Odlišné obvody, které jsou základem odměny za jídlo a účinků ghrelinů na příjem: dopaminergní projekce VTA-accumbens zprostředkovává účinek ghrelinu na odměnu za jídlo, ale nikoli příjem potravy (2013)

Klíčová slova

• ghrelin;
• Motivace potravin;
• Příjem potravy;
• Přejídání;
• Operační kondicionování;
• Dopamin;
• D1;
• D2

1. Úvod

Cirhulující hormon ghrelin a nervové obvody, kterými působí, jsou dobře zkoumány v souvislosti s kontrolou obezity a chuti k jídlu (Skibicka a Dickson, 2011), motivované i terapeutickými příležitostmi v této oblasti onemocnění (Cardona Cano et al., 2012). Ghrelin je mezi cirkulujícími střevními peptidy jedinečný v tom, že zvyšuje příjem potravy (Wren a kol., 2000, Inui, 2001, Shintani a kol., 2001  a  Kojima a Kangawa, 2002) účinek CNS zprostředkovaný vyhrazenými receptory, GHS-R1A (Salome et al., 2009  a  Skibicka et al., 2011) zejména ty, které se nacházejí v mozkových oblastech zapojených do „homeostatického krmení“ (tj. krmení spojené s energetickým deficitem), hypotalamu a brainstému (Melis a kol., 2002, Faulconbridge et al., 2003  a  Olszewski a kol., 2003). Nedávno se však objevila role ghrelinu mimo tyto homeostatické oblasti. GHS-R1A je také přítomen v klíčových uzlech mezolimbického systému odměn, v oblastech, jako je ventrální tegmentální oblast (VTA) a nucleus accumbens (NAc) (Zigman a kol., 2006  a  Skibicka et al., 2011), oblasti zapojené do motivovaného motivovaného chování, které jsou také spojeny s „hedonickým krmením“ (tj. příjem jídla spojený s jeho prospěšnými vlastnostmi). Ghrelin je schopen řídit příjem potravy z obou těchto stránek a tento účinek je pravděpodobně spojen s jeho činností ke zvýšení motivační a motivační odměny potravin (Naleid et al., 2005, Abizaid a kol., 2006  a  Skibicka et al., 2011). U plně nasycených krys nebo myší tedy ghrelin aplikovaný periferně nebo centrálně (včetně přímo do VTA) vede ke zvýšenému příjmu potravy a také k chování při odměňování za jídlo (Naleid et al., 2005, Perello et al., 2010, Skibicka et al., 2011  a  Skibicka et al., 2012b), což se odráží například ve zvýšeném pákovém lisování za odměnu za cukr v harmonogramu operativního progresivního poměru. Tato akce odráží vznikající roli ghrelinu v mezolimbickém systému odměňování pro zlepšení chování při odměňování, a to nejen za jídlo, ale také za zneužívání alkoholu a drog (Dickson a kol., 2011). Důležité je, že tento účinek ghrelinu na motivaci potravy potlačuje signály sytosti, protože ghrelin vyvolává chování při odměňování potravin u saturovaných zvířat na úroveň srovnatelnou s úrovní zjištěnou u potkanů ​​bez potravy. Dále skutečnost, že blokáda ghrelinového signálu, nejen systémově, ale také selektivně v rámci VTA (Skibicka et al., 2011), má za následek silné potlačení chování při odměňování potravin a zdůrazňuje význam a nutnost signálu ghrelinu v odměně za jídlo.

Ghrelinový účinek na úrovni VTA je dostatečný pro řízení příjmu potravy a motivované chování, účinky, které, jak se zdá, vyžadují signalizaci prostřednictvím GHS-R1A (Abizaid a kol., 2006  a  Skibicka et al., 2011). Překvapivě zůstávají obvody po proudu od akcí propagujících odměnu ghrelinu ve VTA do značné míry nevyřešeny. V rámci VTA se ghrelin zabývá opioidní, NPY a GABAergickou signalizací (Abizaid a kol., 2006  a  Skibicka et al., 2012a). Nicméně, dopaminové neurony VTA, dříve prokázané, že exprimují receptory ghrelinu (Abizaid a kol., 2006), může být konečným cílem VTA pro účinky ghrelinu na odměnu za jídlo. Chutné / odměňující se potraviny zabírají dopaminové neurony VTA a dopaminový signál ve vybraných oblastech CNS, jako je NAc, čímž stimulují chování odměny za jídlo (Hernandez a Hoebel, 1988  a  Joseph a Hodges, 1990). Je však třeba poznamenat, že ačkoli uvolňování dopaminu je silně spojeno s motivovaným chováním potravin, je také nezbytné pro základní krmení jako myši, které nejsou schopny syntetizovat dopaminovou matrici hladováním (Cannon a kol., 2004). Funkční souvislost mezi ghrelinem a dopaminem je naznačena účinky ghrelinu na aktivitu dopaminových neuronů VTA a také skutečností, že pro účinky ghrelinu na odměnu za jídlo jsou potřebné intaktní dopaminergní neurony VTA (Abizaid a kol., 2006  a  Weinberg a kol., 2011). Avšak neurony VTA dopaminu se promítají do řady míst a zůstává zcela prozkoumáno, zda je pro účinky ghrelinu na chování vyvolané VTA nutná dopaminová signalizace v NAc. Kromě toho se ghrelin podílí na kontrole jiných chování, než je příjem potravy nebo motivace, jmenovitě vyhledávání novinek, které jsou také spojeny s uvolňováním dopaminu v NAc (Bardo a kol., 1996  a  Hansson a kol., 2012).

V této studii jsme testovali hypotézu, že účinky ghrelinu na jídlo motivované chování a / nebo příjem potravy uplatňované na úrovni VTA vyžadují signalizaci dopaminového receptoru v NAc. Za tímto účelem byl příjem potravy a jídlo motivované chováním indukované germelinem VTA hodnoceno v páce progresivní poměr stlačení pro sacharózové paradigma spolu se současnou NAc dopaminovou signalizační blokádou. V samostatných studiích jsme testovali individuální přínos dopaminových 1 (D1) podobných receptorů a dopaminových 2 receptorů (D2). Abychom prozkoumali příspěvek endogenního ghrelinu k dopaminovému signálu NAc, určili jsme, zda tyto dopaminové receptory hrají roli při zlepšování chování při odměňování jídlem. Nakonec, aby se vyhodnotily molekulární důsledky endogenně zvýšeného ghrelinu v NAc dopaminové signalizaci, jsme stanovili účinek nedostatku hladu / jídla na expresi mRNA NAc dopaminových receptorů a enzymů.

2. Materiály a metody

Zvířata: Dospělí samci krys Sprague-Dawley (200–250 g, Charles River, Německo) byli chováni ve 12hodinovém cyklu světlo / tma (světla zapnuta v 6 hodin ráno) s pravidelným krmením a vodou podle libosti v jejich domácích klecích. Všechny postupy na zvířatech byly prováděny s etickým povolením a v souladu s pokyny Výboru pro ústavní péči a používání zvířat z Göteborgu.

Chirurgie: Všem potkanům ve studiích chování byla implantována vodicí kanyla (26 gauge; Plastics One, Roanoke, VA), zaměřená na VTA a NAc plášť pro následné jednostranné, ipsilaterální injekce. Byla použita anestetika ketaminem. Kanyly byly umístěny 1.5 mm nad cílové místo a pro mikroinjekce byl použit injektor vystupující 1.5 mm od vodicích kanyl. K cílení na VTA byly vybrány následující souřadnice Skibicka a kol. (2011): ± 0.75 od středové čáry, 5.7 mm za bregmou a 6.5 ​​mm ventrálně od povrchu lebky, s injektorem namířeným 8.0 mm ventrálně k lebce. Pro shell NAc byly použity následující souřadnice (upravené z Quarta a kol. (2009): ± 0.75 od středové čáry, 1.7 mm před bregmou a 6.0 mm od břicha k lebce, s injektorem namířeným na břicho 7.5 mm). Kanyly byly k lebce připevněny dentálním akrylovým cementem a klenotnickými šrouby a uzavřeny obturátorem, jak bylo popsáno výše (Skibicka et al., 2009). U všech potkanů ​​bylo místo mikroinjekce pro VTA i NAc ověřeno po smrti mikroinjekcí india-inkoustu se stejným objemem mikroinjekce (0.5 μl) použitým v průběhu studie. Pouze předměty se správným umístěním (Obr. 2) byly zahrnuty do analýzy dat.

2.1. Postup kondicionování obsluhy

Experimenty s kondicionováním operantů probíhaly v komorách pro kondicionování operantů na krysách (30.5 × 24.1 × 21.0 cm; Med-Associates, Georgia, VT, USA). Výcvikový postup používaný k operativní kondici byl upraven z předchozích studií (la Fleur a kol., 2007  a  Hansson a kol., 2012). Pro usnadnění operativního tréninku na sacharózu byly všechny krysy podrobeny mírnému omezení potravy, během kterého byla jejich počáteční tělesná hmotnost postupně snižována na 90% po dobu jednoho týdne. Před umístěním do operantních boxů byly krysy vystaveny působení sacharózových pelet (45 mg sacharózových pelet; test Diet, Richmond, IN, USA) v prostředí domácí klece alespoň dvakrát. Dále se krysy naučily přitlačovat na pelety sacharózy podle plánu FR1 s pevným poměrem, se 2 sezeními denně. U FR1 vedlo jediné stisknutí aktivní páky k dodání jedné pelety sacharózy. Všechna sezení FR trvala 30 minut nebo dokud krysy nezískaly 50 pelet, podle toho, co nastalo dříve. Většina potkanů ​​dosáhla kritéria 50 pelet na relaci po 5–7 dnech. Lisy na neaktivní páku byly zaznamenány, ale neměly žádné naprogramované následky. Po programových relacích FR1 následovaly FR3 a FR5 (tj. 3 a 5 lisů na peletu). Po plánu FR5 následoval plán progresivního poměru (PR), během kterého se náklady na odměnu postupně zvyšovaly za každou následující odměnu, aby se určilo množství práce, kterou je krysa ochotna věnovat získání odměny. Požadavek na odpověď se zvýšil podle následující rovnice: poměr odpovědí = (5e (0.2 × číslo infuze)) - 5 prostřednictvím následujících sérií: 1, 2, 4, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50 , 62, 77, 95, 118, 145, 178, 219, 268, 328. PR relace skončila, když krysa nezískala odměnu do 60 minut. Odpověď byla považována za stabilní, když se počet potravinových pelet získaných za relaci nelišil o více než 15% u tří po sobě jdoucích relací. Ve většině případů se reakce stabilizovala během 5 sezení. Ty krysy, které během této doby nedosáhly požadovaných kritérií, byly vycvičeny v dalších sezeních. PR test byl proveden na 1 sezení / den. Krysy byly následně přeneseny do jejich domovských klecí na 1 h měření příjmu potravy. Na konci tréninku a před chirurgickým zákrokem a testováním měli krysy podle libosti přístup k normální čau.

2.2. Drogy

Acylovaný krysí ghrelin (Tocris, Bristol, UK) byl podáván VTA v dávce 1.0 μg s umělou mozkomíšní tekutinou (aCSF) jako vehikulem (a kontrolou). Dávka 1.0 μg ghrelinu se dříve prokázala, že zvyšuje operativní reakci na cukr a indukuje orexigenní reakci při dodání do VTA (Naleid et al., 2005  a  Skibicka et al., 2011). Antagonista receptoru podobného Dl, SCH-1, byl podáván NAc v dávce 23390 μg (Tocris), s vehikulem (kontrola) aCSF. Pro studii deprivace potravin byla dávka zvýšena na 0.3 μg kvůli nedostatečnému účinku původní dávky 0.5 μg. SCH-0.3 je silný a selektivní antagonista dopaminových receptorů podobných D23390 s> 1 1000násobnou afinitou k dopaminovým receptorům podobným D1 oproti D2 (Barnett a kol., 1986). Má podobnou afinitu k receptorům D1 a D5 (Barnett a kol., 1992) proto v celé studii budeme hovořit o jeho schopnosti blokovat receptory podobné D1, což je termín zahrnující receptory D1 i D5. Počáteční dávka 0.3 μg SCH-23390 byla vybrána na základě (Grimm a kol., 2011). Ukázalo se, že tato dávka injikovaná do pláště NAc byla účinná při snižování tlaku páky na tágo dříve spárované s dodáním roztoku sacharózy, aniž by to ovlivnilo výkon při neaktivní páce. Antagonista dopaminového D2 receptoru, etikloprid hydrochlorid (Tocris), byl podáván NAc s aCSF jako vehikulem (kontrola). Zvolená počáteční dávka etiklopridu (1.0 μg) byla založena na (Laviolette et al., 2008), ale ve studii nedostatku potravin byla zvýšena na 1.5 μg. Všechny léky byly dodávány v objemu 0.5 μl aCSF.

2.3. Experimentální design

Všechny krysy dostaly injekce zaměřené na NAc a VTA na začátku světelného cyklu, s druhou injekcí 10 minut před zahájením operativního testování. Všechny podmínky byly odděleny minimálně 48 hodin a proběhly vyváženým způsobem, takže každá krysa obdržela všechny čtyři podmínky: první vehikulum nebo antagonista dopaminového receptoru na NAc a poté, o 10 minut později, vehikulum nebo ghrelin na VTA. U každé krysy byly namířeny ipsilaterální VTA a NAc. Podrobnosti o každém experimentu jsou také ilustrovány v Obr. 1.

2.3.1. Vliv blokády receptorů typu D1 na odměnu potravin vyvolanou ghrelinem a příjem potravy

Reakce byly zkoumány po cílených VTA a NAc (n = 12–14) dodávka léčiva po čtyřech následujících podmínkách: 1) kontrolní podmínka (roztoky vehikula do NAc a VTA), 2) vehikulum NAc + VTA 1.0 μg ghrelin, 3) NAc 0.3 μg SCH-23390 + VTA vehikulum, 4 ) NAc 0.3 μg SCH-23390 + VTA 1.0 μg ghrelinu. Testování bylo prováděno v nasyceném stavu (po období temného krmení). V experimentální dny byly krysy vráceny do svých domovských klecí po 120 minutách operativního testování a příjem krmiva byl měřen po dobu 1 hodiny v prostředí domácí klece (jako v plánu 1, Obr. 1). Tento časový bod odpovídá třetí hodině po injekci VTA ghrelinu, během níž by se dalo očekávat pokračování orexigenní odpovědi na základě předchozích studií zkoumajících časový průběh působení ghrelinu podávaného centrálně nebo periferně ( Wren a kol., 2000  a  Faulconbridge et al., 2003) a naše předchozí studie, které využívaly podobné experimentální nastavení.

2.3.2. Účinek blokády receptoru D2 na odměnu potravin vyvolanou ghrelinem a příjem potravy

Reakce byly zkoumány po cílených VTA a NAc (n = 7) dodávka léčiva za následujících 1 podmínek: 2) kontrolní stav (roztok vehikula do NAc a VTA), 1.0) vehikulum NAc + VTA 3 μg ghrelinu, 1) NAc 4 μg etikloprid hydrochlorid + VTA vehikulum, 1) NAc 1.0 μg eticloprid hydrochlorid + VTA 120 μg ghrelin. Testování bylo prováděno v nasyceném stavu (po období temného cyklu krmení). Krysy byly vráceny do svých domovských klecí po 1 minutách operantního testování a příjem krmiva byl měřen během 1 hodiny v prostředí domácí klece (jako v plánu XNUMX, Obr. 1), protože orexigenní účinek zprostředkovaný ghrelinem je stále přítomen po opožděném umístění krmných pelet (po 2 hodinách).

2.3.3. Účinky blokády receptoru D1 a D2 (oddělené nebo kombinované) na příjem gowelinem indukovaného chow samotného

Abychom potvrdili, že výsledky získané při příjmu potravy v předchozích experimentech nebyly zmařeny předchozí expozicí sacharosy v operantním paradigmatu nebo 2hodinovým zpožděním, v samostatné studii jsme zkoumali účinky NAc dodávky dva antagonisté dopaminových receptorů samotné nebo v kombinaci s VTA ghrelinem indukovaným 2 a 3 h příjmem potravy u nasycených potkanů ​​(n = 10–11; jako v plánu 2, Obr. 1). V tomto případě nebyly krysy před měřením krmení vystaveny paradigmatu operativní kondicionování. Příjem potravy byl tedy měřen po cíleném dodávání léčiva VTA a NAc po čtyřech následujících podmínkách: 1) kontrolní podmínka (roztoky vehikula k NAc a VTA), 2) vehikulum NAc + VTA 1.0 μg ghrelinu, 3) antagonista NAc dopaminového receptoru + VTA vehikulum, 4) antagonista NAc dopaminového receptoru + VTA 1.0 μg ghrelinu. Nejprve jsme zkoumali dva antagonisty dopaminového receptoru odděleně, takže za podmínek 3 a 4 jedna skupina potkanů ​​dostávala 0.3 μg SCH-23390 a druhá skupina dostávala 1 μg etikloprid hydrochloridu. Po zotavení po dobu 3 dnů byla přibližně polovina potkanů ​​z každé skupiny znovu testována, tentokrát s kombinací dvou antagonistů za podmínek 3 a 4. V každém z těchto 3 experimentů byl mezi léčbami použit vyvážený design (stejně jako dříve) (všechny krysy obdržely všechny podmínky v každém experimentu pro srovnání subjektů s účinkem). Pozice kanyl byla ověřena posmrtně jako dříve. Zobrazené údaje zahrnují pouze potkany s potvrzeným umístěním injekce, aby dosáhly VTA a NAc.

2.3.4. Účinek blokády receptorů D1 a D2 na odměnu potravin vyvolanou deprivací a příjem potravy

Antagonisté dopaminového receptoru byly testovány v různých experimentech 2. V prvním experimentu byly odpovědi zkoumány po cílené NAc (n = 20) dodání buď vehikula nebo antagonisty receptoru podobného Dl (1 μg SCH-0.5). Testování bylo prováděno nalačno (poté, co bylo jídlo omezeno na dobu období tmavého cyklu). Ve druhém experimentu byly odpovědi zkoumány po cílené NAc (n = 7) dodávka buď vehikula nebo 1.5 μg NAc eticloprid hydrochloridu. Testování bylo prováděno nalačno (poté, co bylo jídlo omezeno na dobu období cyklu temnoty; jak je znázorněno v plánu 3, Obr. 1).

2.3.5. Změny genové exprese související s dopaminem v NAc vyvolané deprivací potravin

Změny genové exprese klíčových vybraných dopaminových genů vyvolaných deprivací potravin [dopaminové receptory D1A, D2, D3, D5, katechol-O-methyltransferáza (COMT) a monoamin oxidáza A (MAO)] byly měřeny v NAc.

2.3.6. Izolace RNA a exprese mRNA

Mozky byly rychle odstraněny a NAc byl rozřezán pomocí mozkové matrice, zmrazen v kapalném dusíku a uložen při -80 ° C pro pozdější stanovení exprese mRNA. Jednotlivé vzorky mozku byly homogenizovány v Qiazolu (Qiagen, Hilden, Německo) pomocí tkáňového lyseru (Qiagen). Celková RNA byla extrahována pomocí sady RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) s dalším zpracováním DNAse (Qiagen). Kvalita a množství RNA byly hodnoceny spektrofotometrickými měřeními (Nanodrop 1000, NanoDrop Technologies, USA). Pro syntézu cDNA byla použita souprava iScript cDNA Synthesis (BioRad). RT PCR v reálném čase byla prováděna pomocí TaqMan^® sady sond a primerů pro cílové geny vybrané z online katalogu (Applied Biosystems). Hodnoty genové exprese byly vypočítány na základě C_t metoda ( Livak a Schmittgen, 2001), Kde podle libosti krmená skupina byla označena za kalibrátor. Jako referenční gen byl použit Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza (GAPDH).

2.3.7. Statistická analýza

Všechny behaviorální parametry byly analyzovány analýzou rozptylu opakovaných měření (ANOVA) a následně post hoc Tukey HSD test podle potřeby nebo studentský t test, kde byly porovnány pouze dvě podmínky. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad. Rozdíly byly považovány za významné p <0.05.

3. Výsledek

3.1. Vliv blokády receptorů typu D1 (NAc) na odměnu potravy vyvolanou germelinem VTA a příjem potravy

Pro stanovení toho, zda je aktivita na receptory podobné D1u nezbytná pro zvýšení VTA vyvolaného ghrelinem v odměňování za jídlo, byl testován vliv předběžné léčby antagonistou podobným D1 (SCH-23390) na ghrelinem indukovaného operátora, který reaguje na sacharózu. Post hoc Tukeyův test po jednosměrné ANOVA (F_(3,33) = 11.1, p <0.0005; F_(3,33) = 3.7, p <0.01; F_(3,39) = 3.6, p <0.05 pro odměny, aktivní páka a chow) odhalil významný účinek ghrelinu na zvýšení počtu získaných odměn (p <0.0005; Obr. 3A) počet aktivních stisků páky (p <0.05; Obr. 3B) a příjem chow (p <0.05; Obr. 3C). Parametry související s chováním odměn, odměny získané a aktivní pákové lisy byly jasně blokovány přípravou SCH-23390 ( Obr. 3A, B). Aktivita u neaktivní páky byla menší a mezi jednotlivými léčebnými skupinami se významně nelišila ( Obr. 3B) naznačení, že léčba neprodukuje nespecifické necílové cílené změny aktivity. Hyperfágie chřipky pozorovaná po mikroinjekci ghrelinu do VTA se nemění předběžným zpracováním SCH-23390 ( Obr. 3C). Tyto údaje ukazují, že dopaminové a D1 podobné receptory v NAc plášti jsou po proudu od ghrelinu a jsou nezbytné pro to, aby ghrelin podávaný VTA měl účinky na chování při odměňování za jídlo. Nejsou však nezbytné pro schopnost ghrelinu zvyšovat příjem potravy. Ošetření NAc pomocí SCH-23390 nemělo žádný účinek samo o sobě buď na operátora odpovědného za příjem potravy nebo chow ( Obr. 3).

3.2. Účinek blokády D2 (NAc) na VTA ghrelinem indukovanou odměnu a příjem potravy

Aby se určilo, zda je aktivita na D2 nezbytná pro expresi zvýšeného chování odměňování potravou vyvolaného VTA ghrelinem, byl testován vliv předběžné léčby selektivním antagonistou D2 (eticloprid hydrochlorid) na ghrelinem vyvolané zvýšení chování sacharózy. Jednosměrná ANOVA prokázala významný účinek léčby drogami (F_(3,18) = 9.5, p <0.0005; F_(3,18) = 8.1, p <0.001; F_(3,39) = 3.8, p <0.05 pro odměny, aktivní páka, respektive chow). Post hoc test Tukey naznačil významné zvýšení získaných odměn (p <0.01; Obr. 4A) a aktivní pákové lisy (p <0.01; Obr. 4B) po ošetření ghrelinem, který byl blokován předúpravou eticlopridem. Aktivita u neaktivní páky byla menší a mezi jednotlivými léčebnými skupinami se významně nelišila ( Obr. 4B). Na rozdíl od údajů reagujících na operátora, předběžné ošetření eticlopridem nezměnilo ghrelinem vyvolané zvýšení příjmu chow (p <0.05; Obr. 4C). V této kombinované studii byla interakce potvrzena obousměrnou ANOVA mezi předběžnou léčbou × ghrelinem v získaných odměnách: F_(1,24) = 4.8, p <0.05; aktivní pákové lisy: F_(1,24) = 4.7, p <0.05, ale ne příjem potravy. Receptory D2 tedy mohou být ghrelinem použity k vyvolání změn v chování souvisejícím s odměnami, ale nikoli ke spotřebě.

3.3. Vliv blokády receptoru D1 a / nebo D2 (NAc) na příjem gowelinu vyvolaný VTA ghrelinem

Abychom zjistili další validaci nedostatečného účinku dvou antagonistů dopaminu na krmení krmiva, opakovali jsme studii, tentokrát u potkanů, kteří nikdy nebyli vystaveni paradigmatu operativní kondicionování. Tato validační studie byla rozšířena o třetí test, ve kterém jsme zkoumali účinky společného dodávání antagonistů receptorů podobných D1 a D2 k NAc na příjem potravy řízené VTA ghrelinem. Příjem krmiva byl významně zvýšen VTA ghrelinem 2 hodiny po injekci (jednosměrná ANOVA: F_(3,30) = 6.4, p <0.005 a F_(3,27) = 9.0, p <0.0005 pro studii s receptory D1 a D2) a toto nebylo ovlivněno předběžnou léčbou buď s D1 ( Obr. 5A) nebo antagonisty receptoru D2 ( Obr. 5B). V závěrečném testu, zkoumajícím kombinovaný účinek dvou antagonistů dopaminových receptorů, jsme nemohli detekovat významný účinek VTA ghrelinu až do 3 hodin, což pravděpodobně odráží dopad injekce trojitého parenchymu potřebnou v této studii. Jedním ze způsobů, jak ANOVA naznačila významný účinek léčby (F_(3,30) = 9.6, p <0.0005). Příjem potravy po dodání VTA ghrelinu dosáhl významnosti v časovém bodě 3 hodiny, nicméně toto opět nebylo potlačeno současnou aplikací antagonistů dopaminových receptorů na NAc ( Obr. 5C). Všimněte si, že kombinovaná aplikace obou antagonistů dopaminového receptoru na NAc neměla žádný účinek samo o sobě o příjmu potravy.

3.4. Účinek blokády receptorů D1 a D2 na odměnu potravin vyvolanou deprivací a příjem potravy

Potravinová deprivace zvyšuje jak reakci operantů, tak příjem potravy po dobu 1 hodiny; krysy stiskly aktivní páku téměř dvakrát tolik, když byly hladové, a třikrát až šestkrát více krmiva v místě měření 1 h (srovnejte stav vozidla v Obr. 3 a 4). Blokáda receptorů typu D1 ve skořápce NAc významně snížila zvyšování chování při odměňování potravin vyvolané deprivací potravin, pokud se hodnotí jako snížení získaných potravinových odměn (p <0.01; Obr. 6A) a snížení aktivních stisků páky (p <0.01; Obr. 6B). Toto ošetření nemělo žádný významný účinek na příjem potravy vyvolaný deprivací potravy ( Obr. 6C). Infuze D2 antagonisty do NAc skořápky významně snížila zvýšení potravinové odměny vyvolané deprivací potravin, když bylo hodnoceno jako snížení získaných potravinových odměn (p <0.01; Obr. 7A). I když každá krysa snížila aktivní stisknutí páky po blokádě D2 v NAc, výsledkem byl trend (p = 0.08; Obr. 7B) pravděpodobně kvůli vysoké základní variabilitě při stlačení páky (standardní chyba = 86 pro vozidlo a 41 pro stav léčiva, rozsah aktivního stlačení páky na vozidle od 57 do 707 lisů). Odstranění nejlépe reagující krysy ze souboru dat vede k p = 0.001. Zejména odstraněný potkan vykázal 707 lisů na vehikulum a pouze 303 na lék, což také podporuje celkový závěr. Ani jeden z antagonistů dopaminového receptoru nezměnil páku stisknutou na neaktivní páce. Příjem chow nebyl změněn blokádou D2 v NAc ( Obr. 7C).

3.5. Změny v expresi genů souvisejících s dopaminem v NAc vyvolané deprivací potravin

Jednodenní půst měl významný dopad na expresi mRNA několika genů souvisejících s dopaminem v NAc. Exprese mRNA dopaminového receptoru D2 byla významně snížena, zatímco dopaminový receptor D5 mRNA byl zvýšen. Dopaminový receptor D1, D3, COMT a MAO nebyl přes noc pozměněn (Obr. 8). Receptory D1 a D2 jsou považovány za nejhojnější dopaminový receptor v mozku, zatímco přítomnost D3 a D5 v CNS je mnohem omezenější. Proto jsme porovnali hladiny mRNA v accumbens D5 receptorech s D1 a dospěli k 2%; podobný vztah byl detekován pro D3 a D2 (data nejsou zobrazena). Tady tedy potvrzujeme, že v rámci NAc je většina mRNA dopaminového receptoru tvořena mRNA receptorů D1 a D2, zatímco receptory D3 a D5 představují pouze malou část celkové mRNA dopaminového receptoru detekované v NAc.

4. Diskuse

Hlavní zjištění současné studie naznačují, že dopaminová signalizace v plášti NAc je nezbytným následným mediátorem účinků ghrelinu na odměnu za jídlo. Výsledky naznačují, že receptory podobné D1 a D2 ve skořápce NAc jsou klíčovými složkami obvodů aktivovaných ghrelinem a jsou nezbytné pro to, aby ghrelin aplikovaný VTA ovlivňoval chování při odměňování za jídlo. Signalizace receptoru D1 a D2 v NAc (skořápce) však není nezbytná pro schopnost ghrelinu zvýšit příjem potravy. Tyto údaje naznačují odchylky v nervových cílech ghrelinu, které kontrolují posílení potravy vs. příjem potravy. Nakonec naše zjištění naznačují, že tento obvod je zapojen také endogenním ghrelinem, protože ve stavu hladu, když jsou hladiny cirkulujícího ghrelinu zvýšeny, je nutná signalizace dopaminu v NAc pro zvýšené chování odměny za jídlo.

Překvapivě, zatímco je zřejmé, že ghrelin má vliv na dopaminergní systém (Abizaid a kol., 2006, Jerlhag a kol., 2007, Kawahara a kol., 2009  a  Weinberg a kol., 2011), toto je první studie, která prokázala, že účinky ghrelinu na odměnu za jídlo vyžadují signalizaci dopaminového receptoru NAc (v tomto případě signalizaci podobnou D1 a D2). To se ukázalo jako důležitá otázka, protože v poslední době se ukázalo, že jiné hormony nebo neuropeptidy spojené s kontrolou chuti k jídlu mají poměrně neočekávaný vztah s mezolimbickým dopaminovým systémem. Leptin například jako ghrelin má receptory na dopaminových neuronech ve VTA; většina z těchto leptin-senzitivních dopaminergních neuronů však nevyčnívá do striata, ale místo toho inervuje amygdalu (Hommel a kol., 2006  a  Leshan a kol., 2010). Melanocortin, silný anorexigenní neuropeptid s receptory ve VTA, na rozdíl od toho, co lze předpovídat pro anorexické činidlo, ve skutečnosti zvyšuje dopaminergní aktivitu a uvolňování dopaminu ve striatu, zatímco jasně snižuje chování při příjmu potravy (Torre a Celis, 1988, Lindblom a kol., 2001  a  Kužel, 2005). Další vrstva složitosti je doplněna údaji naznačujícími, že účinek ghrelinu uvolňující dopamin se zdá být závislý na dostupnosti potravy: Hladiny dopaminu NAc detekované mikrodialýzou byly zvýšeny pouze periferně aplikovaným ghrelinem u potkanů, kterým bylo povoleno jíst po podání ghrelinu (stejně jako v experimentálních podmínkách použitých v této studii) a ghrelin byly dokonce potlačeny u těch, kterým byl odepřen přístup k potravě (Kawahara a kol., 2009), což je účinek, který byl nedávno prokázán tak, že zahrnuje diferenciální opioidní signální dráhy ve VTA (Kawahara a kol., 2013). Tyto dva příklady zdůrazňují složitost vztahu mezi krmením peptidy, dostupností potravy a dopaminem a zdůrazňují důležitost studií zkoumajících užitečnost účinků ghrelinu na dopaminový systém v chování za odměnu.

Zajímavým aspektem výsledků je kontrastní účinek blokády NAc dopaminového receptoru na motivaci jídla vs. příjem potravy. Zejména jsme potvrdili nedostatek účinku potlačené signalizace dopaminu NAc na příjem VTA ghrelinem indukovaného příjmu potravy ve studiích nezávislých na 2u: v jednom paradigmatu bylo měření příjmu potravy provedeno okamžitě po testu reagujícího operátora (u kterého se přínosy z konzumace cukru mohly následně změnit u chow) a u ostatních byl u zvířat měřen pouze příjem potravy bez předchozího operativního testování. Kromě toho jsme ve druhém experimentu dokázali, že společná aplikace obou antagonistů dopaminového receptoru na NAc neměla žádný účinek na příjem potravy vyvolané VTA ghrelinem, což zvyšuje podporu hypotézy, že NAc dopaminová signalizace prostřednictvím D1-podobných a D2 receptorů není vyžadována pro hyperfágii ghrelinu. Spolu s faktem, že antagonisté přerušují VTA ghrelinem vyvolané jídlo motivované jídlo, tyto společné výsledky naznačují divergenci neuroobvodů po proudu VTA ghrelinu, přičemž jedna větev řídí příjem potravy a druhá motivace / odměna za jídlo. Zdá se, že ghrelin využívá dopamin ke změně potravinové motivace, ale nikoli k příjmu. Dříve jsme ukázali, že VTA ghrelin zapojuje neuropeptid Y do VTA selektivně za účelem kontroly příjmu potravy a opioidů opačným způsobem (Skibicka et al., 2012a). Tudíž již existuje přednost před divergencí v obvodech zapojených ghrelinem pro příjem potravy před jídlem motivovaným chováním.

Accumbální receptory podobné D1 mají dobře zavedenou roli při posilování léčiv i potravin s řadou dřívějších důkazů, které ukazují, že infúze antagonistů typu D1 jako NAc redukuje cílené chování vůči potravě. Systémoví antagonisté receptoru podobného D1 snižují vlastní nebo kokainem, heroinem, nikotinem a alkoholem indukované naráz nebo kontextem [například (Weissenborn a kol., 1996, Liu a Weiss, 2002, Bossert a kol., 2007  a  Liu a kol., 2010)], zdůrazňující klíčovou roli těchto receptorů v procesech orientovaných na odměny. Tato data ukazují, že NAc D1 podobné receptory jsou nezbytným prvkem obvodu aktivovaného ghrelinem působícím VTA. Podpůrně bylo také prokázáno, že periferní aplikace tohoto D1 antagonisty snižuje rozpoznávání objektů pomocí ghrelinu (Jacoby a Currie, 2011). Avšak vzhledem k tomu, že periferní aplikace se zaměřuje na všechny neuronální populace exprimující D1 v mozku a že populace mimo NAc (například v hippocampu) mohou mít hlavní roli v učení a paměti, není jasné, zda byla zkoumána populace NAc zde přispívají k účinkům ghrelinu na zvýšení paměti.

Receptory D2 často působí ve shodě s D1; tak mnoho studií naznačuje roli D2 receptorů v aspektech zpracování odměn a chování orientovaného na odměny. Je však pozoruhodné, že receptory D1 a D2 ne vždy fungují stejným způsobem jako funkce odměny za odměnu. Například v amygdale blokuje blokáda receptorů D1 opětovné navázání na vyhledání kokainu vyvolaného podnětem, zatímco antagonisté D2 mohou toto chování skutečně zlepšit (Berglind a kol., 2006). Tato funkční disociace může mít také neuroanatomický přínos, protože se zdá, že receptory D2 v NAc mají spíše opačnou funkci než ty v hypotalamu. Zatímco v NAc stimulace receptorů D2 může zvýšit motivaci k jídlu, což zvyšuje pravděpodobnost, že zvíře vyvine úsilí k získání potravy, v hypotalamu je stimulace receptorů D2 jasně anorexická (Leibowitz a Rossakis, 1979  a  Nowend a kol., 2001). Z toho vyplývá, že může být obtížné interpretovat výsledky po periferní aplikaci léků zaměřených na D2, u nichž jsou populace cílových receptorů spojeny s opačnou funkcí. To může být jeden z důvodů, které vysvětlují, proč v předchozí studii neměla periferní injekce antagonisty D2 žádný účinek na ghrelinem indukovanou odpověď na roztok sacharózy. Další možné vysvětlení je, že D2 je autoreceptor neuronů produkujících dopamin v substantia nigra a VTA, kde jeho aktivace může vést k potlačení dopaminergní aktivity (Lacey a kol., 1987). Při periferní injekci by tedy drogy cílící na D2 mohly potenciálně získat přístup k této populaci receptorů, zatímco v naší studii byly zaměřeny pouze receptory D2 NAc shell. Pozoruhodné je, že čistý účinek systémové blokády receptorů typu D1 blokuje reakci na nápoj se sacharózou ve stejném paradigmatu (Overduin et al., 2012). Navíc se zdá, že systémová subkutánní injekce agonisty D1 zvyšuje preferenci chutného jídla, zatímco systémová injekce agonisty D2 ji snižuje (Cooper a Al-Naser, 2006). Zdá se tedy, že naše data naznačující potlačující účinek antagonistů D1 na motivaci potravin vyvolanou ghrelinem jsou v souladu s celkovým čistým (supresivním) účinkem stimulace receptorů D1 na funkci odměny. Naproti tomu čistý účinek populace receptorů D2 následuje přesněji s tím, co je známo o hypotalamických receptorech D2, než zde uvedená data pro NAc.

V této studii byli jak D1-like, tak D2 antagonisté schopni blokovat operativní chování sacharózy po podání VTA ghrelinu a po deprivaci potravy, což naznačuje, že pro působení ghrelinu je nutný kooperativní účinek na oba receptory v NAc. To dává smysl, když se zvažuje endogenní situace, ve které dopaminergní terminály odvozené od VTA uvolňují dopamin ve skořápce NAc současně aktivující všechny dostupné dopaminové receptory. Potřeba současné aktivace D1-podobných a D2-receptorů již byla popsána pro další chování, včetně posílení (Ikemoto a kol., 1997) a lokomotorická aktivita (Plaznik a kol., 1989) a také neuronální palba (Bílá, 1987). Výsledky této studie naznačují, že blokáda pouze jednoho ze dvou dopaminergních receptorů byla dostatečná pro snížení těchto chování, stejně jako blokáda kteréhokoli z těchto receptorů byla dostatečná pro snížení ghrelinem řízeného sacharózového operativního chování. Mechanismus této interakce není jasný. Některé neurony v NAc koexprimují jak receptory D1, tak D2. Jednou z možností je zapojení heterodimerů za odměnu, tvorba heterodimerů pomocí receptorů D1 a D2 byla nedávno zveřejněna a ukázalo se, že tato vazba přispívá k depresím podobnému chování (Pei a kol., 2010). Naše výsledky však ukazují, že signál D1 a D2 v NAc není nadbytečný, a každý receptor je potřebný k přenosu ghrelinového účinku na odměnu za jídlo, protože individuální blokáda byla účinná při tlumení reakce na odměnu. Navíc, protože individuální blokáda nebyla účinná pro ghrelinovou hyperfágii, samostatně jsme vyhodnotili možnost, zda signál D1 a D2 byl nadbytečný pro příjem chow, tj. K odstranění reakce by byla nutná současná blokáda obou. To však neplatilo, protože ghrelinová hyperfagie nebyla ovlivněna současnou blokádou receptorů D1 a D2 v NAc. Samotná nebo v kombinaci signalizace receptoru D1 a D2 NAc shell ghrelinem nevyužívá ke zvýšení příjmu potravy.

Zde jsme zacílili na receptory typu D1 a D2 ve skořápce NAc. Zdá se, že funkce skořápky a jádra NAc je do určité míry disociovatelná, zejména s tím, že základní změny v samoobsluze léčiva spojené s diskrétním narážením a skořepina jsou vlivnější v kontextu samoobsluhy léku závislé na kontextu (Bossert a kol., 2007). Tato funkční disociace je podporována neuroanatomickými spojeními, kde jádro dostává více vstupů od amygdaly a skořápka je hustěji inervována hippocampem (Groenewegen a kol., 1999  a  Floresco et al., 2001). Potkani si také sami podají kombinaci agonistů D1 a D2 receptoru pouze ve skořápce NAc a nikoli v jádru (Ikemoto a kol., 1997), což naznačuje, že jejich kooperativní akce v oblasti odměňování je primárně spojena s cílovou oblastí skořápky.

V této studii jsme konkrétně zkoumali vliv potlačené signalizace dopaminu NAc na příjem potravy a chování motivované jídlem řízené ghrelinem aplikovaným VTA. Je však třeba poznamenat, že ghrelin může také řídit chování při krmení aktivací aferentních drah k VTA. Ukázalo se například, že ghrelin zvyšuje chování zesílené potravou aktivací neuronů orexinu v laterálním hypotalamu (Perello et al., 2010), orexinergní buněčná skupina, která promítá do VTA a stimuluje uvolňování dopaminu (Narita a kol., 2006). Zatímco naše studie využívající neuroanatomii a neurofarmakologii specificky disekuje dráhu VTA-NAc, v endogenní situaci ghrelin uvolněný v oběhu pravděpodobně stimuluje VTA stejně jako další mozková jádra exprimující receptor ghrelinu s efekčními projekcemi na VTA. Ve fyziologické situaci je tedy dopad ghrelinu distribuován na mnoha místech v mozku, která pravděpodobně působí ve shodě. Koncept hormonu nebo neuropeptidu působícího na mnoha distribuovaných místech v mozku, ze kterých může vyvolat podobný výsledek, například změna příjmu potravy, není nový a již byl navržen a vyhodnocen pro leptin a melanokortin (Gril, 2006, Leinninger et al., 2009, Skibicka a Grill, 2009  a  Faulconbridge a Hayes, 2011).

Nedostatek potravin je spojen s vysokou hladinou cirkulujícího ghrelinu. V podmínkách nedostatku potravin způsobuje prezentace potravin uvolňování dopaminu v NAc (Kawahara a kol., 2013). Z toho vyplývá, že nutriční stav, může také ovlivnit signalizaci dopaminu v NAc, dopad potravinové deprivace na mRNA expresi dopaminových receptorů (receptory podobné D1 (D1, D5) a D2 (D2, D3)) a dopamin degradující enzymy (MAO, COMT) hodnocené v této studii. Zatímco deprivace potravin nezměnila expresi mRNA žádného z měřených enzymů degradujících dopamin, viděli jsme rozdílnou regulaci receptorů D5 vs. D2. Exprese receptorů D5 byla zvýšena téměř o 30%, zatímco mRNA receptoru D2 byla snížena o přibližně 20%. V souladu s touto divergencí bylo prokázáno, že současná aplikace agonistů D1-podobných a D2 receptorů down-reguluje receptory D2, ale zvyšuje receptory D1 v substantia nigra (a s podobným trendem v NAc) (Subramaniam a kol., 1992). Je zajímavé, že účinky potravinové deprivace na expresi NAc dopaminového receptoru se shodují s našimi údaji prokazujícími roli D1-podobných (které zahrnují D5) a D2 receptory v motivaci potravy indukované nalačno.

Jednou z náležitostí naší studie je, že deprivace potravin zvyšuje hladiny cirkulujícího ghrelinu, takže potenciálně mohou být aktivovány další populace ghrelinových receptorů mimo VTA. Ačkoli je tedy deprivace potravin endogenním a fyziologicky relevantnějším způsobem zvýšení ghrelinu, neumožňuje selektivní stimulaci VTA. Proto nemůžeme vyloučit možnost, že změny dopaminového receptoru detekované v NAc jsou výsledkem ghrelinové aktivity v oblastech mimo VTA s nepřímým vlivem na NAc. Nakonec je třeba poznamenat, že naše data spojují půst se změnami v expresi NAc dopaminového receptoru, ale k prokázání zprostředkování dopaminergní projekce (ghrelinem stimulované) VTA-NAc v tomto smyslu by bylo zapotřebí dalších experimentů a ve skutečnosti k prozkoumání role dalších drah a systémů vysílačů v tomto smyslu, jako je laterální hypotalamus (jak bylo uvedeno výše).

Protože mnoho neurobiologických substrátů je společných jak pro závislost na drogách, tak pro poruchu příjmu potravy, je možné, že současné nálezy svědčí o roli receptorů typu D1 a D2 v účinkech ghrelinu na posílení léků a alkoholu (Dickson a kol., 2011). Odměna za jídlo i kokain vede k uvolnění dopaminu v NAc (Hernandez a Hoebel, 1988). Blokáda receptorů D1 nebo D2 snižuje chování odměn za zneužívání drog, alkoholu a nikotinu. Protože již dříve byl hlášen významný přínos ghrelinu k chování při příjmu nebo odměňování u všech těchto látek, je spíše pravděpodobné, že zde popsané obvody ghrelin-VTA-dopamin-NAc jsou relevantní pro celou řadu způsobů odměňování, a nikoli výlučně pro potraviny. Předběžnou podporu této myšlenky lze získat z údajů prokazujících, že nedostatek potravin může obnovit hledání heroinu, které je blokováno blokádou receptorů typu D1 (Tobin a kol., 2009).

Naše data poskytují nové znalosti o integraci dvou klíčových signalizačních systémů spojených s odměnou za jídlo: obvody poháněné VTA, které reagují na orexigenní hormon, ghrelin a obvody reagující na dopamin NAc. Zejména jsme ukázali, že ghrelinové dobře zdokumentované účinky spojené s VTA na chování motivované potravinami vyžadují signalizaci D1 a D2 v NAc. Naše data také naznačují, že účinky ghrelinu na odměnu za potravu řízené VTA (závislé na D1 / D2) zahrnují rozdílné obvody s těmi, které jsou důležité pro příjem potravy, protože žádný antagonista neovlivňoval příjem potravy vyvolané ghrelinem, když byl dodán NAc. Nakonec studie hladových (přes noc nalačno, a tedy hyperghrelinemických) potkanů ​​implikují signalizaci NAc D1 / D2 v účincích endogenního ghrelinu na chování motivované potravinami. Zdá se tedy, že mechanismy a terapie interferující se signalizací dopaminu v NAc mají význam pro účinky zprostředkování ghrelinu na systém odměn, včetně těch, které souvisejí s kontrolou krmení, a tedy s obezitou a jejím léčením.

Prohlášení o zveřejnění

Autoři nemají co prozradit.

Reference

• Weissenborn a kol., 1996
• R. Weissenborn, V. Deroche, GF Koob, F. Weiss
• Účinky agonistů a antagonistů dopaminu na kokainem indukovaného operátora, který reaguje na stimul spojený s kokainem
• Psychofarmakologie (Berl), 126 (1996), s. 311 – 322
• Zobrazit záznam v Scopus

   | 

  Citace článků (74)
•  
• Zigman a kol., 2006
• JM Zigman, JE Jones, CE Lee, CB Saper, JK Elmquist
• Exprese mRNA receptoru ghrelinu v mozku krysy a myši
• J. Comp. Neurol., 494 (2006), str. 528–548
• Zobrazit záznam v Scopus

  |

  Plný text přes CrossRef

   | 

  Citace článků (383)
• Wren a kol., 2000
• AM Wren, CJ Small, HL Ward, KG Murphy, CL Dakin, S. Taheri, AR Kennedy, GH Roberts, DG Morgan, MA Ghatei, SR Bloom
• Nový hypothalamický peptid ghrelin stimuluje příjem potravy a sekreci růstového hormonu
• Endokrinologie, 141 (2000), str. 4325 – 4328
• Zobrazit záznam v Scopus

  |

  Plný text přes CrossRef

   | 

  Citace článků (1108)
• Bílá, 1987
• FJ White
• Stimulace dopaminového receptoru D-1 umožňuje inhibici nukleon accumbens neuronů agonistou receptoru D-2
• Eur. J. Pharmacol., 135 (1987), str. 101 – 105
• Článek

  |

   PDF (342 K)

  |

  Zobrazit záznam v Scopus

   | 

  Citace článků (88)
•  
•  

•  
• Odpovídající autor. Oddělení endokrinologie, Ústav neurovědy a fyziologie, Sahlgrenska akademie na univerzitě v Göteborgu, Medicinaregatan 11, PO Box 434, SE-405 30 Göteborg, Švédsko. Tel .: +46 31 786 3818 (kancelář); fax: +46 31 786 3512.