Hypocretin (orexin) usnadňuje odměnu tím, že zmírňuje protizánětlivé účinky jeho cotransmiterového dynorfinu v ventrální tegmentální oblasti (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecká,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b a William A. Carlezon, Jr.^a

Informace o autorovi ► Autorská a licenční informace

Hypocretin (orexin) a dynorfin jsou neuromodulátory, které hrají důležitou roli při regulaci vlivu a motivace. Orexin je rozhodující pro odměnu a je zapojen do hledání léků, zatímco dynorphin zprostředkovává negativní náladu a je zapojen do depresivních stavů. S ohledem na tyto protichůdné účinky jsou zprávy, že oba peptidy jsou exprimovány ve stejných neuronech a jsou Coreleased, kontraintuitivní. Zde demonstrujeme, že orexin a dynorfin jsou koexprimovány ve stejných synaptických váčcích a že tato kolokalizace má hluboký vliv na odměnu, užívání drog a impulzivní chování. Skutečnost, že orexin vylučuje depresivní antirewardové účinky dynorphinu, výrazně mění způsob, jakým vnímáme funkční roli orexinu v mozku.

Hypocretin (orexin) a dynorphin jsou neuropeptidy s opačným působením na motivované chování. Orexin se podílí na stavech vzrušení a odměny, zatímco dynorphin se podílí na depresivních stavech. Ukazujeme, že navzdory jejich protichůdným účinkům jsou tyto peptidy baleny ve stejných synaptických váčcích v hypotalamu. Přerušení funkce orexinu otupuje blahodárné účinky laterální hypotalamické (LH) stimulace, eliminuje kokusem indukovanou impulsivitu a snižuje vlastní podávání kokainu. Současné narušení funkce dynorfinu zvrátí tyto změny chování. Ukazujeme také, že orexin a dynorfin mají protichůdné účinky na excitabilitu dopaminových neuronů ventrální tegmentální oblasti (VTA), prominentní cíl neuronů obsahujících orexin a že antagonismus orexinů uvnitř VTA způsobuje snížení samopodávání kokainu a autostimulace LH které jsou zvráceny antagonismem dynorphinu. Naše zjištění identifikují jedinečný buněčný proces, pomocí kterého může orexin uzavřít účinky zvyšování prahu odměny u coreleased dynorphinu a tím působit permisivně, aby usnadnil odměnu.

Orexin a dynorphin jsou Cotransmitters.

Pomocí fluorescenční mikroskopie jsme potvrdili koexpresi orexinu a dynorphinu ve stejných neuronech myší laterální, perifornální a dorzomediální hypotalamu.18) (Obr. 1A). Existence neuronů, které exprimují více vysílačů, byla popsána v jiných mozkových obvodech a může představovat nervový základ pro filtrační mechanismy, kterými dochází k uvolňování koexpresovaných neurotransmiterů při různých rychlostech střelby (19). Pomocí EM jsme však zjistili, že orexin a dynorfin jsou kolokalizovány ve stejných synaptických váčcích. Většina případů společného balení byla pozorována v nemyelinizovaných varikózních axonálních procesech, kde bylo imunooznačení nalezeno ve vesikulách nebo v jejich blízkosti. V těle neuronálních buněk byla signifikantní značení spojena s komplexem Golgiho, zatímco žádné nebylo nalezeno v sousedních jádrech (Obr. 1 B a C). Dendrity také obsahovaly značení spojené s vezikuly pro oba peptidy, což naznačuje potenciální dendritické uvolňování těchto vysílačů. Malý počet mikrostrukturálních profilů zachytil terminály axonů se značením pro oba peptidy umístěné ve velkých (∼100 nm) vesikulech umístěných mimo uvolňovací zónu asymetrických synapsí (Obr. 1 B a C), poskytující podporu k závěru, že orexin a dynorphin fungují jako ko-vysílače a že za normálních podmínek jsou uvolňovány společně spíše než diferencovaně jako funkce frekvence vypalování buněk.

 

Obr. 1.

Orexin a dynorfin jsou kotransmitery v neuronech hypotalamu. (A, Daleko vlevo) Mikrofotografie s jasným polem ukazuje plochu hypotalamu vyšetřenou na imunoreaktivitu orexinu (červená) a dynorphinu (zelená). (A, zcela vpravo) Sloučený dvoukanálový obraz ...

Účinky Orexinové blokády na zvýšení prahové hodnoty jsou potlačeny Dynorphinovou blokádou.

Abychom prozkoumali funkční význam tohoto jedinečného vzorce exprese vysílače, zkoumali jsme, zda narušení signalizace orexinu a dynorphinu může ovlivnit komplexní chování, které odráží normální a aberantní motivaci. U C57BL / 6 myší trénovaných k provádění intrakraniální autostimulace (ICSS) posílené laterální hypotalamickou (LH) stimulací (20), blokáda OX₁Rs N- (2-methyl-6-benzoxazolyl) -N '-1,5-naftyridin-4-ylmočovinou (SB334867) během světelné fáze způsobil na dávce závislé zvýšení prahů odměny (Obr. 2A; jednosměrná opakovaná měření ANOVA pro dávku: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Zvýšení prahových hodnot ICSS odráží snížení účinků stimulace vyvolané léčbou, což je depresivní známka svědčící o snížené citlivosti na odměnu (20). Tento účinek nebyl způsoben sedací nebo jinými nespecifickými poruchami chování, protože míra odezvy ICSS nebyla ovlivněna (Obr. 2B; jednosměrná opakovaná měření ANOVA pro dávku: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Obr. 2.

Účinky blokování orexinu na zvýšení prahu jsou zvráceny blokádou dynorphinu. (A) Blokování signalizace orexinu v OX₁R by SB334867 (0 – 30 mg / kg, ip) zvyšuje prahové hodnoty odměny v testu ICSS, což ukazuje na sníženou odměnu. Tento efekt ...

Zvýšení prahů odměny způsobených SB334867em bylo zabráněno předběžnou léčbou norbinaltorfiminem (norBNI) [obousměrná opakovaná měření ANOVA pro interakci lék (mezi subjekty) × dávka SB (v rámci faktoru subjektů): F_3,24 = 3.98, P <0.01], což produkuje dlouhotrvající blokádu účinků dynorphinu v KOR (10). Tato data naznačují, že ztráta signalizace orexinu odhaluje latentní protirezistentní účinky coreleased dynorphin. Samotná správa norBNI nesnížila odměny. Ačkoli tento účinek může souviset s jedinečnou farmakodynamikou norBNI a dalších prototypových antagonistů KOR (10), může také naznačovat, že dochází k redundanci v procesech, které modulují aktivitu obvodů odměňování mozku nebo že fázové zvýšení samotného orexinového tónu (neotevřeného korelurovaným dynorfinem) nestačí k přenosu odměnového signálu ze stimulačního místa v laterálním hypotalamu. Tato zjištění se mohou nejprve zdát neslučitelná s prací jiných, kteří zkoumali SB334867 na prahu ICSS během temné fáze (21). Existuje však značný důkaz, že snížení funkce orexinu může mít důsledky, které závisí na tom, zda jsou zvířata testována během jejich světelné nebo temné fáze. Například jídlo a voda si zachovávají své prospěšné účinky u myší s orexinem KO, když se testování provádí během temné fáze, ale ne během světelné fáze (22), kdy jsme provedli všechny naše behaviorální testování.

Pro lokalizaci účinků systémového podávání SB334867 a norBNI na ICSS byla do samostatné kohorty myší implantována LH stimulační elektrody a vodící kanyly VTA. Mikrosinfekce SB334867 do VTA způsobila výrazné zvýšení prahů odměny, což ukazuje na sníženou citlivost odměny. I když intra-VTA norBNI samotný neměl žádný účinek na prahové hodnoty ICSS, blokoval prahové zvýšení účinků následné infúze SB334867 (Obr. 2C; jednosměrná opakovaná opatření ANOVA pro Drug: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Ačkoli intrakraniální infuze léků vedly k mírnému snížení maximální míry odpovědi ve srovnání se systémovými injekcemi drog, tyto účinky nedosáhly statistické významnosti (Obr. 2D; jednosměrná opakovaná opatření ANOVA pro Drug: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulzivita regulovaná přenosem orexinu a dynorphinu.

Impulzivita je charakterizována nedostatky v potlačení chování při hledání odměn, přičemž vysoká úroveň impulsivity je běžným rysem mnoha psychiatrických chorob (23). Drogy zneužívání, včetně kokainu, mohou také vyvolat zvýšení impulzivity, což je hypotéza, která řídí vývoj závislosti (24). Vzhledem k klíčové úloze coreleased orexinu a dynorphinu při kontrole citlivosti na prospěšný účinek stimulace LH v testu ICSS jsme předpokládali, že interakce mezi těmito dvěma neuropeptidy mohou ovlivnit základní impulzivitu a deficity vyvolané kokainem v tomto chování. Impulsivita může být kvantifikována u hlodavců měřením předčasných reakcí v úkolu sériové reakční doby 5-výběr (5-CSRTT) (25), zvířecí model analogický testu nepřetržitého výkonu, který se používá ke studiu pozornosti u lidí. Předčasná reakce v tomto testu bývá za normálních podmínek nízká a je zhoršována léky, které zvyšují přenos DA (26). Použili jsme 5-CSRTT ke zkoumání příspěvku systému orexin-dynorphin na spontánní a kokainem vyvolané impulzivní chování. Při samostatném podání SB334867 dále snížil již tak nízký počet spontánních předčasných odpovědí (Obr. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). K těmto snížením došlo při absenci účinků na přesnost odpovědi (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latence načítání pelet (F_3,21 = 0.91, P = 0.44) nebo počet dokončených pokusů o stimulaci (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), což naznačuje, že nebyly způsobeny zhoršenou bdělostí nebo motorickými schopnostmi. Administrace norBNI však zvrátila účinky SB334867 na předčasnou reakci (Obr. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), což naznačuje, že při zprostředkování těchto antiimpulzních účinků je kritický neoficiální přenos dynorphinu. NorBNI, pokud byl podáván samostatně nebo v kombinaci se SB334867em, neměl žádný vliv na přesnost odezvy (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latence (F_3,18 = 3.09, P > 0.06) nebo počet dokončených stimulačních testů (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Předběžná léčba s SB334867 také zabránila dvojnásobnému nárůstu předčasné odpovědi vyvolané kokainem (Obr. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Tato data poskytují důkaz, že neurotransmise orexinu může regulovat impulzivní chování jak za výchozích podmínek, tak za podmínek stimulovaných kokainem, způsobem citlivým na dynorphin.

 

Obr. 3.

Impulzivní chování regulované rovnováhou orexinu a dynorphinu. (A) SB334867 tlumí předčasné reakce u modelu 5-CSRTT potkana s motorickou impulsivitou. Míra přesnosti, latence pro získání potravinové pelety a počet vynechaných pokusů byly ...

Dynorphin zprostředkovává sníženou samokapitu kokainu v OX₁R-nulové myši.

Zranitelnost vůči závislosti je u impulzivních jedinců výrazně zvýšena a předpokládá se, že zvýšení impulzivity vyvolané kokainem přispívá ke vzniku závislosti (23, 27). Kromě toho byl přenos orexinu a přenos dynorfinu nezávisle zapojen do regulace prospěšných účinků kokainu a jiných drog zneužívání (28-32). Předpokládali jsme, že interakce mezi přenosem orexinu a dynorphinu mohou přímo řídit užívání drog. Abychom tuto možnost prozkoumali, zkoumali jsme iv podání kokainu u geneticky modifikovaných myší postrádajících OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Myši tohoto genotypu vykazují signifikantně nižší samopodávání kokainu v širokém rozmezí dávek (0.1 – 1 mg / kg na infuzi), ale vykazují nezměněnou odpověď na odměny za jídlo podle stejných schémat zesílení (33), což naznačuje, že snížení užívání kokainu není sekundární vzhledem k deficitům v chování. Navíc, OX₁R^{- / -} myši vykazují normální míru samopodávání kokainu během přibližně tří počátečních relací přístupu k kokainu, ale pak rychle vykazují pokles v užívání kokainu (33). Tento fenotyp jsme potvrdili v dávce 0.3 mg / kg na infuzi, což ukazuje na signalizaci prostřednictvím OX₁Rs hraje rozhodující roli při zavádění a udržování chování při užívání kokainu [Obr. 4; obousměrná opakovaná měření ANOVA, genotyp (mezi faktorem subjektu) × Léčba léčiva (v rámci faktoru subjektu): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Stejně jako předběžná léčba norBNI obnovila normální ICSS a impulzivní chování u myší, kterým byl podán SB334867, částečně obnovila i samopodávání kokainu v OX₁R^{- / -} myši, což poskytuje jedinečný příklad, ve kterém je behaviorální deficit produkovaný genetickou ablací ve funkci jednoho neurotransmiterového systému zachráněn blokádou jiného. Tato zjištění naznačují, že v OX₁R^{- / -} u myší, neotřelé účinky dynorfinu oslabují prospěšné vlastnosti kokainu, a tím snižují samoaplikování léčiva. Zajímavé je, že v OX₁R^{+ / +} (kontrolní) myši, norBNI neočekávaně snížilo vlastní podávání kokainu. Jedním možným vysvětlením tohoto účinku je to, že dynorfin uvolňovaný neorexinovými neurony, jako jsou tzv. „Přímé“ striatonigrální středně ostnaté neurony, má opačné účinky na příjem kokainu a může ve skutečnosti usnadňovat prospěšné účinky kokainu. Existence dvou populací KOR s opačnými rolemi v odměňování za kokain by také vysvětlila, proč norBNI pouze částečně zvrátil deficity v chování při přijímání kokainu zjištěné v OX.₁R KO myši. Alternativně antagonismus KOR snižuje averzivní nebo stresující účinky vysazení kokainu (34), které přispívají k způsobům příjmu drog (17). Bez ohledu na to tyto údaje naznačují, že depresivní účinky dynorfinu převládají v nepřítomnosti neporušené signalizace orexinu, což vede ke snížení prospěšných účinků kokainu, zatímco účinky orexinu usnadňují prospěšné účinky kokainu a prodlužují jejich trvání v nepřítomnosti dynorphinová signalizace.

 

Obr. 4.

Snížené užívání kokainu v OX₁Myši R KO jsou obnoveny blokádou KOR. Porucha signalizace orexinu v OX₁R genetickou delecí tohoto receptoru snižuje iv samoaplikování kokainu (0.3 mg / kg na infuzi). Tento deficit je částečně ...

Orexin a dynorphin mohou mít vyvážené opoziční účinky na excitabilitu neuronů VTA DA.

Mozkové struktury, které dostávají vstup od hypothalamických orexinových a dynorfinových neuronů, jsou potenciálně vystaveny oběma peptidům, a tak podléhají jejich protichůdným účinkům na neuronální excitabilitu (35, 36). Míra, v níž převažují účinky jednoho peptidu nad účinky jiného, ​​závisí na mnoha faktorech, včetně relativního hojnosti každého peptidu, dlouhověkosti v extracelulárním prostoru a exprese receptoru v různých populacích cílových neuronů, jakož i na interakcích mezi receptory a jejich intracelulární signální mechanismy v postsynaptických buňkách. Impulzivita a kokainová odměna jsou regulovány, alespoň částečně, DA neurony ve VTA (26), prominentní cíl hypothalamických buněk obsahujících orexin (37). Kromě toho infúze orexinu do VTA zvyšuje vyhledávání léků (6). Pro stanovení relativního příspěvku každého peptidu na aktivitu neuronů VTA jsme provedli elektrofyziologické záznamy z buněk DA v mozkových řezech C57BL / 6 vystavených orexinu a dynorphinu aplikovaným jednotlivě nebo společně. Jak se očekávalo, při samostatném použití byl orexin rovnoměrně excitační, zatímco dynorfin měl pouze inhibiční účinky (Obr. 5 A a B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). V zaznamenané populaci DA neuronů většina reagovala na saturační koncentrace obou peptidů, i když malá menšina byla selektivně citlivá pouze na orexin nebo dynorfin (Obr. 5B). Je pozoruhodné, že když byly oba peptidy aplikovány na duálně reagující neurony (n = 10), nebyl zaznamenán žádný čistý vliv na rychlost střelby (Obr. 5A), což naznačuje, že protichůdné účinky každého peptidu v nasycených koncentracích se při společném uvolňování účinně navzájem ruší. Čtyři z 10 neuronů vykazovaly preferenční inhibici dynorphinem navzdory přítomnosti orexinu, zatímco jedna buňka byla přednostně vzrušena (> 1.5násobná změna) orexinem navzdory přítomnosti dynorphinu (Obr. 5 A a C). Celkově, ačkoli více buněk reagovalo na orexin než dynorphin, ty buňky, které reagovaly na oba peptidy, neměly žádnou čistou změnu rychlosti vypalování, když byly orexin a dynorphin společně aplikovány, což naznačuje, že protichůdné vlivy každého peptidu byly vyváženy v sadě VTA DA neurony studovaly.

 

Obr. 5.

Orexin a dynorphin vykazují vyvážené, ale protichůdné účinky na neurony VTA DA. (A, vlevo) Coappliedovaný orexin a dynorphin nevedou k žádné čisté změně rychlosti střelby neuronů VTA DA (n = 10). Při samostatném použití byl dynorphin inhibiční a orexin byl excitační. ...

Abychom dále objasnili potenciální interakce orexin-dynorphin v neuronech VTA DA, které byly citlivé jak na orexin, tak na dynorfin, pokusili jsme se alternativně zvýšit inhibiční účinky dynorphinu aplikovaného v lázni ošetřením SB334867 (Obr. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) nebo ke zvýšení excitačních účinků orexinu aplikovaného v lázni působením norBNI (Obr. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). V obou experimentech, OX₁Blokáda R a KOR tyto účinky nevyvolala, což naznačuje, že SB334867 a norBNI nevyvolávají účinky prostřednictvím nespecifických akcí. Ještě důležitější je, že tato data naznačují, že tón každého peptidu in vitro je nedostatečný, aby byl ovlivněn aplikací antagonistů s malou molekulou, jako je SB334867 a norBNI. Toto zjištění je v souladu s předchozí prací naznačující, že exocytóza velkých vezikul obsahujících peptidy se obvykle vyskytuje pouze při vysokých frekvencích trvalého vypalování, které se normálně nevyskytují v preparátech plátek (38).

Ověřit, že norBNI neovlivňovalo chování prostřednictvím akcí „mimo cíl“ přímo v OX₁Rs, dále jsme zkoumali účinky tohoto antagonisty na OX₁R signalizace. Konkrétně jsme použili test fluorometrických zobrazovacích destiček (FLIPR) ke stanovení schopnosti orexinu A, SB334867 nebo norBNI aplikovaného v lázni indukovat intracelulární přechody vápníku v kultivovaných buňkách CHO exprimujících lidské OX.₁Rs. Přestože orexin A způsobil očekávané zvýšení intracelulárního vápníku (EC₅₀ = 0.01 μM) a SB334867 v závislosti na dávce tento účinek zeslabily (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI nezpůsobil žádné účinky na zvýšení intracelulárního vápníku vyvolané ani orexinem A, ani indukovaným orexinem. To naznačuje, že účinky norBNI na VTA DA neuronální fyziologii jsou pouze prostřednictvím navrhovaných signálních mechanismů KOR a lék nemá přímý účinek na OX₁R (39) (Obr. S3 A-C).

Interakce orexin-dynorphin ve VTA regulují vlastní podávání kokainu.

Naše elektrofyziologické studie ukazují, že dynamické interakce mezi orexinem a dynorfinem regulují aktivitu VTA DA a že neurony VTA pravděpodobně slouží jako klíčový substrát pro účinky systému orexin-dynorphin na motivovaná chování. Pro přímé testování této hypotézy jsme zkoumali účinky infuze SB334867 intra-VTA na iv podání kokainu samcům potkanů. Ve srovnání s infuzí vehikula uvnitř VTA způsobil intra-VTA SB334867 výrazné snížení příjmu kokainu, které bylo blokováno norBNI (Obr. 6; jednosměrná ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), což naznačuje, že nenarozené akce dynorphinů v této oblasti mozku oslabují odměnu za kokain. Tyto výsledky se zdají být v rozporu s těmi, které prokázaly absenci intra-VTA SB334867 při samopodávání kokainu v harmonogramech posilování s nízkým úsilím 1 (FR1) (40). Několik zpráv však ukázalo, že se zvyšováním požadavků na úkoly je SB334867 účinnější při snižování užívání drog (2, 33). Protože krysy v tomto experimentu prováděly plán FR5 s větším úsilím, jsou současná zjištění v souladu s touto literaturou. Tato data poskytují přímý důkaz, že protikladná povaha orexinu a dynorfinu na VTA DA neuronální fyziologii může mít významný vliv na chování řízené odměnou.

 

Obr. 6.

Interakce orexin-dynorphin ve VTA zprostředkují užívání drog. Samopodávání kokainu je sníženo intra-VTA SB334867 (3 μg na stranu), zatímco tento účinek je zvrácen předběžnou léčbou norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Zvířata.

Dospělé samce myší C57BL / 6J (8 týdně; Jackson Laboratory) použité v EM experimentech byly ustájeny ve skupinách (tři až pět na klec); ty používané pro ICSS byly umístěny jednotlivě po operaci. Dospělí samci (350 g) Sprague-Dawley potkani (Charles River Laboratories) byli použiti v pokusech o samo-podávání 5-CSRTT a kokainu a byli ubytováni ve skupinách po čtyřech. Dospělé samce myší C57BL / 6J (postnatální dny 19 – 21) použité pro elektrofyziologické experimenty byly ustájeny ve skupinách (tři až pět na klec). OX1^{- / -} myši a jejich OX1^{+ / +} Littermates (6 wk věku) použitý pro samo-administrační studie byly získány od Jackson Laboratory a byly zpětně kříženy více než sedm generací k C57BL / 6 myším. Tyto myši byly ustájeny ve skupinách (dvě v kleci). Všechna zvířata byla ustájena za teplotně kontrolovaných podmínek v cyklu 12-h světlo / tma a do cyklu světla došlo 4 – 5 h; jídlo a voda byly k dispozici ad libitum, pokud není uvedeno jinak. Postupy byly vedeny v souladu s Národními zdravotními instituty Průvodce pro péči a používání laboratorních zvířat (50) a byly schváleny institucionálními výbory pro péči o zvířata a jejich použití v nemocnici McLean Hospital, University of British Columbia a Scripps Florida.

Imunohistochemie a mikroskopie.

Fluorescence a stříbrem zesílené imunoznačení orexinu A nebo prodynorfinu bylo provedeno na alternativních řezech mozku myši podle dříve popsaných postupů (51) a zpracovány podle standardních protokolů EM. Nepřekrývající se oblasti imunoznačené tkáně byly poté náhodně vybrány a vyfotografovány pro kvantifikaci částic pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health) (National Institutes of Health) (SI Materiály a metody, imunohistochemie a mikroskopie).

Elektrofyziologie.

Patchové pipety (3 – 5 MΩ) byly naplněny 143 mM glukonátem draselným, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (s pH 7.2) a 270 – 280 mM mOsmol. Data byla získána při 20 kHz a filtrována při 2 kHz pomocí softwaru pClamp 10.0 (Molecular Devices). Po získání konfigurace s celými buňkami byly buňky napěťově sevřeny při -70 mV a pro detekci hyperpolarizace byla použita řada napěťových kroků (250 ms, od -60 do -130 mV v krocích 10-mV).I_h) proudy. I_h byla stanovena jako změna proudu mezi ∼30 ms a 248 ms po použití kroku napětí. Vnitřní aktivita neuronů VTA DA byla měřena v režimu proud-svorka. Pokusy byly zahájeny, když bylo dosaženo stabilní základní rychlosti střelby; substráty byly poté naneseny po dobu 5 min a následně vyplaveny umělou mozkomíšní tekutinou. Pro analýzu dat bylo použito posledních 3 min každého segmentu 5-min. Dynorphin A (1 – 17; 200 nM) a orexin A (100 nM) byly získány z amerického peptidu a rozpuštěny v destilované vodě. Bylo zjištěno, že tyto koncentrace dříve měly saturační účinky na aktivitu buněk VTA (5, 52). Thiorfan (1 μM) a bestatin (10 μM) byly získány od Sigma – Aldrich, rozpuštěny v destilované vodě a aplikovány společně s dynorfinem A (SI Materiály a metody, Elektrofyziologie).

Test FLIPR.

OX₁R aktivita byla hodnocena měřením intracelulárních hladin vápníku pomocí testu FLIPR, jak bylo popsáno výše (53) (Materiály a metody SI, test čtecího zařízení pro fluorescenční zobrazovací desky).

ICSS.

Myším byly implantovány monopolární stimulační elektrody nebo kanyly (PlasticsOne) pod ketamin / xylazin (80 a 10 mg / kg, ip; Sigma) směrované stereotakticky k LH (18) a / nebo kontralaterální VTA [od bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; střední (ML), -0.5 mm; dorsoventral (DV), -4.7 mm od dura]. Po období zotavení 7-d byly myši vyškoleny, aby reagovaly na stimulaci mozku, jak bylo popsáno výše (18). Nejnižší frekvence, která podporovala odpověď (práh), byla vypočtena pomocí analýzy nejmenších čtverců nejmenších čtverců. Když myši splnily kritéria stability pro prahové hodnoty ICSS (± 10% po 5 po sobě jdoucích dnů), měřily se účinky léčení léčivem. SB334867 (Scripps Florida) nebo DMSO vehikulum bylo podáváno v alternativní dny za použití injekční stříkačky Hamilton (0.1 mL / kg ip) a prahové hodnoty byly okamžitě kvantifikovány v testovacích relacích 15-min. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) byl podán ve fyziologickém roztoku (10 ml / kg) 48 h před zahájením testování ICSS.

5-CSRTT.

Potkani byli omezeni na jídlo (na 85% hmotnosti krmení zdarma) a vyškoleni v počítačově ovládaných komorách pro operátory umístěných uvnitř větraných skříní, tlumících zvuk (Med Associates), a postupech 5-CSRTT prováděných tak, jak je popsáno (25). SB334867 (v DMSO, 0.1 ml / kg) a / nebo kokain (ve fyziologickém roztoku, 1 ml / kg; Sigma) byl podán ip injekcí 10 min před testováním, jako v jiných experimentech, a norBNI byl podán alespoň 48 h před začátek testování (Materiály a metody SI, 5-Vyberte úlohu Serial Reaction Time Task).

IV Samopodávání kokainu.

Krysy a myši byly anestetizovány směsí par kyslíku s isofluranem (1 – 3% obj./obj.) A chirurgicky připraveny pomocí katalytrů Silastic (VWR Scientific) v jugulární žíle podle zavedených postupů (54). Bezprostředně po implantaci katétru potkanům byly do VTA implantovány oboustranné vodicí kanyly z nerezové oceli (23 gauge, 17 mm na délku) (od bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm od dura ). Testování s SB334867 nebo norBNI během 60minutových denních relací bylo provedeno po dosažení stabilního příjmu kokainu (<20% variace v reakci po dobu 3 po sobě následujících dnů; Materiály a metody SI, IV).

Statistiky.

Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Pro experimenty ICSS byla použita dvojitá opakovaná měření ANOVA ke srovnání průměrů mezi stavy ošetřenými SB334867 a norBNI + SB334867. Jednosměrná opakovaná měření ANOVA s Newman – Keulsovými post hoc testy byly použity k porovnání prostředků v podmínkách SB334867 a norBNI + SB334867. Jednosměrná opakovaná měření ANOVA a Newman – Keulsovy testy byly také použity k porovnání prostředků ve všech experimentech 5CSRTT. Dvoucestná opakovaná měření ANOVA byla použita k porovnání prostředků mezi léčebnými skupinami v pokusech o samopodávání kokainu s OX₁R KO myši. Jednosměrná opakovaná měření ANOVA a Newman – Keulsovy testy byly použity k porovnání průměrných odpovědí na orexin a dynorphin neurony VTA DA. Jednosměrná opakovaná měření ANOVA a Newman – Keulsovy testy byly také použity ke srovnání prostředků příjmu kokainu u potkanů ​​ošetřených SB334867 a norBNI. Rozdíly byly považovány za významné, pokud P <0.05.

Děkujeme Dr. Garrettovi Fitzmaurice za užitečné komentáře k rukopisu a Mirandě S. Gallo a Melissa Chen za pomoc při sběru dat. Tato práce byla podporována Národními instituty zdravotnictví Granty F32-DA026250 a K99-DA031767 (do JWM), F32-DA024932 a K99-DA031222 (do JAH), R01-DA023915 (do. PJK) a R01-W063266 ) a grantem na objevení Rady pro přírodní vědy a strojírenský výzkum (SLB).

Prohlášení o střetu zájmů: WAC je držitelem patentu (US Patent 6,528,518; Assignee: McLean Hospital) vztahujícího se k použití kappa-opioidních antagonistů k léčbě depresivních poruch. Všichni ostatní autoři prohlašují, že si nekonkurují finanční zájmy.

Tento článek je PNAS přímé podání.

Viz komentář na stránce 5765.

Tento článek obsahuje podpůrné informace online na adrese www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.