Přední endocrinol (Lausanne). 2017; 8: 216.
Publikováno online 2017 Aug 29. dva: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† a Vincent Paillé1,*†
Abstraktní
Perinatální konzumace husté potravy matkou zvyšuje riziko obezity u dětí. To je spojeno s nadměrnou spotřebou chutného jídla, které se konzumuje pro své hedonické vlastnosti. Základní mechanismus, který spojuje perinatální mateřskou stravu a preferenci tuku potomků, je stále špatně pochopen. V této studii se zaměřujeme na studium vlivu mateřské stravy s vysokým obsahem tuku / cukru s vysokým obsahem cukru [západní strava (WD)] během těhotenství a laktace na cestě odměňování, která řídí krmení potomků krysy od narození po pohlavní dospělost. Provedli jsme podélné sledování potomstva WD a Control ve třech kritických časových obdobích (dětství, dospívání a dospělost) a zaměřili jsme se na zkoumání vlivu perinatální expozice chutné stravě na (i) preference tuku, (ii) profil genové exprese a (iii) neuroanatomické / architektonické změny mezolimbických dopaminergních sítí. Ukázali jsme, že krmení WD omezené na perinatální období má jasný dlouhodobý vliv na organizaci homeostatických a hedonických mozkových obvodů, nikoli však na tukovou preferenci. Ukázali jsme období specifického vývoje preference tuku, který jsme korelovali se specifickými mozkovými molekulárními podpisy. U potomků z matek krmených WD jsme v dětství pozorovali existenci preference tuku spojenou s vyšší expresí klíčového genu zapojeného do dopaminových (DA) systémech; v adolescenci, preference s vysokým obsahem tuků pro obě skupiny, postupně snížená během 3 dnů testu pro skupinu WD a spojená se sníženou expresí klíčového genu zapojeného do systémů DA pro skupinu WD, která by mohla navrhnout kompenzační mechanismus pro jejich ochranu z další expozice tukům; a konečně v dospělosti, preference tuku, který byl identický s kontrolními krysy, ale byl spojen s hlubokou modifikací v klíčových genech zapojených do sítě kyseliny y-aminomáselné, receptorů serotoninu a remodelace hypotalamu závislé na kyselině polysialové - NCAM. Celkově tato data ukazují, že mateřská WD, omezená na perinatální období, nemá trvalý dopad na energetickou homeostázu a preferenci tuků později v životě, přestože došlo k silné remodelaci hypothalamické homeostatické a odměnové dráhy, která je součástí stravovacího chování. K pochopení významu remodelace těchto obvodů by byly zapotřebí další funkční experimenty.
Úvod
Prostředí a události raného života jsou nyní dobře známy a přispívají ke zdraví a predispozici nemocí později v životě (1-3). Koncept metabolického imprintingu byl navržen k popisu toho, jak mohou změny ve výživném a hormonálním prostředí během perinatálního období předisponovat potomka k obezitě a související patologie později. Důležitým tématem našeho náhodného způsobu života je nadvýživa v důsledku konzumace husté energie. U jedinců, kteří jsou vystaveni mateřskému příjmu tohoto typu potravy, je vyšší riziko vzniku obezity a metabolického syndromu (4, 5). Mnoho studií ukázalo, že mateřská strava s vysokým obsahem tuků (HFD) těhotenství a kojení má dlouhodobý účinek na metabolismus potomstva (6-8). Kromě cest podílejících se na metabolické regulaci hrají systémy odměňování mozku také důležitou roli v chování při krmení (9, 10). Neurotransmise mezolimbického dopaminu (DA), intenzivně studovaná v souvislosti s odměnou a závislostí, se u obezity vyvolané dietou mění u obou lidí (11-13) a zvířata (14-16). Projekce DA se z velké části vyvíjejí postnatálně (17), a proto jejich vývoj může být ovlivněn časnou stravou. V posledních několika letech experimenty na hlodavcích prokázaly, že příjem HFD u matky zvyšuje hedonické krmení u potomků (18, 19). Přestože toto pozorování zahrnovalo některé změny ve funkci systému DA (20-22) jsou k dispozici omezené údaje týkající se ontogeneze a přestavby drah v raném věku (21). Navíc není zdokumentováno, jak a jak by mohla být perinatální nutriční zátěž ovlivněna část signalizačního systému, která není součástí DA systému, jako je systém GABA (kyselina y-aminobutyrové). Zdá se, že neurony GABA hrají klíčovou roli v odměně a averzi. Neurony ventrální tegmentální oblasti (VTA) GABA dostávají podobný vzorec vstupu z různých oblastí mozku (23) a nedávné studie chování založené na optogenetice zdůrazňují hlavní roli VTA GABA v averzi k podmíněnému místu (24) a v odměně konzumního chování (25). Nucleus accumbens (NAc) je hlavně tvořen projekcí neuronů středního ostří GABAergic a působí jako rozhraní limbic-motor integrující signály vznikající z limbického systému a přeměňující je v akci přes výstup do ventrálního pallidum (VP) a dalších motorických efektorů (26). A konečně hypotalamus, který je tvořen četnými spojeními GABA v LH (27) a obloukovatelné jádro, integruje signály hladu a sytosti (10).
Tato studie si klade za cíl identifikovat vliv příjmu mateřské západní stravy (WD) u potomků krysy od narození do sexuální zralosti (i) na preference tuku (ii) na profil genové exprese systému DA, GABAergický systém a plasticitu hypotalamu. a (iii) o neuroanatomických / architektonických změnách mezolimbických dopaminergních sítí ve stejném období. Proto jsme v dlouhodobé studii (od odstavu, P25, do sexuální zralosti, P45 a dospělosti, P95) hodnotili vliv mateřské WD na růst tělesné hmotnosti a vývoj tukové tkáně potomstva chovaného po odstavení pod pravidelným krmením. Souběžně jsme provedli test preference tuku následovaný specializovanou transkriptomickou analýzou a následnou analýzou hlavních složek (PCA) výběru markerů pro regulaci příjmu potravy, výběru a motivace. Naše výsledky výrazně obohatily nedávné výsledky se zaměřením na nutriční programování systému DA.
Materiály a metody
Etické prohlášení
Všechny experimenty byly provedeny v souladu s pokyny místního výboru pro dobré životní podmínky zvířat, EU (směrnice 2010 / 63 / EU), Institut National de la Recherche Agronomique (Paříž, Francie) a francouzského veterinárního oddělení (A44276). Experimentální protokol byl schválen institucionální etickou komisí a zaregistrován pod referencí APAFIS 8666. Byla přijata všechna opatření k minimalizaci stresu a počtu zvířat použitých v každé sérii experimentů.
Zvířata a diety
Zvířata byla udržována v cyklu 12 h / 12 h světlo / tma v 22 ± 2 ° C s jídlem a vodou podle libosti. Třicet dva samic krys Sprague-Dawley (tělesná hmotnost: 240 – 290 g) v den březosti 1 (G1) bylo zakoupeno přímo od Janvier (Le Genest Saint Isle, Francie). Byly chovány jednotlivě a krmeny buď kontrolní dietou (CD) (5% hovězí tuk a 0% sacharóza) pro 16 z nich, nebo WD (21% hovězí tuk a 30% sacharóza) pro 16 z nich během těhotenství a laktace (viz tabulka Table1: 1: složení stravy v procentech kcal od ABdiet Woerden, Nizozemsko). Při narození byla velikost vrhu upravena na osm mláďat na vrh s poměrem 1: 1 mezi muži a ženami. Chovali jsme 12 mimo přehrady 16 s vrhem složeným z samců 4 a 4 pro každou skupinu. Při odstavení (P21) byli potomci narození na přehradách CD a WD chováni do standardní chow až do konce experimentu (obrázky (Figures1A, B) .1A, B). Tělesná hmotnost mláďat byla zaznamenána při narození a poté každý den v 10: 00 am až do P21 (odstavení). Po odstavení a do konce experimentu byly krysy váženy každých 3 dní. Uvádíme pouze údaje o potomcích samců. Samice potkanů byly použity pro další studii (obrázek č (Obrázek 11).
Chování (test dvou lahví)
Byla studována tři kritická vývojová období (P21 až P25: juvenilní, P41 až P45: adolescence a P91 až P95: mladý dospělý). Psi 24 (n = 12 na skupinu) byly náhodně vybrány a umístěny do individuální klece k provedení bezplatného testu s výběrem dvou lahví (obrázky (Figures1A, B) 1A, B) (28-30). Tento test byl použit ke specifické studii atraktivity vůči tukové chuti jeho oddělením od sladké chuti a co nejvíce od metabolického účinku příjmu kalorií. Spotřeba roztoku 1% kukuřičného oleje je ve skutečnosti spojena pouze s příjmem 0.09 kcal / ml. Po jednom dni návyku na přítomnost dvou lahví byl test proveden po dobu 2 dní v P25 a přes 4 dní v P41 a P91 (obrázek (Obrázek 1A) .1A). V odstavu (P21) byla mláďata 24 umístěna individuálně po dobu 2 dní (obrázek (Figure1A): 1A): den 1, návyková fáze, den 2, potkanům byla dána možnost volby dvou lahví mezi emulzí 1% kukuřičného oleje v 0.3% xanthanové gumě (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, Francie) a roztokem xanthanové gumy ( 0.3%). U P41 a P91 byla použita mláďata 24 a na tři po sobě jdoucí dny byla navržena volba bez dvou lahví. Spotřeba roztoku xanthanové gumy a chuťového roztoku (kukuřičný olej 1%) byla zaznamenána denně v 11: 00 am po dobu 3 dní (P45 a P95). Poloha obou lahví byla denně převrácena, aby se zabránilo zaujatosti preferencí polohy. Skóre preference tuku bylo vypočteno jako poměr objemu „tukového roztoku“ spotřebovaného k celkovému objemu spotřebovanému v 24 h. Všechny krysy byly během behaviorálního testu udržovány ve standardní krmné stravě.
Odběr tkání a odběr krve
Den po posledním dni testu dvou lahví na výběr, polovina krys (n = 6 na skupinu) byly rychle usmrceny mezi 09:00 a 12:00 hodinou CO2 inhalace. Krev byla odebrána do zkumavek s EDTA (Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, Francie) a centrifugována při 2,500 g pro 15 min při 4 ° C. Plazma byla zmrazena při -20 ° C. Orgány a individuální retroperitoneální tukové skladiště byly pitvány a zváženy. Mozek byl rychle odstraněn a umístěn do mozkové matrice (WPI, Sarasota, FL, USA krysa 300 – 600 g). Nejprve byl pitván hypothalamus [podle Paxinosových atlasových souřadnic: −1.0 až −4.5 mm od Bregmy (31)], pak pro každou krysu byly získány dva koronální plátky o tloušťce 2 mm na úrovni NAc a další na úrovni VTA. Vzorky pravého a levého NAc a pravého a levého VTA (celkem čtyři vzorky na zvíře) byly rychle získány pomocí dvou různých bioptických údů (Stiefel Laboratories, Nanterre, Francie) (průměr 4 mm pro NAc a 3 mm pro ventrální midbrain). Vzorky byly rychle zmrazeny v tekutém dusíku a uloženy při -80 ° C pro následné stanovení genové exprese pomocí TaqMan pole s nízkou hustotou (TLDA).
Ostatní krysy (n = 6 na skupinu) byli hluboce anestetizováni pentobarbitalem (150 mg / kg ip) a perfundováni transkardiální fyziologickou solnou perfúzí následovanou ledově chladným 4% paraformaldehydem ve fosfátovém pufru (PB), pH 7.4. Mozky byly rychle odstraněny, ponořeny do stejného fixačního prostředku na 1 h při 4 ° C a nakonec uloženy do 25% PB sacharózy po dobu 24–48 h. Mozky byly poté zmrazeny v isopentanu při -60 ° C a nakonec skladovány při -80 ° C až do použití. NAc, hypotalamus a VTA byly rozřezány na 20 um sériové koronální řezy pomocí kryostatu (Microm, Microtech, Francheville, Francie). Byly provedeny dvě nebo tři série 10 skleněných sklíček obsahujících 4–6 řezů pro každou oblast mozku. U každého skleněného sklíčka jsou sériové řezy rozmístěny po 200 µm (obrázek (Obrázek 66).
Biochemické analýzy plazmatu
Plazma EDTA shromážděná na potkanech P25, P45 a P95 byla použita k měření plazmatické glukózy, NEFA (neesterifikovaných mastných kyselin), inzulínu a leptinu. Glukóza a NEFA byly měřeny pomocí kolorimetrických enzymatických reakcí se specifickými soupravami (soupravy pro glukózu a NEFA PAP 150, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, Francie). Hormony byly testovány pomocí specifických souprav ELISA podle pokynů výrobce pro inzulín a leptin (souprava ELISA pro potkana / myší inzulín, souprava ELISA pro potkana, Linco Research, St. Charles, MO, USA).
Imunohistochemie
Skleněné sklíčka obsahující sériové řezy VTA a NAc byly nejprve blokovány pro 3 – 4 ha potom inkubovány přes noc při 4 ° C se směsí následujících protilátek: myší anti-NeuN (1: 500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, USA) a králičí anti-TH (1: 1,000; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, USA). Po inkubaci s primárními protilátkami a následném promytí PB byly řezy inkubovány ve směsi sekundárních protilátek: Alexa 488 konjugovaný osel anti-myší IgM a Alexa 568 konjugovaný osel anti-králičí IgG (1: 500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham , MA, USA) pro 2 h. Řezy byly namontovány do superfrostu plus zlatých sklíček (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), sušeny na vzduchu a zakryty krycím činidlem ProLong ™ Gold antiifade (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).
TH Neuronové se počítají ve VTA
Pro každou krysu byly TH-pozitivní buňky počítány, jak bylo popsáno dříve (32) ve třech různých rostrocaudálních hladinách VTA: na úrovni výstupu třetího nervu (vzdálenost vzhledem k Bregma: −5.3 mm), 200 µm rostral a 200 µm kaudální k této úrovni (obrázky (Figures6A) .6A). Pro levou a pravou stranu byl digitalizovaný obraz zahrnující celou VTA od koncového traktu příslušenství mediálně k laterálnímu okraji mezencefalonu získán pomocí zvětšení × 40 digitálního skeneru NanoZoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Japonsko). Po obvodu VTA byla pro každou sekci nakreslena čára. Hranice byly vybrány zkoumáním tvaru buněk a odkazem na atlas Paxinos a Watson. Dopaminergní neuron byl definován jako NeuN (+) / TH (+) imunoreaktivní buněčné tělo s jasně viditelným jádrem. Za použití softwaru NIH Image J (plugin pro čítač buněk) byly buňky NeuN (+) / TH (+) počítány dvěma různými osobami bez znalosti skupin zvířat. Chyby počítání rozdělených buněk byly opraveny pomocí vzorce Abercrombie (32), kde N = n[t/(t + d)] (N = celkový počet buněk; n = počet spočítaných buněk; t = tloušťka profilu; a d = průměr buňky) a tento korekční faktor byl 0.65. Data jsou vyjádřena jako průměr [NeuN (+) / TH (+) v levé a pravé VTA] ± SEM.
TH Fiber Density v NAc
Obsah TH proteinu v dopaminergních nervových zakoncích NAc byl stanoven anatomickou denzitometrickou analýzou imunoznačených řezů TH. Hustota vláken TH byla kvantifikována na třech libovolných úrovních podél rostrokaudální osy NAc (Bregma 2.20, 1.70 a 1.20 mm) (obrázek (Obrázek6B) .6B). Stručně, digitalizovaný obrázek obsahující celé striatum a NAc získaný použitím × 40 zvětšení digitálního skeneru NanoZoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Japonsko). Pro daný NAc byla kolem celého jádra nakreslena čára pro definování oblasti měření optické hustoty (OD) (obrázek) (Obrázek6B) .6B). Získaná hodnota byla normalizována s hodnotou OD měřenou z kruhové zóny nakreslené na corpus callosum (oblast neobarvená pro imunochemii TH) ve stejné sekci pomocí softwaru NIH Image J. Data jsou vyjádřena jako průměr OD poměru (hodnota OD v NAc / OD hodnota v corpus callosum ze tří sekcí) ± SEM.
Exprese genů TLDA a TaqMan
RNA byla izolována ze vzorků mražených NAc, VTA-obohacených vzorků a hypotalamu pomocí soupravy RNA / protein NucleoSpin (Macherey-Nagel, Hoerdt, Francie). Celková RNA byla podrobena digesci DNázy podle pokynů výrobce, množství bylo odhadnuto pomocí UV absorbance 260 / 280 nm a kvalita byla hodnocena pomocí Bioanalyzerového systému Agilent 2100, poté bylo vypočteno číslo integrity RNA (RIN). Vzorky s RIN pod 8 byly vyřazeny. Jeden mikrogram celkové RNA byl reverzně transkribován do cDNA pomocí vysokokapacitní RT soupravy (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) v celkovém objemu 10 ul.
Jak bylo popsáno výše (33), TLDA je 384-mikrokapalinová karta, na které lze provádět současné 384 PCR v reálném čase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Použili jsme speciálně navržený TLDA vytvořený k pokrytí různých genových rodin souvisejících s plasticitou a regulací příjmu potravy. Každá vlastní karta byla nakonfigurována jako nakládací řádky vzorků 2 × 4 obsahující reakční komory 2 × 48 (reference: 96a). Sada genů 92 (tabulka S1 v doplňkovém materiálu) a byly studovány čtyři úklidové geny (18S, Gapdh, Polr2a a Ppia). PCR v reálném čase byla prováděna pomocí reagencií Life Technologies TaqMan a prováděna na systému ABI Prism 7900HT sekvenční detekce (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Nezpracovaná fluorescenční data byla sbírána pomocí PCR s použitím softwaru SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), který dále generoval prahové cykly Ct s automatickým stanovením jak základní linie, tak prahu. Po filtraci pomocí cloudové aplikace ThermoFisher (ThermoFisher, USA) k rozlišení aberantních běhů PCR byly testy na vzorek n = 6 (n = 5 pro skupinu WD na P25). Data byla poté analyzována pomocí ThermoFisher Cloud App (ThermoFisher, USA) pro relativní kvantifikaci. Relativní kvantifikace genové exprese (RQ) byla založena na komparativní Ct metodě využívající rovnici RQ = 2−ΔΔCt, kde AAT pro jeden genový cíl byla jeho vlastní varianta Ct odečtená ze vzorku kalibrátoru a normalizována endogenní kontrolou. Přesně jsme určili nejstabilnější gen pro domácnost pomocí algoritmu geNorm (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, USA). Mezi čtyřmi geny hospodaření byl Gapdh definován jako endogenní kontrola NAc a hypotalamu a Ppia pro VTA, což platilo pro všechny vzorky ze tří analyzovaných časových období. Grafické znázornění exprese genů bylo navrženo manuálně tak, aby přiřazovalo jednu barvu pro 10% zvýšení genové exprese vzhledem ke skupině CD. Významná variace pomocí neparametrického Wilcoxonova testu se znaménkem byla zaznamenána s hvězdičkou.
Statistická analýza
Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM v tabulkách a obrázcích. Pro analýzu tělesné hmotnosti v různých časových bodech, preferencích tuku a poměru OD získaných z imunohistochemie byl použit neparametrický test Mann – Whitney.
Abychom vyhodnotili význam předvoleb tuků 3 dní, provedli jsme statistickou analýzu sloupců pro každý den. Pro každou skupinu byla testována spotřeba tukového roztoku a kontrolního roztoku pomocí neparametrického Wilcoxonova testu se znaménkem. Srovnali jsme preferenční střední hodnotu s hypotetickou hodnotou 50% (tečkovaná červená čára). S červenou hvězdičkou byla zaznamenána významná variace. Stejný test jsme použili pro analýzu hodnot qPCR RQ; porovnali jsme střední hodnotu RQ s hypotetickou hodnotou 1. Významná variace byla zaznamenána s hvězdičkou (obrázek 5) (Obrázek 44).
Pro analýzu vzorků plazmy jsme provedli neparametrický Mannův a Whitneyův test. Počet TH-pozitivních buněk byl analyzován pomocí obousměrné ANOVA a p hodnota byla vypočtena. Kvůli velkému množství implementovaných testů, Bonferroni post hoc oprava byla použita pouze po tomto testu. Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
PCA bez dozoru byl nejprve proveden na parametrech 130 (TLDA, chování a údaje o plazmě) v různých časových bodech pro každé údery mozkové biopsie (VTA, NAc a hypothalamus), aby se vizualizovala obecná struktura datové sady (tj. Tři globální PCA) za časový bod). PCA lze definovat jako ortogonální promítání dat do dolního dimenzionálního lineárního prostoru, takže rozptyl promítaných dat je maximalizován v podprostoru. Nejprve jsme odfiltrovali geny, které nejsou exprimovány nebo mírně exprimovány (obrázek č (Obrázek5) .5). Hodnoty pro potomky z matek s krmením CD a z matek s krmením WD se objevily v různých barvách v jednotlivých grafech PCA, aby se vizualizovalo, zda jsou tyto dvě experimentální skupiny dobře odděleny nekontrolovanými komponenty PCA. Tato analýza odděluje skupiny genů, které jsou odlišně exprimovány mezi oběma skupinami potomků. Následně byly provedeny zaměřené PCA na různých klastrech markerů mRNA: plasticita (buněčná adheze, cytoskelet, neurotrofní faktor, synaptogeneze a transkripční regulace), DA cesta, GABAergická cesta, epigenetické modulátory (histon deacetyláza a histon acetyltransferáza). Tyto zaměřené PCA umožňují současné vizualizaci korelace mezi mateřskou stravou a některými markery a korelací mezi specifickými rodinnými geny. Kvalitativní měřítko bylo použito pro analýzu PCA a soustředěného PCA: +++: velmi dobrá separace; ++: dobrá separace s jednou krysou na špatné straně separace PCA; +: docela dobré oddělení se dvěma krysy (jedna z každé skupiny) na špatné straně, -: žádné jasné oddělení.
výsledky
Tělesná hmotnost a růst
Příjem WD během těhotenství (z G1 do G21) neovlivnil tělesnou hmotnost mláďat při narození (obrázek (Obrázek 2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g vs. WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (obrázky (Figures2A, B) .2A, B). Přírůstek tělesné hmotnosti od narození do odstavu byl o 21% vyšší u potomků narozených z matek WD než u potomků z matek CD s tělesnou hmotností výrazně vyšší při odstavení u potomků narozených z matek WD (36.19 ± 0.90 g vs 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (obrázek (Obrázek 2C) .2C). Od odstavu do konce experimentu (P95) byly krysy krmeny standardní krmnou stravou a tělesná hmotnost zůstávala vyšší pro potomky od WD přehrad, než od CD potomků. Podrobnosti: během dospívání (P39) (obrázky (Figures2A, D), 2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g vs. WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 a na P93 (mladý dospělý) (obrázky (Figures2A, E) 2A, E) CD: 478 ± 9.9 g vs. WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Hormony a metabolické markery v různých časových obdobích
Koncentrace plazmatického leptinu, inzulínu, glukózy a NEFA byly měřeny v P25, P45 a P95. Hladiny glukózy v plazmě, NEFA a leptinu WD potomků se ve všech věkových skupinách statisticky nelišily od CD potomků (tabulka (Table2,2, n = 6 na skupinu). Pozorovali jsme významné zvýšení ukládání tuků (poměr retroperitoneální tukové hmoty) u potomků samic krmených WD pouze na P25 (p = 0.0327, Mannův a Whitneyův test).
Dopad perinatální WD na preferenci tuků od odstavu do dospělosti
Abychom prozkoumali vliv WD na tukovou preferenci, použili jsme paradigma dvou lahví ve třech různých časových bodech během růstu. Tento test byl použit ke specifickému studiu preference tukové chuti tím, že se co nejvíce zabránilo metabolickému účinku jeho požití. Ukázali jsme, že rozdíly v „extra“ kalorickém příjmu z láhve (na P25, P45 a P95) nejsou statisticky významné mezi skupinami (obrázky S1A – C v doplňkovém materiálu). Navíc rozdíl ve spotřebě roztoku 1% kukuřičného oleje vede ke zvýšení kalorií o 1% pro WD krysy u P25 (WD: 4.9% vs CD: 3.9% požitých kalorií) a 0.5% pro CD krysy u P45 (WD: 2% vs CD: 2.5% spotřebovaných kalorií) (obrázky S1D – F v doplňkovém materiálu). U P25 nemají štěňata z matek CD přednost před tukem (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); na opačných krysách WD preferují tuky (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 po Wilcoxonově testu se znaménkem (červená hvězdička). Navíc existuje statistický rozdíl mezi oběma skupinami s p = 0.0347 (Mannův a Whitneyův test, značka černé hash) (obrázek (Obrázek 33A).
U P45 a P95 mají obě skupiny významnou preferenci pro tuk, tj. Výrazně se liší od teoretické hodnoty 50% (v P45, CD: 80.68 ± 2.2% p = 0.0005 a WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; při P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 a WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 po Wilcoxonově testu se znaménkem, červená hvězdička) (obrázek (Obrázek 3A) .3A). Hodnoty pro obě skupiny byly nerozeznatelné po jednom dni prezentace chuti (na P45) p = 0.7857 a na P95 p = 0.9171 Mann – Whitneyův test) (obrázek (Obrázek 33A).
Abychom věděli, jak krysy regulují svou spotřebu tuku v čase, opakovali jsme prezentaci tuku tři po sobě následující dny v P45 a P95 (obrázky (Figures3B, C) .3PŘED NAŠÍM LETOPOČTEM). Zajímavé je, že u P45 pouze muži z přehrad WD postupně ztratili preferenci pro řešení s obsahem tuku (obrázek 5) (Obr. 3B) 3B) (třetí den: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 po Wilcoxonově testu se znaménkem). V P95 (dospělý věk) však všechna zvířata upřednostňovala tuk bez vývoje během 3denního testu (obrázek (Obrázek 33C).
Souhrnně lze říci, že v tomto modelu jsme v rané fázi (dětství) pozorovali preferenci tuku u potkanů krmených přehradami WD s progresivním nezájemem v průběhu času během dospívání. V dospělosti jsme nepozorovali žádný rozdíl mezi těmito dvěma skupinami potkanů.
Molekulární podpis plasticity mozku a obvodů GABA remodelace v hypotalamu a odměněných cestách
Abychom určili, zda příjem mateřské WD během těhotenství a laktace má vliv na dráhy hypotalamu a odměny potomků, měřili jsme relativní expresi několika klíčových faktorů plasticity mozku, modelování mozku a markerů neuronových obvodů zapojených do příjmu potravy a epigenetiky. regulátory. TLDA jsme použili k analýze jejich hojnosti v různých oblastech mozku (tj. Hypothalamus, VTA a NAc) (tabulka S1 v doplňkovém materiálu) ve třech časových obdobích. Screening byl proveden po testech dvou lahví na P25, P45 a P95 (obrázek (Obrázek 1) 1) u šesti samců narozených z matek krmených WD a šesti samců narozených z matek krmených CD.
Na P25 v hypothalamu vykazovalo pět genů ze třinácti různých kategorií výrazně nižší hladinu exprese mRNA hlavně u markerů plasticity a markerů GABA v rozmezí mezi –20% (Gfap) a –40% (Gabra5) u mláďat krmených matkami ve srovnání s krysy z Přehrady krmené CD. V biopsiích odměnových cest (VTA a NAc) dva geny vykazovaly statisticky vyšší úrovně exprese mRNA (D2R a Gabra1), tj. DA signální a GABA receptory a jeden gen nižší expresi (Hcrtr2) (tj. Orexinový 2 receptor) v NAc , zatímco čtyři geny vykazovaly ve VTA významně vyšší úroveň exprese mRNA (Map2, Gabara1, Hcrtr1 a Hcrtr2) (tj. markery plasticity, GABA receptory a serotoninergní receptory) (Obrázek 44).
V P45 v hypotalamu pět genů ze třinácti různých kategorií vykazovalo nižší hladinu exprese mRNA v rozmezí mezi –20% (Fos) a –50% (FosB) u mláďat od matek krmených WD ve srovnání s krysy z matek krmených CD. V P45 v biopsiích odměnových cest vykazovaly čtyři geny vyšší úroveň exprese mRNA (Gfap, Dat, Cck2r a Kat5) a dva geny nižší expresi (Fos a FosB) v NAc, zatímco tři geny vykazovaly nižší úroveň exprese mRNA (Arc, FosB a Th) a jeden gen vyšší úrovně (Gabrg2) ve VTA.
V P95 v hypotalamu vykazovaly geny 20 ze třinácti různých kategorií vyšší hladinu exprese mRNA v rozmezí + 20 až + 40% (Syt4 až Gjd2) a geny 3 vykazovaly nižší expresi mRNA (FosB, D1r a GabarbXNUMD) u mláďat krmení přehrad v porovnání s krysy z krmení přehradami CD. V P1 v biopsiích odměnových drah vykazovaly geny 95 vyšší úroveň exprese mRNA v rozmezí + 12 až + 20% (Syn40 až Hcrt1) a gen 1 nižší expresi (Th) v NAc, geny 1 vykazovaly vyšší expresi mRNA (Ncam6) , Gja1, Gjd1, Gabra2, Htr5a a Htr1b) a 1 geny vykazovaly nižší úroveň exprese mRNA (Cntf, Igf6, Fos, Socs1, Gabrb3 a Hdac2) ve VTA.
Potom jsme provedli tři PCA bez dozoru odpovídající třem biopsiím mozku za použití všech kvantifikovaných parametrů (tj. Dávky plazmy, behaviorálních dat a variací exprese mRNA). Jasné oddělení těchto dvou skupin bylo získáno pouze u P95 pro NAc a VTA (tabulka (Table33).
Podle korelačního kruhu PCA a dat TLDA (představujících většinu proměnných zahrnutých v tomto PCA) jsme definovali genové rodiny, které by mohly být zodpovědné za segregaci, a provedli soustředěný PCA (obrázky (Obrázky 5A, B, 5Například A, B). Zaměřená PCA odhalila, že v P25 DA mohly markery v NAc a markery plasticity v hypothalamu oddělit dvě skupiny potomků (tabulka (Table33 pro shrnutí). V P45 pak nebyla taková diskriminace dosažena. Stejná analýza u P95 však odhalila, že různé markery systému GABA v NAc a hypothalamus, plus markery plasticity (v hypothalamus, NAc a VTA) a regulátory epigenetiky (pouze v NAc) přispívají k oddělení dvou skupin zvířat ( Postava (Figure5; 5; Stůl Table33).
Tato analýza odhaluje dlouhodobý vliv perinatální stravy na GABAergické markery, jakož i plastičnost a epigenetické markery v homeostatické i odměnové dráze, které se podílejí na stravovacím chování.
Imunohistochemie TH buněk potvrzená transkripční analýza
Protože jsme pozorovali určité variace v TH mRNA v NAc a VTA v různých vývojových obdobích, zaměřili jsme se na korelaci těchto výsledků s TH imunostainingem. Počet TH / NeuN pozitivních buněk byl analyzován ve VTA, kde jsou umístěna dopaminergní buněčná těla a OD imunoznačení TH byla kvantifikována v nervových zakončeních umístěných v NAc. TH (+) buňky byly méně hojné ve VTA WD ve srovnání s CD krysy pouze u P45 (obrázky) (Obrázky 6A, C, E; 6ESO; Postava S2A v doplňkovém materiálu). Ve třech obdobích (P25) nedošlo k žádné významné interakci mezi úrovní řezu a kvantifikací TH / NeuN p = 0.9991, P45 p = 0.9026 a P95 p = 0.9170). Pouze na P45 byl získán statistický rozdíl mezi oběma skupinami potomků (p = 0.0002) (Obrázek (Figure6E) .6E). Kromě toho jsme nepozorovali žádný rozdíl v OD imunitního barvení TH v NAc v P25 a P45 mezi dvěma skupinami (hodnoty poměru OD v P25: 1.314 ± 0.022 v CD vs 1.351 ± 0.026 v WD, p = 0.2681; Hodnoty OD poměru při P45: 1.589 ± 0.033 u CD vs. 1.651 ± 0.027 u WD, p = 0.1542). Bylo však zjištěno významné snížení OD nervových zakončení TH v NAc ze skupiny WD na P95 (hodnoty OD poměru na p95: 1.752 ± 0.041 v CD vs 1.550 ± 0.046 v WD, p = 0.0037) (obrázky (Obrázky 6B, D, F; 6B, D, F; Postava S2B v doplňkovém materiálu).
Diskuse
V této studii jsme předpokládali, že perinatální mateřská výživa matek bude mít vliv na program rozvoje cest odměňování zapojených do energetické homeostázy, výběru potravin a příjmu potravy potomků. Intenzivně jsme zkoumali vliv příjmu mateřské WD od narození po odstavení na GABA, serotonin a DA dráhy specifických oblastí mozku (VTA, NAc a hypothalamus) u potomků, od dětství do dospělosti. Naše výsledky naznačují, že použití stravy bohaté na tuky a sladkosti, přísně omezené na perinatální období, má dopad na předčasnou tukovou preferenci (dětství) u potomků korelovaných se změnou profilu genové exprese a neuroanatomických / architektonických změn mezolimbic dopaminergní sítě. Když však byli potomci chováni v krmivech pro chow, pozorovali jsme u dospívajících potkanů krmených WD postupnou ztrátu atraktivity vůči tuku, která korelovala se sníženou expresí genů DA systému a mírným snížením TH pozitivních neuronů ve VTA . Později v životě se preference tuku mezi skupinami nelišily, přestože u potkanů z hnízd krmených WD byla u potkanů identifikována důležitá plasticita GABAergických sítí a energetické homeostázy sítě hypotalamu (obrázek) (Obrázek 77).
Prvním dopadem příjmu perinatálního WD, který jsme pozorovali v této studii, je zvýšení tělesné hmotnosti potomstva při odstavení, ale žádný rozdíl při narození. Zvířata ve skupině WD na konci období sání přibývají o 21% více než CD. Předchozí studie přinesly protichůdné výsledky, pokud jde o změnu porodní hmotnosti pro potomky z matek krmených WD: vyšší tělesná hmotnost (19, 34), nižší tělesná hmotnost (18, 21, 35) nebo žádný rozdíl (6, 22). Naše data jsou v souladu s nedávnou meta-regresní analýzou (36) provedené na experimentálních publikacích 171, které dospěly k závěru, že expozice HFD u matky neovlivnila porodní hmotnost potomstva, ale na konci laktačního období vyvolala zvýšenou tělesnou hmotnost. Vyšší tělesná hmotnost potomstva WD pravděpodobně odráží změnu ve složení mléka a / nebo produkci mléka, jak bylo ilustrováno v předchozích publikacích (37, 38). V souladu s jejich vyšší tělesnou hmotností byl poměr retroperitoneálního tuku u potomstva WD významně vyšší než u potomstva CD na konci období kojení (P25, tabulka Table2), 2), což je také v souladu s předchozími studiemi (18, 21). Vyšší adipozita však u P45 a P95 nepřetrvávala a další metabolické parametry jako inzulín, NEFA a glukóza v plazmě se mezi skupinami nelišily. Naše výsledky prokázaly, že bez jasné mateřské obezity během těhotenství a laktace není strava sama o sobě dostatečná k vyvolání trvalých metabolických účinků u potomků (22, 39, 40).
Bylo hlášeno, že příjem perinatálního HFD pozitivně koreluje s preferencí potomků pro chutné jídlo (41). V naší studii jsme provedli longitudinální studii zaměřenou na testování preference tuku u potomků, kteří jsou odstaveni na pravidelných krmivech.
Dopad perinatální WD na dětství (po odstavení)
Štěně hlodavců jedí pevné jídlo 19 – 20 dny po narození (42), když jejich mozkové cesty odměny ještě nejsou zralé (17). Bylo proto velmi zajímavé studovat jejich velmi časné preference pro tuk a korelovat tuto časnou preferenci s analýzou mozkových transkriptů. Hned po odstavení jsme pozorovali preferenci tuku u potomstva WD, který nebyl u CD potkanů prokázán. To je v souladu s ostatními zprávami, které ukazují spojení mezi perinatální podvýživou a chutnou preferencí potravy a nízkou preferencí tuku v raném věku u kontrolních potkanů (43).
Globální PCA neumožňovala diskriminaci skupiny štěňat s ohledem na výživu matek v tomto věku. Když však byla provedena cílená PCA, omezená na DA markery, jsme získali dobrou segregaci skupin. Ve skutečnosti existuje výrazné zvýšení exprese mRNA D2 receptoru v NAc u WD mláďat. Tato postsynaptická nadměrná exprese D2 v NAc by mohla být částečně zapojena do vyšší motivace k tuku (44). Jen málo dalších transkriptů je modifikováno u WD mláďat ve srovnání s CD mláďaty, jako je zvýšení alfa 1 GABAA podjednotky v NAc a VTA a snížení alfa 5 GABAA podjednotky v hypotalamu, což naznačuje reorganizaci GABAA receptorů v těchto jádrech.
Vliv perinatální WD na dospívání
U P45u jsme pozorovali podobnou preferenci s vysokým obsahem tuků pro obě skupiny v první den prezentace, ale zajímavé je, že WD krysy postupně ztratily zájem o tuk po opakované prezentaci. Adolescence je kritické období neurobehaviorální reorganizace nezbytné pro celoživotní kognitivní zpracování (45) a různé studie prokázaly značnou zranitelnost vůči škodlivému kognitivnímu účinku tukové stravy (46-48). Tento výsledek je ve zjevném rozporu s předchozí prací skupiny Muhlhausler (21, 35), ve kterém mláďata potkanů (6 týdny) vykazovala jasnou preferenci pro nezdravé jídlo. Experimentální paradigma se však ve svých publikacích lišila, protože krysy měly volný přístup ke standardním krmivům pro žvýkačky a nezdravé potraviny od odstavu do oběti (6 týdny).
Současně jsme měřili zvýšení Dat mRNA v NAc a snížení Th mRNA ve VTA, což bylo potvrzeno imunohistochemií, která prokázala snížený počet TH (+) buněk ve VTA WD krys. Po zvýšené transkriptomické aktivitě pro systém DA při odstavení může snížená aktivita v P45 vysvětlit nízký zájem o chutné jídlo pozorované u našich potkanů WD. Je třeba také poznamenat, že systematické snížení exprese mRNA Fos a FosB v různých jádrech, která jsme analyzovali, by mohlo být známkou snížené mozkové aktivity po expozici matkám WD.
Dospívající krysy WD vykazovaly rychlejší nezájem o tuk, který je v rozporu s jejich dřívějším chováním. Zdá se, že použití „normální“ stravy během dětství je „chrání“ před přehnanou tukovou preferencí v dospívání. Naopak, když mají krysy po odstavu volný přístup k nezdravému jídlu, jako je uvedeno v Ref. (21, 35), ukazují v dospívání silnou preferenci tuku. Tento výsledek svědčí o tom, že dieta 3 v týdnech krmení po odstavení by mohla přeprogramovat obvody a učinit dospívající potomky méně citlivými na akutní tukovou výzvu.
Dopad perinatálního WD na dospělé
Dospělé krysy již nevykazovaly rozdíl v preferenci tuku, a to ani po opakovaném podání tuku, jak již bylo popsáno (22, 35). Současně jsme pozorovali pokles Th mRNA a proteinu v NAc a tendenci ke snížené expresi Dat mRNA ve VTA. Naef a spolupracovník (20) již uvedli nízkou aktivitu systému DA u dospělých potkanů krmených perinatálním obdobím pomocí HFD, s oslabenou odpovědí DA na amfetamin měřenou mikrodialýzou a zvýšenou motivací k odměňování tuků (viz tabulka shrnující nejnovější údaje o qPCR na tomto modelu Stůl S2 v doplňkovém materiálu). Jedno omezení kvantifikace TH (mRNA a imunohistochemie) v NAc vychází ze skutečnosti, že NAc buňky mohou také exprimovat Th mRNA a protein a pak mohou zkreslit kvantifikaci DA vláken (49, 50). Avšak použití imunofarbení TH v NAc odhalilo hlavně husté axonové terminály pocházející z midbrainových DA neuronů (VTA a SNc). Obvykle byly neurony exprimující TH ve striatu a NAc rozeznatelné pouze u zvířat silně postižených DA (51), a proto by bylo v našich imunitních sekcích těžko detekovatelné. V této studii jsme také pozorovali silné zvýšení mu opioidního receptoru u NAc, když jiné skupiny, s různými modely, vykazovaly sníženou expresi ve ventrálním striatu potkanů, kteří byli brzy vystaveni HFD (během laktace a těhotenství) (19, 21) nebo žádná změna (35). Tyto modifikace, měřené pouze na úrovni mRNA, by mohly odrážet mírnou hypo aktivitu DA obvodů spojenou s vyšší citlivostí na opioidy (52), které pravděpodobně nepostačují k tomu, aby měly dopad na test chování, který jsme provedli. Tyto předpoklady je třeba potvrdit pomocí funkčních přístupů. V nedávném článku, s podobným modelem, Romani-Perez et al., Nebyli schopni pozorovat výrazný nárůst motivace v boxech pro operativní kondicionování potomků HFD, ale pozorovali kratší latenci k dosažení cílového boxu v paradigmatě testovací dráhy (22). Navzdory absenci dlouhodobé preference tuku v našich experimentálních podmínkách jsme zjistili, že příjem perinatálního mateřského WD má dlouhodobý účinek na další mozkové obvody většinou zprostředkované remodelací GABA v NAc a hypotalamu. NAc je považován za „smyslový sentinel“ pro konzumní chování (52). Nedávné studie ukázaly, že příjem potravy byl potlačen inhibicí LH neuronů uvolňujících GABA (53). O'Connor a kol. ukázalo, že neurony NAc D1R (GABAergické projektující neurony) selektivně inhibují LH VGAT neurony, aby zastavily příjem potravy (54). Tyto experimenty odhalily obvod GABA (NAc / Hypothalamus), který může být zodpovědný za řízení behaviorální reakce. Tento ventrální striatum - hypothalamický systém doplňuje další obvod, který zahrnuje jádro postele stria terminalis GABA uvolňující VGAT promítající neuron na glutamát uvolňující Vglut LH neurony a přímou inhibici krmení LH vglut2 (55). Další důležitou součástí obvodu regulujícího chuť k jídlu, který zahrnuje NAc shell, je inhibiční projekce uvolňující GABA na VP (56). Tato data zdůrazňují klíčovou roli signalizace GABA v souhře mezi hypotalamem a NAc při podpoře krmení. V naší studii jsme nebyli schopni rozlišit populaci neuronů zapojených do remodelace GABA a jak tyto modifikace mohly změnit sítě. Ústřední role obvodů GABA si však zaslouží větší zájem. Zejména by bylo velmi zajímavé provádět další funkční experimenty těchto obvodů GABA pomocí elektrofyziologických přístupů (57). Ve třech studovaných jádrech jsme také pozorovali globální upregulaci transkriptu mRNA pro receptory 5HT1a a 5HT1b. Většina vyčnívajících serotoninových vláken pochází z dorzálního jádra raphe (DRN) a středního jádra raphe (MRN). Nedávná data z in vivo nahrávky a zobrazovací studie ukázaly pozitivní roli 5HT v odměně (58). 5HT vlákna z DRN se podílejí na řízení impulsivity (59). Zvýšení 5HT1a ve VTA a NAc by mohlo být kompenzačním mechanismem, který by mohl řídit impulsivitu. V hypothalamu farmakologické studie naznačují, že podtypy receptorů 5HT1a mohou potlačit chování při jídle vyvolané stimulací serotoniny (60, 61). Zvýšené receptory 5HT1a a b v hypotalamu by mohly potencovat účinek serotoninu na potlačení příjmu potravy, a proto by mohly představovat kompenzační mechanismus. Tyto předpoklady je třeba ověřit řádnými funkčními experimenty.
Tyto změny v síti jsou spojeny s úpravami markerů plasticity, jako je Ncam mRNA. V hypotalamu dospělých potkanů jsme pozorovali zvýšený počet transkriptů Ncam1 a St8sia4, což naznačuje a zvyšuje signalizaci kyseliny polysialové (PSA). PSA je glykan na buněčném povrchu, který moduluje interakce buňka-buňka. Polysialylace buněčných adhezních proteinů se podílí na různých procesech závislých na synaptické plasticitě v centrálním nervovém systému a bylo hlášeno, že je vyžadována pro adaptivní synaptickou plasticitu napájecích obvodů během akutní pozitivní energetické bilance (33, 62). Kromě toho mohou být do této hypothalamické plasticity zapojeny další regulátory buněčné interakce a synaptogeneze.
Na závěr (obrázek č (Obrázek7), 7), mateřský příjem WD má dlouhodobý vliv na organizaci homeostatických a hedonických obvodů regulujících stravovací chování u potomků. Analýzou tří kritických časových období jsme byli schopni prokázat jasný vývoj tukové preference korelované se specifickými mozkovými molekulárními podpisy. Během dětství by preference tuku mohla souviset s vyšší aktivitou systému DA. Adolescence, charakterizovaná inverzí tukové preference, byla spojena s nižší expresí markerů DA systému, což naznačuje kompenzační mechanismus. Velmi zajímavým bodem pro oznámení je, že v tomto modelu by vyvážená strava po odstavení mohla chránit dospívající krysy před škodlivými stravovacími návyky snížením jejich touhy po tuku. Ačkoli v dospělosti mají obě skupiny podobnou vysokou preferenci pro tuk, potkani z matek krmených WD vykazovali hlubokou přestavbu obvodů GABA. Jaké jsou důsledky této trvalé plasticity? Bude přehnaný obezogenní příjem potravy během dospívání reaktivovat tento otupený systém odměn? Tyto otázky by mohly být relevantní při nutričních sledování novorozenců a dětí vyrůstajících v západních zemích.
Etické prohlášení
Všechny experimenty byly provedeny v souladu s pokyny místního výboru pro dobré životní podmínky zvířat, EU (směrnice 2010 / 63 / EU), Institut National de la Recherche Agronomique (Paříž, Francie) a francouzského veterinárního oddělení (A44276). Experimentální protokol byl schválen institucionální etickou komisí a zaregistrován pod referencí APAFIS 8666. Byla přijata všechna opatření k minimalizaci stresu a počtu zvířat použitých v každé sérii experimentů.
Autorské příspěvky
JP a PB provedli experiment a účastnili se diskuse a psaní. TM provedla PCA a zúčastnila se diskuse a psaní. SN přispěla k návrhu experimentu a zúčastnila se diskuse. PP přispěl k návrhu experimentu, zúčastnil se diskusí a napsal rukopis. VP navrhl a provedl experimenty, analyzoval data a napsal rukopis.
Prohlášení o konfliktu zájmů
Autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez obchodních či finančních vztahů, které by mohly být považovány za potenciální střet zájmů.
Poděkování
Autoři by rádi ocenili Guillaume Poupeau a Blandine Castellano za péči o zvířata během studie, Anthony Pagniez za jeho pomoc při extrakci mRNA a TLDA, Isabelle Grit za její pomoc při analýze vzorků plazmy a Alexandre Benani a Marie-Chantal Canivenc za jejich užitečnou diskusi a návrh TLDA.
Poznámky pod čarou
Financování. Tento výzkum byl podpořen grantem regionu des pays de la Loire PARIMAD (VP), grantem LCL nadace (VP a PP), nadací SanteDige (VP) a INRA Metaprogram DIDIT (SN, VP, PP).
Doplňkový materiál
Doplňkový materiál k tomuto článku je k dispozici online na adrese http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Obrázek S1
Celkový příjem energie z láhve obsahující kukuřičný olej. (A) Příjem kalorií z láhve kukuřičného oleje pro 24 h u P25 u štěňat z hnízd krmených západní stravou (WD) a u mláďat hnízd krmených kontrolní dietou (CD). (B) Příjem kalorií z láhve kukuřičného oleje pro 24 h v P45 (třetí den testu v lahvi). (C) Příjem kalorií z láhve kukuřičného oleje pro 24 h v P95 (třetí den testu v lahvi). Pro panely (A – C), data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM, žádný statistický rozdíl (p > 0.05) bylo pozorováno po neparametrickém testu Manna a Whitneyho ve všech věkových skupinách. (D) Procento příjmu kalorií z láhve kukuřičného oleje ve srovnání s celkovým příjmu kalorií (láhev kukuřičného oleje + standardní krmná strava) pro 24 h v P25 u mláďat WD a CD štěňat. (E) Procento příjmu kalorií z láhve kukuřičného oleje ve srovnání s celkovým příjmu kalorií (láhev kukuřičného oleje + standardní krmná strava) pro 24 h u P45 (třetí den testu v lahvi) u štěňat WD a CD štěňat. (F) Procento příjmu kalorií z láhve kukuřičného oleje ve srovnání s celkovým příjmu kalorií (láhev kukuřičného oleje + standardní krmná strava) pro 24 h v P95 (třetí den testu v lahvi) u štěňat WD a štěňat CD. Pro panely (D, E), údaje jsou vyjádřeny v procentech celkového příjmu kalorií bez statistického rozdílu (p > 0.05) bylo pozorováno po chí-kvadrátu s Yatesovou korekcí ve všech věkových skupinách.
Obrázek S2
Reprezentativní mikrofotografie TH imunobarvení v nucleus accumbens (NAc) a ventrální tegmentální oblasti (VTA) ve třech různých časových bodech. (A) Fotomikrograf imunofarbení TH / NeuN na úrovni VTA, -5.30 mm od Bregma. Červené značení je pro NeuN a zelené pro TH. Bílá šipka ukazuje výstup třetího nervu. (B) Fotomikrograf imunofarbení TH na úrovni NAc, + 1.70 mm od Bregma. Zelené značení je pro TH. Bílá šipka ukazuje přední komisi.
Tabulka S1
Seznam genů pole s nízkou hustotou TaqMan s odpovídajícími inventarizovanými kódy životních technologií.
Tabulka S2
Souhrn publikovaných údajů týkajících se exprese transkriptů dopaminové dráhy. Červené postavy odpovídají období dětství, modré adolescenci a černé dospělým. =: odpovídá podobné transkripční expresi mezi skupinami, +: odpovídá vyšší transkripční expresi u mláďat krmených krmivy s vysokou kalorickou výživou [nezdravé jídlo, západní strava (WD) nebo strava s vysokým obsahem tuku (HFD)]) a -: odpovídá nižší transkripční expresi u mláďat z krmení s vysokou kalorickou stravou (nezdravé jídlo, WD nebo HFD).
Reference
;
