Nat Neurosci. Autorský rukopis; k dispozici v PMC Jan 1, 2014.
Publikováno v posledním editovaném formuláři:
Nat Neurosci. Jul 2013; 16 (7): 10.1038 / nn.3420.
Publikováno online červen 2, 2013. doi: 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Hui Wang,*,1,2,3 Florian Duclot,*,1,2 Yan Liu,2,3 Zuoxin Wang,2,3 a Mohamed Kabbaj1,2
Konečná upravená verze tohoto článku vydavatele je k dispozici na adrese Nat Neurosci
Viz další články v PMC to citovat publikovaný článek.
Abstraktní
V společensky monogamní prérie vole (Microtus ochrogaster), páření indukuje trvalé párové vazby iniciované tvorbou preferencí partnera a regulované řadou neurotransmiterů včetně oxytocinu, vasopresinu a dopaminu. Zde jsme zkoumali možné epigenetické mechanismy zprostředkující regulaci párové vazby. Ukazujeme, že inhibitory histon deacetylázy sodné soli butyrát a TrichoStatin A (TSA) usnadňují tvorbu preferencí partnera u ženských prérijních hrabošů v nepřítomnosti páření. To bylo spojeno se specifickou up-regulací oxytocinových (OTR) a vazopresinových V1a receptorů (V1aR) v nucleus accumbens, zvýšením acetylace histonu na jejich příslušném promotoru. Preferování partnerů s podporou TSA bylo dále zabráněno blokádou OTR nebo V1aR v nucleus accumbens. Důležité je, že preference partnerů vyvolaných párováním vyvolala stejnou epigenetickou regulaci promotorů genu OTR a V1aR jako TSA. Tato pozorování tedy naznačují, že TSA a páření usnadňují preferenci partnera prostřednictvím epigenetických událostí, což poskytuje první přímý důkaz pro epigenetickou regulaci párové vazby.
Úvod
Sociální příslušnost je základní charakteristikou lidského sociálního chování a sociální kognitivní deficity jsou běžnými rysy mnoha neuropsychiatrických poruch, včetně schizofrenie a poruch spektra autismu, jakož i závislosti a deprese.1. Společensky monogamní prérie voles (Microtus ochrogaster) se ukázaly jako velmi zajímavý model pro zkoumání neurobiologických základů sociální vazby, protože laboratorní i volně žijící jedinci vytvářejí dlouhodobé párové vazby2-4, které jsou nejprve iniciovány tvorbou selektivního afilačního chování vůči partnerovi, zvaného partnerská preference5. Tato tvorba partnerských preferencí zahrnuje celou řadu neurotransmiterů a hormonálních systémů, včetně neuropeptidů oxytocinu a vasopresinu (AVP) a mezolimbického dopaminu5.
In obecně je tvorba partnerských preferencí zprostředkována prostřednictvím AVP neurotransmise ve ventrálním palidu a laterálním septum (LS) u mužů a oxytocinové neurotransmise v nucleus accumbens (NAcc) a předimbické kůry u ženských prérijních hrabošů6-8.
Dopamin se obvykle podílí na přirozené odměně, jako je páření, také jako kritický zprostředkovatel partnerských preferencí v prérijních hrách. Aktivace dopaminových receptorů typu D2 (D2R) v NAcc usnadňuje, zatímco aktivace dopaminových receptorů typu D1 (D1R) inhibuje tvorbu preferencí partnera u mužských i ženských prérijních hrabošů9-11.
Důležité je, že změny v genové expresi oxytocinových a AVP V1a receptorů, OTR a V1aR, v daném pořadí, mohou samy dramaticky ovlivnit preference partnera. Například u ženských prérijních volé usnadňuje nadměrná exprese OTR v NAcc preferenci partnera v případě, že není páření12-14.
Kromě regulace párových vazeb jsou oxytocin a AVP také zapojeny do široké škály sociálních chování, včetně sociálního uznávání, agrese a mateřské péče.15, 16. Zejména narušení posledně uvedeného chování u hlodavců vyvolává dlouhodobé neuroadaptace epigenetickými mechanismy, včetně DNA methylace alfa alfa estrogenového receptoru.17 a AVP geny18a také acetylaci histonu promotoru glukokortikoidového receptoru19. Inhibitory histon deacetylázy (HDAC), zvyšující genovou expresi zvýšenou acetylací histonu v mozku hlodavců20, může tyto změny zvrátit19a přímo ovlivňují sociální chování, jako je sexuální vnímavost21. Důležité je, že v buněčné linii rakoviny plic inhibitor HDAC trichostatin A (TSA) přímo zvyšuje transkripci OTR lokální podporou acetylace histonu.22.
Proto je možné navrhnout epigenetický základ při tvorbě preferencí partnerů u prérijních hrabošů. Abychom tuto hypotézu otestovali, nejprve jsme vyhodnotili účinky dvou inhibitorů HDAC, butyrátu sodného (NaB) a TSA, na tvorbu preferencí partnera u dospělých ženských prérijních hrabošů. Poté jsme zkoumali molekulární mechanismy zprostředkující účinky TSA při vyvolávání preferencí partnerů u ženských prérijních hrabošů. Nakonec jsme se snažili zjistit, zda epigenetické změny vyvolané TSA během soužití byly také vyvolány pářením.
výsledky
Léčba TSA usnadňuje preferenci partnera
Sexuálně naivní ženské prérie byly injikovány intracerebroventrikulárně (icv.) s CSF nebo CSF obsahující 0.08, 0.4 nebo 4 ng TSA bezprostředně před 6hodinovým soužitím se samcem bez páření a poté byla testována jejich partnerská preference. Šest hodin soužití s mužem bez páření neindukuje formování preferencí partnera u ženských prérijních hrabošů4 a tak se toto paradigma chování široce používá k posouzení účinků různých léků na usnadnění vytváření preferencí partnera5.
Zvířata ošetřená CSF vykazovala neselektivní vzájemný kontakt s partnerem nebo cizincem po 6 hodinách soužití bez páření (t15= 0.76, P = 0.46; Obr. 1a). Zvířata ošetřená TSA ve všech testovaných dávkách však trávila s partnerem přednostně více než s cizím člověkem (t8= 4.35, P = 0.002 pro TSA 0.08 ng skupina; t15= 3.63, P = 0.002 pro TSA 0.4 ng skupina; a t8= 2.58, P = 0.03 pro TSA 4 ng skupina). Důležité je, že nebyly nalezeny žádné skupinové rozdíly v pohybové aktivitě (F3,46 = 1.25, P= 0.30, Obr. 1b) a nebyly pozorovány žádné agresivní chování testované ženy vůči cizince ani partnerce, což prokazuje, že účinky TSA byly specifické pro sociální preference, spíše než aby byly sekundární ke změně lokomoce nebo sociální averze k cizince.
Pro zkoumání, zda TSA zvyšuje acetylaci histonu v mozkových strukturách podílejících se na tvorbě preferencí partnera, byla do skupiny dávek žen injekčně podána střední dávka TSA (0.4) ng) a soužití s mužem v nepřítomnosti páření během 30 min, 2 nebo 9 hodin. Pozoruhodně, žádná významná změna v globálních hladinách histonové H3 acetylace (Lys14) nemohla být detekována v žádném časovém bodě jak v NAcc, tak v caudate putamen (P > 0.05 pro všechny skupiny, Obr. 1c a d). To ukazuje, že TSA usnadňuje tvorbu preferencí partnera v nepřítomnosti páření, přestože neovlivňuje globální acetylaci histonu H3 v NAcc nebo v putamenu kaudátu.
Důležité je, že butyrát sodný také usnadnil preferenci partnerů u ženských prérijních hrabošů po soužití se samcem po dobu 6 bez páření, spojené se zvýšením globální acetylace histonu H3 (Lys14) v NAcc (Doplňkový obrázek 1). Účinky TSA na tvorbu preferencí partnera by tedy mohly být reprodukovány s jiným inhibitorem HDAC, což naznačuje zapojení HDAC inhibice, spíše než nespecifický účinek TSA při usnadnění preferencí partnera. Vzhledem k tomu, že TSA je specifičtější a afinnější inhibitor třídy I / II HDAC23, 24a že behaviorální účinky TSA byly výraznější než NaB, rozhodli jsme se použít TSA oproti NaB pro zkoumání specifických molekulárních korelací v následujících částech studie.
Molekulární koreláty preferencí partnerů usnadňujících TSA
Protože variace v úrovních genové exprese ve vole NAcc byly spojeny s různými strategiemi páření mezi monogamními a nemonogamními hrabošemi a se změnou tvorby preferencí partnera zejména u prérijních hrabošů12, 13, 25, 26, hodnotili jsme, zda tvorba preferenčních partnerů usnadňujících TSA byla spojena se změnami genové exprese v NAcc.
Ošetření TSA (0.4 ng, icv.) vyvolalo zvýšení hladin OTR mRNA v NAcc po 2 hodinách soužití ve srovnání s kontrolami ošetřenými CSF (t10 = 2.38, P = 0.038, Obr. 2a), která měla tendenci být udržována i po 9 hodinách soužití (t9 = 2.17, P = 0.058, Obr. 2b). Přestože v NAcc 1 hodinách po injekci TSA bylo možno pozorovat mírné, ale nikoli významné zvýšení mRNA V2aR, nebyly v žádném časovém bodě detekovány žádné jiné rozdíly ve skupině pro kteroukoli z ostatních měřených mRNA, včetně D1R nebo D2R (P > 0.05, Obr. 2a, b. Obr). Důležité je, že v kaudátových putamenech nebyly pozorovány žádné skupinové rozdíly v žádném časovém bodě ani u žádné měřené mRNA (P > 0.05 pro všechny skupiny, Obr. 2c, d), což naznačuje, že zvýšení OTR mRNA pozorované u zvířat ošetřených TSA bylo specifické pro NAcc. Kromě toho byla taková zvýšená regulace přítomna pouze po soužití s mužem, protože hladiny mRNA OTR a V1aR v NAcc zůstaly nezměněny 2 hodiny po injekci TSA bez soužití (OTR: 100.0% ± 11.70 pro skupinu CSF, 86.7% ± 12.11 pro TSA skupina, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 pro skupinu CSF, 92.3% ± 13.75 pro skupinu TSA, t9 = 0.27, P = 0.791).
V souladu s vyššími hladinami mRNA OTR vykazovaly zvířata ošetřená TSA také vyšší hladiny proteinů OTR v obou časových bodech v NAcc (2 hodin: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 hodin: t10 = 3.16, P = 0.01, Obr. 2e, f. Obr), ale ne caudate putamen (t10 = 0.41, P = 0.69, Obr. 2g, h). Je zajímavé, že zatímco na NAcc v 1 nebo 2 hodin po injekci TSA nebylo možné detekovat významnou změnu hladin mRNA V9aR (Obr. 2a, b. Obr), hladiny proteinu V1aR byly významně zvýšeny v 9 hodin, ve srovnání se zvířaty ošetřenými CSF, v NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, Obr. 2f), ale ne caudate putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, Obr. 2h). Ačkoli s některými odchylkami, hladiny D1R a D2R v NAcc a v caudate putamen nebyly signifikantně ovlivněny podáváním TSA (P > 0.05, Obr. 2e-h).
TSA usnadňuje acetylaci histonu oxtr a avpr1a
Zvýšení hladin mRNA a proteinů pro OTR po soužití po léčbě TSA naznačovalo, že TSA pravděpodobně zvýšila transkripci oxtr, gen kódující OTR, spíše než změnit translaci nebo obrat proteinu. Kromě toho byly hladiny proteinu V1aR vyšší v NAcc, spojené s mírným, ale nevýznamným zvýšením hladin mRNA po ošetření TSA (Obr. 2). Vzhledem k tomu, že TSA je silný inhibitor třídy I a II HDAC23, 24, 27, předpokládali jsme, že TSA zvyšuje acetylaci histonu na oxtr a avpr1a promotory v NAcc, poté posílily jejich transkripci. Byla přijata nová šarže zvířat icv. injekce TSA (0.4 ng) a bezprostředně soužití s mužem bez páření po dobu 30 minut před usmrcením. Časové okno 30-min bylo vybráno na základě předchozí práce uvádějící maximální zvýšení acetylace histonu po lokální injekci TSA u potkanů a myší28, 29. H3K14 acetylace na oxtr a avpr1a promotory byly poté analyzovány imunoprecipitací chromatinu.
V souladu s dříve pozorovaným zvýšením hladin OTR mRNA a proteinů vykazovaly zvířata ošetřená TSA velmi vysoké zvýšení (+ 460%) acetylace histonu H3 na oxtr genový promotor ve srovnání s kontrolami ošetřenými CSF v NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), ale ne caudate putamen (t9= 0.31, P = 0.76, Obr. 3a). Kromě toho acetylace histonu H3 na avpr1a promotor byl významně zvýšen 30 min po podání TSA (+ 196%) v NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01), ale ne caudate putamen (t9= 0.38, P = 0.71), ve srovnání s kontrolami ošetřenými CSF (Obr. 3b). Proto TSA zvýšila místo acetylace histonu konkrétně v NAcc již v 30 minutách po začátku soužití s mužem.
TSA usnadňuje preferenci partnera prostřednictvím OTR a V1aR
Z předchozí sady experimentů se objevuje molekulární model účinku, kde během soužití TSA potencuje acetylaci histonu na oxtr a avpr1a promotory, které následně zvyšují jejich transkripci a vedou k vyšším hladinám proteinů OTR a V1aR až do 9 hodin po začátku období soužití. Důležité je, že tento účinek TSA je specifický pro danou lokalitu, protože putamen kaudátu zůstává nedotčen. Zde jsme testovali, zda toto zvýšení indukované TSA v OTR a V1aR souvisí s usnadněním tvorby preferencí partnera. Žíly prérijních prérijních žen dostali injekci TSA (0.04) do NAccng na stranu) s předchozí injekcí nebo bez ní (30minuty před injekcí TSA, 0.5ng na stranu) CSF nebo CSF obsahujícího jednoho ze dvou různých antagonistů OTR, OTA (B) a OTA (T) nebo antagonistu V1aR (V1aRA). Ihned po injekci TSA byly samice spolužity s mužem po dobu 6 hodin bez páření, následoval test preferenčního partnera.
Zvířata ošetřená CSF nevykazovala partnerské preference (t5 = 0.17, P = 0.87, Obr. 4a). Zvířata ošetřená TSA však strávila podstatně více času v kontaktech vedle sebe s „partnerem“ než s „cizím člověkem“, což naznačuje, že jediná injekce TSA přímo do NAcc je dostatečná pro usnadnění vytváření preferencí partnera bez párování (t5 = 7.04, P = 0.0009). Zajímavé je, že blokáda buď OTR nebo V1aR předběžným ošetřením OTA (B), OTA (T) nebo V1aRA zabránila účinkům TSA (P > 0.05 pro všechny skupiny). Protože nebyly zjištěny žádné skupinové rozdíly v pohybové aktivitě (F4,32 = 1.89, P = 0.14, Obr. 4b), tato data naznačují, že TSA v NAcc usnadňuje vytváření preferencí partnerů prostřednictvím mechanismů zprostředkovaných OTR a V1aR způsobem specifickým pro chování.
Páření indukuje podobné neuroadaptace jako TSA
Na základě našich předchozích pozorování jsme zjistili, že epigenetická potenciace neurotransmise oxytocinu a vasopressinu u samičích NAcc byla dostatečná pro usnadnění tvorby preferencí partnera v nepřítomnosti párování. Aby se prozkoumalo, zda k těmto neuroadaptacím dochází také při přirozené tvorbě preferencí partnera, byly samice prérijních hrabošů spolunažívány se samcem během 24 hodin v přítomnosti páření, což vyvolává preferenci partnera4, a obětoval. Pozorovali jsme zvýšení hladin mRNA OTR a V1aR a proteinů v NAcc ve srovnání se sexuálně naivními samicemi (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = 0.02 pro mRNA a + 58%, t8 = 3.05, P = 0.01 pro protein; V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = 0.02 pro mRNA a + 26%, t20 = 2.23, P = 0.037 pro protein, Obr. 5a, b. Obr).
Protože jak mRNA, tak hladiny proteinů pro OTR a V1aR byly zvýšeny soužití s pářením, dále jsme zkoumali, zda tato up-regulace byla spojena s epigenetickým posílením oxtr a avpr1a transkripce genů. Nová šarže samic tak byla soužití s mužem po dobu 6 s pářením a acetylací H3K14 na oxtr a avpr1a promotory měřené imunoprecipitací chromatinu. V souladu s hladinami mRNA a proteinů OTR a V1aR vykazují ženské voly prérie vyšší acetylaci H3K14 na oxtr a avpr1a promotory v NAcc ve srovnání se sexuálně naivními ženami (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 Obr. 5c, d). Tato data naznačují, že paradigmata soužití, která spolehlivě indukují preferenci partnera v ženských prériích, vyvolávají up-regulaci exprese OTR a V1aR v NAcc prostřednictvím epigenetických mechanismů, jak bylo pozorováno po léčbě TSA.
Diskuse
V této studii poprvé uvádíme epigenetickou regulaci tvorby preferencí partnera. Nejprve jsme demonstrovali, že zvýšení acetylace histonu v NAcc podáváním inhibitoru HDAC usnadňuje tvorbu preferencí partnera u dospělých ženských prérijních hrabošů v nepřítomnosti páření. Tslepice jsme odhalili přímé důkazy o tom, že tvorba partnerských preferencí u žen je epigeneticky řízena, protože se zvyšuje soužití a páření se samcem oxtr a avpr1a Exprese genů prostřednictvím zvýšené acetylace histonu v NAcc. Administrace TSA v NAcc vyvolala preferenci partnera a vedla k vyšším hladinám OTR mRNA a proteinů v NAcc. Ačkoli globální acetylace histonu H3 nebyla u žen ošetřených TSA ovlivněna, výrazné obohacení acetylace histonu na oxtr promotor v NAcc byl pozorován již v 30 minutách po podání TSA. Konečně, blokování OTR v NAcc bylo dostačující k tomu, aby se zabránilo preferencím partnera podporovaného TSA. Vzhledem k tomu, že podobné epigeneticky řízené modifikace byly detekovány po soužití s pářením, podle postupů, o nichž je známo, že vyvolávají preference partnerů, předložila naše data model epigenetické regulace sociálního chování. Dnaléhavé soužití s mužem, TSA nebo pářením, rychle indukuje specifickou acetylaci histonu H3 na oxtr promotor v NAcc, který zvyšuje jeho transkripci, což vede k vyšším hladinám OTR mRNA a proteinu, což následně usnadňuje tvorbu preferencí partnera.
U ženských prérijních voles 6 hodin soužití se samcem bez páření nevyvolává formování preferencí partnera4, a toto paradigma chování bylo použito ke zkoumání účinků farmakologických manipulací na vyvolání preferencí partnera5. V naší studii, zatímco u kontrol léčených solným roztokem nebo CSF nedošlo k preferenci partnera, ženské prérijní hraboše ošetřené NaB nebo TSA ano. Protože ani NaB, ani TSA neovlivnily celkovou lokomoce, jejich účinky na preferenci partnera se zdály být spíše specifické pro chování než sekundární účinky na lokomoce. Tento specifický účinek TSA byl dále potvrzen našimi molekulárními pozorováními. Opravdu, i když se podává icv., jsme byli schopni detekovat specifickou změnu genové exprese v NAcc, ale ne v sousední struktuře, caudate putamen. Navíc ani v NAcc, D1R a D2R nebyly ovlivněny hladiny mRNA a proteinů. Tato specifičnost se zdá být překvapující pro široký inhibitor HDAC, jako je TSA, který ovlivňuje jak HDAC třídy I, tak II. Bylo však popsáno, že TSA ovlivňuje expresi pouze malé podskupiny genů v savčím genomu30-32, včetně myší20.
Ukázali jsme zde, že acetylace histonu H3 na Lys14 na oxtr promotor, modifikace spojená se zvýšenou transkripcí genu, včetně během cerebrální plasticity33, 34, zdůrazňuje vyšší hladiny OTR mRNA a proteinů. V reakci na TSA, acetylace histonu na oxtr promotor zvyšuje a usnadňuje aktivaci jeho transkripce v lidské buněčné linii22, podporující naše zjištění oxtr lze regulovat epigeneticky. Protože lokální blokáda OTR v NAcc byla dostatečná pro prevenci behaviorálních účinků TSA, naše data naznačují, že TSA-indukovaná exprese OTR v NAcc během soužití zprostředkovala usnadnění tvorby preferencí partnera. Kromě toho 24 hodin soužití s pářením, o kterém je známo, že spolehlivě indukuje preferenci partnera u ženských prérijních hrabošů, vyvolalo podobné zvýšení OTR exprese u ženských NAcc. To je zcela v souladu se známým zapojením oxytocinu a jeho receptoru do neurobiologie tvorby partnerských preferencí u ženských hrabošů. Páření indukuje zvýšení extracelulárních hladin oxytocinu v NAcc25a lokální infuze oxytocinu do NAcc usnadňuje tvorbu preferencí partnera v nepřítomnosti páření8. Navíc antagonisté OTR blokují tvorbu preferencí partnera indukovanou podáváním nebo pářením oxytocinu8, 35. Důležité je, že virově zprostředkovaná nadměrná exprese OTR u samičích NAcc je dostatečná pro usnadnění tvorby preferencí partnera12, 13.
Kromě posílení role OTR, naše výsledky také poskytují důkaz pro aktivaci exprese OTR genu prostřednictvím epigenetických mechanismů během soužití s mužem v nepřítomnosti páření. Ve skutečnosti, i když nedostatečné k vyvolání preferencí partnera, takové soužití bez párování na krátkou dobu aktivuje neurobiologické procesy, které jsou základem formování preferencí partnera.. Například dvě hodiny volné expozice samci vyvolávají mírné, ale nevýznamné zvýšení uvolňování oxytocinu u samic NAcc.25. Lze proto navrhnout, že TSA nebo NaB potencují neuroadaptace indukované soužití s mužem, což usnadňuje rozvoj preference partnera. Je zajímavé, že taková potenciace již byla hlášena u hlodavců, kde inhibitory HDAC třídy I a II, včetně NaB a TSA, usnadňují konsolidaci události učení, která nevede k dlouhodobé tvorbě paměti u kontrolních zvířat.36, 37. Na podporu této představy, delší období soužití (např.., 48hours) může vyvolat preferenci partnera i v případě, že nedojde k páření4. Je také důležité poznamenat, že soužití s pářením vyvolalo u samičích NAcc up-regulaci exprese OTR a V1aR prostřednictvím stejných epigenetických mechanismů, jaké jsou pozorovány po soužití s léčbou TSA, což prokazuje, že TSA a páření ovlivňují stejné dráhy k podpoře formování preferencí partnera. Důležité je, že TSA nevyvolává upregulaci OTR a V1aR u samic NAcc v nepřítomnosti soužití s samcem. Celkově to podporuje hypotézu, že TSA usnadňuje utváření partnerské preference prostřednictvím potenciace endogenních neuroadaptací přirozeně vyvolaných soužití s mužem, spíše než aktivováním těchto nebo různých neuroadaptací samostatně.
Our studie také zdůrazňuje kritickou roli NAcc V1aR ve vytváření partnerských preferencí ženy, protože zvířata ošetřená TSA vykazují vyšší hladiny V1aR, jejichž blokáda zabránila tvorbě preferencí partnerů usnadňujících TSA. Kromě toho byly tyto účinky spojeny s vyšší acetylací histonu v EU avpr1a promotor, navzdory žádnému významnému zvýšení V1aR mRNA, pravděpodobně způsobenému neoptimálním časovým bodem. I když nemůžeme vyloučit regulaci stability proteinu pomocí TSA acetylací non-histonových proteinů38, toto zjištění naznačuje, že podobně jako oxtr promotor, může TSA propagovat avpr1a transkripce prostřednictvím lokální acetylace histonu. Zatímco příspěvek AVP v mužském páru byl popsán5, jeho role v chování ženy je stále kontroverzní. Na jedné straně, icv. Injekce AVP usnadňuje tvorbu preferencí partnera u hrabošů samců i samic, kterému je zabráněno blokádou V1aR nebo OTR39. Na druhé straně, icv. injekce antagonisty V1aR blokuje preferenci pářením indukovaného partnera u mužských, ale ne u žen, prérijních hraboší40. Všechny tyto studie však byly použity icv. injekce, které brání jakémukoli dalšímu vhledu do příslušných struktur. Zde poskytujeme první důkaz, že neurotransmise AVP v rámci NAcc může být zapojena do tvorby preferencí partnerů u ženských hrabošů, zatímco většina literatury popisuje její zapojení do různých oblastí, jako je ventrální pallidum, laterální septa, jádro lůžka stria terminalis a amygdala u mužů5. Je proto zajímavé poznamenat, že blokáda buď OTR nebo V1aR v ženské NAcc byla dostatečná k zabránění vytváření preferencí partnera po léčbě TSA, což naznačuje, že tvorba preferencí partnera vyžaduje aktivaci V1aR a OTR.. Tjeho zjištění je v souladu s dřívějším pozorováním mužských prérijních volů a podporuje je, že souběžný přístup k oběma OTR a V1aR v LS je nezbytný pro preferenci partnerů indukovaných AVP.6. Kromě toho pozorování specifického zvýšení hladin OTR a V1aR u zvířat léčených TSA dále podporuje požadavek simultánní aktivace neurotransmise AVP a oxytocinu pro párovou vazbu.
V kombinaci s oxytocinem a AVP moduluje dopaminová neurotransmise v NAcc tvorbu partnerských preferencí u ženských hrabošů9. I když páření indukuje uvolňování dopaminu v NAcc9, variace v hladinách receptorů jsou pozorovány až po delší době - delší než 24h - soužití s párením, důležité pro udržení párové vazby10. V souladu s těmito pozorováními vykazovaly proužky ženské prérie ošetřené TSA preference partnera bez významné variace v dopaminových D1R a D2R receptorech. Proto tato absence regulace dopaminového receptoru poskytuje další důkaz specifičnosti TSA.
Naše data uvádějí poprvé epigenetickou složku v neurobiologii párových vazeb a naznačují, že TSA indukuje „permisivní stav“ u ženských prérijních hrabošů, zesiluje přirozenou molekulární odpověď na soužití a podporuje vytváření silnějších sociálních interakcí. což vede k preferenci partnera. Je proto lákavé předpokládat, že preference partnerů s podporou TSA by mohla být dále posílena a vést k trvalé vazbě. Přestože konkrétní HDAC, kterých se to týká, zbývá určit, bylo by zajímavé dále zkoumat účinky TSA na další chování spojené s monogamní životní strategií u prérijních hrabošů, jako je selektivní agrese a bi-rodičovská péče. S ohledem na význam prérijních hrabošů při modelování neurobiologických mechanismů párového párování u lidí5a slibné inhibitory HDAC již v klinických studiích24, 41, 42, naše data připravují cestu pro nové farmakologické možnosti ovlivňovat sociální chování.
Metody
Předměty
Sexuálně naivní ženské prérie vole (Microtus ochrogaster) z laboratorní chovné kolonie byly odstaveny ve věku 21 a byly umístěny v sourozeneckých párech stejného pohlaví v plastových klecích (12 × 28 × 16 cm) s vodou a jídlem podle libosti. Všechny klece byly udržovány v cyklu 14: 10 h světlo-tma a teplota byla přibližně 20 ° C. Všechna zvířata byla náhodně zařazena do experimentálních skupin, když dosáhly 70 – 90 dnů věku. Počet použitých zvířat byl založen na předchozích studiích v terénu naší skupinou a dalšími, v kombinaci s výkonovou analýzou. Experimentální postupy byly schváleny Výborem pro ústavní péči o zvířata a jejich použití na Floridské státní univerzitě.
Drogy
Butyrát sodný (NaB), rozpuštěný ve fyziologickém roztoku, a Trichostatin A (TSA), rozpuštěný v umělém mozkomíšním nosiči tekutin (CSF, BioFluids, Rockville, MD), byly oba zakoupeny od Sigma-Aldrich (St Louis, MO). NaB byl injikován intraperitoneálně (ip) v dávce 600 mg / kg, o které je známo, že vyvolává acetylaci histonu v několika mozkových strukturách u myší43, 44. Podobně rozsah dávek použitý pro TSA byl založen na předchozí práci, která určovala jeho účinnost při vyvolání lokálních acetylačních histonových dějů a variací v genové expresi u hlodavců19, 20. Selektivní antagonista receptoru V1aR V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP a OTR antagonista OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (Me)2, Thr4, Tyr-NH29] -OVT), byly získány od Bachem (Torrance, CA). Druhý, selektivnější antagonista OTR, OTA (T), dGly-NH2-d(CH2)5 [Tyr (já)2, Thr4] OVT45, laskavě poskytla Dr. Maurice Manning (University of Toledo, OH). Tito antagonisté a použité dávky byly vybrány na základě předchozích studií prokazujících jejich selektivitu buď pro V1aR, nebo OTR.35, 39, 46-49.
Stereotaxická kanylace a mikroinjekce
Samice byly anestetizovány pentobarbitálem sodným (1mg / 10g tělesná hmotnost) a vodicí kanyly z nerezové oceli měřicí 26 (Plastics One, Roanoke, VA) byly stereotaxicky implantovány, zaměřené na laterální komoru (jednostranně; nosní tyč při -2.5 mm, 0.6 mm rostrální, 1.0 mm laterální a 2.6 mm ventrální k bregma) nebo site-specific k NAcc (bilaterálně; nosní tyč při -2.5 mm, 1.7 mm rostral, ± 1.0 mm bilaterálně a 4.5 mm ventrálně k bregma). Po 3 dnech zotavení dostali subjekty mikroinjekce buď CSF nebo CSF obsahující různé koncentrace TSA. Když se použili selektivní antagonisté pro OTR nebo V1aR, injektovali se 30 minut před TSA. Injekce byly provedeny s měřicí jehlou 33, která prodloužila 1 mm pod vodicí kanylou do cílové oblasti, v injekčním objemu 500 nL do laterální komory (icv.) nebo 200 nL na stranu do NAcc. Jehla byla připojena k injekční stříkačce Hamilton (Hamilton, Reno, NV) pomocí hadičky z polyethylenu-20 a stlačení pístu bylo prováděno pomalu, což vyžadovalo 1 minutu na injekci. Na konci experimentu byly všechny subjekty usmrceny rychlou dekapitací a mozky extrahovány pro ověření umístění kanyly pozorovatelem slepým do experimentálních podmínek. Subjekty s nesprávně umístěnými kanyly byly vyloučeny z analýzy dat.
Test soužití a preference partnerů
Bezprostředně následuje ip., icv, nebo injekcí léků uvnitř NAcc, byly ženy soužití se samcem po dobu 6 hodin bez páření. Nepřítomnost páření byla ověřena zkoumáním chování videokazety. Pro zkoumání neuroadaptací vyvolaných soužití s pářením estrogenem aktivovaných žen (2 μg za den, ip., po dobu 3 dnů) byli soužití se samcem během 6 nebo 24 hodin a byla ověřena přítomnost páření a posteriori na videokazetě (od 6u po 11 záchvaty během prvních 6 hodin soužití).
Test preference partnera byl proveden bezprostředně po soužití 6-hodin, jak bylo popsáno výše11. Stručně řečeno, tříkomorové testovací zařízení sestávalo z neutrální klece připojené ke dvěma paralelním identickým klecím, z nichž každá obsahovala stimulační zvíře - neznámého mužského „cizince“ nebo známého mužského „partnera“ použitého během období soužití. Ženské subjekty se mohly během 3hodinového testování volně pohybovat v celém aparátu a stimulační muži byli uvázáni v jejich klecích, což neumožňovalo žádný přímý vzájemný kontakt. Celá relace byla zaznamenána na video a doba trvání kontaktu subjektu s partnerem nebo cizím člověkem byla později kvantifikována vyškoleným experimentátorem, který nevěděl o biologických skupinách. Preference partnera byla definována jako subjekty, které tráví podstatně více času v tělesném kontaktu s partnerem versus cizinec, jak je určeno spárovaným, dvoustranným t-test. Kromě toho byl tříkomorový aparát vybaven senzory fotobeamů, což umožnilo stanovení lokomotorické aktivity indikované počtem vstupů ženy do stimulačních komor. Toto lokomotorické skóre nám tedy umožňuje kontrolovat domnělé sekundární účinky léků na chování žen, jako je obecná aktivita, úzkost nebo změněné zkoumání nového prostředí, jak je běžně používáno naší skupinou a dalšími12.
Extrakce RNA a proteinů
Samice byly obětovány rychlou dekapitací a mozky byly okamžitě extrahovány a zmrazeny na suchém ledu. Koronální řezy (200 um) byly nařezány na kryostatu a na sklíčka mikroskopu byly namontovány mrazy. Z celého NAcc a kaudátového putamenu byly odebrány bilaterální tkáňové děrování o průměru 1 mm, přičemž druhá z nich byla kontrolní oblastí a do zpracování zpracována při -80 ° C. Celková RNA a proteiny byly extrahovány pomocí protokolu TRI-Reagent podle pokynů výrobce (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
Analýza proteinové exprese pomocí Western blotu
Po separaci na 10% polyakrylamidovém gelu (15% pro histony) byly proteiny přeneseny na nitrocelulózové membrány a inkubovány s následujícími primárními protilátkami: anti-OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR (sc-18096, 1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -D2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -aktin (A2066, 1, Aldma. Louis, MO) nebo anti-acetyl histon H1000 (Lys3, # 14 – 06, 911: 1) a celkový H1000 (# 3 – 05, 928: 1, Millipore, Temecula, CA). Všechny protilátky jsou validovány pro jejich použití u lidí, potkanů a myší, s nimiž prérijní hraboši sdílejí vysoké procento homologie (od 1000 do 81%). Po hybridizaci s HRP-konjugovanou sekundární protilátkou byly membrány odhaleny s ECL (substrát ECL SuperSignal West Dura, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) a exponovány na Fuji XAR filmu (Fuji Film, Tokio, Japonsko). Kvantifikace byla provedena za použití softwaru AIS 96 Image (Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Kanada) a všechny signály byly normalizovány v rámci stejné membrány na aktin, s výjimkou signálu acetyl-H6.0, který byl normalizován na celkový histonový signál H3. Normalizovaná data jsou pak vyjádřena jako procento zvířat ošetřených CSF.
Semikvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR)
0.5 ug celkové RNA byl zpracován pro komplementární syntézu DNA a poté analyzován, jak bylo popsáno výše50 s normalizací na gen nikotinamid adenindinukleotid dehydrogenázy (NADH). Všechny reakce byly provedeny trojmo a jejich specificita byla ověřena analýzou křivky tání a separací na 2% agarózovém gelu. Byly použity následující sekvence primerů: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 '(Fwd) a 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3' (Rev) pro OTR, 5'-GAGGTGAACAATGGACCATRGATRACGATRGATRAT (Rev) pro AVP3aR, 5'- TTAACAACAATGGGGCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG. GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG ) pro D3R a 1'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-5 '(For) a 3'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-5' (Rev) pro NADH. Normalizovaná data jsou vyjádřena jako procento zvířat ošetřených CSF.
Imunoprecipitace chromatinu
Acetylace histonu H3 (Lys14) v tkáňových tkáních NAcc a caudate putamen byla analyzována pomocí soupravy Magna ChIP protein G Tissue Kit (Millipore, Temecula, CA) podle pokynů výrobce. Stručně, po zesítění s 1% formaldehydem byl chromatin střižen za použití Misonix XL-2000 na fragmenty 200 – 600 bp. Imunoprecipitace acetylovaného histonu H3 (Lys14) byla poté realizována s 10 ug anti acetyl-H3 (Lys14) protilátky (Millipore) přes noc při 4 ° C. Po promytí, eluce z kuliček a obrácení zesítění byla imunoprecipitovaná DNA purifikována a analyzována ve trojím opakování pomocí RT-PCR na platformě iCycler (viz výše) s interní standardní křivkou vyrobenou ze sdružených vzorků INPUT. Primery byly navrženy tak, aby amplifikovaly 236 bp-dlouhou oblast lokalizovanou 128 bp před prvním exonovým kódováním pro prérie vole OTR (oxtr, Genbank přístup #AF079980) nebo 192 bp dlouhá oblast lokalizovaná 141 bp před prvním exonovým kódováním prérie V1aR (prérie vole)avpr1a, Genbank přístup #AF069304). Sekvence byly následující: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3 '(Fwd) a 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) pro oxtra 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) a 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) pro avpr1a. Každý vzorek byl normalizován příslušnou hodnotou INPUT a data jsou poté vyjádřena jako procento zvířat ošetřených CSF.
Statistické analýzy a zpracování dat
Pro analýzy preferencí partnera byla vyloučena zvířata, která vykazovala chování při páření v období soužití nebo s nesprávně umístěnými kanyly. Pro všechny ostatní molekulární analýzy byl vyloučen maximálně jeden datový bod na biologickou skupinu, pokud byl identifikován jako odlehlý. Většina experimentů byla replikována, s výjimkou případů, kdy byly výsledky velmi jasné. Čas strávený v kontaktu bok po boku s jakýmkoli stimulačním zvířetem během testu preferencí partnera byl analyzován pomocí dvojstranného páru. t-test. Skóre lokomoce bylo analyzováno pomocí dvoustranného t-test (pro dvě skupiny) nebo jednosměrná ANOVA (pro více než dvě skupiny) a případně Fischerův PLSD post-hoc testy byly provedeny s prahem významnosti P <0.05. Po ověření normality byla všechna ostatní data analyzována oboustranně t-test za předpokladu stejných nebo nerovných odchylek testovaných předem. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru StatView (SAS Institute). Když jsou data standardizována podle jejich příslušných kontrol (% CSF, fyziologický roztok nebo páření), byla provedena statistická analýza surových dat.
Poděkování
Tuto práci podpořil Národní institut duševního zdraví (NIMH), který uděluje MHR21-083128 MK a ZW, a MHR01-058616 společnosti ZW. Děkujeme také Dr. Maurice Manningové za štědrý dar antagonisty OTR (T).
Poznámky pod čarou
Konflikt zájmů: Autoři neuvádějí žádný střet zájmů.
Autorské příspěvky
HW, FD a YL provedly experimenty. HW a FD analyzovala data. Studii navrhli HW, FD, ZW a MK. FD, ZW a MK napsal článek. Všichni autoři diskutovali o výsledcích a komentovali rukopis.
Reference
;
