Antagonista ghrelinového receptoru (GHS-R1A) zmírňuje odměňující vlastnosti morfinu a zvyšuje hladiny opioidního peptidu v oblastech odměny u myší (2015)

Akutní i chronická expozice návykových látek výrazně ovlivňuje mezolimbický dopaminový systém, důležitý klíčový obvod systémů odměňování mozku (Nestler, 2005). Tyto účinky byly navrženy tak, aby podporovaly, alespoň částečně, vývoj drogové závislosti (Wise, 2004). Závislost na drogách způsobuje široké spektrum škodlivých účinků na jednotlivce i společnost a jsou zaručeny nové farmakologické intervence, které se zabývají tímto hlavním problémem v oblasti veřejného zdraví (Koob a Le Moal, 2001). Vyjasněním signalizačních systémů zprostředkujících schopnost návykových látek aktivovat mezolimbický dopaminový systém lze identifikovat jedinečné léčebné strategie poruch užívání návykových látek.

Výzkum ukázal, že běžné neurobiologické mechanismy regulují příjem a odměnu indukovanou potravinami a návykovými drogami (Morganstern et al., 2011), což naznačuje, že role potravinových regulačních peptidů střeva a mozku, jako je ghrelin, zahrnuje zprostředkování odměny. Zpočátku se ukázalo, že ghrelin způsobuje uvolňování růstového hormonu (Kojima et al., 1999) a indukuje adipozitu u potkanů ​​(Tschop et al., 2000). Dosud je známo, že ghrelin zvyšuje příjem potravy, hlad a stimuluje chuť k jídlu přes hypotalamické obvody (přehled viz Egecioglu et al. (2011)). Kromě hypotalamu jsou receptory ghrelinu (GHS-R1A) exprimovány v oblastech souvisejících s odměnami, jako je amygdala, striatum, prefrontální kůra, ventrální tegmentální oblast (VTA) a hipokampus (přehled viz Engel a Jerlhag (2014)), což znamená, že fyziologická role ghrelinu přesahuje regulaci energetické homoeostázy. Ukázalo se, že orexigenický peptid ghrelin je aktivátorem mesolimbického dopaminového systému a také regulátorem odměny, motivace a příjmu alkoholu, nikotinu, amfetaminu a kokainu u myší (přehled viz Engel a Jerlhag (2014)).

Opioidy, stejně jako jiné návykové látky, aktivují mezolimbický dopaminový systém a způsobují uvolnění dopaminu v mozku přes aktivace μ- a / nebo 5-opioidních receptorů v nucleus accumbens (NAc) (Hirose a kol., 2005, Murakawa a kol., 2004, Yoshida a kol., 1999) a ve VTA, pravděpodobně snížením GABA -inhibice dopaminových neuronů (Johnson a North, 1992). Dále, akumbální K-opioidní receptory regulují aktivitu mezolimbického dopaminového systému (Chefer a kol., 2005, Spanagel a kol., 1992). Opakovaná expozice opioidům vytváří adaptivní změny několika neurotransmiterů, včetně opioidních peptidů, v oblastech odměňování, které přispívají k rozvoji závislosti (De Vries a Shippenberg, 2002). U potkanů ​​farmakologické potlačení GHS-R1A zeslabuje morfinem vyvolané uvolňování akumbálního dopaminu a stereotypní chování (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Cílem první části předkládané série experimentů bylo prozkoumat akutní účinek GHS-R1A antagonisty, JMV2959, na schopnost morfinu vyvolat lokomotorickou stimulaci, uvolnění akumbálního dopaminu a podmíněné upřednostnění místa u myší. Cílem druhé části této studie bylo zhodnotit účinek opakovaného ošetření JMV2959 nebo ghrelinu na hladiny opioidních peptidů (Met-enkephalin-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), dynorfin B (DynB) a Leu-enkefalin-Arg⁶ (LeuArg)) v oblastech souvisejících s odměnami, včetně amygdaly, striata, prefrontální kůry, VTA a hippocampu.

Byly použity dospělé samčí NMRI myši po pubertálním věku (8 – 12 týdny staré a 25 – 40 g tělesná hmotnost; Charles River, Sulzfeld, Německo). Stručně řečeno, všechny myši byly ustájeny ve skupině a udržovány v cyklu 12 / 12 h světlo / tma (světla svítila v sedm hodin ráno). Byla dodána voda z kohoutku a jídlo (Normální krmivo; Harlan Teklad, Norfolk, Anglie) podle libosti, s výjimkou experimentálních nastavení. Nové myši byly použity pro každý jednotlivý test chování i pro analýzu opioidních peptidů. Pokusy byly schváleny Švédskou etickou komisí pro výzkum zvířat v Göteborgu. Bylo vynaloženo veškeré úsilí k minimalizaci utrpení zvířat a ke snížení počtu použitých zvířat. Všechna zvířata byla ponechána aklimatizovat nejméně jeden týden před zahájením experimentů.

Morfin hydrochlorid (Apoteksbolaget Sahlgrenska Hospital; Gothenburg, Švédsko) byl rozpuštěn ve vehikulu (0.9% roztok chloridu sodného) a byl podáván ip v dávce 20 mg / kg 10 min před zahájením experimentu. Tato dávka byla vybrána, protože nižší dávka (10 mg / kg, ip) nezpůsobila lokomotorickou stimulaci u našich myší (data nejsou uvedena). Vybraná dávka (6 mg / kg, ip) JMV2959 (syntetizovaná na Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 a 2 Universities, Francie), GHS-R1A antagonista, byla stanovena dříve a byla stanovena žádný účinek na lokomotorickou aktivitu, uvolnění akumbálního dopaminu a podmíněné upřednostňování u myší (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 byl rozpuštěn ve vehikulu (0.9% roztok chloridu sodného) a byl vždy podáván dvacet minut před expozicí morfinu nebo dekapitací pro analýzu hladin opioidních peptidů. Vybraná dávka JMV2959 neovlivnila hrubé chování myší v žádném experimentu. Pro behaviorální testy byl přípravek JMV2959 podáván akutně, protože naše propustné studie ukazují, že jediná injekce přípravku JMV2959 zeslabuje odměnu vyvolanou léky (přehled viz Engel a Jerlhag (2014)). JMV2959 byl podáván subchronicky po dobu pěti následujících dnů pro analýzu opioidních peptidů, aby se zvýšila možnost detekce robustního účinku. Kromě toho se opakovanými injekcemi vyhnete možnému matoucímu účinku akutního stresu při injekci na peptidy. Acylovaný krysí ghrelin (Bionuclear; Bromma, Švédsko) byl zředěn v 0.9% chloridu sodném a u vybrané dávky ghrelinu (0.33 mg / kg, ip) bylo dříve prokázáno, že u myší způsobuje odměnu (Jerlhag, 2008). U všech drogových výzev byl použit vyvážený design.

Předchozí studie ukázaly, že morfin způsobuje u hlodavců stimulaci pohybového aparátu (Wise a Bozarth, 1987). Lokomotorická aktivita byla registrována v osmi zvukově tlumených, větraných a tlumeně osvětlených lokomotorových boxech (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mät-och reglerteknik AB; Fjärås, Švédsko). Pět až pět řad světelných paprsků na úrovni podlahy v krabici umožnilo vytvoření detekce fotobunky počítačovému systému zaregistrovat aktivitu myší. Lokomotorická aktivita byla definována jako kumulovaný počet nových paprsků fotobuněk přerušených během periody 60-min. Ve všech experimentech byly myši ponechány habituovat do lokomotorické aktivity jednu hodinu před podáním léků. Nebyly zjištěny žádné rozdíly mezi návyky v žádné z léčených skupin (data nejsou uvedena).

V první sérii experimentů byly zkoumány účinky JMV2959 (6 mg / kg, ip) na morfinem indukovanou (20 mg / kg, ip) lokomotorovou stimulaci. JMV2959 byl podán 20 min před morfinem a registrace aktivity byla zahájena deset minut po poslední injekci. Každá myš dostala jednu léčebnou kombinaci (vehikulum / vehikulum, JMV2959 / vehikulum, morfin / vehikulum nebo JMV2959 / morfin; n= 8 na léčebnou kombinaci) a byl podroben pouze jedné experimentální zkoušce.

Pro vyhodnocení účinků JMV2959 na prospěšné účinky morfinu u nových myší byly provedeny testy preferenčního místa u myší, jak bylo popsáno dříve (Jerlhag, 2008). Stručně řečeno, bylo použito dvoukomorové CPP zařízení s 45 lx osvětlením a odlišnými vizuálními a hmatovými narážkami. Jeden oddíl byl definován černými a bílými pruhovanými stěnami a tmavou laminátovou podlahou, zatímco druhý měl bílou natřenou dřevěnou podlahu a stěny dřevěné textury. Postup sestával z předkondicionování (den 1), kondicionování (dny 2 – 5) a následného kondicionování (den 6). Při předběžném kondicionování byly myším injikovány ip s vehikulem a umístěny do komory s volným přístupem do obou kompartmentů během 20 min, aby se stanovilo výchozí místo (nebo boční) preference. Kondicionování (20 min na relaci) bylo provedeno pomocí zkreslené procedury, ve které byl morfin (20 mg / kg) spárován s nejméně preferovaným oddílem a vehikulem s preferovaným oddílem. Všechny myši dostávaly jednu injekci morfinu i vehikula každý den a injekce se měnily mezi ranním a odpoledním v rovnovážném designu. Po kondicionování myši (n= 16) byly injikovány JMV2959 (6 mg / kg, ip) nebo stejný objem roztoku vehikula a 20 min později umístěny na středovou linii mezi dvěma kompartmenty s volným přístupem do obou kompartmentů pro 20 min (vytvoření následujících léčebných skupin; Morph-Veh a Morph-JMV2959).

Preferovaná podmínka místa byla vypočtena jako rozdíl v% celkového času stráveného ve spárované drogě (tj. nejméně upřednostňovaný prostor během post-kondicionování a předkondicionování.

Vzhledem k tomu, že JMV2959 zeslabuje stimulaci lokomotorem indukovanou morfinem a je preferováno umístění u myší, byl zkoumán vliv JMV2959 (6 mg / kg, ip) na morfinem vyvolané (20 mg / kg, ip) akumbální dopaminové uvolňování in vivo mikrodialýza u volně se pohybujících myší. Pro měření extracelulárních hladin dopaminu byly myši jednostranně implantovány s mikrodialyzační sondou umístěnou v nucleus accumbens. Proto byly myši anestetizovány isofluranem (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), umístěny do stereotaxického rámu (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, USA) a drženy na vyhřívací podložce, aby se zabránilo podchlazení. Jako lokální anestetika byl použit xylocain adrenalin (5 μg / ml; Pfizer Inic; New York, USA) a ke zmírnění jakékoli možné bolesti byl použit karprofen (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Gothenburg, Švédsko). Kost lebky byla odkryta a byl vyvrtán jeden otvor pro sondu a jeden pro kotevní šroub. Sonda byla náhodně střídána na levou nebo pravou stranu mozku. Pro jádro accumbens (Franklin a Paxinos, 1.5) byly použity souřadnice 0.7 mm před bregmou, ± 4.7 laterálně ke středové linii a 1997 mm pod povrchem mozkového povrchu. Exponovaná špička dialyzační membrány (20,000 kDa odříznutá od / id 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Švédsko) sondy byla 1 mm. Všechny sondy byly chirurgicky implantovány dva dny před experimentem. Po operaci byly myši drženy v individuálních klecích až do dne testu (Macrolon III).

V testovací den byla sonda připojena k mikroperfuzní pumpě (injekční stříkačka U-864; AgnThós AB) a perfundována Ringerovým roztokem rychlostí 1.5 μl / min. Po jedné hodině návyku k nastavení mikrodialýzy byly odebírány perfúzní vzorky každých 20 min. Základní hladina dopaminu byla definována jako průměr ze tří po sobě jdoucích vzorků před první expozicí léku / vehikulu a vzestup akumbálního dopaminu byl vypočten jako procento zvýšení ze základní hodnoty. Po vzorcích základní linie (-40 min. Až 0 min.) Byly myším injikovány JMV2959 nebo vehikulum (v 0 min.), Po kterém následovala injekce morfinu nebo vehikula (v 20 min.). Po těchto podáních léčiv bylo odebráno dalších osm 20 min vzorků. Souhrnně následující léčebné skupiny (n= 8 v každé skupině) byly vytvořeny: vozidlo-vozidlo (Veh-Veh), vozidlo-morfin (Veh-Morph), JMV2959-vozidlo (JMV2959-Veh) a JMV2959-morfin (JMV2959-Morph).

Hladiny dopaminu v dialyzátech byly stanoveny pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí. Pumpa (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Švédsko), iontoměničová kolona (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Švédsko) a detektor (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude) , Nizozemsko) vybavené průtokovou kyvetou VT-03 (Antec Leyden). Mobilní fáze (pH 5.6), sestávající z kyseliny sulfonové 10 mM, kyseliny citronové 200 mM, citranu sodného 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, byla vakuově filtrována za použití membránového filtru 0.2 μm (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Švédsko). Mobilní fáze byla dodána při průtoku 0.2 ml / min procházejícího odplyňovačem (Kovalent AB) a analyt byl oxidován při + 0.4 V.

Po dokončení experimentů na mikrodialýze byly myši dekapitovány a sondy byly perfundovány pontaminovou nebeskou modří 6BX pro usnadnění lokalizace sondy. Mozky byly namontovány na zařízení s vibroslemi (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, Velká Británie) a rozřezány na 50 μm sekce. Poloha sondy byla stanovena hrubým pozorováním světelnou mikroskopií. Byla ověřena přesná poloha sondy (Franklin a Paxinos, 1997) a ve statistické analýze byly použity pouze myši se správným umístěním.

Byly zkoumány účinky léčby JMV2959 na hladiny MEAP, DynB a LeuArg v oblastech souvisejících s odměnami. Myším bylo injikováno buď JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) nebo stejný objem vozidla (ip, n= 8) po dobu pěti následujících dnů. 20 min. Po poslední injekci byly myši usmrceny a byly odebrány mozky z těchto myší. Samostatným myším bylo injikováno buď ghrelinem (0.33 mg / kg, ip, n= 8) nebo stejný objem vozidla (ip, n= 8) po dobu pěti následujících dnů. Pět minut po poslední injekci byly myši usmrceny a mozky z těchto myší byly odebrány. Amygdala, striatum, prefrontální kůra, VTA a hippocampus byly rychle pitvány a okamžitě umístěny na suchý led a poté uloženy při -80 ° C do dalšího zpracování.

Postupy homogenizace a extrakce peptidu se řídily standardním postupem, který byl podrobně popsán dříve (Nylander et al., 1997). Stručně řečeno, k zmrazeným vzorkům byla přidána horká (95 ° C) kyselina octová (1 M). Vzorky byly zahřívány ve vodní lázni (95 ° C) po dobu 5 min, ochlazeny na ledu a poté homogenizovány Branson Sonifier (Danbury, CT, USA). Homogenát byl znovu zahříván při 95 ° C po dobu 5 min a ochlazen na ledu před centrifugací po dobu 15 min při 4 ° C a 12,074 ×g v odstředivce Beckman GS-15R (Fullerton, CA, USA). Extrakty byly dále čištěny podle dříve popsaného postupu (Nylander et al., 1997). Byly shromážděny dvě frakce: frakce III (Leu-Arg a MEAP) a frakce V (DynB). Vzorky byly sušeny ve vakuové odstředivce (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA) a uloženy v mrazničce (-20 ° C) až do analýzy peptidů.

Imunoreaktivní (ir) hladiny DynB, LeuArg a MEAP byly analyzovány pomocí zavedených radioimunoanalýz a protokoly byly podrobně popsány jinde (Nylander et al., 1997). V testu DynB byl k separaci volného a protilátky vázaného peptidu použit kozí anti-králičí IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Švýcarsko). Antisum Dyn (113 +) bylo použito v konečném ředění 1: 600000. Křížová reaktivita s velkým Dynem byla 100% a s DynB (1 – 29) 1%. Nebyla pozorována zkřížená reaktivita s jinými opioidními peptidy. V testech LeuArg a MEAP byla k separaci volného peptidu a peptidu vázaného na protilátku použita suspenze aktivního uhlí. U antiséra LeuArg (91: 6D +, konečné ředění 1: 60000) byla zkřížená reaktivita nižší než 0.01% pro Leu-enkefalin a MEAP, 0.02% pro DynB, 0.04% pro DynA a 0.08% pro alfa-neoendorfin. Antisérum MEAP 90: 3D (II) bylo použito v konečném ředění 1: 160 000. Křížová reaktivita s Met-enkefalinem, Met-enkefalinem-Arg⁶, Met-enkefalin-Arg⁶Gly⁷Leu⁸, Leu-enkephalin a Leu-enkephalin-Arg⁶ byla <0.1%

Celkový hlavní účinek léčby byl nalezen na lokomotorické aktivitě u myší po systémovém podání morfinu (20 mg / kg) a JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 pro Veh-Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph a n= 7 pro Veh-Morph). Jak je uvedeno v Obrázek 1A, posthoc analýza odhalila, že předběžné ošetření jednou injekcí JMV2959 (P<0.001) významně zmírnila morfiem indukovanou pohybovou stimulaci (P<0.01 Veh – Veh vs Veh-Morph). Vybraná dávka JMV2959 neměla žádný účinek na lokomotorickou aktivitu ve srovnání s léčbou vehikulem (P> 0.05). U myší léčených vehikulem a myší léčených JMV2959-morhpinem nebyl žádný rozdíl v reakci na pohybovou aktivitu (P> 0.05).

  

Obrázek 1

GHS-R1A antagonista JMV2959 zmírňuje morfinem indukovanou lokomotorickou stimulaci, akumbální uvolňování dopaminu a podmíněné upřednostňování u myší. (A) Morfinem indukovaná (20 mg / kg ip) lokomotorická stimulace byla oslabena jedinou injekcí JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7 – 8 v každé skupině; **P<0.01, ***P<0.001 jednosměrná ANOVA následovaná post-hoc testem Bonferroni). (B) Preference stavu (CPP) vyvolaná morfinem (20 mg / kg ip) byla oslabena akutní jednorázovou injekcí JMV2959 (6 mg / kg ip) u myší (n= 8 v každé skupině, *P<0.05, nepárový t-test). (C) Nejprve jsme prokázali významný účinek morfinu (20 mg / kg ip) na zvýšení uvolňování dopaminu ve srovnání s léčbou vehikulem (časový interval 40–180 min (P<0.001), Veh – Veh vs Veh-Morph). Jak je ukázáno v (C) předběžné ošetření JMV2959em (6 mg / kg ip), zmírnilo zvýšení uvolňování dopaminu vyvolané morfinem ve srovnání s předúpravou vehikulem v časovém intervalu 40 – 100 a 140 – 180 min (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph ve srovnání s léčbou Veh – Morph). Vybraná dávka JMV2959 neměla v žádném časovém intervalu žádný významný účinek na uvolňování dopaminu accumbal ve srovnání s léčbou vehikulem (P> 0.05, Veh – Veh vs JMV2959-Veh). JMV2959 snížil, ale nezablokoval úplně, morfinem vyvolané uvolňování akumbálního dopaminu v časovém intervalu 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph ve srovnání s léčbou Veh – Morph). Šipky představují časové body injekce JMV2959, vehikula a morfinu. Data analyzována pomocí obousměrné ANOVA následované post-hoc testem Bonferroni (n= 8 v každé skupině). Veh-veh (čtverec), Veh-Morph (kosočtverec), JMV2959-Veh (trojúhelník), JMV2959-Morph (kruh). Všechny hodnoty představují průměr ± SEM.

Zobrazit velký obrázek | Zobrazit obrázek s vysokým rozlišením | Stáhněte si PowerPoint Slide

Morfinem indukovaná (20 mg / kg) (Morph-Veh) preferovaná místa byla výrazně oslabena akutní jednorázovou injekcí JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) v den po kondicionování (P= 0.025, n= 8 v každé skupině; Obrázek 1B).

Měření dopaminu v mozkové mikrodialýze u myší odhalilo celkový hlavní účinek léčby (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), čas F(11,308) = 7.05, P<0.0001) a léčba × časová interakce (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Obrázek 1C; n= 8 v každé skupině). Morfin zvyšoval uvolňování dopaminu z akumbalu vzhledem k léčbě vehikulem v časovém intervalu 40 – 180 min (P<0.001). Jak je uvedeno v Obrázek 1C tento účinek byl snížen předběžnou léčbou pomocí JMV2959 v časovém intervalu 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) a 160–180 min (P<0.001). JMV2959 snížil, ale neblokoval úplně, morfinem indukované uvolňování dopaminu vumbumbal, protože byl rozdíl mezi léčbou vehikulem a léčbou JMV2959-morfinem v časovém intervalu 60–80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) a 160 min (P<0.05). Vybraná dávka JMV2959 neměla v žádném časovém intervalu žádný významný účinek na uvolňování dopaminu accumbal ve srovnání s léčbou vehikulem (P> 0.05).

Tato studie dále podporuje hypotézu, že fyziologická role orexigenního peptidu zahrnuje regulaci odměny. Ve skutečnosti jsme ukázali, že periferní podávání antagonisty GHS-R1A zeslabuje schopnost morfinu způsobovat lokomotorickou stimulaci, zvyšovat hladiny dopaminu v NAc a indukovat podmíněnou preferenci místa u myší. Zjistili jsme také, že subchronická JMV2959, ale nikoli ghrelin, léčba zvýšila ir tkáňové hladiny MEAP ve VTA, DynB v hippocampu a LeuArg ve striatu, což poskytuje první důkaz, že schopnost ghrelinové signalizace regulovat zesílení může zahrnovat opioidní peptidy .

Data zde uvedená ukazují, že antagonismus GHS-R1A ovlivňuje schopnost morfinu aktivovat mesolimbický dopaminový systém u myší. V souladu jsou zjištění ukazující, že JMV2959 blokuje schopnost morfinu zvyšovat extracelulární hladiny dopumbalinu accumbal a vyvolávat stereotypní chování u potkanů ​​(Sustkova-Fiserova et al., 2014). Centrální administrace ghrelinu podpůrně zvyšuje bod zlomu, ale ne počet aktivních stisknutí páky, v harmonogramu postupného posilování poměru u samců spravujícího heroinu u potkanů ​​(Maric et al., 2012). Tvrzení, že signalizace ghrelinu je základem drogové závislosti, je dále podporováno zjištěními, které ukazují, že JMV2959 snižuje příjem i motivaci ke konzumaci alkoholu u potkanů ​​a že odměna vyvolaná amfetaminem, kokainem a nikotinem je blokována antagonismem GHS-R1A u hlodavců ( pro přehled viz Engel a Jerlhag (2014)) a že polymorfismy v genech souvisejících s ghrelinem jsou spojeny s příjmem alkoholu, kouření a amfetaminu (přehled viz Engel a Jerlhag (2014)).

Současná zjištění se zvýšenými hladinami opioidních peptidů ve striatu, VTA a hippocampu po subchronické léčbě JMV2959 naznačují poprvé interakce mezi opioidními peptidy a ghrelinovou signalizací. Endogenní opioidy se podílejí na odměňovacích účincích nejen indukovaných opioidy, ale také jinými drogami zneužívání a přirozenými odměnami, a v adaptivních procesech pozorovaných po opakované expozici lékům (Trigo a kol., 2010, Van Ree a kol., 2000). Ve skutečnosti je aktivita mezolimbického dopaminového systému regulována endogenními opioidy jak na úrovni VTA, tak na NAc (Hirose a kol., 2005, Spanagel a kol., 1992) a tyto účinky jsou buď přímé nebo nepřímé prostřednictvím modulace dalších vysílačů (Charbogne et al., 2014).

Zjistili jsme, že subchronická léčba JMV2959 zvýšila hladiny MEAP ve VTA. MEAP je výhradně odvozen od proenkefalinu a byl používán jako marker proenkefalinových peptidů, které aktivují hlavně 5-opioidní receptory. Předpokládáme, že zvýšené hladiny endogenního MEAP ve VTA po léčbě JMV2959 mohou zabránit schopnosti morfinu snížit inhibici GABA mezoakcumbálních dopaminových neuronů (Johnson a North, 1992), což může přispět ke snížení účinků indukovaných morfinem pozorovaných po JMV2959. Podporně jsou GHS-R1A umístěny na GABAergických interneuronech ve VTA (Abizaid et al., 2006). Navíc předchozí studie ukázaly, že infuze JMV2959 v rámci VTA, přes neznámé mechanismy, zeslabují odměnu indukovanou ghrelinem (Jerlhag a kol., 2011) a ghrelinem zprostředkovaný příjem sacharózy u hlodavců (Skibicka a kol., 2011) naznačují, že ventrální tegmentální GHS-R1A jsou důležité pro regulaci odměny. Na podporu tohoto tvrzení jsou zjištění, že jiné peptidy regulující hlad, jako je galanin a orexin, zprostředkovávají prospěšné vlastnosti morfinu přes lokální mechanismy v rámci VTA (Narita et al., 2006, Richardson a Aston-Jones, 2012).

Ve striatu jsme zjistili, že subchronická JMV2959 zvýšila ir hladinu LeuArg, což naznačuje, že schopnost JMV2959 utlumit morfinem indukovanou preferovanou kondici místa, uvolňování dopaminu a stimulaci pohybového aparátu, alespoň částečně, závisí na zvýšeném akumbálním δ- aktivita opioidního receptoru. Zvýšené hladiny LeuArg mohou být výsledkem zvýšené enzymatické přeměny dynorfinových peptidů na enkefalin nebo zvýšeného uvolňování Dyn v NAc jako reakce na zvýšený dopamin, po kterém následuje degradace na LeuArg. Ačkoli předchozí studie ukázaly, že aktivita mezolimbického dopaminového systému je regulována přes K-opioidní receptory v NAc (Spanagel et al., 1992) a endogenní K-opioidní receptory poskytují tonickou inhibici mesoaccumbální dopaminové neurotransmise a tlumí uvolňování dopaminu vyvolané kokainem v NAc (Chefer et al., 2005), ukazují, že JMV2959 mění úrovně ir DynB ve striatu. Proto jsou vyžadovány další studie na prodynorfinových peptidech, aby se objasnily interakce mezi GHS-R1A antagonismem a dynorfiny.

V této studii jsme také ukázali, že léčba JMV2959em významně zvyšuje hladiny hipokampálního DynB. Ghrelin zvyšuje konsolidaci paměti a tvorbu dendritických páteřů, generuje dlouhodobé potenciace a vyvolává usnadňování paměti přes hippocampální GHS-R1A u hlodavců (Carlini a kol., 2010, Diano a kol., 2006). Navíc knockoutované myši GHS-R1A vykazují zlepšenou prostorovou paměť v testu Morrisova vodního bludiště a narušenou kontextovou paměť v paradigmatu strachu ve srovnání s myšmi divokého typu (Albarran-Zeckler et al., 2012). Dynorfinové peptidy, včetně DynB, jsou hojné v hippocampu a zmírňují dlouhodobé potenciace (Chavkin a kol., 1985, Wagner a kol., 1993) a také zhoršují prostorové učení u potkanů ​​(Sandin a kol., 1998). Proto předpokládáme, že antagonista GHR-R1A může zeslabit paměť odměny inhibicí dlouhodobého potenciace hipokampu. přes aktivace DynB. Souhrnně tato data poskytují nový potenciální mechanismus, kterým JMV2959 přes opioidní peptidy mohou změnit zesílení. Opioidní receptory jsou však v mozku široce distribuovány, což naznačuje, že do odměny indukované morfinem GHS-R1A mohou být zapojeny i jiné oblasti, které nejsou zahrnuty v této studii. Například příjem potravy vyvolaný ghrelinem a stisknutí páky na sacharózu je sníženo centrálním nebo intrahypalhalamickým podáváním antagonisty κ-opioidního receptoru (Romero-Pico et al., 2013). V nadcházejících studiích však musí být objasněna úloha opioidních peptidů v jiných oblastech.

Endogenní ligandy μ-receptoru, endomorfiny a beta-endorfin zde nebyly analyzovány, takže nemůžeme vyloučit možný účinek JMV2959 na tyto peptidy. Ve skutečnosti obohacující vlastnosti morfinu zahrnují μ-opioidní receptory ve VTA i na NAc (Hirose a kol., 2005, Johnson a North, 1992, Murakawa a kol., 2004, Yoshida a kol., 1999). Antagonista μ-receptoru však neztlumil příjem potravy indukované ghrelinem (Naleid et al., 2005) ani ghrelinem indukovanou lokomotorickou stimulaci a akumbální uvolňování dopaminu (Jerlhag et al., 2011), což naznačuje, že schopnost GHSR- Antagonista 1A pro regulaci zesílení nezahrnuje μ-receptory. Na druhé straně JMV2959 ovlivňoval opioidní peptidy odvozené od proenkefalinu a prodynorfinu, což ukazuje, že se mohou účastnit účinků vyvolaných antagonisty GHSR-1A.

Zatímco předchozí studie ukázaly, že systémové podávání ghrelinu způsobuje odměnu (Jerlhag, 2008) a také zvyšuje prospěšné vlastnosti návykových látek (přehled viz Engel a Jerlhag (2014)), zde ukazujeme, že subchronická léčba ghrelinem se nezměnila hladiny tkáně opioidů v tkáni ir v jakékoli ze studovaných oblastí souvisejících s odměnami. Systémové podávání ghrelinu aktivuje expresi c-fos v hypothalamických oblastech, ale ne v mezolimbických a hippocampálních oblastech (Pirnik et al., 2011) a vazba fluorescenčně značeného ghrelinu je omezena na potravinové regulační neurony hypotalamu (Schaeffer et al., 2013) ). Spolu se zjištěními, že ghrelin, vyjmutý ze stopových množství v hypotalamu, nemůže být detekován v hlubších oblastech mozku po podání periferního ghrelinu (Furness a kol., 2011, Grouselle a kol., 2008, Sakata a kol., 2009 ), zvyšuje možnost, že systémový ghrelin aktivuje systém odměn přes nepřímé mechanismy nezávislé na endogenních opioidech. Podporované uvolňování akumbálního dopaminu vyvolaného ghrelinem vyžaduje upstream orexigenní hypotalamickou signalizaci (Cone et al., 2014), podávání periferního ghrelinu nemění příjem alkoholu u myší (Lyons et al., 2008) a neutralizace periferního ghrelinu nezmiňuje alkohol - indukovaná odměna u myší nebo příjem alkoholu u potkanů ​​(Jerlhag et al., v tisku). Je třeba zvážit možnost, že subchronické podávání ghrelinu zvyšuje hladinu ir tkáňových peptidů opioidů, avšak v nadcházejících studiích je třeba to podrobně prozkoumat.

Schopnost návykových látek vyvolat stimulaci, uvolňování dopaminu a vyvolat preferované místo je úzce spojena s posilovacími vlastnostmi návykových látek a tyto parametry jsou považovány za součást procesu závislosti (Wise, 2004). Vzhledem k tomu, že jsme zde zjistili, že JMV2959 u myší zmírňuje tyto parametry odměny, předpokládáme, že GHS-R1A může hrát důležitou roli v procesech závislosti a že do těchto procesů jsou zapojeny endogenní opioidy. Souhrnně tato data ukazují, že GHS-R1A antagonisté by měli být objasňováni jako léčba závislosti na lécích.

JE a EJ jsou podporovány granty od Švédské rady pro výzkum (Grant č. 2011-4646, 2009-2782 a 2011-4819), švédské mozkové nadace, LUA / ALF (Grant č. 148251) od Sahlgrenské fakultní nemocnice, Alkohol výzkumná rada švédského monopolu na maloobchod s alkoholem a nadace Adlerbertska, Fredrik a Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten a Ragnar Söderberg, Wilhelm a Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut a Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åkeerg , Švédská lékařská společnost, Švédská společnost pro lékařský výzkum a Gothenburgská psychiatrická výzkumná nadace. Rada pro výzkum alkoholu u švédského monopolu pro maloobchod s alkoholem a švédská rada pro výzkum (K2012-61X-22090-01-3) podporovaly IN. Zdroje financování neměly žádnou roli při návrhu studie, při sběru, analýze a interpretaci údajů, při psaní zprávy a při rozhodování o zveřejnění údajů.