Indian J Pharmacol. 2016 Jan-Feb; 48 (1): 53 – 58.
PMCID: PMC4778208
Abstraktní
Cíl:
Nucleus accumbens (NAcc) hraje roli v závislosti a požití. Za účelem posouzení orexinergního systému, který se na tom podílí, jsme infuzi antagonisty Orexinu A posoudili a ovlivnili příjem tekutin pro příjem potravy a preferenci alkoholu u potkanů Wistar.
Materiály a metody:
Inbrední krysy Wistar (n = 54) byly rozděleny do kontrolních a experimentálních skupin (nízká dávka a vysoká dávka). Použitím stereotaxické metody byla zavedena vodící kanyla na místě bilaterálně pro dosažení NAcc. Nízká dávka (3 ng) a vysoká dávka (6 ng) antagonisty Orexinu A (SB-334867) byla podána infuzí a v potravě byla provedena konzumace potravy, příjem vody a příjem alkoholu a dva preferované testy na výběr alkoholu bez alkoholu experimentální skupina. Kontrolní skupina obdržela infuzi fyziologického roztoku a zbytek následujících metod byl stejný. Měření byla prováděna okamžitě po infuzi, v 1 h, 2 h, 4 h, a celý den a znázorněna na obrázku a v tabulkách.
výsledky:
Ihned po infuzi 1u byl pozorován pokles příjmu vodyst h (P <0.05) a 2nd h (P <0.01), což bylo více ve skupině s vysokou dávkou ve srovnání s nízkou dávkou a kontrolami. Stejný vzorec sledoval také příjem alkoholu. Při volbě dvou lahví krysy nevykazovaly žádnou konkrétní preferenci vůči alkoholu.
Závěr:
U léčených potkanů došlo ke snížení příjmu potravy a tekutin v závislosti na dávce. To naznačuje možnou roli orexinergního systému při požití. Orexin A však nemusí hrát roli v modulaci závislosti na alkoholu prostřednictvím odměnovacího centra NAcc.
Úvod
accumbens (NAcc) je známo, že ovlivňuje požité chování a závislost na látkách. [1,2] Bylo také zapojeno do odměny a motivace. [3] V NAcc byly popsány dva odlišné podoblasti a ve fungování těchto dvou oblastí došlo k velkému překrývání. [4Mikroinjekce návykových látek do NAcc ukázala na dávce závislé zvýšení hladin dopaminu. Dopamin je neurochemikum zapojené do obvodů odměňování. Intranukleární sebepodávání amfetaminu ukázalo zvýšený pocit odměny. [5] Ostatní části subkortikální oblasti také ovlivňují požité chování, které může být úzce spojeno s accumbens. Ukázalo se, že příjem potravy a příjem vody je ovlivňován několika částmi bazálního mozku, jako je laterální hypotalamus, [6] paraventrikulární jádro, septum pellucidum, [7] a basolaterální amygdala. [8] V regulaci požitého chování existuje rozsáhlá nervová síť. Ukázalo se, že NAcc je dobře napojen na hlavní subkortikální centra, jako je ventrální tegmentální oblast (VTA);9] basolaterální amygdala a další centra. [10] Hlavní neurotransmitery podílející se na modulaci příjmu alkoholu, odměny a příjmu potravy byly hlášeny z nervových obvodů v této oblasti. [11]
Nedávno byly hypokretiny, skupina heterogenních peptidů, identifikovány z hypotalamu, hypokretinu 1 a 2 (Orexin A a B), peptidů majících 32 aa resp. 29 aa. [12Původně byly tyto látky zapojeny do regulace spánkového probuzení, což dokládá zvýšený Orexin A nalezený v hypotalamu během aktivní fáze bdělosti. [13V naší laboratoři jsme zjistili, že Orexin A při vstřikování do NAcc zvýšil příjem potravy a tekutin. [14] Centrálně podávaná orexinová protilátka inhibuje příjem potravy v závislosti na dávce u krys 24 h na lačno a intraperitoneální podávání orexinové protilátky nedokázalo potlačit spotřebu potravy, což představuje, že orexinová protilátka působí v centrálním nervovém systému, ale nikoli v periferní tkáni. [15] Dále potvrdili, že endogenní orexiny mají fyziologickou roli při stravování. Ačkoli zpočátku byly Orexiny předpokládány, že ovlivňují požité chování, důkazy o roli Orexinu A v chování při krmení a příjmu alkoholu a také preferování alkoholu jsou povrchní. V naší předchozí studii jsme prokázali, že Orexin A zvýšil příjem potravy a tekutin u hladovějících krys. [14] Abychom jednoznačně objasnili roli Orexinu A v požití, provedli jsme tuto sadu experimentů na samcích potkanů Wistar, kteří se nechali přes noc, infuzí antagonisty Orexinu A SB-334867 do NAcc. [16] Rovněž jsme testovali preference alkoholu u léčených potkanů, abychom objasnili účinek antagonisty Orexinu A na příjem alkoholu. Zde jsou diskutovány výsledky experimentů týkajících se příjmu potravy, vody a alkoholu a preference alkoholu.
Materiály a metody
Padesát čtyři samců krys albínů Wistar (n = 54) vážení (250 ± 10 g), 3-4 měsíce staré byly vybrány pro studii. Byly rozděleny do tří skupin viz. Vodní skupina, alkoholová skupina a dvě láhve zdarma výběrová skupina (n = Každý 18). Byly rozděleny do tří podskupin, viz. Skupina 1 - Kontrola (infuze solného roztoku); Skupina 2 - Nízká dávka SB-334867 (3 ng); Skupina 3 - Vysoká dávka SB-334867 (6 ng, n = 6 každý). Jídlo a tekutina byla poskytována všem skupinám ad lib, s výjimkou případů, kdy je uvedeno pro půst přes noc.
Všechna zvířata byla chována jednotlivě v polypropylenových klecích, se správnou loupanou postelí a udržována v cyklu 12-h světlo / tma v prostředí s kontrolovanou teplotou. Zvířata byla chována podle pokynů výboru za účelem kontroly a dohledu nad experimenty na zvířatech a podle pokynů vlády Indie pro použití laboratorních zvířat. Institucionální etická komise pro zvířata schválila tento studijní protokol.
Drogy a přístroje
Solný 0.9%, SB-334867 (od: Tocris bioscience) byl rozpuštěn v 2% cyklodextranu ve sterilní vodě. Pokud se nepoužívaly, byly roztoky skladovány při 4 ° C až 3 týdnů. K dodání léčiva byla použita infuzní pumpa Harvard Pico plus (USA). Voda z vodovodu byla dodána v plastových nápojových lahvích a byly poskytnuty potravinové pelety potkanů (Hindustan Unilever Ltd.). Byl získán ethylalkohol (Absolute) (Hayman Ltd., Eastways Park, Witham, Essex, CM83YE, Velká Británie) a zředěn na výrobu alkoholu 10% (Tato koncentrace byla vybrána na základě pilotní studie o preferenci koncentrace alkoholu) . Pro anestezii byly použity ketamin (NEON Laboratories limited, Thane, MS) a xylazin (Indian imunological Ltd., Hyderabad).
Chirurgický zásah
Samci potkanů albínů Wistar se anestetizovali injekcí směsi ketamin hydrochloridu (60 mg / kg), xylazin hydrochloridu (6 mg / kg) a namontovali se na stereotaxický přístroj (Inco, Indie). Na pokožce hlavy byl proveden řez, který byl důkladně dezinfikován chirurgickým duchem. Tato oblast byla očištěna bavlnou a peroxidem vodíku. Souřadné body byly označeny na lebce v odpovídajících oblastech tak, aby dosáhly NAcc, s odkazem na mozkový atlas Paxinos a Watsona [17] (Z Bregma: Anteroposterior + 2.2 mm, laterální ± 1 mm a vertikální 7.4 mm). Byla vyrobena otřepová díra a vodicí kanyla z nerezové oceli (gáza 22) byla implantována podle stereotaxických souřadnic. Jakmile je kanyla na svém místě, je zajištěna pomocí šroubů a dentálního akrylu. Vodicí kanyla byla vybavena styletem a krysy byly ponechány zotavit se alespoň 7 dní před experimentováním. Infuzní kanyla (vnitřní kanyla) byla vyrobena z dentální jehly z nerezové oceli Septoject z měřidel 30, která má náboj vhodný pro manipulaci. [18] Infuzní kanyla přesahuje 1 mm za příslušnou vodicí kanylu. Před zahájením experimentů všechny krysy podstoupily dvě tréninková cvičení, ve kterých byly drženy na půstu 24 h a poté dostávaly jídlo, vodu a 10% alkohol. Během této relace se krysy naučily půst.
Experimentální procedura
Normální fyziologický roztok a SB-334867 (ve dvou dávkách) byly infundovány do samostatných skupin potkanů po 24 h půstu; neestetizované (volně se pohybující) krysy zajištěnou vodicí kanylou. Infuze byla prováděna injekční stříkačkou 10 μl Hamilton spojenou s polyetylenovou trubicí a vnitřní kanylou. Tato stříkačka byla namontována na Harvardovo čerpadlo. Poté byl odstraněn mandrén ve vodicí kanyle. Vnitřní kanyla byla vložena do vodicí kanyly a zajištěna. Poté se pumpa začala dodávat roztok na pravou a levou stranu NAcc jeden po druhém, 1 μl / min (po infuzi se vnitřní kanyla nechala asi 10 s, aby se umožnila difúze léčiva). Dvě dávky SB-334867 byly infundovány v 3 ng (nízká dávka) a 6 ng (vysoká dávka). Na konci infuze byla vnitřní kanyla odstraněna a stylet byl umístěn zpět na místo a byl zaznamenán čas. Po infuzi bylo v příslušných skupinách poskytnuto bezprostředně předem odměřené množství jídla, vody a 10% alkoholu. Účinek SB-334867 na spotřebu byl měřen a zaznamenán pečlivě v časových intervalech infúze 1, 2, 4 a 24 h. Zbyly pelety, voda a alkohol byly odstraněny a vypočteno spotřebované množství (spotřebované množství = předběžné množství - zbylé množství nad množství, např. Na konci 1 h).
Po dokončení studie byly krysy usmrceny smrtící dávkou anestézie a mozek byl vyříznut a uchován pro histologické zpracování. Sedm mikronových řezů bylo nakrájeno na plátky a obarveno krezylovou fialovou k potvrzení místa infúze [Obrázek 1].
Statistická analýza
Analýza dat byla provedena pomocí statistického softwaru SPSS verze - 16 (SPSS pro Windows, verze 16.0. Chicago, SPSS Inc. USA); byla provedena jednosměrná ANOVA pro srovnání konzumního chování mezi skupinami. Interní srovnání provedl post-hoc Tukeyho test (hodinová spotřeba porovnána samostatně, např. 1 h kontrolní příjem potravy vs. 1 h SB-334867 ošetřený příjem potravy). Data byla vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru P <0.05, byla považována za významnou.
výsledky
Experiment I
Byla měřena spotřeba potravin a vody (n = 18) v této skupině zvířata kanylovaná NAcc (n = 18), byly rozděleny do podskupin, skupina 1 (0.9% infuze fyziologického roztoku), skupina 2 (SB-334867-3 ng), skupina 3 (SB-334867-6 ng). Léky byly vstříknuty bilaterálně do NAcc [Data ukázaná v Tabulka 1 a Obrázek Figure1a, 1a, , Bb].
Příjem potravy
Ve srovnání s kontrolou v 1 h po ošetření SB-334867em došlo k významnému poklesu (F [2, 15] = 9.171 p = 0.003) v příjmu potravy (tj. Skupina 1 vs. skupina 3, p <0.002); zatímco po 2 hodinách nebyla zaznamenána žádná významná změna (F [2, 15] = 0.190 p = 0.829); 4 h (F [2, 15] = 0.160 p = 0.854); 24 h postinfúzní časové intervaly (F [2, 15] = 4.873 p = 0.023) (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.028; Skupina 2 vs. Skupina 3, p <0.05).
Příjem vody
Ošetření SB-334867em neprokázalo žádný účinek na příjem vody při 1 h (F [2, 15] = 0.957 p = 0.406); 2 h (voda 2 h F [2, 15] = 0.773 p = 0.479); 4 h (F [2, 15] = 0.288 p = 0.753) postinfúzní časové intervaly; ale celkový příjem vody 24 h byl snížen (F [2, 15] = 10.688 p = 0.001) ve srovnání s kontrolou (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.002; Skupina 2 vs. Skupina 3, p <0.006).
Pokus II
Byl měřen alkohol (10%) a spotřeba potravin [n = 18, data v Tabulka 2 a Obrázek 2].
NAcc kanylované krysy byly rozděleny do tří podskupin, skupina 1 (0.9% solný roztok) n = 6), skupina 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) a skupina 3 (SB-334867-6 ng, n = 6).
10% příjem alkoholu
Při léčbě 1 ha 2 h SB-334867 významně oslabila konzumace alkoholu v 1st h (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030), (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.004), 2nd h (F [2, 15] = 11.122 p = 0.001) (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.001; Skupina 2 vs. Skupina 3, p <0.038). Ve 4 hodinách však nedošlo k žádné významné změně v konzumaci alkoholu (F [2, 15] = 0.709 p = 0.508) a 24 h (F [2, 15] = 2.631 p = 0.105) intervaly.
Příjem potravy
Při léčbě 1 ha 2 h SB-334867 významně (F [2, 15] = 4.230 p = 0.035) oslabený příjem potravy (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.03); (F [2, 15] = 16.558 p = 0.000) (skupina 1 vs. skupina 2, p <0.000; Skupina 2 vs. Skupina 3, p <0.021), ve srovnání s kontrolou. Po 4 hodinách nebyly zaznamenány žádné významné změny (F [2, 15] = 0.070 p = 0.933). Zatímco celkový příjem potravy byl snížen (0 – 24 h) (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030) (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.025).
Pokus III
Jídlo, 10% alkohol a voda [dvě láhve, Tabulka 2] byla měřena spotřeba. NAcc kanylované krysy byly rozděleny do skupiny 1 (0.9% fyziologický roztok, n = 6), skupina 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) a skupina 3 (SB-334867-6 ng, n = 6), byly injikovány.
Příjem potravy
Ošetření SB-334867 při 1 h (F [2, 15] = 5.111, p = 0.02) oslabený příjem potravy (skupina 1 vs. skupina 3, p <0.011), ale nebyl pozorován žádný významný rozdíl po 2 h, 4 h (F [2, 15] = 0.093 p = 0.911), (F [2, 15] = 0.797 p = 0.469), a v 24 h obě dávky antagonisty vykázaly snížení příjmu potravy (F [2, 15] = 12.698 p = 0.001) (skupina 1 vs. skupina 2 a skupina 3, p <0.039, p <0.000) ve srovnání s kontrolní skupinou.
Příjem vody
Ošetření SB-334867 nezpůsobilo žádnou změnu příjmu vody v žádné skupině s časovým intervalem v 1 h (F [2, 15] = 0.584 p = 0.578), 2 h (F [2, 15] = 0.662 p = 0.530), 4 h (F [2, 15] = 1.655 P = 0.224) a 24 h (F [2, 15] = 0.513 p = 0.609).
Alkohol (10%) příjem
Ošetření SB-334867 oslabilo příjem alkoholu při 1 h (F [2, 15] = 9.098 p = 0.003), (skupina 1 vs. skupina 2 a skupina 3, p <0.004, p <0.008). Žádná významná změna v žádné skupině po 2 hodinách (F [2, 15] = 0.854 p = 0.446), 4 h (F [2, 15] = 0.931 p = 0.416) a 24 h (F [2, 15] = 0.349 p = 0.711).
Celkový příjem tekutin
V 1 nedošlo k žádné významné změně v žádné ze skupinst h (F [2, 15] = 2.064 p = 0.161), 2nd h (F [2, 15] = 1.023 p = 0.383), 4th h (F [2, 15] = 1.205 p = 0.327) a 24 h (F [2, 15] = 0.484, p = 0.626).
Diskuse
Byla zkoumána modulace příjmu potravy a vody různými neurochemikály. Mezi několik kandidátních molekul, u nichž bylo prokázáno, že ovlivňují chování při krmení, včetně příjmu alkoholu, jsou zahrnuty také Orexiny. [19] Orexiny byly původně považovány za stimulanty příjmu potravy a regulaci požití; později bylo zjištěno, že ovlivňují spánek a bdělé stavy. [20] Dube et al. prokázali, že centrální podávání Orexinů má modulační roli při požití, primárně se zaměřuje na hypotalamus. [21] V našem současném experimentu jsme testovali účinek antagonistu Orexinu A (SB-334867) na NAcc. NAcc má klíčovou roli v činnostech souvisejících se závislostí a krmením. [22Orexiny byly také zapojeny do zprostředkování tohoto působení NAcc. [4] NAcc však vykazoval dva histologicky odlišné okresy, [23] které mohou mít funkční rozdíly [24] a jejich funkce se zdály výrazně překrývat. [25] V našich předchozích experimentech jsme zjistili, že infuze Orexinu A do NAcc pomocí mikroinjekční techniky zvýšila příjem potravy a vody v hodinách bezprostředně po infuzi, ale při testování metodou dvou lahví bez volby neexistovala žádná zvláštní preference vůči alkoholu. [14] Pokusili jsme se tedy injikovat antagonistu Orexinu A do NAcc a analyzovali příjem potravy, příjem vody a příjem alkoholu u potkanů, kteří byli přes noc nalačno.
Spotřeba v 1st u zvířat léčených antagonistou orexinu významně poklesl. Naše studie dále prokazuje roli Orexinu A v chování při krmení. Antagonista receptoru Orexinu typu 1 (OX1R) SB-334867 infuze tlumí krmení a pití. Orexin A trvale vykazoval stimulační účinek na krmení a pití. Antagonista OX1R má 10krát větší afinitu k Orexinu A než B. [26,27]
Orexinergní neurony se promítají do AccSh a oba receptory orexinu (OX1R a OX2R) jsou přítomny v NAcc, přičemž OX2R je exprimován ve větší míře. [28,29] Orexin A zvýšil izolované GABAergické proudy a snížil N-methyl-D-aspartátové proudy v izolovaných neuronech accumbens. [30] Navíc orexiny excitují dopaminergní neurony VTA. [31] Protože dopaminergní neurony VTA inervují a excitují AccSh GABAergické (inhibiční) neurony, signalizace orexinu by mohla dále zvýšit lokální inhibici v Acc zvýšením neuronální aktivity ve VTA, což by mělo za následek další zlepšení konzumního chování. Ale Baldo a Kelley tomu odporovali [32] kteří nezjistili žádný účinek na krmení nebo pohybovou aktivitu s intra-AccSh Orexinem A.
Testovali jsme možnost, že by Orexin A působil jako modulátor konzumace alkoholu [Tabulka 2] spolu s jídlem. Z naší předchozí studie jsme zjistili, že krysy dávají přednost konzumaci alkoholu v roztoku 10%, což bylo potvrzeno v naší předchozí předchozí studii. [33] Proto jsme v této studii poskytli alkohol v tomto ředění po infuzi léčiva do NAcc. Zjistili jsme významné snížení příjmu alkoholu v hodinách bezprostředně po infuzi antagonisty Orexinu A. Pokles příjmu potravy a vody byl ve skupině s nízkou dávkou (3 ng) nižší, zatímco ve skupině s vysokou dávkou (6 ng) byl vyšší. Za účelem testování preference alkoholu jsme potkanům poskytli dvě podmínky pro výběr láhve, přičemž jedna láhev vody a druhá obsahující 10% alkoholu byly dodány současně. Po infuzi antagonisty Orexinu A došlo k významnému poklesu příjmu potravy a alkoholu. Tento typ poklesu byl zjištěn jak v nízké, tak ve vysoké dávce, ale omezen na 1st h po infuzi. Pokles příjmu potravy byl však výraznější ve srovnání s vodou nebo alkoholem. Tento důkaz podporuje zapojení Orexinu A do regulace buď příjmu potravy, ale nepodporuje možnost zapojení Orexinu A při upřednostňování alkoholu.
Finanční podpora a sponzorství
Oddělení biotechnologie, část projektu financovaného DBT, Ref: Ref: Ref: BT / PR14012 / MED / 30 / 315 / 2010 ze dne 30.09.2010 Indická vláda.
Střet zájmů
Nejsou zde žádné střety zájmů.
Poděkování
Autoři jsou vděční ministerstvu biotechnologií, indické vládě, za finanční podporu. Kasturba Medical College, Mangalore, Manipal University.
Reference