinjekcemi fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS) nebo IgG. Oba ochucené roztoky obsahovaly během kondicionování glukózu. Ve skupině s kontrolní mikroinjekcí se neočekávalo žádné rozdílné preference mezi příchutěmi, zatímco ve skupině s mikroinjekční skupinou InsAb se očekávalo, že se zvýhodní směrem k falešné mikroinjekci.

  

  

(a) Schéma znázorňující kondicionování jedné láhve (vlevo) a testu dvou lahví (vpravo). (b) Objem spotřebovaný (ml) během relací s jednou lahví. Mezi relací kondicionování infekce a léčbou mikroinjekcí došlo k významné interakci (n= Krysy 19 – 20 na skupinu, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 smíšená ANOVA s opakovanými opatřeními při úpravě infuzí). Mikroinjekce InsAb významně snížila spotřebu ve srovnání s kontrolou během třetí (t(40) = 3.026, **P<0.01) a čtvrtý (t(40) = 3.052, **P<0.01, chráněný jednostranný t-test) infuze. Mock injekce neměly žádný vliv na spotřebu v žádné skupině (F_3,111= 1.110, 2 × 4 smíšené ANOVA s opakovanými měřeními v simulované relaci). (c) Objem spotřebovaný během testu preference chuti ve dvou lahvích. Během kondicionování došlo k významné interakci mezi léčbou chutí a mikroinjekcí (F_1,37= 5.36, P<0.05, dvousměrná směs ANOVA s opakovaným měřením chuti). Skupina InsAb konzumovala významně méně příchuti spárované s InsAb ve srovnání s předstíranou příchutí (t(18) = 2.82, ** P<0.01, chráněný jednostranný t-test); kontrolní skupina nevykazovala žádnou chuťovou preferenci (t(19) = 0.803, P> 0.05, chráněno t-test). Ve srovnávacích skupinách pili krysy InsAb výrazně méně příchuti spárované s infuzí (t(40) = 1.96, *P<0.05) a podstatně více falešně spárované chuti (t(40) = 1.77, *P<0.05, chráněný jednostranný t-test) než kontroly.

• Obrázek v plné velikosti (161 KB)

 

 

Během kondicionování s jednou lahví mikroinjekce InsAb významně snížila spotřebu ve srovnání s vehikulem během třetí a čtvrté infuze (Obr. 4b). Naproti tomu obě skupiny spotřebovaly stejný objem roztoku během všech čtyř simulovaných injekcí (F_3,111= 0.127, P>0.05, smíšená obousměrná ANOVA) (Obr. 4b). Po celkem osmi kondicionovacích sezeních byla preference chuti hodnocena ve dvou-lahvovém testu, ve kterém krysy měly přístup k oběma ochuceným roztokům současně (Obr. 4a). Statistická analýza odhalila významnou interakci mezi příchutí a mikroinjekcí ošetřenou během kondicionování (Obr. 4c). Skupina InsAb spotřebovala podstatně méně aroma spárované InsAb ve srovnání s falešnou chutí (Obr. 4c), zatímco skupina vozidel nevykazovala žádnou chuťovou preferenci (Obr. 4c), což znamená, že neporušená signalizace inzulínu přispěla k výběru sladkého kalorického roztoku. Ve srovnání s vehikulem pijí potkani mikroinjektovaní InsAb výrazně méně příchuti spárované s infuzí a výrazně více příchuti spárované injekcí (Obr. 4c). Mikroinjekce IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, chráněno t-testy) nebo PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, chráněno t- testy) neměly žádný vliv na preference chuti (data nejsou uvedena), což argumentuje proti možnosti, že nespecifický účinek mikroinjekce InsAb snížil spotřebu nebo preferenci chuti. Je třeba také poznamenat, že preference skupiny InsAb při testu není preferencí pro méně novou chuť, protože u skupiny InsAb nedošlo k interakci mezi relací a typem relace (skutečná inflace versus simulovaná infuze) (F_3,54= 1.584, P> 0.05, obousměrná ANOVA). To znamená, že skupina InsAb nekonzumovala více příchuti simulované infuze spárované ve srovnání s příchutí spárované infuze InsAb; spíše se rozdíly mezi léčebnými skupinami objevily pouze během relací kondicionování infuzí. Celkově tato data naznačují, že inzulín v NAc hraje roli při posílení preference chuti, která signalizuje glykemickou zátěž.

Uvádíme zde, že inzulin zesiluje striatální DA uvolňování způsobem závislým na nAChR modulací excitability ChI pomocí InsR. Naše výsledky naznačují, že inzulín může sloužit jako odměnový signál, navíc k jeho zavedené úloze v signalizaci sytosti. Zejména účinek inzulinu na uvolňování DA je modulován dietou, se výrazně zvýšenou citlivostí na inzulín po FR, ale úplnou ztrátou regulace zvýšenou na inzulín na OB dietě. Zdá se, že tyto změny odrážejí změny v citlivosti InsR, které nepřímo souvisejí s hladinami cirkulujícího inzulínu, vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že hladiny inzulínu v plazmě jsou závislé na stravě, ale citlivost nAChR nebyla. Naše studie o chuti a preferencích chování zvířat naznačují, že inzulinová signalizace ve skořápce NAc ovlivňuje preference potravin, což implikuje nejen inzulín při učení souvisejícím s potravinami, ale také potvrzuje jeho roli jako odměnového signálu.

Čistá [DA]_o odráží rovnováhu mezi uvolněním DA a absorpcí DA pomocí DAT. Předchozí důkaz prokazující, že inzulín může regulovat aktivitu DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} vedlo k predikci, že zvýšení inzulinu by mělo způsobit čisté snížení evokovaného [DA]_o prostřednictvím zvýšeného příjmu DA. Zjistili jsme však, že ve striatu je účinek inzulínu komplexnější než tento. Přestože se expozice inzulínu zvýšila V_max pro DAT byl primární účinek inzulínu na uvolňování DA, nikoli na vychytávání DA, se stálým zvýšením vyvolaného [DA]_o napříč fyziologickým rozsahem koncentrací inzulínu ve skořápce a jádru NAc a v CPu. Ačkoli nárůst vyvolaný [DA]_o vrátili se k kontrolním hladinám při suprapysiologické koncentraci 100 nM, V_max byl také nezměněn od kontroly, což vylučovalo převládající účinek na DAT jako vysvětlení. Místo toho ztráta účinku na absorpci a uvolňování implikuje desenzibilizaci InsR nebo downregulaci downstream signálních drah při vysokých koncentracích inzulínu. InsRs skutečně procházejí rychlou endocytózou a degradací po vazbě na inzulín v periferních tkáních¹, se objevujícím se důkazem ztráty neuronální InsR citlivosti po krátkodobém vystavení vysokým hladinám inzulínu nebo dietám s vysokou kalorickou hodnotou^{10, 11, 39}.

Dominantní účinek inzulínu na zvýšení uvolňování striatálního DA je zde v rozporu s výsledky dvou posledních nedávných ex vivo slice studies. V první, inzulín způsobil pokles elektricky vyvolaného přetečení [³H] DA ze striatálních plátků, i když se zvýšila [³H] Bylo detekováno přetečení DA, když byl DAT inhibován²². Vzhledem k tomu, že byl vydán [³H] DA musí uniknout absorpci zprostředkované DAT skrz tkáň, která má být detekována v superfúzním roztoku, tento protokol je zvláště citlivý na regulaci DAT. Naše výsledky, které ukazují, že inzulín zvyšuje uvolňování DA prostřednictvím ChI a aktivace nAChR, kromě zvýšení absorpce zprostředkované DAT, by vysvětlily zdánlivě paradoxní zvýšení inzulinu zvýšeného [³H] Přetečení DA pozorované, když byly blokovány konkurenční účinky na DAT²². Druhá studie použila FCV pro přímou detekci somatodendritického uvolňování DA ve VTA, ale také zjistila převládající účinek inzulinu na vychytávání DA, což se projevilo sníženým evokovaným [DA]_o (ref. 23). Rozdíly v řadě faktorů, od lokálních mikroobvodů po somatodendritické versus axonální DA uvolňovací mechanismy⁴⁰, může přispět k tomuto regionálnímu rozdílu. Jak je dále diskutováno níže, regionálně závislé role inzulínu jsou však spíše komplementární, než protichůdné.

Dříve se předpokládalo, že jakákoli role regulace závislosti na inzulínu na signalizaci DA je zprostředkována přímou aktivací InsR na DA neuronech. Ukážeme zde, že InsR jsou také vyjádřeny na striatálních ChI a že inzulin moduluje ChI excitabilitu pro zesílení uvolňování striatálního DA, což může hrát klíčovou roli při ovlivňování inzulínu na stravu. Striatální CHI přijímají projekce z neuronů intralaminárních jader thalamu, které vykazují výpary v reakci na výběžné smyslové podněty a pomáhají řídit výkyvy pauzy v CHI, které jsou důležité při řízení pozornosti, posílení a asociativního učení⁴¹. Proto působení inzulinu na InsR na striatální ChI by mohlo zvýšit účinek senzorických potravinových narážek na striatální reakci na thalamické pálení, což přispívá ke zvýšenému vnímání hodnoty odměny požitého jídla. Přímá propagace striatálního uvolňování DA aktivací ChI vedla k názoru, že faktory, které stimulují CHI, budou mít jako spouštěcí spouště DA privilegovanou roli.³³. Naše data k tomu poskytují první podpůrné důkazy, díky inzulínem vylepšené ChI excitabilitě a ACh signalizaci, která dynamicky zvyšuje uvolňování DA.

Zvýšené uvolňování DA v přítomnosti inzulínu také argumentuje proti zesílení signalizace ACh do té míry, že způsobuje desenzibilizaci nAChR nebo aktivaci muskarinického ACh receptoru (mAChR), z nichž kterýkoli může potlačit jednopulsní evokované [DA]_o (viz 29, 30, 31, 42). Zde uvedené mechanismy se tedy liší od aktivace mAChRs ACh, která byla spojena s averzí a saturací⁴³.

Single-pulse-evokeed [DA]_o byl nižší u obou krys FR a OB než u AL krys; i když tyto výsledky jsou v souladu s předchozími zprávami^{44, 45, 46}, naše studie poskytují první systematické srovnání tří striatálních podoblastí ve dvou skupinách stravy v konstantním časovém rámci. Mechanismy, na nichž jsou založeny změny v uvolňování DA závislé na stravě, nebyly objasněny a jsou mimo rozsah předkládaných studií. Avšak vzhledem k tomu, že plazmatické hladiny inzulínu jsou protichůdně změněny pomocí FR a OB diet, je nepravděpodobné, že by snížené evokované [DA]_o v obou skupinách je důsledkem hladiny inzulínu závislé na stravě.

Na druhé straně, změny v citlivosti InsR s dietou a následné hladiny plasmatického inzulínu závislé na stravě poskytují nejpravděpodobnější vysvětlení zvýšené citlivosti na inzulín u FR a ztráty citlivosti na inzulín u OB. Neexistoval žádný důkaz pro alternativní vysvětlení změněné citlivosti nAChR u potkanů ​​FR nebo OB oproti AL. Ačkoli naše nálezy patří mezi první, které naznačují zvýšenou striatální InsR citlivost s FR¹⁸, úbytek hmotnosti může být doprovázen sníženými hladinami inzulínu v CSF⁷, což by přispělo ke zvýšené citlivosti uvolňování DA na inzulin v FR. Naopak ztráta citlivosti na inzulín u OB krys je v souladu s předchozími důkazy o snížené citlivosti mozku na InsR indukovanou přírůstkem hmotnosti nebo OB dietou^{3, 10, 11}.

Náš ex vivo data řezů podporují hypotézu, že inzulín může signalizovat odměnu i sytost. Tuto hypotézu jsme testovali blokací účinku endogenního inzulínu s bilaterální mikroinjekcí InsAb do skořápky NAc během kondicionování. V souladu s rolí v odměňování blokování účinku inzulínu snížilo preferenci aroma párovaného roztoku obsahujícího glukózu proti aroma spojené s intaktní signalizací inzulinu. Blokování inzulínu ve skořápce NAc také snížilo spotřebu spárovaného roztoku během kondicionování v jedné lahvi, zatímco falešné nebo kontrolní mikroinjekce neměly žádný vliv na spotřebu. Tato data naznačují, že inzulín ve skořápce NAc hraje roli v preferenci jídla. Předchozí studie ukázaly, že intaktní DA signalizace v NAc je nezbytná pro získání aroma kondicionování^{37, 38}, potvrzující úlohu NAc DA při zprostředkování posilovacích účinků výživných řešení. V tomto světle preference glukózového roztoku ve spojení s intaktní dostupností inzulínu argumentuje proti primárnímu účinku inzulínu na DAT-zprostředkovanou absorpci DA ve skořápce NAc, protože se očekává, že se sníží [DA]_o a proto snižují spotřebu chuti s kontrolním párem. Naše výsledky jsou také v souladu s výsledky z předchozí studie, ve které mikroinjekce inzulínu do skořápky NAc prodloužila dobu, kdy byla zvířata zapojena do orálního podání sacharózy, s hraničním zvýšením spotřeby sacharózy.²⁶, což bylo oproti očekávanému důsledku zvýšeného příjmu DA. Celkově jsou tato behaviorální data v souladu s předpokládaným vlivem inzulínu na striatální ChI a zvýšené uvolňování DA. Tyto výsledky však nevylučují zapojení dalších prvků striatální mikroobvody do sledovaného chování, vzhledem k rozšířené expresi InsR v celém striatu^{1, 14}.

Studie uváděné v tomto dokumentu poskytují první důkaz, že inzulín hraje roli při sdělování kalorické hodnoty, a tedy i prospěšných účinků jídla, což má důležité důsledky pro vliv inzulínu u podváhy i obézních jedinců. Několik studií naznačuje, že post-ingestivní účinky jídla, bez ohledu na to, zda jsou cesty přenosu chuti neporušené⁴⁷, zvýšit uvolňování NAc DA a pozitivní posílení chování^{37, 47}. Postabsorpční inzulínová odpověď tedy může kódovat glykemický výnos jídla a přispívat k posílení preferencí a chování potravin, které umožňují spotřebu. Extrémní změny hladiny cirkulujícího inzulínu a centrální citlivost InsR však mohou hrát roli v abnormálním i adaptivním chování. Například hypoinzulinemie a kompenzační upregulace citlivosti InsR u jedinců s FR by mohla být faktorem jejich dispozice k flámu⁴⁸. Naopak centrální necitlivost na inzulín u diabetu typu II nebo obezity, zde zrcadlená u OB potkanů, by mohla přispět ke sníženému pocitu odměny po požití a řídit příjem potravin s vysokým glykemickým indexem jako kompenzaci^{49, 50}. K patologickému stravování by proto mohlo přispět buď zvýšení, nebo snížení striatální citlivosti na inzulín, což by mělo za následek přejídání a / nebo obezitu.

Celkově naše zjištění odhalí novou roli inzulínu jako signálu odměny. Taková role kontrastuje s její známou funkcí jako signál sytosti, včetně nedávných zjištění, že inzulín mikroinjektovaný do VTA může snížit hedonické krmení a preferenci pro narážky spojené s odměnou za jídlo^{23, 24}. To vyvolává otázku, jak lze smířit zdánlivě protichůdné role inzulínu v těchto funkcích závislých na DA. Odpověď může znít tak, že tyto účinky jsou spíše doplňkové než protichůdné. Současné výsledky ukazují, že inzulín ve striatu sděluje hodnotu odměny za požití jídla. Dvojí role v signalizaci sytosti může jednoduše umožnit inzulinu sloužit důležitému účelu ukončení jídla a současně vytvořit paměť jeho nutričních a tím i odměňujících vlastností, čímž se posiluje opakování požitého chování.

Zacházení se zvířaty

Postupy na zvířatech byly v souladu s pokyny NIH a byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití zvířat v NYU. Všechna zvířata byla na 12 h světlo: tmavý cyklus, se světly zapnutými od 06: 00 do 18: 00; ex vivo plátky byly připraveny mezi 08: 00 a 12: 00. Mechanické studie na AL potkanech a myších byly provedeny v roce 2007 ex vivo plátky zvířat chovaných ve dvojicích, zatímco potkani byli jednotlivě chováni pro všechna srovnání dietních skupin a pro behaviorální studie.

Stravovací režimy potkanů

Dospělé samce krys Sprague – Dawley (Taconic) byly 8 – 10 týdny staré na začátku dietních režimů trvajících 21 – 30 dní. Krysy byly polo náhodně přiřazeny do dietních skupin: subjekty byly řazeny podle počáteční hmotnosti, potom byla každá následující trojice potkanů ​​náhodně rozdělena do dietních skupin. AL krysy měly volný přístup k krysímu krmivu po stejné období jako párové krysy na FR nebo OB dietě. Všechny krysy měly volný přístup k vodě. Omezení potravin bylo provedeno jako dříve⁵¹; krátce, krysy dostávaly 40 – 50% AL příjmu standardní krmné dávky pro krysy denně, dokud se tělesná hmotnost nesnížila o 20%, a poté se jídlo titrovalo, aby se tato hmotnost udržela. OB krysy měly volný přístup k potkanům a čokoládě Zajistit, vysoce chutná tekutina s mírně vysokým obsahem tuku a cukru⁵².

Přední mozek Povídat si knockout mouse

Myši s podmíněnou florální alelou Povídat si (Povídat si^hejno) byly zkříženy s Nkx2.1^Cre transgenní linie k produkci myší, u kterých je ablace syntézy ACh omezena na přední mozek³². Nemutantní transgenní vrhu byli kontroly; jejich genotypy Cre⁺;Povídat si^{flox / +} a Cre^-;Povídat si^{flox / flox} jsou označovány jako „heterozygoti“. Dospělé samce myší použité pro studie řezů měly podle libosti přístup k potravě a vodě.

Ex vivo příprava řezů a fyziologické roztoky

Krysy nebo myši byly hluboce anestetizovány 50 mg kg^-1 pentobarbitál (intraperitoneální (ip)) a dekapitovaný. Pro voltametrii byly řezy koronálního předního mozku (tloušťka 300 – 400-μm) nařezány na vibračním lopatkovém mikrotomu Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) v ledově chladném umělém CSF pufrovaném HEPES (aCSF): (Na mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glukóza (10); HEPES kyselina (6.7); KCl (5); Sodná sůl HEPES (3.3); CaCl₂ (2); a MgSO₄ (2), ekvilibrovaný s 95% O₂/ 5% CO₂. Plátky byly potom udržovány v tomto roztoku při laboratorní teplotě po dobu 1 h před experimentováním^{30, 32, 53}. V případě elektrofyziologie byly krysy po anestézii perfundovány transkardiálně ledovým roztokem obsahujícím (v mM): sacharóza (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glukóza (7); askorbát (1); a pyruvát (3), a ekvilibrován s 95% O₂/ 5% CO₂. Plátky byly nařezány v tomto roztoku a poté přeneseny do regenerační komory v modifikovaném aCSF obsahujícím (v mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glukóza (25); askorbát (1); pyruvát (3); a myo-inositol (4), ekvilibrovaný s 95% O₂/ 5% CO₂; tento roztok byl zpočátku při 34 ° C, pak se nechal postupně ochladit na pokojovou teplotu⁵⁴. Všechny experimenty voltametrie a fyziologie byly provedeny v ponorné záznamové komoře při 32 ° C, která byla superfuzována při 1.5 ml min^-1 s aCSF obsahujícím (v mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); a glukóza (10) a hovězí sérový albumin (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml^-1) ekvilibrované 95% O₂/ 5% CO₂; plátky se nechaly před experimentem ekvilibrovat v tomto prostředí po dobu 30 min.

Rychlá skenovací cyklická voltametrie

Evokované studie uvolňování DA byly prováděny s použitím FCV v mozkových řezech^{32, 53} připravené z krys samců nebo Povídat si myši na předním mozku a kontroly heterozygotů (týdny 5 – 8). Studium v Povídat si knockoutované myši byly oslepeny, ale skupiny potkanů ​​s dietou měly zřejmé fenotypy, které vylučovaly oslepení. Voltammetrická měření byla provedena pomocí Millar Voltammeter (k dispozici na zvláštní žádost dr. Julian Millerovi na St Bartholomew's a Royal London School of Medicine and Dentistry, University of London). Pro FCV byl použit konvenční tvar vlny trojúhelníku, s rozsahem skenování −0.7 až + 1.3 V (versus Ag / AgCl), rychlost skenování 800 V s^-1a vzorkovací interval 100 ms^{30, 32, 53}. Data byla získána za použití desky DigiData 1200B A / D řízené softwarem Clampex 7.0 (Molecular Devices). Uvolňování DA bylo vyvoláno pomocí koncentrické stimulační elektrody; amplituda impulsu stimulu byla 0.4 – 0.6 mA a trvání bylo 100 μs^{30, 32, 53}. V jádru NAc a CPu byla použita lokální jednopulzní stimulace; k zesílení evokovaného signálu byl však použit krátký vysokofrekvenční sled pulzů (pět pulzů při 100 Hz) [DA]_o ve skořápce NAc. Oba stimulační paradigmy evokují uvolnění DA, které je akčním potenciálem a Ca²⁺ závislý, neovlivněný současně uvolňovaným glutamátem a GABA^{42, 55}a usnadněno současným uvolněním ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Kvantifikace evokovaného [DA]_obyly elektrody kalibrovány známými koncentracemi DA při 32 ° C po každém experimentu v aCSF a v přítomnosti každého léčiva použitého během daného experimentu⁵³.

Voltametrické experimenty k posouzení účinku inzulínu na vyvolaný [DA]_o byly získány použitím jednoho ze dvou protokolů. Počáteční experimenty ke stanovení časového průběhu účinku inzulínu (Sigma, I5523) byly provedeny sledováním evokovaného [DA]_o každých 5 min na jednom místě. Inzulín byl aplikován po důsledném vyvolání [DA]_o byla získána (obvykle měření 4 – 5); účinek inzulínu byl maximální po 50 – 60 min. a poté vyvolal [DA]_o zůstal na této úrovni po celou dobu experimentu (obvykle 90 min. celková expozice inzulinu; Obr. 1c). Následně byl účinek inzulinu vyhodnocen zaznamenáním evokovaného [DA]_o na diskrétních místech 4 – 5 v řezech (+ 1.5 mm od bregma) v každé ze tří striatálních podoblastí za kontrolních podmínek (aCSF nebo aCSF plus lék) a znovu v době maximálního účinku inzulínu (odběr vzorků přes 60 – 80 min), pak tyto vzorky byly zprůměrovány pro každý podoblast. Účinek inzulínu se časem po přípravě řezů snížil; minimalizovat čas ex vivo a pro optimalizaci použití zvířete byly obvykle testovány dva plátky z daného zvířete v záznamové komoře současně. Léky používané ke stimulaci účinku inzulínu byly aplikovány 15 min. Před inzulinem superfuzí aCSF, včetně trisacetoxymethylesteru HNMPA (HNMPA-AM)_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodofylotoxin (PPP; Tocris), mecamylamin (Tocris) a DHβE (Tocris). Jak je popsáno ve výsledcích, možná změněná senzitivita nikotinových ACh receptorů mezi skupinami stravy byla testována porovnáním poměru píku [DA]_o evokováno 5 p (100 Hz) s evokovaným 1 p evokováno (poměr 5 p: 1 p)^{30, 31} v jádru NAc v přítomnosti nikotinu 0 – 500 nM (Sigma).

Stanovení V _max od evokovaného [DA]_o přechodné ve striatálních řezech

Pro vyhodnocení změn vyvolaných inzulinem indukovaným DAT zprostředkovaným vychytáváním DA byla počáteční část klesající fáze vyvolána [DA]._o křivky byly vytaženy do Michaelisovy-Mentenovy rovnice V_max (maximální konstanta absorpce)⁵⁶. K_m (což nepřímo souvisí s afinitou DAT k DA) bylo stanoveno na 0.2 μM a je známo, že je podobný napříč striatálními podoblastmi⁵⁷ a nejsou ovlivněny inzulinem (viz Doplňkový obrázek 4 titulek).

Záznam celých buněk

Plátky mozku byly připraveny z krys samců 29 až 35 dní; podmínky záznamu byly totožné s podmínkami použitými ve studiích uvolňování DA. Celobuněčné nahrávky se svorkami proudu používaly konvenční metody⁵⁴. Striatální ChI byly vizualizovány pomocí mikroskopu Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) s infračervenou kontrastní kontrastní optikou a objektivem pro ponoření do vody X XUMUMX. Pipetový roztok obsahoval (v mM): K-glukonát (40); KCl (129); HEPES (11); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-ATP (2); Na₃-GTP (0.3); a upraveno na pH 7.2 – 7.3 pomocí KOH. Pro zaznamenané neurony, které mají být hodnoceny na imunoreaktivitu ChAT, byl do pipetového roztoku zahrnut 0.3% biocytin a neurony byly zaznamenány krátce (~ 5 min), aby se minimalizovalo ředění intracelulárního obsahu. Odpor pipety byl ~ 3 – 5 MΩ. Záznamy byly získány za použití zesilovače Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) a nízkofrekvenčního filtrování při 2 kHz. ChI byly identifikovány podle zavedených elektrofyziologických kritérií²⁸; většina z nich byla zpočátku tonicky aktivní, ale aktivita se po opravě proměnlivě snížila. Reakce na současnou injekci však byla v průběhu času obecně robustní a konzistentní, a proto byla použita ke zkoumání účinku inzulínu na excitabilitu ChI (viz Výsledky). Při pokusech zkoumat roli InsRs a IGF-1R v této odpovědi byl aplikován HNMPA nebo PPP po dobu alespoň 20 min. Předtím, než byl doplněn ChI. Maximální účinky samotného inzulínu byly typicky pozorovány po ~ 16 min expozice, ačkoli v některých buňkách nebylo toto zvýšení maximální až do 50 min nebo déle. Kromě toho ve čtyřech ze šesti neuronů zaznamenaných v PPP způsobil inzulín počáteční pokles počtu špiček, než se zotavil a překročil počáteční počet špiček. V důsledku toho byl ve všech experimentech kvantifikován účinek inzulínu porovnáním maximálního účinku na počet špiček s počtem špiček vyvolaných bezprostředně před aplikací inzulínu. Zjevný rozdíl v době dosažení maximálního účinku by mohl odrážet řadu faktorů, včetně hloubky zaznamenané buňky v řezu. Evokované akční potenciály byly také zaznamenány u ChI v nepřítomnosti inzulínu ve srovnatelných časových bodech.

Vysoce výkonná kapalinová chromatografie

Obsah DA v plátech striatálních potkanů ​​(tloušťka 400-μm) byl stanoven pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí⁵⁸. Páry řezů byly ekvilibrovány po dobu 30 min při 32 ° C v aCSF, a poté byl jeden řez na pár inkubován dalších 60 min při 32 ° C v aCSF, zatímco druhý byl inkubován v aCSF s 10 nebo 30 nM inzulínem. Pro srovnání dietních skupin byla striatální tkáň odebrána mezi 30 – 60 min po zotavení. Po inkubaci byl přebytek aCSF z plátků opatrně odstraněn, vzorek striatální tkáně (7 – 10 mg) byl zvážen, zmražen na suchém ledu a poté uložen při -80 ° C. V den analýzy byly vzorky sonikovány v ledově chladném, eluentu, deoxygenovaném argonu⁵⁸, centrifugoval se v mikrocentrifúze po dobu 2 min a supernatant se vstřikoval přímo na HPLC kolonu (BAS, West Lafayette, IN); detektorem byla skelná uhlíková elektroda nastavená na 0.7 V versus Ag / AgCl.

Imunohistochemie

Pro imunohistochemické značení byly krysy anestetizovány pentobarbitálem sodným (50 mg kg^-1, ip), pak perfundoval transkardiálně PBS (154 mM NaCl v 10 mM fosfátovém pufru, pH 7.2) následovaný 4% paraformaldehydem v tomto PBS; mozky byly odstraněny a koronální řezy (20 μm) byly vyříznuty a konvenčně zpracovány^{27, 59}. Imunofluorescenční snímky byly získány konfokálním mikroskopem Nikon PM 800 vybaveným digitálním fotoaparátem řízeným Spot softwarem (Diagnostic Instruments Inc.) a použitím objektivu × 100 (numerická apertura = 1.4) nebo konfokálním mikroskopem Zeiss LSM 510 pomocí × 63 objektiv (numerická apertura = 1.2). Lasery byly Argon (488 nm), He / Ne (543 nm) a He / Ne (633 nm). Příslušné filtry pro každý laser byly vybrány pomocí softwaru pro konfokální mikroskopy. Velikost dírky se lišila s použitým objektivem a zvolenou tloušťkou sekce z-stack generace; vybrali jsme optimální hodnotu dírky indikovanou softwarem (obvykle 30 μm). Digitální soubory byly analyzovány pomocí dekonvolučního softwaru (AutoQuant Imaging), přičemž konečné obrázky byly zpracovány pomocí programu Adobe Photoshop 7.0. Všechny obrázky byly upraveny pro jas a kontrast; takové úpravy byly provedeny jednotně ve všech částech obrazu. Striatální DA axony byly identifikovány pomocí dvou TH protilátek: polyklonální AB152 králičí anti-TH (1: 800) a monoklonální MAB318 myší anti-TH (1: 500) (oba od Chemicon). Byly použity tři protilátky InsR: sc-57342 a sc-09 (1: 100; Santa Cruz) a PP5 (dárek od Pfizer). Specifičnost každého z nich byla prokázána již dříve^{60, 61}a v těchto studiích byla potvrzena nepřítomností imunoznačení protilátkami sc-57342 nebo PP5 v přítomnosti odpovídajícího blokujícího peptidu. Protilátka ChAT byla AB144 (1: 200; Millipore) a biotin byl z Vector (1: 200). Jako sekundární protilátky byly použity oslí anti-králíci Alexa 488 (Invitrogen) nebo oslí anti-králíci Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), oslí anti-kozí Cy3 (Jackson) a oslí anti-myší Cy5 (Jackson).

K vyhodnocení ko-lokalizace InsR v TH + axonech jsme použili dříve popsané metody k identifikaci přítomnosti Kir6.2, podjednotky tvořící póry ATP-senzitivních K⁺ kanály v DA axonech²⁷. Puncta představující InsRs byly distribuovány do upravených obrazů, což ukazuje, že superimpozice s TH imunoreaktivitou se může do jisté míry vyskytnout náhodou. Pro testování tohoto předpokladu jsme spočítali InsR / TH superpozice v 42 nezávislých polích ve třech NAc imunoznačených řezech od dvou krys. Digitální soubory InsR byly poté otočeny o 90 ° ve směru hodinových ručiček a počty se opakovaly; rotace snížila počet InsR puncta, které ve většině polí ko-lokalizovaly s TH (viz Výsledky). Snížení počtu superpozic s rotací²⁷ označil podíl InsR puncta v každém striatálním poli spojeném s DA axony.

Krevní glukóza a inzulin ELISA

Krevní kmen byl odebrán v době dekapitace pro studie řezů. Hladina glukózy v krvi byla stanovena okamžitě standardním monitorem hladiny glukózy v krvi. V případě inzulínu byla další krev odebrána do zkumavek obsahujících EDTA a odstředěna při 1,500g pro 15 min; supernatant (plazma) byl odebrán a skladován při -80 ° C až do zpracování pomocí soupravy ELISA pro krysí inzulín ALPCO.

Umístění kanyly a histologické ověření

Čtyřicet dospělých samců krys Sprague – Dawley (Taconic a Charles River) původně vážících 350 – 425 g bylo anestetizováno ketaminem (100 mg kg^-1, ip) a xylazin (10 mg kg^-1, ip) a stereotaxicky implantované dvěma chronicky umístěnými vodícími kanylami (26 měřidlo) umístěnými bilaterálně 2.0 mm hřbetní do infuzních míst v mediální skořápce NAc⁶² (1.6 mm před bregmou; 2.1 mm laterálně k sagitálnímu stehu, hroty zahnuté 8 ° směrem k střední linii, 5.8 mm ventrálně k povrchu lebky). Potkanům byl podán banamin (2.0 mg kg)^-1(subkutánně) jako pooperační analgetikum po zotavení z anestézie a ráno po něm. Jeden týden po operaci byly krysy umístěny na FR (popsané výše) a po zbytek studie byly udržovány na 80% své pooperační regenerační hmotnosti. Umístění kanyly bylo stanoveno histologicky po dokončení behaviorálního testování. Každá krysa byla zabita CO₂, dekapitován a mozek odstraněn a fixován v 10% pufrovaném formalinu po dobu> 48 hodin. Zmražené koronální řezy (tloušťka 40 μm) byly nařezány na Reichert-Jung Cryostat, rozmraženy namontovány na sklíčka podložená želatinou a obarveny kresylovou fialovou. Data od dané krysy byla použita pouze v případě, že obě kanyly byly uvnitř středního NAc pláště⁶² (včetně okraje skořápky / jádra nebo skořápky / čichového tuberu) (Doplňkový obrázek 5); na základě těchto kritérií byly z konečné analýzy vyloučeny dvě krysy.

Předběžná expozice s přednostní expozicí chuti

Krysy dostaly jednu noc (v domácí kleci) a šest 30-min-za-den předběžné expozice (v testovacích komorách) 0.2% sacharinu sodného (Sigma) ve vodě s intervalem 48-h mezi jednotlivými relacemi. Potkani pak dostali dvě 5-min-za-den za den expozice 0.2% sacharinu sodného v 0.05% neslazeného hroznového nebo třešňového Kool-Aid (Kraft Foods) ve vodě. Pro první předběžnou expozici Kool-Aid dostala polovina potkanů ​​roztok s příchutí třešně a druhá polovina roztok s příchutí hroznů. Chuť byla obrácena při druhé expozici Kool-Aid před expozicí, aby bylo zajištěno, že všechny krysy vzorkovaly každou příchuť. Příjem byl měřen pro všechny předexpoziční relace. Testovací komory byly čiré plastové klece s čerstvým ložním prádlem. U všech předběžných expozic měly krysy přístup ke stejnému řešení na obou stranách komory. S výjimkou jednodenní předexpoziční relace byly všechny relace vedeny v místnosti pro behaviorální chování, s 30minutovou návykovou dobou před jakýmkoli tréninkem nebo testováním.

Úprava jedné láhve

Předchozí studie ukázaly, že mikroinjekce InsAb do ventromediální hypotalamu může blokovat účinek inzulínu na stravovací chování a sekreci glukagonu.^{63, 64}. Zde jsme použili tento přístup k posouzení možné úlohy inzulínu při posílení výběru potravin. Krysy byly polo náhodně přiřazeny na základě průměrného objemu před expozicí do dvou skupin, kontrolní nebo experimentální (InsAb). V kontrolní skupině krysy dostaly vehikulum (mikroinjekce PBS; 137 mM NaCl a 2.7 mM KCl v 10 mM fosfátovém pufru) nebo IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 v PBS, jak bylo přijato) mikroinjekce do NAc obalu před konzumací jednoho ze dvou ochucených roztoků a falešná mikroinjekce před konzumací druhého ochuceného roztoku. V experimentální skupině krysy dostaly mikroinjekci InsAb na skořápce NAc (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl^-1 v PBS, jak bylo přijato) před expozicí jednomu ochucenému roztoku a falešnou mikroinjekcí před expozicí druhému. Byly použity dvě sady subjektů se střídáním mezi tekutinou mikroinjekcí a simulovanou mikroinjekcí, takže celkový počet mikroinjekcí byl omezen na čtyři, čímž se minimalizovalo možné poškození tkáně a ztráta citlivosti v místě mikroinjekce.⁶⁵. Pro tekutou mikroinjekci byl kontrolní roztok nebo InsAb vložen do dvou trubek PE-30 s délkou 50 cm připojených na jednom konci k injekčním stříkačkám Hamilton 5 plným destilovanou vodou a na druhém konci k injektážním kanylám 31 s rozchodem, které rozšířily 2.0 mm za implantovanými průvodci. Objemy infuze 0.5 μl byly dodávány přes 90 s rychlostí 0.005 μl s^-1; injektor byl ponechán na místě po dobu ~ 60, aby byl poskytnut čas pro difúzi, pak byl injektor nahrazen styletem.

Krysy byly přeneseny přímo do behaviorálních komor během 2 min. Po dokončení mikroinjekce nebo simulované mikroinjekce. Kondicionační roztoky obsahovaly 0.2% sacharin sodný, 0.05% neslazený hroznový nebo třešňový Kool-Aid a 0.8% glukózu. Přístup k řešení byl omezen na 30 min za relaci. Párová chuť a strana komory s přístupem k pití byly v každé skupině polořadovky náhodně přiřazeny a vyvažovány. Interval mezi mikroinjekcemi byl alespoň 72 h, střídavě mezi infuzí a simulovanými relacemi, celkem osm kondicionačních relací.

Přednostní test dvou lahví

Čtyřicet osm hodin po poslední relaci kondicionování byly krysy umístěny do testovacích komor se současným přístupem k oběma kondicionujícím příchutím; roztoky byly 0.2% sacharin sodný v 0.05% hroznů nebo třešňových Kool-Aid, bez glukózy. Testování proběhlo během 2 dnů (60 min za den). Poloha pitné zkumavky obsahující falešně spárovaný nebo infuzně spárovaný roztok se měnila, aby se zajistilo, že každá krysa byla testována na spotřebu každého roztoku na obou stranách klece. Příjem každého ochuceného roztoku byl zprůměrován pro dva zkušební dny, aby se stanovila preference.

[³H] DA vychytávání ve striatálních synaptosomech pro hodnocení účinnosti InsAb

Striatální synaptosomy^{21, 66} byly připraveny z AL potkanů ​​(samci, 350 – 400 g), s pitvou NAc (skořápka a jádro) a CPu a připraveni zvlášť. Tkáň z každé oblasti byla homogenizována v objemech 15 ledově chladného roztoku 0.32 M sacharózy ve skleněném homogenizátoru s motorovým teflonovým tloučkem; Po opláchnutí a odstředění byla finální peleta resuspendována v ledově studené 0.32 M sacharóze^{21, 66}. Před zahájením [³H] Test absorpce DA⁶⁶, synaptosomální alikvoty v celkovém objemu 180 μl absorpčního pufru byly inkubovány v třepačce po dobu 15 min při 30 ° C v přítomnosti nebo nepřítomnosti 30 nM inzulínu, ve vehikulu (PBS) nebo v InsAb (konečné ředění 1: 500) , v IgG (konečné ředění 1: 500) nebo ve vehikulu. Absorpční pufr obsažený (v mM): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glukóza (10), CaCl₂ (1); nialamid (0.01); tropolon (0.1); a kyselina askorbová (0.001), pH 7.4. Využití [³H] DA byl zahájen rychlým dávkováním 20 μl každé synaptosomální suspenze do 96-jamkových destiček s měnící se koncentrací DA (0.003 – 1.0 μM) a [³H] DA (5 nM); po 5 min v třepačce desek při 25 ° C byl příjem ukončen studenou rychlou vakuovou filtrací⁶⁶. Počty na jamku byly převedeny na pmoly, pak korigovány na mg celkového proteinu za minutu. Všechny testy byly provedeny trojmo a opakovány alespoň čtyřikrát; V_max a K_m byly vypočteny pomocí softwaru Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Velká Británie).

Statistická analýza

Data jsou uvedena jako průměr ± sem; význam byl hodnocen pomocí párových nebo nepárových Studentových t- testy nebo ANOVA, pokud není uvedeno jinak. Pro voltametrické údaje n je počet záznamových míst, vzhledem k tomu, že variabilita mezi místy v rámci striatálního podoblasti je větší než variabilita mezi zvířaty nebo mezi výseči^{30, 32, 55, 56}; u každého souboru údajů je uvedeno číslo zvířete. EK₅₀ pro účinek inzulínu a nikotinu na vrchol vyvolaný [DA]_o byla vypočtena za použití Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Pro elektrofyziologická data byla statistická významnost hodnocena pomocí párů t- testy nebo test Wilcoxon v Prism 6.0 nebo smíšený obousměrný ANOVA v SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Pro hodnocení účasti inzulínu v kondicionování preferenčních chutí byly dokončeny dvě úplné studie s použitím protokolů, které byly totožné s výjimkou použité léčby vehikulem. V první studii dostaly krysy 10 infuze vehikula PBS a 9 infuze InsAB. Ve druhé studii dostaly krysy 10 infuze vehikula IgG a 10 infuze InsAb. Během infuzních kondicionačních relací nebyl mezi oběma vehikulovými skupinami (PBS nebo IgG) žádný významný rozdíl (F₁₉= 0.619, smíšený obousměrný ANOVA) s opakovanými měřeními při infuzním kondicionování) nebo při testu (F₁₉= 0.012, obousměrně smíchaná ANOVA s opakovaným měřením chuti). V důsledku toho byly dva experimenty spojeny pro analýzu. Pro tuto analýzu byl ke stanovení účinků mikroinjekční léčby během kondicionování použit smíšený ANOVA 2 × 4 (s opakovanými měřeními v den infuze-kondicionování), po kterém následovalo chráněné t-zkoušky (jedno ocasní k určení, ve kterém ošetření kondicionováním mikroinjekční léčba snížila objem příjmu). Stejná analýza byla dokončena pro simulované relace. Aby se určil účinek kondicionačního ošetření během testu dvou lahví s preferencí chuti, byla data analyzována pomocí smíšeného obousměrného ANOVA (s opakovanými měřeními na příchuť), poté následovala chráněná t-testy (jeden sledoval hypotézu, že InsAb by snížil preference).

Jak citovat tento článek: Stouffer, MA et al. Inzulín zvyšuje uvolňování striatálního dopaminu aktivací cholinergních interneuronů, a tím signalizuje odměnu. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Inzulínové receptory a působení inzulínu v mozku: přehled a klinické důsledky. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Článek
   • Zobrazit kontext
2. Gerozissis, K. Brainův inzulín, energetická a glukózová homeostáza; geny, prostředí a metabolické patologie. Eur. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Článek
6. Zobrazit kontext
7. CAS
8. PubMed
9. Článek
10. Zobrazit kontext
11. CAS
12. PubMed
13. Článek
14. Zobrazit kontext
15. CAS
16. PubMed
17. Článek
18. Zobrazit kontext
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Článek
23. Zobrazit kontext
24. ISI
25. PubMed
26. Článek
27. Zobrazit kontext
28. CAS
29. PubMed
30. Článek
31. Zobrazit kontext
32. Zobrazit kontext
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Článek
37. Zobrazit kontext
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Článek
42. Zobrazit kontext
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Zobrazit kontext
47. ISI
48. PubMed
49. Článek
50. Zobrazit kontext
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Článek
55. Zobrazit kontext
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Článek
60. Zobrazit kontext
61. Zobrazit kontext
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Článek
66. Zobrazit kontext
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Článek
71. Zobrazit kontext
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Článek
76. Zobrazit kontext
77. PubMed
78. Článek
79. Zobrazit kontext
80. Zobrazit kontext
81. CAS
82. PubMed
83. Článek
84. Zobrazit kontext
85. ISI
86. PubMed
87. Článek
88. Zobrazit kontext
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Článek
93. Zobrazit kontext
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Článek
98. Zobrazit kontext
99. CAS
100. PubMed
101. Článek
102. Zobrazit kontext
103. Zobrazit kontext
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Článek
108. Zobrazit kontext
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Článek
113. Zobrazit kontext
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Článek
118. Zobrazit kontext
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Článek
123. Zobrazit kontext
124. PubMed
125. Článek
126. Zobrazit kontext
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Článek
131. Zobrazit kontext
132. CAS
133. PubMed
134. Článek
135. Zobrazit kontext
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Článek
140. Zobrazit kontext
141. CAS
142. PubMed
143. Článek
144. Zobrazit kontext
145. ISI
146. PubMed
147. Článek
148. Zobrazit kontext
149. Zobrazit kontext
150. Zobrazit kontext
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Článek
155. Zobrazit kontext
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Článek
160. Zobrazit kontext
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Článek
165. Zobrazit kontext
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Článek
170. Zobrazit kontext
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Zobrazit kontext
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Článek
179. Zobrazit kontext
180. PubMed
181. Článek
182. Zobrazit kontext
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Článek
187. Zobrazit kontext
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Článek
192. Zobrazit kontext
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Článek
197. Zobrazit kontext
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Článek
202. Zobrazit kontext
203. Zobrazit kontext
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Zobrazit kontext
208. Zobrazit kontext
209. Zobrazit kontext
210. Zobrazit kontext
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Článek
215. Zobrazit kontext
216. CAS
217. PubMed
218. Článek
219. Zobrazit kontext
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Zobrazit kontext
224. Zobrazit kontext
225. CAS
226. PubMed
227. Článek
228. Zobrazit kontext
229. ISI
230. PubMed
231. Článek
232. Zobrazit kontext
233. Zobrazit kontext
234. ISI
235. PubMed
236. Článek
237. Zobrazit kontext
238. Zobrazit kontext
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Článek
243. Zobrazit kontext
244. Zobrazit kontext
245. Vogt, MC & Bruning, JC Signalizace inzulínu CNS při řízení energetické homeostázy a metabolismu glukózy - od embrya po stáří. Trendy endokrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identifikace inzulínu v mozku krysy. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737–5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Receptorem zprostředkovaný transport inzulínu přes endotelové buňky. Science 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Inzulínové odpovědi a hladiny glukózy v plazmě a mozkomíšním moku během hladovění a doplňování potravy u potkanů. Physiol. Chovat se. 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Diferenciální permeabilita hematoencefalické bariéry pro dva pankreatické peptidy: inzulín a amylin. Peptides 19, 883–889 (1998).
250. Banky, WA Zdroj mozkového inzulínu. Eur. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
251. Nemoto, T. et al. Nové poznatky o syntéze inzulínu a jeho sekreci v hippocampu a mozkové kůře potkanů: snížení hladiny proinzulinu vyvolané amyloidem-β1-42 prostřednictvím glykogen syntázy kinázy-3β. Buněčný signál. 26, 253 – 259 (2014).
252. De Souza, CT et al. Spotřeba tučné stravy aktivuje prozánětlivou reakci a indukuje inzulínovou rezistenci v hypotalamu. Endokrinologie 146, 4192 – 4199 (2005).
253. Anthony, K. et al. Zmírnění inzulinem vyvolaných odpovědí v mozkových sítích, které řídí chuť k jídlu a odměnu v inzulínové rezistenci: mozkový základ pro zhoršenou kontrolu příjmu potravy u metabolického syndromu? Cukrovka 55, 2986 – 2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC Neurověda o přírodních odměnách: význam pro návykové drogy. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuitry of návyku. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA et al. Lokalizace a charakterizace inzulínových receptorů v mozku potkana a hypofýze in vitro autoradiografie a počítačová denzitometrie. Endokrinologie 121, 1562 – 1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Exprese receptorů pro inzulin a leptin ve ventrální tegmentální oblasti / substantia nigra (VTA / SN) krysy. Brain Res. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC et al. Inzulinová signalizace a závislost. Neurofarmakologie 61, 1123 – 1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energetické regulační signály a odměna za potraviny. Pharmacol. Biochem. Chovat se. 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA et al. Potravní deprivace snižuje mRNA a aktivitu krysího dopaminového transportéru. Neuroendokrinologie 68, 11 – 20 (1998).
261. Carvelli, L. et al. PI 3-kinázová regulace absorpce dopaminu. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
262. Williams, JM et al. Hypoinzulinémie reguluje reverzní transport dopaminu vyvolaný amfetaminem. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Chronické omezení potravy a funkce dopaminového transportéru ve striatu krysy. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN et al. Inzulín moduluje funkci monoaminového transportéru citlivého na kokain a impulzivní chování. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Inzulín ve ventrální tegmentální oblasti snižuje hedonické krmení a potlačuje koncentraci dopaminu prostřednictvím zvýšeného zpětného vychytávání. Eur. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. et al. Inzulín indukuje dlouhodobou depresi dopaminových neuronů ventrální tegmentální oblasti prostřednictvím endokanabinoidů. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
267. Konner, AC et al. Role pro inzulínovou signalizaci v katecholaminergních neuronech při kontrole energetické homeostázy. Cell Metab. 13, 720 – 728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Inzulin působí na různých místech CNS, aby snížil akutní příjem sacharózy a samopodání sacharózy u potkanů. Dopoledne. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Subsekundová regulace striatálního uvolňování dopaminu presynaptickým K_ATP kanály. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Funkční rozmanitost a specificita neostriatálních interneuronů. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685–692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Endogenní nikotinová cholinergní aktivita reguluje uvolňování dopaminu ve striatu. Nat. Neurosci. 4, 1224–1229 (2001).
272. Rice, ME & Cragg, SJ Nikotin zesiluje dopaminové signály související s odměnou ve striatu. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Frekvenčně závislá modulace uvolňování dopaminu nikotinem. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Odporující regulace striatálního uvolňování dopaminu a průzkumné motorické chování předním mozkem a cholinergními vstupy mozkového kmene. Nat. Commun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. et al. Uvolnění striatálního dopaminu je vyvoláno synchronní aktivitou v cholinergních interneuronech. Neuron 75, 58 – 64 (2012).
276. Cachope, R. et al. Selektivní aktivace cholinergních interneuronů zvyšuje akumbální uvolňování fázového dopaminu: nastavuje tón pro zpracování odměny. Rep. 2, 1 – 9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Presynaptická lokalizace imunoreaktivity nikotinového acetylcholinového receptoru beta2 podjednotky v nigrostriatálních dopaminergních neuronech potkanů. J. Comp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ et al. Cholinergní interneurony zprostředkovávají ve striatu rychlý glutamatergický přenos závislý na VGluT3. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Aktivace dopaminových receptorů podobných D1 v nucleus accumbens je rozhodující pro získání preferencí chuti podmíněných živinami u potkanů, nikoli však pro jejich expresi. Eur. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamin a naučené potravinové preference. Physiol. Chovat se. 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD Centrální signalizace inzulínu je oslabena dlouhodobou expozicí inzulínu prostřednictvím fosforylace serinového substrátu-1, serinové fosforylace, proteasomální degradace a degradace lysozomálního inzulínového receptoru. Endocrinology 151, 75–84 (2010).
282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Uvolňování dopaminu v bazálních gangliích. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamic příspěvky k změně chování a posílení chování související s bazálními gangliemi. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. et al. Striatální muskarinové receptory podporují závislost na aktivitě přenosu dopaminu prostřednictvím různých podtypů receptorů na cholinergních interneuronech ve ventrálním versus dorzálním striatu. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens dopamin-acetylcholinová rovnováha v přístupu a vyhýbání se. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Omezené stravování s úbytkem hmotnosti selektivně snižuje extracelulární dopamin v nucleus accumbens a mění dopaminovou odpověď na amfetamin, morfin a příjem potravy. J. Neurosci. 15, 6640 - 6650 (1995).
287. Geiger, BM et al. Deficity mezolimbické neurotransmise dopaminu v potravní obezitě u potkanů. Neurovědy 159, 1193 – 1199 (2009).
288. Morris, JK et al. Inzulinová rezistence zhoršuje nigrostriatální dopaminovou funkci. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
289. De Araujo, IE et al. Odměna za jídlo při absenci signalizace chuti. Neuron 57, 930 – 941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Vztah mezi obezitou a otupělou striatální odpovědí na jídlo je moderován alelou TaqIA A1. Science 322, 449–452 (2008).
291. Wang, GJ et al. Mozkový dopamin a obezita. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
292. Johnson, PM & Kenny, PJ Dopaminové D2 receptory v závislosti na dysfunkci odměn a nutkavém jídle u obézních potkanů. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Odměny a lokomotorické aktivační účinky přímých agonistů dopaminových receptorů jsou zvýšeny chronickým omezením potravy u potkanů. Psychopharmacology (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE & Keesey, RE Obrana odlišných hodnot tělesné hmotnosti u obézních a rezistentních potkanů ​​vyvolaných dietou. Dopoledne. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Monitorování axonálního a somatodendritického uvolňování dopaminu pomocí cyklické voltametrie rychlého skenování v řezech mozku. Methods Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Regulace substantia nigra pars reticulata GABAergická aktivita neuronu H₂O₂ prostřednictvím kanálů citlivých na kyselinu flufenamovou a K_ATP kanály. Přední. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Omezená regulace somatodendritického uvolňování dopaminu napěťově citlivým Ca²⁺ kanály kontrastovaly se silnou regulací uvolňování axonálního dopaminu. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
298. Li, X. et al. Zvýšený přenos striatálního dopaminu a motorický výkon s nadměrnou expresí LRRK2 u myší je eliminován familiární Parkinsonovou chorobou mutací G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Stanovení parametrů uvolňování a absorpce z elektricky vyvolané dynamiky dopaminu měřené voltametrií v reálném čase. J. Neurosci. Methods 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H₂O₂ je nový endogenní modulátor uvolňování synaptického dopaminu. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Imunocytochemická identifikace proteinů podílejících se na uvolňování dopaminu ze somatodendritického kompartmentu nigrálních dopaminergních neuronů. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Sugimoto, K. et al. Inzulinový receptor v periferním nervu potkana: jeho umístění a alternativně sestřihané izoformy. Diabetes Metab. Res. Rev. 16, 354 – 363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. et al. Inzulín způsobuje hypertermii přímou inhibicí teplocitlivých neuronů. Cukrovka 59, 43 – 50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. The Brain Rat in Stereotaxic Coordinates 6. vydání akademické (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Zvýšené krmení v reakci na oboustrannou injekci protilátek proti inzulínu do VMH. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA et al. Vliv inzulínu v ventromediální hypotalamu na sekreci glukagonu pankreatu in vivo. Cukrovka 59, 1521 – 1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalizace mechanismů odměny za léky intrakraniálními injekcemi. Synapse 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interakce mezi analogem hydroxypiperidinu 4- (2-benzhydryloxy-ethyl) -1- (4-fluorbenzyl) piperidinu a aspartátu 68 v lidský transportér dopaminu. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Stáhnout odkazy

Tyto studie byly podporovány granty NIH DA033811 (MER, KDC a MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) a NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 byl štědrý dárek od Dr. Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Protilátka PP5 byla štědrým dárkem od společnosti Pfizer. Děkujeme Dr. Charlesu Nicholsonovi, NYU School of Medicine, za software, který lze extrahovat V_max hodnoty z dat FCV.