PLoS One. 2014 Jul 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Abstraktní
Chronická expozice kokainu u závislých na lidech i u modelů závislostí na hlodavcích snižuje prefrontální kortikální aktivitu, která následně narušuje zpracování odměn a výkonnou funkci vyššího řádu. Síťovým efektem tohoto narušeného spojení chování je zvýšená zranitelnost vůči relapsům. Dříve jsme ukázali, že kokainem vyvolané zvýšení exprese mozku odvozeného neurotrofického faktoru (BDNF) ve středním prefrontálním kortexu (PFC) je neuroadaptivní mechanismus, který otupuje zesilující účinnost kokainu. Jelikož je známo, že BDNF ovlivňuje přežití neuronů a synaptickou plasticitu, testovali jsme hypotézu, že abstinence od samopodávání kokainu povede ke změnám v neuronální morfologii a synaptické hustotě v PFC. Pomocí nové techniky, maticové tomografie a Golgiho barvení byly analyzovány morfologické změny v PFC potkanů po 14 dnech po podání kokainu a 7 dnech vynucené abstinence. Naše výsledky ukazují, že celkové dendritické větvení a celková synaptická hustota jsou u potkaního PFC významně sníženy. Naproti tomu hustota tenkých dendritických páteří je na pyramidálních neuronech vrstvy PFC významně zvýšena. Tato zjištění ukazují, že během abstinence kokainu dochází k dynamickým strukturálním změnám, které mohou u jedinců závislých na kokainu přispívat k pozorované hypoaktivitě PFC.
Úvod
Navrhují se změny strukturální plasticity v obvodech odměňování jako klíčové mechanismy přispívající k silné schopnosti kokainu udržovat chování při hledání drog (shrnuto v [1]). Předchozí studie prokázaly nárůst dendritické arborizace a hustoty páteře v nucleus accumbens (NAc) [2]-[4], ventrální tegmentální oblast [5]a prefrontální kůra (PFC) [6] po expozici kokainu. Zatímco většina studií se zaměřila na strukturální změny spojené s dysfunkční aktivitou NAc, podstatně méně studií zkoumalo změny v PFC. Několik důkazů prokazuje dysfunkci PFC po chronické expozici kokainu u obou závislých na lidech [7], [8] a v modelech závislosti na hlodavcích [9], [10]. Proto je charakterizace strukturálních změn, ke kterým dochází v PFC, relevantní pro pochopení molekulárních událostí, které jsou základem závislosti.
PFC reguluje kontrolu impulzů a rozhodování, a hraje tak důležitou roli ve schopnosti jednotlivce kontrolovat chování, zejména v drogové závislosti [8], [11]. Například u jedinců závislých na kokainu je snížená preortální aktivace kůry spojená s vysazením léku a narušuje výkonné reakce vyšších řádů [7], [8], což může zvýšit zranitelnost vůči relapsům. U hlodavců je zvýšená neuronální aktivita v PFC spojena s příjmem kokainu [9], [10], nutkavé chování při hledání drog [12]a navrácení kokainu po stažení [13]-[15]. Kromě toho je po chronickém podání kokainu v PFC zrušena bistabilita membrány [16]. Nakonec je metabolická aktivita vyvolaná léčivem v PFC otupena u potkanů, kterým byla podána provokační injekce během vysazení ze samopodávání kokainu. [9], [17]. Společně tyto studie naznačují, že chronický kokain indukuje hluboké funkční změny v PFC, které mohou být spojeny se zvýšením počtu inhibičních synapsí a / nebo snížením excitačních synapsí v PFC. Morfologické změny, ke kterým dochází v PFC po chronickém užívání drog, však nebyly objasněny.
V této studii jsme se snažili prozkoumat, zda abstinence od kokainu vede ke strukturálním změnám v PFC. Morfologické změny byly zkoumány pomocí tradiční metody, Golgiho barvení a také pomocí nové techniky, maticové tomografie. Array tomography je jedinečná metoda, která kombinuje řezy ultratenkých tkání s imunofluorescencí a trojrozměrnou rekonstrukcí obrazu, což umožňuje přesnou kvantifikaci celkové a subtypové specifické hustoty synapse [18], [19]. Použitím těchto metod naše výsledky naznačily podstatnou plasticitu potkaního PFC v reakci na abstinenci kokainu.
Materiály a metody
Zvířata a bydlení
Samci krys Sprague-Dawley (Rattus norvegicus) o hmotnosti 250–300 g byli získáni od Taconic Laboratories (Germantown, NY). Zvířata byla jednotlivě umístěna s potravou a vodou k dispozici ad libitum ve své domácí kleci. Všechny experimentální protokoly byly v souladu s pokyny vydanými americkými Národními instituty zdraví a byly schváleny Lékařskou fakultou Perelman na Pensylvánské univerzitě a Výborem pro ústavní péči a používání zvířat na Pensylvánské univerzitě.
Chirurgie
Před operací byly krysy anestetizovány 80 mg / kg ketaminu a 12 mg / kg xylazinem (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Do pravé krční žíly byl zaveden zavedený silastický katétr (vnitřní průměr 0.33 mm, vnější průměr 0.64 mm) a sešitý na místo. Katétr pak byl podán subkutánně přes lopatku lopatky a směrován na platformu backmount sítě (CamCath, Cambridge, UK), která byla sešita pod kůží přímo nad lopatkami. Katétry byly propláchnuty denně 0.3 ml antibiotika Timentin (ticarcillin disodný / klavulanát draselný, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY) rozpuštěný v heparinizovaném solném roztoku (10 U / ml). Pokud se katétry nepoužívaly, byly uzavřeny plastovými uzávěry.
Kokainová samospráva
Krysy byly ponechány 7 dny zotavit se z chirurgického zákroku před zahájením vlastního podávání kokainu. Krysy byly náhodně přiřazeny do jedné ze dvou skupin: zvířata, která si samy podávaly kokain, a kontroly jhacího solného roztoku. Každá krysa vyškolená pro reakci na případné infuze kokainu byla spárována s jhočím subjektem, který obdržel stejný počet a časový průběh infuzí jako sám podávaný spárovaným kokainem experimentálním potkanem. Páka, která naléhala na krysy potažené solným roztokem, neměla žádné naplánované důsledky.
Zpočátku byly potkani experimentální s kokainem umístěni do modulárních operačních komor (Med Associates, St. Albans, VT) a nechali páku stlačit pro intravenózní infuze kokainu (0.25 mg kokainu / 59 ul solný roztok, infuze přes 5 s) na fixním poměr 1 (FR1) plán vyztužení. Jakmile kokainový pokusný potkan dosáhl alespoň 20 infuzí kokainu v jedné operativní relaci podle plánu FR1, požadavek na odpověď byl přepnut na plán zesílení FR5. Pro odpověď na oba plány s pevným poměrem byl maximální počet infuzí kokainu omezen na 30 na denní relaci samostatné aplikace a po každé infuzi kokainu následoval časový limit 20, během kterého byla aktivní odpověď na páku zaznamenána do tabulky, ale neměla žádné naplánované důsledky . Denní 2 h operativní sezení (7 dny / týden) byly vedeny celkem 14 dní. Reakce na neaktivní páku, které neměly žádné naplánované důsledky, byly zaznamenány také během tréninků FR1 a FR5.
Po 14th Denní operativní sezení, kokainové experimenty a jholové kontrolní krysy se vrátily do svých domácích klecí, kde prošly 7 dny nucené drogové abstinence. Na 7th den abstinence kokainu byly mozky odstraněny a PFC byl pitván na ledu. Sedm dní abstinence kokainu bylo vybráno za účelem přímého srovnání s naší dříve publikovanou studií zkoumající změny v expresi PFC BDNF vyvolané kokainem. [20].
kapání
Krysy byly anestezovány (100 mg / kg, ip pentobarbital sodný) a perfundovány ledově chladným 4% paraformaldehydem v 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). Jedna hemisféra z každého mozku byla použita pro barvení golgi a druhá hemisféra pro pole tomografie. Hemisféry pole byly dodatečně fixovány v 4% PFA s 2.5% sacharózou po dobu 2 hodin a Golgiho hemisféry byly dodatečně fixovány po 48 h v 4% PFA.
Array Tomography
Experimenty s poli tomografií byly provedeny, jak bylo popsáno výše [19], [21]. Stručně řečeno, PFA fixovaná tkáň byla zapuštěna do pryskyřice a koronální (70 nm) řezy na úrovni mPFC byly nařezány a shromážděny jako pásek. Stuhy byly hydratovány v 50 mM glycinu v Tris a blokovány v blokovacím roztoku (0.05% Tween / 0.1% hovězí sérový albumin v Tris pufru (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). Stuhy byly obarveny primárními protilátkami, GAD65 ( Chemicon), PSD95 (Cell Signaling) nebo synaptophysin (Abcam), v blokujícím roztoku přes noc při 4 ° C. Stuhy byly promyty Tris pufrem a barveny sekundárními protilátkami v 1![[poměr]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 v blokujícím roztoku (kozí anti-myší Alexa-mouka 488 a kozí anti-králičí cy3 nebo oslí anti-králičí cy5). Stuhy byly obarveny DAPI, aby se usnadnilo nalezení stejných míst v každé sekci. Obrázky dlaždic-sken byly získány pomocí epifluorescenčního mikroskopu Zeiss AxioImager Z2. Obrázky ze stejného místa na každé ze sériových sekcí 20 – 30 na pásek byly získány v 63x pomocí automatizovaných programů specializovaných na tomografii pole.
Analýza pole tomografie
Sériové obrázky z každé pásky byly otevřeny postupně, převedeny do zásobníku a zarovnány s zásuvnými moduly MultiStackReg a StackReg (se svolením B. Busse na Stanford University a [21], [22]. K výběru kvantitativních oblastí zájmu (ROI) v neuropilu byly použity kvantové rámečky pro oříznutí (19.5 µmx19.5 um). Selekce musely vylučovat těla neuronálních buněk nebo jiné zakrývající rysy. Pro automatizovanou analýzu obrazu byly požadované plodiny (nebo ROI) pro synaptopysin, dekarboxylázu kyseliny glutamové-65 (GAD65) a PSD95 automaticky prahovány automaticky pomocí automatizovaných algoritmů v ImageJ. Plodiny byly kódovány a analýza byla slepá až do stavu. Jak bylo popsáno výše, byl použit automatizovaný detekční program založený na prahu pro kvantifikaci počtu puncta identifikovaných jako pozitivní synapse [23]. Hustoty presynaptických terminálů, excitačních postsynaptických terminálů a procenta GAD-pozitivních (inhibičních) synapsí byly vypočteny z průměrných míst vzorku 75 na zvíře odebraných ze dvou různých tkáňových bloků z PFC (n
=5 ošetřená kokainem, 5 solná zvířata) pro celkový počet 29,154 postsynaptických puncta a 53,565 presynaptických puncta z odběrných míst 818 přes zvířata ošetřená fyziologickým roztokem 5 a presynaptická puncta 29,662 ze zvířat ošetřených 17,034. Byly vypočteny střední hodnoty hustoty synapsí a procenta inhibičních synapsí na zvíře a byly provedeny t-testy s použitím mediánů zvířat pro testování, zda existuje rozdíl mezi průměry skupiny.
Rapid-Golgiho metoda
Jednobarevné Golgiho barvení bylo provedeno, jak bylo popsáno výše [24], [25]. Stručně, mPFC z jedné hemisféry každého zvířete byl rozřezán na 100 um koronální řezy a následně fixován v 1% oxidu osmičelém a následně třikrát promyt v 0.1 M PB, pH 7.4. Řezy byly inkubovány v 3.5% dichromanu draselném přes noc, krátce promyty a infiltrovány 1.5% dusičnanem stříbrným sendvičovou metodou [25]. Řezy byly namontovány na želatinou potažená sklíčka s 20% sacharózou a dehydratovány prostřednictvím řady koncentrací alkoholu, následované odtučněním v xylenu a krycí sklouznutím.
Golgiho analýza
Golgiho sklíčka byla kódována a analyzována slepě do stavu a všechna analyzována stejným experimentátorem. Neuronové obrazy a stopy a reprezentativní obrazy dendritických páteří byly získány za použití svislého mikroskopu BX51 Olympus s integrovaným motorizovaným stolem (Prior Scientific, Rockland, MA) s objektivem 20 × 0.7 NA. Pro dendritické větvení byly neurony 7 vybrány pro analýzu na zvíře. Měřili jsme délku a složitost neuritů pomocí makra NeuronJ a Advanced Sholl Analysis, v tomto pořadí. Počet průsečíků (větvených bodů) uvnitř soustředných kruhů v poloměrech mezi 5 – 250 µm (včetně bazálních a apikálních dendritů) byl měřen a porovnáván mezi skupinami. Pro analýzu hustoty páteře byly segmenty 4 – 5 o délce nejméně 20 um z bazálních dendritů třetího řádu analyzovány na neuron z neuronů 5 – 7 na zvíře pomocí epifluorescenčního mikroskopu Zeiss AxioImager Z2 s olejovým imerzním objektivem 63x. Morfologie páteře byla klasifikována, jak bylo popsáno výše [26]. Mezi skupinami byla srovnána lineární hustota páteře pro každý dendritický segment a morfologie páteře (tenká, zakulacená, hub, ve tvaru pohárku) každé páteře. Pro analýzu dat Golgiho a maticové tomografie byl použit software s otevřeným zdrojovým kódem od National Institutes of Health (ImageJ).
výsledky
Abstinence od kokainu snižuje celkovou hustotu synapse
Array tomografie byla použita k měření změn excitačních i inhibičních synapsí za účelem stanovení specifických morfologických změn, které se vyskytují v PFC v reakci na abstinenci od samopodání kokainu. Array tomography je vysoce výkonná metoda, která umožňuje přesnou kvantifikaci celkových, inhibičních a excitačních synapsí ve strukturách, které jsou příliš malé na to, aby byly řádně identifikovány nebo lokalizovány tradičními konfokálními mikroskopickými metodami. [19]. Protože jak inhibiční, tak excitační synapse jsou nezbytnými součástmi obvodů odměňování léčiv [13], [27], [28] Tuto novou metodologii jsme použili k posouzení morfologických změn v PFC během abstinence od kokainu. Řezy PFC ze sedmdesáti nm z jedné mozkové hemisféry potkanů s joke-fyziologickým roztokem 5 a s kokainem 5 byly obarveny protilátkami proti PSD95, postsynaptickému excitačnímu markeru, synaptofysinu, presynaptickému markeru a GAD65, které značily inhibiční neurony a synapsy. Hustoty synapsí a procento inhibičních synapsí byly stanoveny v kortikální vrstvě V (Obrázek 1A a 1B). Naše výsledky ukazují, že během abstinence od kokainu došlo k významnému snížení hustoty synaptopysinu (Obrázek 1C), které měří všechny presynaptické terminály [t (7)=2, p <0.05]. Nebylo zjištěno žádné významné snížení hustoty excitační synapse [t (8)=0.48, str=0.32] měřeno počítáním PSD95 puncta (Obrázek 1D). Je zajímavé, že došlo k nevýznamnému trendu ke zvýšení procenta GAD65-pozitivních inhibičních synapsí [t (8)=−1.39, str=0.9] (Obrázek 2E).
Abstinence od kokainu snižuje dendritické větvení a současně přechodně zvyšuje hustotu páteře v PFC
Golgiho metoda byla použita ke zkoumání změn v rozvětvení neuronů a dendritické hustotě páteře, aby se potvrdily ultrastrukturální změny pozorované v hustotě synapse (Obrázek 1). Provedli jsme rychlou impregnaci Golgiho sekcí na podskupině neuronů v PFC od ostatních hemisfér stejných zvířat, která byla použita pro studii tomografie pole. Bylo hodnoceno dendritické větvení, počet dendritických páteřů a morfologie páteře. Dva reprezentativní pyramidální neurony z PFC kontroly s joke-solným roztokem a kokainem exponovaná krysa jsou znázorněny na Obrázek 2A. Shollův graf měřil počet průsečíků (větvených bodů) uvnitř soustředných kruhů v poloměrech mezi 5 – 250 µm. Naše výsledky ukazují, že po 7 dnech nucené abstinence od užívání kokainu došlo k významnému snížení dendritické složitosti (Obrázek 2B). Dvousměrná opakovaná měření ANOVA analýza údajů o ploše sholl odhalila významné hlavní účinky léčby [F(1,738)=30.59, p <0.0001] a poloměr [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Obrázek 2B), což potvrzuje ztrátu dendritů, které souhlasí se ztrátou synapsí měřených ve studiích pole (Obrázek 1C). Analýza bazálních dendritů druhého a třetího řádu odhalila významné zvýšení dendritických páteří po 7 dnech abstinence kokainu [t (6)=−3.12, p <0.05] (Obrázek 2D). Přesněji řečeno abstinence z expozice kokainu zvýšila počet subtypů tenké páteře, zatímco neměla žádný významný účinek na jiné podtypy páteře (Obrázek 2E), jak bylo odhaleno dvěma opakovanými měřeními ANOVA s hlavními účinky léčby [F(1,30)=11.9, str=0.0017], podtyp páteře [F(4,30)=57.7, p <0.0001] a významná interakce x podtyp páteře [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Diskuse
V této studii jsme demonstrovali, že ve vrstvě V PFC po 7 dnech nucené abstinence od samopodání kokainu dochází k výrazným strukturálním a synaptickým změnám. Konkrétně dochází k významnému snížení dendritického větvení pyramidálních neuronů a obecné ztrátě hustoty synapse, měřeno sníženou hustotou celkových presynaptických boutonů značených synaptopysinem. Přes ztrátu presynaptické hustoty podstoupily bazální dendrity pyramidálních neuronů vrstvy V nárůst hustoty dendritické páteře, zejména tenkých plastových hřbetů. Protože jsme nezjistili významné změny v hustotě PSD95, lze spekulovat, že pokles presynaptických terminálů, ale zvýšení hustoty páteře může být způsobeno zvýšením počtu multynaptických boutonů. Kromě toho stojí za zmínku, že jsme pozorovali trend směrem ke zvýšeným inhibičním synapsím v PFC. Protože tenké páteře se podílejí na plasticitě [29], nárůst těchto páteří by mohl představovat kompenzační plasticitu pro udržení synaptických vstupů na těchto denervovaných neuronech, které ztratily dendritické větve.
Předchozí studie prokázaly, že kokain zvyšuje na NAc dendritickou arborizaci a hustotu páteře [2]-[4]. Nedávno Dumitriu a kol., 2012 [30] prokázali, že kokain dynamicky mění proximální páteře v jádru a skořápce NAc. Konkrétně, ve skořápce, stahování z kokainu zvýšilo tenké páteře, zatímco se snížila hustota hlavy páteře hub ve skořápce NAc [30]. Na rozdíl od studií NAc existuje jen několik studií, které zkoumaly účinky kokainu na neuronální morfologii v PFC [6], [31]. Naše data jsou v souladu s nedávnou studií, která prokazuje, že kokain indukuje zvýšení hustoty páteře v PFC [31]. Zejména myši, které měly větší nárůst perzistentních a stabilních páteří, tj. Páteře přítomné 3 dny po stažení, na apikálních dendritech vykazovaly vyšší skóre preferencí pro místo s kokainem a hyperaktivitu indukovanou kokainem [31]. Předchozí studie na krysích PFC vrstvách II-III neuronů uváděla hodnoty přibližně 3 páteří na µm dendritu na apikálních i bazálních dendritech, překvapivě hustá úroveň páteř, která byla modifikovatelná stresem [32]. Naše hodnoty u kontrolních krys ∼2 páteří / 10 um dendritických segmentů jsou nižší, což může být způsobeno různou analyzovanou neuronální populací (základní dendrity vrstvy V) nebo rozdílem v zobrazovací technice. V této studii jsme použili jednobarevnou metodu rychlého Golgiho barvení, zatímco iontoforetické injekce Luciferova žlutého barviva kombinované s konfokálním zobrazováním byly použity Radleyem a jeho kolegy [32] vizualizovat neuronální a dendritickou morfologii. Naše zjištění navíc zdůrazňují důležitost trvání abstinence od užívání kokainu, které vedou ke strukturálním změnám v mozku. Dříve publikovaná zpráva prokázala nárůst dendritické arborizace po dlouhodobém (24 – 25 dnech) stažení z kokainu u samic potkanů [6], na rozdíl od našeho pozorovaného poklesu po 7 dnech nucené abstinence u samců potkanů. Přes tyto metodologické rozdíly a rozdíly v údajích o větvení byl v obou studiích pozorován zvýšený počet páteří, což potvrdilo reorganizaci obvodů ve velkém měřítku během abstinence kokainu. Budoucí studie objasní časový průběh těchto událostí, aby se určilo, zda jsou tyto strukturální změny přechodné nebo dlouhodobé.
Naše zjištění naznačují, že nucená abstinence od užívání kokainu indukuje dynamické strukturální změny a způsobuje synaptickou reorganizaci v PFC. Tyto výsledky mohou vysvětlit hypo-aktivitu v PFC, ke které dochází v důsledku opakované expozice kokainu [8], [33]. Naše zjištění dále podporují předchozí studie prokazující deaktivaci PFC [7], [8]a zvýšený extracelulární GABA ve středním PFC během odběru kokainu [34]. Mechanismy vysvětlující hypoaktivitu PFC po chronické expozici kokainu [8], [10] může zahrnovat (1) zvýšení GABAergic, (2) snížení glutamatergického a / nebo (3) snížení dopaminergního synaptického vstupu do PFC. Tato studie ukazuje, že abstinence od kokainu významně snižuje celkovou hustotu synapse, což naznačuje snížení počtu synaptopysin pozitivních synaptických punkt. Tato data naznačují, že v PFC dochází ke snížení postsynaptické citlivosti, pravděpodobně zprostředkované sníženým vstupem glutamátu nebo dopaminu. Existují studie, které naznačují, že kokain indukuje snížení glutamatergického tonusu [35], [36]. Při použití Golgiho metody jsme však pozorovali nárůst počtu tenkých dendritických páteří na bazálních dendritech pyramidálních neuronů, což naznačuje zvýšení excitačního vstupu v PFC vůči zbývajícím neuritům. Tato zjevně protichůdná data mohou odrážet celkovou ztrátu synapsí spojených s velkou ztrátou dendritů, které pozorujeme s kompenzační odpovědí, možná zprostředkovanou zvýšeným BDNF, jak ukazuje naše předchozí zjištění [20], ke zvýšení hustoty dendritických páteří na zbývajících neuritech.
Souhrnně naše zjištění naznačují dynamickou reorganizaci v PFC během abstinence kokainu. Konkrétně dochází k významnému snížení synaptické konektivity, ke ztrátě dendritického větvení a ke zvýšení počtu tenkých hřbetů u potkaního PFC po 7 dnech nucené drogové abstinence od samopodání kokainu. Tyto výsledky mohou poskytnout strukturální základ pro pozorovanou hypo-aktivitu pozorovanou v PFC u chronických zneuživatelů kokainu a možná vysvětlují ztrátu kognitivní kontroly, ke které dochází během závislosti na kokainu.
Poděkování
Autoři by chtěli poděkovat Gavinovi Sangreymu za jeho pomoc při přípravě vložených tobolek.
Prohlášení o financování
Tuto práci podpořily granty NIDA DA22339 a DA033641 (RCP & GSV) a DA18678 (RCP). HDS byl podpořen individuálním oceněním K01 (DA030445). Financující subjekty neměly žádnou roli v designu studií, sběru a analýze dat, rozhodnutí o publikování nebo přípravě rukopisu.
Reference
;
