Přední psychiatrie. 2018; 9: 81.
Publikováno online 2018 Mar 12. dva: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* a Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstraktní
Pozadí
Návykové používání internetu a online her je potenciální psychiatrická porucha nazývaná porucha internetového hraní (IGD). Byly hlášeny změněné profily exprese mikroRNA (miRNA) v krvi a mozkové tkáni pacientů s určitými psychiatrickými poruchami a byly navrženy jako biomarkery. V IGD však nebyly zaznamenány žádné zprávy o krevních profilech miRNA.
Metody
Abychom zjistili miRNA spojené s IGD, analyzovali jsme expresní profily miRNA vzorků 51 (kontroly 25 IGD a 26) pomocí miRNA pole TaqMan s nízkou hustotou. Pro ověření jsme provedli kvantitativní reverzní transkripci PCR se vzorky nezávislými na 36 (kontroly 20 IGD a 16).
výsledky
Prostřednictvím objevu a nezávislé validace jsme identifikovali tři miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), které byly významně downregulovány ve skupině IGD. Jedinci se všemi třemi změnami miRNA měli mnohem vyšší riziko IGD než ti bez změny [poměr šancí (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11] a OR se zvyšovala v závislosti na počtu změněných miRNA. Predikované cílové geny tří miRNA byly spojeny s nervovými cestami. Prozkoumali jsme proteinovou expresi tří downstream cílových genů pomocí western blotu a potvrdili jsme, že exprese GABRB2 a DPYSL2 byla významně vyšší ve skupině IGD.
Proč investovat do čističky vzduchu?
Zjistili jsme, že exprese hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p byly u pacientů s IGD sníženy. Naše výsledky budou užitečné pro pochopení patofyziologie IGD.
Úvod
Návykové používání internetu a her založených na internetu není jen sociálním jevem v zemích s rozsáhlou infrastrukturou přístupu na internet, ale potenciální psychiatrická porucha nazývaná porucha hraní na internetu (IGD) (1-3). Podle epidemiologických zpráv se míra prevalence IGD u dospívajících liší v různých zemích, od 0.8 do 26.7% (4). Zejména studie ukazují míry prevalence vyšší než 10% u dospívajících v mnoha asijských zemích, jako je Jižní Korea, Čína, Tchaj-wan, Hongkong a Singapur (4). IGD je spojena s narušením kognitivních funkcí, psychosociálních vztahů a každodenního života; například snížení akademického nebo pracovního výkonu (4-7). IGD je nyní součástí oddílu III (Podmínky pro další studium) páté revize Diagnostického a statistického manuálu duševních poruch (DSM-V) (8). I přes klinicko-sociální význam je však o molekulárně genetickém mechanismu IGD známo jen málo.
Nedávné rozsáhlé dvojče studie navrhly genetické pozadí IGD (9, 10). Vink a kol. zkoumali jednotlivé rozdíly v kompulzivním používání internetu s monozygotními a dizygotními dvojčaty dospívajících v nizozemském Twin Register a uvedli, že 5,247% rozdílů bylo vysvětleno genetickými faktory (9). Li a kol. pozorovali páry čínských dospívajících dvojčat 825 a uvedli, že genetické faktory vysvětlují 58 – 66% rozdílů (10). V souladu s tím polymorfismy genů zapojených do neurotransmise, poznání a pozornosti, jako je dopaminový receptor D2 gen (DRD2), katecholamin-O-methyltransferázový gen (COMT), serotoninový transportní gen (5HTTLPR) a cholinergní receptor nikotinový alfa 4 gen (CHRNA4) bylo hlášeno, že významně souvisí s závislostí na internetu (11-13). Kim a kol. prověřili varianty více než 100 kandidátních genů souvisejících s produkcí, působením a metabolismem neurotransmiterů analýzou sekvenování další generace a uvedli, že rs2229910 NTRK3 gen je spojen s IGD (14).
Kromě genetických faktorů je také dobře známo, že neurobehaviorální fenotypy jsou epigeneticky kontrolovány nekódujícími RNA, včetně mikroRNA (miRNA) (15, 16). miRNA jsou malé nekódující jednovláknové molekuly RNA (přibližně 20 – 23 nukleotidů na délku), které negativně regulují expresi genů kódujících protein degradací mRNA a hrají rozhodující roli v patofyziologickém procesu různých onemocnění (17). Řádky důkazů prokázaly, že miRNA jsou hojné v lidském centrálním nervovém systému (CNS) a působí tak, že jemně vylaďují úrovně exprese svých cílových genů, které se podílejí na vývoji a zrání systému CNS (15). Nedávné studie skutečně odhalily, že expresní profily miRNA se mění v mozkové tkáni pacientů s psychiatrickými poruchami, což naznačuje, že jejich expresní profily by mohly být biomarkery psychiatrických poruch (15, 16, 18). Například prostřednictvím analýzy postmortem Lopez et al. uvádí, že exprese miR-1202, která reguluje expresi genu metabotropního glutamátového receptoru-4 a předpovídá odpověď na antidepresivum, byla downregulována v prefrontálních tkáních kůry pacientů s velkou depresí (19). Pokud jde o screening biomarkerů, má tento přístup jasné omezení, protože provedení biopsie tkáně CNS pro screening není možné. Protože miRNA lze detekovat v krvi (plazmě nebo séru), mají cirkulující miRNA jednoznačnou výhodu jako neinvazivní biomarkery v neuropsychiatrických poruchách. Dosud však neexistovaly žádné studie o profilech cirkulující miRNA v IGD. Lepší porozumění profilům cirkulující miRNA exprese by mohlo pomoci objasnit mechanismus vývoje IGD a usnadnit klinický překlad.
V této studii jsme se zaměřili na identifikaci miRNA markerů asociovaných s IGD pozorováním odlišně exprimovaných plazmatických miRNA mezi IGD a kontrolními skupinami a zkoumali jsme jejich biologické důsledky.
Materiály a metody
Studijní předměty
Zkoumali jsme teenagery 3,166 (ve věku 12 – 18) pomocí bodování DSM-V IGD. Mezi nimi byly 251 (samci 168 a samice 83) diagnostikováni jako IGD podle kritérií DSM-V (8). Informovaný souhlas s touto studií poskytl celkem 91 jednotlivců (49 IGD a 42 kontroly). Z nich byli vyloučeni čtyři jednotlivci podle kritérií vyloučení. Nakonec byli do této studie zařazeni jednotlivci 87 (subjekty 45 IGD a zdraví kontrolní jedinci 42). Mezi nimi byli přijati účastníci 51 (pacienti 25 IGD a kontroly 26) jako soubor objevů od 2014 do 2016. Ostatní účastníci 36 (pacienti 20 IGD a kontroly 16) byli přijati jako nezávislá ověřovací sada od 2016. Všichni účastníci byli korejští jednotlivci zapsaní do Soulské nemocnice sv. Marie (Soul, Jižní Korea) a Soulské národní univerzity Boramae Hospital (Soul, Jižní Korea). Všichni účastníci podstoupili strukturovaný rozhovor psychiatra na základě harmonogramu afektivních poruch a schizofrenie Korejského dítěte (K-SADS-PL) (20). Všichni účastníci dokončili dílčí testy blokového designu a slovní zásoby Korejsko-Wechslerovy stupnice inteligence pro děti, 4th vydání (K-WISC-IV) (21). Impulzivnost byla hodnocena pomocí Barrattovy stupnice impulsivity (BIS) (22). Měří se škály Behavioral Inhibition System (BInS) a Behavioral Activation System (BAS), aby se vyhodnotila osobnostní dimenze (23). Kritéria pro vyloučení zahrnovala minulé nebo současné závažné lékařské poruchy (např. Diabetes mellitus), neurologické poruchy (např. Záchvaty, poranění hlavy), psychiatrické poruchy (např. Velká depresivní porucha, úzkostné poruchy), mentální retardace nebo jakékoli zneužívání návykových látek (např. , tabák, konopí, alkohol). Obecné charakteristiky studovaných subjektů jsou shrnuty v tabulce Table1.1. Tato studie byla schválena Institucionální revizní radou Korejské lékařské fakulty katolické univerzity (MC16SISI0120). Všichni účastníci a jejich rodiče dali písemný informovaný souhlas.
Tabulka 1
Obecná charakteristika studovaných předmětů.
| objev | Potvrzení | Kombinovaný | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ovládání | IGD | P-hodnota | ovládání | IGD | P-hodnota | ovládání | IGD | P-hodnota | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Věk (let) | |||||||||
| Medián (min – max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Týdenní internetové herní hodiny (h) | |||||||||
| Medián (min – max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E - 6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E - 5a |
| Měsíční příjem domácnosti (milion KRW) | |||||||||
| Medián (min – max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Vzdělání (roky) | |||||||||
| Medián (min – max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: návrh bloku | |||||||||
| Medián (min – max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: slovní zásoba | |||||||||
| Medián (min – max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Medián (min – max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E - 6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E - 5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E - 10a |
| BIS | |||||||||
| Medián (min – max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Medián (min – max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| BInS | |||||||||
| Medián (min – max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, pacienti s poruchou internetového hraní; KS, korejská stupnice závislosti na internetu; BIS, Barrattova stupnice impulsivity; BAS, Behavioral Activation System; BInS, Behavioral Inhibition System; KRW, korejský Won.
aP <0.05 (Mann – Whitney – Wilcoxonův test).
Experimenty s miRNA Array (TLDA) s nízkou hustotou TaqMan
Od každého účastníka byla odebrána periferní krev a přenesena do laboratoře v 4 h, aby se minimalizovala lýza krevních buněk. Vzorek byl odstředěn při 3,000 rpm po dobu 10 min. Při pokojové teplotě. Poté byl odebrán supernatant (plazmová vrstva) bez kontaminace krvinek. Cirkulační miRNA byly extrahovány za použití TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, smíchalo se 50 ul vzorku plazmy a 100 ul ABC pufru. Po hybridizaci s cílově specifickými anti-miRNA magnetickými kuličkami byly z perliček eluovány ohraničené cirkulující miRNA 100 ul elučního pufru. Ve fázi objevu byly miRNA 381 zkoumány ze vzorků plazmy 51 (kontroly 25 IGD a 26) s použitím purifikační soupravy TaqMan miRNA ABC (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) podle pokynů výrobce. Byly provedeny reverzní transkripční a pre-amplifikační reakce Megaplex za účelem zvýšení množství cDNA pro analýzu exprese miRNA pomocí megaplexPreAmp primerů Human Pool A a TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). TLDA panel A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) byl spuštěn na ViiA7 PCR systému v reálném čase (Thermo Fisher Scientific) pro vyhodnocení exprese miRNA. Nezpracovaná data byla zpracována za použití softwaru ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) pro stanovení hodnot Ct pro každou miRNA.
Analýza dat pro TLDA
Nejprve jsme měřili prahové cykly (hodnotu Ct) každé miRNA. miRNA s hodnotou Ct> 35 byly považovány za nedetekovatelné a byly vyloučeny z následné analýzy. Všechny hodnoty Ct byly normalizovány na hodnotu Ct miR-374b (hodnota ACt), jedné z nejstabilněji exprimovaných miRNA cirkulujících v lidské plazmě (24). Log2 poměr násobné změny (hodnota ACt) exprese byl vypočten s použitím průměrných hodnot kontrolních vzorků jako kalibrátoru v balíčku HTqPCR v Bioconductor (25). Relativní kvantifikace (RQ) každého cíle miRNA byla definována jako 2−ΔΔCt. Pro hypotetické testování rozdílu v expresi mezi dvěma skupinami jsme použili náhradní analýzu proměnných (SVA) k zachycení heterogenit, jako jsou šarže, v experimentech pomocí Sva balíček v Bioconductor (26). miRNA s a P-hodnota <0.05 byla považována za významně odlišnou mezi dvěma skupinami.
Analýza obohacení genové sady
Pro analýzu obohacení genové sady jsme použili ToppFun v ToppGene Suite (27) odvodit významně obohacenou genovou ontologii (GO) (28) výrazy, cesta a choroby. Jako vstup pro tento přístup jsme použili 1,230 predikované cílové geny kandidátních miRNA. Pathway analýza byla použita k nalezení významných cest predikovaných cílových genů podle KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP a MSigDBin v ToppGene drahách. Význam termínů funkčního obohacení byl stanoven na základě upraveného Bonferroni P-hodnota.
Kvantitativní reverzní transkripční PCR (qRT-PCR) Validace a replikace
Pro validaci miRNA 10, které byly odlišně exprimovány ve fázi objevu, byla provedena qRT-PCR s použitím testu TaqMan MicroRNA (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p # 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5; -002340p, #483; a miR-5-002338p, #652) a systém ViiA3 (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Deset nanogramů celkové RNA bylo převedeno na cDNA s prvním vláknem pomocí primerů specifických pro miRNA pomocí soupravy pro reverzní transkripci TaqMan MicroRNA (#002352, Life Technologies), následované PCR v reálném čase s TaqMan Probes. RQ každé miRNA byl definován jako 7−ΔCt, kde ΔCt je rozdíl v prahových cyklech pro dotyčný vzorek, normalizovaný proti endogenní miRNA (miR-374b-5p, #001319). Všechny PCR reakce byly provedeny trojmo a jejich Ct hodnoty byly zprůměrovány. Vypočítali jsme log2 poměr násobné změny (AACt) každé miRNA stejným způsobem jako v analýze založené na poli. Byl proveden neparametrický Mann – Whitney – Wilcoxonův test k testování rozdílů v hladinách exprese miRNA ve dvou skupinách s prahem P-hodnota 0.05.
Analýza Western Blot
Každý vzorek séra byl nejprve vyčerpán z top 14 vysoce hojných proteinů (albumin, imunoglobulin G, imunoglobulin A, serotransferrin, haptoglobin, alfa-1 antitrypsin, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, alfa-1 kyselý glykoprotein, imunoglobulin M, apolipoprotein A, apolipoprotein A , apolipoprotein A-II, komplement C3 a transthyretin) za použití kolony MARS-14 (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) před analýzou westernovým přenosem. Nenavázaná frakce získaná z kolony MARS-14 byla koncentrována za použití odstředivého filtru Amicon Ultracel-3 (mezní hodnota 3 kDa) a potom byla koncentrace proteinu stanovena pomocí metody kyseliny bicinchoninové. Stejná množství (od 10 do 30 ug) kontrolních a IGD vzorků séra byla separována na prefabrikovaném gelu 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, USA) a přenesena na polyvinyliden difluoridovou membránu. Dále byla membrána blokována v TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI, pH 7.5 a 0.05% Tween 20) 5% netučným sušeným mlékem při pokojové teplotě po dobu 30 min. Membrány pak byly inkubovány s primárními protilátkami proti DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) a CNR1 (1: 100, Santa Cruztechnology) , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) a PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) v TBS-T s 5 % netučného sušeného mléka při 4 ° C přes noc a poté s příslušnými sekundárními protilátkami buď hovězí anti-myš (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) nebo kozí anti-králík (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA) ) konjugovaný na křenovou peroxidázu při teplotě místnosti po dobu 1 h. Detekce signálu byla provedena pomocí chemiluminiscence s ECL činidlem (GE zdravotnictví, Piscataway, NJ, USA). Kvantifikovali jsme výsledky westernového přenosu pomocí analytického softwaru TotalLab 1D (nelineární dynamika, Newcastle upon Tyne, Velká Británie). Potom byla hodnota denzitometrického poměru vypočtena vydělením hodnoty denzitometrie každého vzorku, jak je popsáno jinde (29). Jako kontrola normalizace byl pro každý experiment použit vzorek séra shromážděný z 46 IGD a kontrolní vzorky. Statistická významnost byla stanovena pomocí neparametrického Mann-Whitney-Wilcoxonova testu s prahem P-hodnota 0.05.
výsledky
Charakteristika studijních předmětů
Demografické a klinické rysy studovaných subjektů jsou uvedeny v tabulce Table1.1. Když jsme porovnávali IGD a kontrolní skupiny podle korejské stupnice závislosti na internetu (K-Scale) jak je popsáno jinde (20, 30), skupina IGD vykázala výrazně vyšší střední hodnotu K-Scale než kontrolní skupina (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Stůl (Table1) .1). Medián týdenního času stráveného na internetových hrách ve skupině IGD byl výrazně delší než u kontrol (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Zatímco mezi dvěma skupinami nebyl významný rozdíl ve věku, měsíčním příjmu domácnosti, délce vzdělávání, designu bloků a nejjemnějších výsledcích slovní zásoby K-WISC, BIS, BInS a BAS.
Diferenciálně exprimované miRNA mezi IGD a kontrolami
Abychom objevili miRNA spojené s IGD, přijali jsme přístup založený na dvou krocích (objev a nezávislá validace). Návrh studie a celková strategie jsou ilustrovány na obrázku S1 v doplňkovém materiálu. Ve fázi objevu jsme analyzovali expresní profily miRNA vzorků 51 (25 IGD a 26 kontroly) pomocí pole miRNA obsahujícího 384 miRNA. Bylo zjištěno, že úrovně exprese miRNA 10 jsou významně odlišné mezi IGD a kontrolními skupinami (tabulka č (Table2) .2). Relativní úrovně exprese těchto 10 miRNA jsou ukázány na obrázku Obrázek1.1. Mezi nimi byly dva (hsa-miR-423-5p a hsa-miR-483-5p) regulovány a osm (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p-125p-5 hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411c-5p, hsa-miR-652-3p a hsa-miR-XNUMX-XNUMXp) byly downregulované v IG.
Tabulka 2
Diferenciálně exprimované mikroRNA (miRNA) a násobné změny.
| miRNA | objev | Potvrzení | Kombinovaný | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-hodnota | Skládací změna | P-hodnota | Skládací změna | P-hodnota | Skládací změna | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNAs se významně měnily konzistentně v detekčních i validačních sadách.
qRT-PCR Validace kandidátních miRNA
K ověření platnosti miRNA pro 10 jsme provedli qRT-PCR s nezávislou validační sadou (20 IGD a 16 kontroly) (tabulka S1 v doplňkovém materiálu). Tři z těchto miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p) byly významně sníženy ve skupině IGD validační sady (tabulka) (Table2) .2). Tři další miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b a hsa-miR-423-5p) byly také downregulovány ve skupině IGD, ale ne významně. Zbylé čtyři miRNA (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p a hsa-miR-423-5p) byly vyjádřeny opačně v ověřovací sadě. Když jsme kombinovali zjišťovací a ověřovací sady (celkem 45 IGD subjektů a 42 kontrol), byly tři validované miRNA trvale významné (tabulka (Table2) .2). Podrobné informace, umístění chromozomů, zralé sekvence a úrovně exprese v CNS těchto tří miRNA jsou k dispozici v tabulce S2 v doplňkovém materiálu.
Synergický účinek současné změny tří miRNA na riziko IGD
Pro vyhodnocení kombinovaného účinku tří miRNA jsme pozorovali pravděpodobnostní poměry (OR) čtyř podskupin (s 0, 1, 2 nebo 3 změnami miRNA). Změna miRNA byla definována hodnotou RQ, jak je popsáno v části „Materiály a metody. “Protože všechny tři miRNA markery byly downregulovány ve skupině IGD, miRNA, jejíž hodnota RQ byla pod jednou, byla odchycena jako pozměněná. Podrobné informace o RQ hodnotě každého studovaného subjektu pro tři miRNA jsou k dispozici v tabulce S3 v doplňkovém materiálu. Pro každou podskupinu byly šance vypočteny jako poměr počtu kontrol k počtu IGD, pak byl každý OR vypočten vydělením šancí každé podskupiny pravděpodobnostmi podskupiny bez jakýchkoli změn miRNA. Jedinci se třemi změnami miRNA vykazovali riziko 22krát vyšší než u lidí bez jakékoli změny miRNA (NEBO 22, 95% CI 2.29 – 211.11). OR vykazovaly rostoucí trend s počtem pozměněných miRNA z 0 na 3 (r2 = 0.996) (Obrázek (Obrázek 22).
GO a Pathway analýza cílových genů kandidátních miRNA
Abychom získali přehled o funkcích tří miRNA markerů výrazně snížených ve skupině IGD, byly jejich cílové geny predikovány pomocí databáze miRWalk 2.0 (31). Celkem 1,230 genů bylo důsledně předpovídáno jako downstream cíle pomocí čtyř algoritmů (miRWalk, miRanda, RNA22 a Targetscan) pomocí databáze miRWalk (32-34(Tabulka S4 v doplňkovém materiálu). Analýza obohacení genových sad pomocí ToppFun v ToppGene Suite ukázala, že cílové geny těchto miRNA byly významně spojeny s nervovými vývojovými cestami, jako je „Axon navádění“ a GO termíny jako „neurogeneze“ (tabulka S5 v doplňkovém materiálu).
Vyjádření předpokládaných cílových genů
Mezi cílovými cílovými geny tří miRNA byl 140 předpovídán současně pro dvě nebo více miRNA (tabulka S4 v doplňkovém materiálu). Abychom prozkoumali, zda se jejich úrovně exprese proteinů downstream cílových genů liší mezi IGD a kontrolními skupinami, vybrali jsme geny 2 (DUSP4 a PI15), které jsou předpovídány jako downstream cíle všech miRNA 3 a dalších genů 3 (GABRB2, DPYSL2, a CNR1) od těch, které byly předpovězeny pro 2 miRNA, a provedly analýzu westernovým přenosem se vzorky plazmy z 28 IGD a 28 kontrol, které byly k dispozici pro experiment. Porovnávali jsme výrazy pěti cílů mezi IGD a kontrolními skupinami měřením intenzity pásma a oblasti, jak je popsáno jinde (29). Mezi nimi jsou úrovně exprese DPYSL2 (28 IGD a 28 kontroly, P = 0.0037) a GABBR2 (27 IGD a 28 kontrol, P = 0.0052) byly významně vyšší ve skupině s IGD (obrázek (Obrázek3) .3). Nedokázali jsme však pozorovat diferenciální výrazy CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) a PI15 (P = 0.6346).
Diskuse
Bylo popsáno, že miRNA jsou zapojeny do vývoje neuronů (35, 36) a diferenciální exprese mozkových miRNA je pozorována u psychiatrických onemocnění, jako je schizofrenie (37). Je proto pravděpodobné, že cirkulující miRNA profily by mohly být užitečnými biomarkery pro IGD. Cirkulační miRNA byly navrženy jako biomarkery pro různé neuropsychiatrické poruchy (38-40); molekulární mechanismy vývoje IGD jsou však stále z velké části neznámé, a to i přes svůj klinický a sociální význam. Konkrétně nebyly provedeny žádné studie miRNA spojených s IGD. Cíl této studie byl dvojí. Nejprve jsme se pokusili objevit plazmatické miRNA spojené s IGD. Za druhé, hodnotili jsme biologickou implikaci kandidátů miRNA zkoumáním exprese proteinu a GO downstream cílových genů. Skríningem expresních profilů miRNA v celém genomu a následnou validací kandidátů jsme zjistili, že exprese tří miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p) signifikantně nižší u pacientů s IGD než u kontrol. Ačkoli expresní vzorce dalších sedmi kandidátů miRNA nebyly při validaci replikovány, může to být falešně negativní kvůli malé velikosti vzorku v této studii. Pokud je nám známo, jedná se o první zprávu o možnosti, že expresní profily miRNA v krvi by mohly být užitečnými biomarkery pro IGD. Kombinace tří miRNA markerů by mohla sloužit jako minimálně invazivní nástroj pro včasnou identifikaci lidí ohrožených IGD.
Bylo popsáno, že miRNA identifikované v této studii se podílejí na různých neuropsychiatrických poruchách. Bylo hlášeno, že exprese hsa-miR-200c v krvi byla snížena u několika psychiatrických poruch, jako je schizofrenie (41) a velké depresivní epizody (42). Bylo prokázáno, že miR-200c je více exprimován v synaptických frakcích než v celkovém předním mozku (43) a také být spojen se smrtí neuronálních buněk (44). Na základě těchto předchozích zpráv je miR-200c zapojen do vývoje neuropatie a může být spojen s neuropsychiatrickými poruchami, pokud je jeho exprese narušena. Několik studií navrhlo souvislost mezi miR-652 a rizikem neuropsychiatrických poruch. Podobně jako v případě našeho přístupu k identifikaci biomarkerů krve u schizofrenie, Lai et al. provedli analýzu TLDA u pacientů se schizofrenií a normální kontroly a zjistili, že sedm miRNA včetně hsa-miR-652 bylo diferencovaně exprimováno u pacientů se schizofrenií (45). V následující studii navrhli predikční model využívající data exprese miRNA a úspěšně odlišili schizofrenii od normální kontroly (46). U alkoholiků byla pozorována také změněná exprese hsa-miR-652.47). Bylo zjištěno, že Hsa-miR-26b byl aktivován během diferenciace neuronálních buněk (48). Perkins a kol. uvádí, že hsa-miR-26b byl downregulovaný v prefrontální kůře schizofrenických pacientů (49).
Přestože neexistuje přímý důkaz podporující vztah mezi narušenou expresí těchto miRNA a patofyziologií IGD, můžeme odvodit, že dysregulace těchto miRNA může být spojena s patofyziologií IGD na základě různých předchozích zpráv o downstream genech, které jsme předpovídali . Některé z downstream genů tří miRNA, jako je GABRB2, CNR1, NRXN1, a DPYSL2 se uvádí, že jsou spojeny s neuropsychiatrickými poruchami. Kyselina gama-aminomáselná (GABA) je hlavním inhibičním neurotransmiterem v CNS. Dysregulace GABA receptoru se podílí na neuropsychiatrických poruchách včetně závislosti, úzkosti a deprese (50), které jsou také hlavními rysy IGD (8). Uvádí se, že genetické polymorfismy v GABA receptorových genech jsou spojeny se závislostí na alkoholu a schizofrenií (51, 52). Dihydropyrimidinázový 2 (DPYSL2) je členem rodiny proteinů zprostředkovatelů kolapsinové reakce, která hraje roli při sestavování mikrotubulů, synaptické signalizaci a regulaci růstu axonů. V důsledku toho byla tato molekula navržena jako biomarker psychiatrických poruch (53, 54). Polymorfismus v EU DPYSL2 gen byl také popisován být spojován s poruchou užívání alkoholu (55). Předchozí zprávy a naše data naznačují, že nadměrná exprese GABRB2 a DPYSL2, downstream cílů downregulovaných miRNA, má důsledky pro patogenezi neuropsychiatrických poruch včetně IGD. Kanabinoidní receptor typu 1 (CNR1) je presynaptický heteroreceptor, který moduluje uvolňování neurotransmiterů a poruchy kanabinoidní signalizace jsou spojeny s různými neuropsychiatrickými poruchami (56). Genetický polymorfismus CNR1 Je známo, že gen je spojen s látkovou závislostí u Kavkazanů (57). V modelu potkanů narušení aktivace ventrálního hipokampu CNR1 naruší normální sociální chování a kognitivní funkce (58). Je známo, že genetická změna v rodině NRXN se podílí na různých neuropsychiatrických poruchách včetně závislosti (59).
Pro přímější prozkoumání biologické implikace tří kandidátů na miRNA jsme zkoumali expresi proteinů jejich downstream cílových genů. Kvůli omezené dostupnosti vzorků plazmy, společných kandidátů 140 (předpovídaných jako downstream od 2 nebo více miRNA), jsme zkoumali cíle 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 a PI15) pomocí Western blotu a potvrdili jsme expresi GABXBUM a DPYSL2 byly významně vyšší ve skupině IGD. Předchozí zprávy a naše data naznačují, že nadměrná exprese GABRB2 a DPYSL2, downstream cílů downregulovaných miRNA, může mít důsledky pro patogenezi neuropsychiatrických poruch včetně IGD. Výsledky GO a analýzy dráhy nervových vývojových cest také podporují neurobiologické implikace markerů miRNA. Dalším zajímavým nálezem byl synergický účinek simultánní alterace miRNA. Jednotlivci s downregulací všech miRNA 2 vykazovali 3krát vyšší riziko než ti bez downregulace a OR se zvyšovaly v závislosti na dávce. Přestože CI pro tyto tři změny byly široké kvůli omezené velikosti vzorku, jasná pozitivní korelace (r2 = 0.996) podporuje synergický účinek tří miRNA.
Přestože jsme objevili markery miRNA spojené s IGD a jednotlivci se všemi třemi alteracemi miRNA měli riziko 22krát vyšší než ti bez jakýchkoli změn miRNA, v této studii existuje několik omezení. Za prvé, malá velikost vzorku zvýšila pravděpodobnost chybějících dalších významných miRNA markerů. Za druhé, protože naše data nestačila k objasnění toho, zda jsou profily miRNA v plazmě buď příčinou nebo účinkem, nemůžeme potvrdit biologické role těchto neinvazivních markerů v klinickém prostředí. Přímější odpověď může poskytnout další profilování miRNA a jejich následná genová analýza s použitím lidské mozkové tkáně z banky mozkové tkáně. Užitečná by byla také analýza mozkové tkáně se zvířecím modelem herní poruchy. Zatřetí, kvůli omezené dostupnosti vzorků plazmy jsme zkoumali pouze pět downstream kandidátních molekul. Pro další pochopení molekulárního mechanismu IGD bude užitečné prozkoumat více downstream cílů s větší sadou vzorků.
Stručně řečeno, skríningem genomových expresních profilů miRNA a nezávislou validací jsme objevili tři miRNA spojené s IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p). Uvádí se, že mnoho z jejich downstream genů je zapojeno do různých neuropsychiatrických poruch a experimentální validace pozměněné exprese těchto downstream genů podporuje implikaci miRNA identifikovaných v této studii. Zjistili jsme, že jedinci se sníženou regulací všech tří miRNA jsou vystaveni vysokému riziku IGD. Spolu se známými klinickými nebo environmentálními rizikovými faktory a diagnostickými kritérii mohou naše zjištění usnadnit včasný zásah a pomoci lidem s vyšším rizikem IGD.
Etické prohlášení
Tato studie byla schválena Institucionální revizní radou Korejské lékařské fakulty katolické univerzity (MC16SISI0120). Všichni účastníci a jejich rodiče dali písemný informovaný souhlas.
Autorské příspěvky
ML a HC přispěly k této práci stejně. Studii navrhly ML, D-JK a Y-JC. SJ, S-MC, YP, DC a JL prováděly experimenty a generovaly data. J-WC, S-HP, J-SC a D-JK odebraly vzorky krve a klinické informace. Data analyzovaná podle ML, HC, S-HY a Y-JC. Rukopisy popsaly ML, HC, S-HY a Y-JC. Y-JC dohlížel na projekt.
Prohlášení o konfliktu zájmů
Autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez obchodních či finančních vztahů, které by mohly být považovány za potenciální střet zájmů.
Poznámky pod čarou
Financování. Tato práce byla podpořena grantem z programu výzkumu mozku prostřednictvím Národní výzkumné nadace v Koreji (NRF), financovaného ministerstvem vědy a IKT a plánováním budoucnosti (NRF-2015M3C7A1064778).
Doplňkový materiál
Doplňkový materiál k tomuto článku je k dispozici online na adrese http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Reference
;
