Přechodná inhibice neuronů odhaluje protichůdné role nepřímých a přímých cest v senzitizaci (2011)

Abstraktní

Navzdory ohromujícím negativním důsledkům závislosti na drogách zůstává používání psychostimulantů a zneužívání nadále převažující. Postup od počáteční expozice léčiva k pravidelnému užívání a nakonec k nutkálnímu, obvyklému chování a ztrátě inhibiční kontroly zahrnuje řadu molekulárních adaptací v diskrétních neurosurcích^1,2,3. Striatum bylo identifikováno jako klíčové místo pro mnoho behaviorálních a neurobiologických adaptací, u nichž se myslelo, že tvoří základní procesy, které zprostředkovávají závislost^1,2,3. Většina neuronů v striatum (~ 95%) jsou neurony GABAergic medium spiny projection neurons (MSNs) tklobouk se liší svou neuropeptidovou expresí a tvoří dvě hlavní eferentní dráhy⁴.

• Striatopallidní MSN obsahují enkefalin (ENK) a tvoří nepřímou cestu
• zatímco stritonigrální MSN obsahují dynorfin (DYN) a látku P a tvoří přímou dráhu.

Mnoho koncepčních modelů předpokládá, že tato populace MSN se navzájem opírají jak mechanicky, tak funkčně^5,6. Existuje ovšem málo empirických důkazů, které by podpořily jejich rozdílnou úlohu při kontrole chování, protože tyto buněčné populace jsou fyzicky propletené a morfologicky nerozlišitelné, což dělá selektivní manipulaci technicky nepolapitelnou.

Abychom zkoumali úlohu těchto populací striatálních buněk ve vývoji chování, ke kterému dochází po opakované expozici zneužívajícím lékům, jsme spojili dvě nové strategie: virové vektory, které používají promotory genu ENK nebo DYN k cílení exprese transgenu na striatopallidní nebo striatonigrální neurony , respektive upravený GPCR (G_{i / o}spojený s lidským muskarinem M₄ DREADD; Designer Receptor Exkluzivně aktivovaný Designer Drug; hM₄D)⁷ který je aktivován jiným farmakologicky inertním ligandem, klozapin-N-oxid^8,9 (CNO; Obr. 1a, h). Po expresi v kultivovaných neuronech podávání CNO stimuluje G_{i / o}- spojený hM₄D receptory, čímž aktivují kanálky draslíku 3 (Kir3), které směřují dovnitř, což vede k membránové hyperpolarizaci a přechodnému neuronálnímu tlumení⁹.

  

Obrázek 1

Přechodné a cílené zeslabení signalizace striatální buňky. (a, h) Ampliconové mapy pENK-hM₄D/pENK-GFP (a) a strDYN-hM₄D/pDYN-GFP (h) zaměřujícím vektory. (b, i) Konfokální mikroskopie ukázala, že pENK-hM₄D receptory byly selektivně exprimovány v striatopallidních ...

Pro testování specifičnosti virových vektorů na fenotypových buňkách jsme použili imunofluorescenční mikroskopii s dvojím označením po infuzi virů z dorsálního striatu (Doplňkový obrázek 1), které exprimují hemaglutinin-značený hM₄D receptorů pod kontrolou buď promotoru ENK (strENK-hM₄D) nebo promotoru DYN (strDYN-hM₄D). Zjistili jsme, že pENK-hM₄D exprese byla primárně u MSN s obsahem ENK (90% hemaglutininových buněk bylo ENK +, 85 z 94, 6% hemaglutininových buněk byly látky P +, 4 z buněk 70; Obr. 1b), zatímco pDYN-hM₄D exprese byla primárně v MSN obsahujících látku P (95% hemaglutininových buněk byly látky P +, 109 z buněk 115, 5% hemaglutininových buněk byly buňky ENK +, 5 z 97 buněk; Obr. 1i). Podobné výsledky byly získány po infuse promotor-specifických virů, které exprimují zelený fluorescenční protein (strENK-GFP a pDYN-GFP; Doplňkové slevy. 2a a 3a).

Vzhledem k tomu, že striatopallidní MSN se primárně projevují na globus pallidus external (GPe) a striatonigrální MSN primárně projevují na substantia nigra pars reticulata (SNpr), použili jsme injekce retrográdního značkovacího činidla Fluoro-Gold do těchto oblastí mozku následovanou fluorescenční imunohistochemií potvrďte, že pENK a pDYN viry způsobily infekci specifickou pro dráhu. Zjistili jsme, že pENK-GFP buňky ko-lokalizované s striatálním Fluoro-Gold výrazem po infuse do GPe, ale ne SNpr (Doplňkový obrázek 2b), zatímco pDYN-GFP buňky ko-lokalizované s striatálním Fluoro-Gold výrazem po infuzích do SNpr, ale ne GPeDoplňkový obrázek 3b). Exprese virových vektorů neměnila počet neuronů ENK + nebo P + v oblasti virové infekce, což naznačuje, že použití těchto promotorů pro přenos viru zprostředkovaného genem neinterferovalo s hladinami endogenních neuropeptidů. Všechny tyto výsledky ukazují, že pENK a pDYN virové vektory exprimují geny ve svých vhodně segregovaných populacích striatálních buněk.

Ačkoli hM₄D receptorů bylo prokázáno, že modulují aktivitu jiných neuronových typů⁹, jejich schopnost ovlivnit striatální neurony nebyla zkoumána. Proto jsme infikovali striatální středně špinavé neurony s hM₄D receptory pod kontrolou promotoru viru herpes simplex (HSV), připravily koronální plátky dorzálního striatu o dva dny později a zkoumaly, jak hM₄D-exprimující středně ostré neurony striatální reagují na CNO. Pozorovali jsme, že lokální aplikace CNO (10 μM) indukovala hyperpolarizaci membránového potenciálu (~ 7 mV, výchozí membránový potenciál byl nastaven na -80 mV; Obr. 1c) a snížil vstupní odpor neuronů po aplikaci CNO (Obr. 1d, e), což naznačuje, že vodivost draslíku (tj. proud zprostředkovaný Kir3) je aktivována CNO v hM₄D receptorů exprimujících neurony. Kromě toho perfúze CNO podstatně snížila počet evokovaných akčních potenciálů v hM₄D-exprimující neurony, ale ne v kontrolních buňkách, čímž účinně inhibuje funkční výstup virálně infikovaných neuronů Exprese hM₄D receptory samotné nezměnily vstupní odpor (P = 0.84) nebo spuštění akčního potenciálu (P = 0.64). (Obr. 1f, g). Společně tyto údaje naznačují, že podobně jako hipokampální neurony⁹, hM₄Metoda založená na D / CNO může účinně snížit excitabilitu neuronů striatálního potkana.

Jako dodatečný důkaz koncepce jsme testovali, zda je hM₄D receptory by blokovaly neurotransmisi v dobře zavedeném okruhu, kde je nervová aktivita předvídatelně vyvolána pomocí behaviorálně relevantních stimulů. V souladu s tím jsme infikovali neurony ventrální tegmentální oblasti (VTA) s hM₄D receptory pod kontrolou HSV promotoru, který silně exprimuje dopaminové neurony¹⁰, a použil rychlou kontrolu cyklické voltametrie k měření změn uvolňování dopaminu v nucleus accumbens po neočekávané dodávce potravinové odměny¹¹. Podávání CNO výrazně zeslabilo uvolňování dopaminu vyvolané potravními peletami v nucleus accumbens ve srovnání s vehikulem (Doplňkový obrázek 4). Nakonec jsme testovali, zda klesá aktivita specifických typů neuronálních buněk v striatu in vivo může změnit schopnost amfetaminu stimulovat expresi Fos. Psychostimulanty, jako je amfetamin, jsou robustní aktivátory c-fos v striatu¹² a zvýší c-fos v obou striatonigrálních a striatopallidních neuronech za našich experimentálních podmínek¹³. Kromě jeho použití jako markeru neuronální aktivity indukuje psychostimulant c-fos se předpokládá, že hraje důležitou roli při zahájení a udržování nervových adaptací spojených s psychomotorickou senzitizací^1,14. Zjistili jsme, že CNO zprostředkovaná aktivace pENK-hM₄D receptorů významně snížil celkový počet buněk c-Fos indukovaných amfetaminem v striatémObr. 1k a Doplňkový obrázek 5a). Toto snížení se vyskytlo u hemaglutinin-pozitivních neuronů (tj. Těch, které exprimují hM₄D receptory) a hemaglutinin-negativní neurony (tj. Ty, které neexprimují hM₄D receptory; Obr. 1l), což naznačuje efekt neuronálního křížového hovoru mezi hM₄D-exprimující neurony a neinfikované neurony. Významné snížení celkového počtu buněk c-Fos vyvolaných amfetaminem a počtu hemaglutinin-pozitivních c-Fos buněk bylo také pozorováno, když hM₄D receptory byly aktivovány v neuronech s přímou cestou (Obr. 1n, o a Doplňkový obrázek 5b). Důležité je, že tyto účinky nejsou jednoduše způsobeny virovou expresí nového receptoru, protože exprese buď pENK-hM₄D nebo strDYN-hM₄D receptory v nepřítomnosti léčby CNO neměl žádný vliv na počet Fos buněk vyvolaných amfetaminem (Doplňkové obrázky. 6 a 7). Takže tato zjištění ukazují, že aktivita hM zprostředkovaná CNO₄D receptorů může také vést ke snížení neuronální aktivity snížením uvolňování neurotransmiteru a oslabení intracelulární signalizace.

Opakované vystavení návykovým látkám může vést k postupnému a trvalému zvyšování reakce na chování, často označované jako senzibilizace chování. Důležité je, že senzibilizace zahrnuje některé z těch stejných neurálních okruhů, které se podílejí na vývoji lidské závislosti na drogách³. Zde využíváme naše nové nástroje ke zkoumání účinku obvodově specifického tlumení striatální neuronové aktivity na vývoj senzitizace amfetaminu. Předpokládali jsme hypotézu, že přímé a nepřímé dráhy neuronů mají protichůdné role, kde striatonigrální neurony zvyšují senzibilizaci a striatopallidní neurony potlačují senzibilizaci v souladu s jejich koncepčně navrhovanými roly v aktivaci a inhibici chování^5,6. V souladu s tím jsme zkoušeli, zda by biochemicky klesající neuronální excitabilita striatopallidních neuronů vyvolala senzibilizaci režimu dávkování amfetaminu, který vyvolá prahovou úroveň senzitizace a zda snížená neuronální excitabilita striatonigrálních neuronů by zabránila senzibilizaci v protokolu, který normálně vyvolává silnou senzibilizaci.

U první studie jsme použili režim léčby, který indukuje prahovou úroveň pohybové senzitizace u kontrol GFP (čtyři expozice léku). Po uplynutí ochranné lhůty byla podávána amfetaminová dávka (2 mg / kg) s mírnou výzvou v nepřítomnosti CNO-indukované útlumu neuronové aktivity, aby se zjistilo, zda je senzitizace perzistentní. CNO zprostředkovaná aktivace pENK-hM₄D během léčby amfetaminem nezměnil akutní lokomotorickou odpověď na amfetamin (Obr. 2a). Nicméně CNO-zprostředkované narušení neuronové aktivity u neuronů s nepřímou cestou usnadnilo vývoj výrazně silnější senzibilizace ve srovnání s kontrolou GFP (Obr. 2b). Toto zvýšení senzitivity bylo udržováno na výzvě amfetaminu, která byla provedena o týden později v nepřítomnosti léčby CNO (Obr. 2c, d). Tyto účinky mohou být přičítány redukci aktivity striatopallidních neuronů závislou na CNO pomocí hM₄D receptory, protože hM₄D exprese receptoru bez léčby CNO nevyvolává lokomotorickou senzibilizaci tohoto mírného dávkovacího režimu amfetaminu (Doplňkový obrázek 6).

  

Obrázek 2

Přechodné snížení excitability striatopallidních nebo striatonigrálních neuronů mělo protichůdné účinky na senzitizaci amfetaminu. (a, e) Akutní lokomotorické reakce na amfetamin po CNO-indukované aktivaci pENK-hM₄D (a) a strDYN-hM₄D (e) receptory. ...

Abychom zjistili, zda striatonigrální neurony mohou regulovat reakci léku protikladným způsobem, dále testujeme účinek biochemicky snižujícího excitability striatonigrálních neuronů v dorzomediálním striatu během léčebného režimu amfetaminu, který produkuje silnou senzibilizaci u kontrol GFP (šest expozičních forem ), stejně jako během nízkého podání dávky amfetaminu (0.5 mg / kg) v nepřítomnosti porušení neuronální aktivity zprostředkované receptory. Stejně jako při tlumení nepřímých cest, CNO-zprostředkované snížení excitability neuronů s přímou cestou během léčby amfetaminem nezměnilo akutní lokomotorickou odpověď na amfetamin (Obr. 2e). Ačkoli vývoj senzitizace se podobal kontrolám GFP po CNO-indukované aktivaci pDYN-hM₄D receptorů během léčby (Obr. 2f), nebyla v p. přetrvávána senzibilizaceDYN-hM₄D skupina, ale byla stále udržována v kontrolách GFP (Obr. 2g, h). Tyto účinky mohou být také připisovány CNO-závislému poklesu aktivity striatonigrálních neuronů hM₄D receptory, protože hM₄Exprese D receptoru v nepřítomnosti léčby CNO nezabránilo rozvoj pohybové senzitizace, neboť byla pozorována senzitizace během léčby a na podání léku (Doplňkový obrázek 7). Tyto údaje naznačují, že striatonigrální neurony mohou být zvláště důležité pro regulaci dlouhodobých behaviorálních adaptací, které jsou důsledkem opakovaného užívání drog.

Na závěr tyto údaje poskytují první důkaz kritické a protikladné role striatopallidních a striatonigrálních neuronů při regulaci plasticity chování závislé na zkušenostech s drogami. Kromě toho nedostatek účinku inhibice neuronů na akutní lokomotorickou odpověď na amfetamin poskytuje další důkaz, že mechanismy, které regulují akutní reakce na léky, jsou odlišné od mechanismů, které modulují trvalé adaptace, ke kterým dochází při opakované expozici léčiva. Konečně, párování fenotypově specifických virových vektorů s návrhovými receptory schopnými měnit neuronovou aktivitu bez trvalého narušení funkce buněk poskytuje nový a silný přístup k dekonstrukci molekulárního základu závislosti.

Doplňkový materiál

Poděkování

Poznámky pod čarou

Reference