Endogene Opioid-induzierte Neuroplastizität von dopaminergen Neuronen im ventralen Tegmentalbereich beeinflusst natürliche und opiate Belohnung (2014)

BEMERKUNGEN: Das DeltaFosB-Studien wir zitieren oft alle konzentriert auf der Nucleus accumbens (Belohnungszentrum) und stellte fest, dass Sex so ziemlich die gleichen Gehirnmechanismen auslöst wie Meth und Kokain. Aus der wegweisenden Studie desselben Forschers (Natural and Drug Rewards-Gesetz über gemeinsame Mechanismen der neuronalen Plastizität mit ΔFosB als Schlüsselmediator (2013)):

Somit konvergieren natürliche und medikamentöse Belohnungen nicht nur auf demselben Nervenweg, sondern auch auf denselben molekularen Mediatoren und wahrscheinlich in denselben Neuronen im Nucleus Accumbens, um die Anreizwirkung und das „Wollen“ beider Arten von Belohnungen zu beeinflussen

Das Mitnehmen: Meth, Kokain und Sex machen die gleichen grundlegenden Dinge für die gleichen Nervenzellen im Belohnungszentrum (Nucleus accumbens), was auch immer sie anderswo im Gehirn anders machen mögen. Dies löste das übliche Argument auf, dass natürliche Belohnungen und Drogen sich in Mechanismen und Wirkungen unterscheiden.

Diese neue Studie untersuchte, was Sex mit dem VTA macht. Im VTA beginnen die Dopamin-produzierenden Nervenzellen - und sie verzweigen sich zum Nucleus accumbens, zur frontalen Kortikalis und zur Amygdala. Grundsätzlich ist das VTA die Quelle (Quelle) des größten Teils unseres Dopamins. Sehen Sie sich diese 2 Bilder der Belohnungsrunde an: Pic1, Pic2

Forscher fanden heraus, dass Sex (Höhepunkt) die Zellkörper in der VTA vorübergehend (bei Männern) schrumpft. Zellkörper und ihre Dendriten umfassen die graue Substanz des Gehirns. Genau dies bewirkt die Heroinabhängigkeit der VTA (kein einmaliger Heroinkonsum, sondern chronischer Heroinkonsum). Beachten Sie, dass die gleiche Schrumpfung der VTA-Zellkörper tritt bei Menschen Heroinsüchtigen auf.

Die geschlechtsbedingte Zellschrumpfung dauert mindestens 7 Tage. Die durch den Geschlechtsverkehr induzierten Veränderungen hatten sich zu 30-Tagen normalisiert, aber die Forscher bewerteten nur die Tage 1, 7 und 30.

Das Schrumpfen der Zellkörper bei Heroinsucht führt zu einem niedrigeren Dopaminspiegel im Nucleus accumbens - oder wie wir es nennen Desensibilisierung. Die Forscher verabreichten den Ratten Morphium, um ihre Reaktion (nach dem Geschlecht) zu beurteilen, aber es passierte nichts. Normalerweise mögen die Ratten das Morphium sehr, aber hier waren sie vorübergehend desensibilisiert. Kurz gesagt, der Belohnungskreislauf der Ratten nach der Ejakulation reagierte nicht auf den niedrigen Heroinspiegel. Die Forscher vermuteten, dass höhere Dosen erforderlich wären, um eine „normale“ Rattenreaktion auszulösen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sex (vorübergehend) im VTA genau dasselbe tut wie Heroinsucht: Schrumpfen der Dopamin-produzierenden Nervenzellkörper. Dies führt zu einem niedrigeren Dopaminspiegel im Belohnungszentrum und einer geringeren Reaktion auf Betäubungsmittel - und es dauert mindestens 7 Tage, bis sich das Gehirn von Ratten erholt hat.

 

J Neurosci. 2014 Jun 25;34(26):8825-36. doi: 10.1523 / JNEUROSCI.0133-14.2014.

Pitchers KK1, Coppens CM2, Beloate LN3, Fuller J2, Van S2, Frohhaber KS2, Laviolette SR2, Lehman MN4, Coolen LM5.

Abstrakt

Natürliche Belohnung und Drogen des Missbrauchs konvergieren auf dem mesolimbischen Weg und aktivieren den gemeinsamen Mechanismus der neuralen Plastizität im Nucleus accumbens. Eine chronische Opiat-Exposition induziert Plastizität in dopaminergen Neuronen des ventralen tegmentalen Bereichs (VTA), die die Morphin-Belohnungstoleranz reguliert.

Hier testen wir die Hypothese, dass die Paarungs-induzierte Freisetzung von endogenen Opioiden in der VTA morphologische Veränderungen von VTA-Dopamin-Zellen in männlichen Ratten verursacht, die wiederum die langfristige Expression von erfahrungsbedingten Verstärkung des Sexualverhaltens regulieren.

Erstens, sexuelle Erfahrung verringert VTA Dopamin Soma Größe 1 und 7 Tage, aber nicht 30 Tage nach der letzten Paarungssitzung. Dieser Effekt wurde mit Naloxon blockiert vor jeder Paarungssitzung; Daher war die VTA-Dopaminzellplastizität abhängig von der Wirkung endogener Opioide.

Im Gegenzug wurde die VTA-Plastizität mit einer veränderten Opiatbelohnung assoziiert, da sexuell erfahrene Männer keine bedingte Präferenz für 0.5 mg / kg Morphin bildeten.

Als nächstes wurde bestimmt, ob die endogene Opioidwirkung sexuelle Belohnung und Gedächtnis in männlichen Ratten vermittelt, die während der Paarungserfahrungen mit Naloxon entweder systemisch oder intra-VTA behandelt wurden. Naloxon verhinderte nicht die anfängliche erfahrungsinduzierte Erleichterung des Sexualverhaltens über wiederholte Paarungssitzungen oder konditionierte Platzpräferenz für Paarung. Die Naloxonbehandlung dämpfte jedoch den längerfristigen Ausdruck der erfahrungsinduzierten Erleichterung des Sexualverhaltens und der neuralen Aktivierung in mesolimbischen Gebieten, die durch Paarungs-assoziierte konditionierte Signale induziert wurden.

Zusammen zeigen diese Daten, dass endogene Opioide während der Paarung eine neurale Plastizität in VTA-Dopamin-Neuronen induzieren, die für die Morphiumbelohnung und das Langzeitgedächtnis für das natürliche Belohnungsverhalten kritisch zu sein scheinen.

 

Einleitung

Natürliches Belohnungsverhalten wird durch das mesocorticelimbische System vermittelt (Meisel und Mullins, 2006; Hoebel et al., 2009; Frohmaderet al., 2010a; Pitcher et al., 2010a; Young ua, 2011; Blum et al., 2012). Missbrauchsdrogen verursachen neurale Veränderungen in diesem System, die wiederum zur Entwicklung und zum Ausdruck von Drogenmissbrauch beitragen (Hyman et al., 2006; Nestler, 2012). Wir haben zuvor festgestellt, dass Erfahrung mit natürlichem Belohnungsverhalten, dh sexuelle Erfahrung bei männlichen Ratten, auch neurale Plastizität im Nucleus Accumbens (NAc) verursacht, einschließlich erhöhter dendritischer Stacheln (Pitcher et al., 2010a) und deltaFosB (Pitcher et al., 2013). Im Gegenzug ist diese geschlechtsbedingte Plastizität entscheidend für die Auswirkungen der Sexualerfahrung auf die nachfolgende Paarung, die sich als Erleichterung der Initiation und der Ausführung des sexuellen Verhaltens manifestiert (Pitcher et al., 2010b, 2012, 2013). Darüber hinaus verändert die Sexualerfahrung die Ansprechbarkeit auf Psychostimulantien, einschließlich der Sensibilisierung der lokomotorischen Aktivität und der erhöhten Belohnung (Frohmaderet al., 2010a; Pitcher et al., 2010a, 2013).

Die NAc ist ein Downstream-Ziel der dopaminergen Neuronen im ventralen tegmentalen Bereich (VTA). VTA-Dopamin-Neuronen werden während der Paarung und nach Exposition gegenüber konditionierten Signalen aktiviert, die eine sexuelle Belohnung vorhersagen (Balfour et al., 2004; Frohmaderet al., 2010a), durch endogene Opioidpeptid (EOP) -Bindung an μ-Opioidrezeptoren (MORs; Matthews und Deutsch, 1984; Johnson und Norden, 1992; Klitenick et al., 1992; Ikemotoet al., 1997; Balfour et al., 2004). Daher verursacht die Exposition gegenüber konditionierten Signalen, die auf Sexualverhalten hinweisen, eine Freisetzung von EOP- und VTA-Dopamin-Zell-Aktivierung, was die sexuelle Motivation erleichtert (Mitchell und Stewart, 1990; van Furth et al., 1995; van Fürth und van Ree, 1996) und Dopaminfreisetzung im NAc (Fiorinoet al., 1997).

Wiederholte Exposition gegenüber exogenen Opiaten verursacht morphologische Veränderungen in der VTA (Mazei-Robison et al., 2011; Mazei-Robison und Nestler, 2012), reduzierte Soma-Größe von VTA-Dopamin-Neuronen (Sklair-Tavron et al., 1996; Spiga et al., 2003; Chuet al., 2007; Russo et al., 2007; Mazei-Robison et al., 2011), verringerte Spiegel von Neurofilamentproteinen (Beitner-Johnson et al., 1992), erhöhte Erregbarkeit von Dopamin-Zellen und reduzierte axoplasmatischen Transport und Dopamin-Ausgang zu den NAc (Beitner-Johnson et al., 1992; Mazei-Robison et al., 2011). Diese Veränderungen der VTA-Dopaminneuronen verursachen eine Morphin-Belohnungstoleranz und sind vorübergehend, wenn sie innerhalb eines Monats nach Arzneimittelabstinenz abgebaut werden (Russo et al., 2007). Es ist derzeit unklar, ob Plastizität in den VTA-Dopamin-Neuronen einzigartig für die Wirkungen von Opiaten ist oder ob sie auch durch die Freisetzung von EOP während des natürlichen Belohnungsverhaltens erzeugt werden.

Hier testen wir die Hypothese, dass natürliche Belohnungserfahrungen Neuroplastizität verursachen, ähnlich der von Opiaten, und dass Opiate daher auf einen Plastizitätsmechanismus konvergieren, der für natürliches Belohnungsverhalten und Belohnungsgedächtnis entscheidend ist. Wir testen, ob sexuelle Erfahrung bei männlichen Ratten die Soma-Größe von VTA-Dopamin-Neuronen über einen Prozess, der von der EOP-Wirkung in der VTA abhängt, reduziert. Darüber hinaus untersuchen wir, ob EOP-induzierte Veränderungen in VTA-Dopamin-Neuronen mit der Verstärkung des natürlichen Belohnungsverhaltens und der Zuschreibung von Anreiz-Salienz zu Signalen verbunden sind, die mit natürlicher Belohnung assoziiert sind, während sie eine Toleranz gegenüber Morphin-Belohnung verursachen.

Materialen und Methoden

Tiere

Adulte männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-225 g) wurden von Charles River erhalten und paarweise in künstlich beleuchteten Räumen in einem 12 h-Hell / Dunkel-Zyklus in allen Experimenten untergebracht (Lichter an 10: 00 AM bis auf das Morphintoleranz-Experiment) , Lichter bei 5: 00 PM). Essen und Wasser waren vorhanden ad libitum außer während des Verhaltenstests. Stimulus-Weibchen wurden ovariektomiert und subkutan mit 5% 17-β-Östradiolbenzoat-SILASTIC-Kapseln (1.98 mm Innendurchmesser, 0.5 cm Länge, Dow-Corning) implantiert. Injektionen von Progesteron (subkutan, 500 & mgr; g in 0.1 ml Sesamöl) wurden 3-6 h vor dem Test verabreicht, um sexuelle Empfänglichkeit zu induzieren. Alle Verfahren wurden von den Animal Care Committees der University of Western Ontario und der University of Michigan genehmigt und entsprachen den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und National Institutes of Health für Wirbeltierforschung.

Zeitverlauf der VTA-Dopamin-Soma-Größenveränderungen

Tägliche Paarungssitzungen.

Um den zeitlichen Verlauf der Veränderungen der Dopamin-Neuronen-Soma-Größe in der VTA zu untersuchen, wurden sexuell erfahrene und naive Tiere bei 1, 7 oder 31 d getötet (n = 5-8 pro Gruppe) nach dem letzten Tag der Paarung (erfahren) oder der Handhabung (naiv). Sexuell erfahrene Gruppen wurden hinsichtlich des sexuellen Verhaltens während der letzten Paarungssitzung sowie der Gesamtanzahl der Ejakulationen über die fünf Sitzungen (Durchschnitt von 5 für jede Gruppe) verglichen und unterschieden sich in keinem Parameter des sexuellen Verhaltens.

Paarungssitzungen.

Sexuell naive Männer wurden einer der beiden Versuchsbedingungen zugeordnet: sexuell naiv oder sexuell erfahren. Sexuell erfahrene Tiere durften sich fünf aufeinanderfolgende Tage mit rezeptiven Weibchen in rechteckigen Testkäfigen (60 × 45 × 50 cm) bis zur Anzeige der Ejakulation oder bis zu 1 h paarweise paaren (je nachdem, was zuerst eintrat). Die Käfige wurden gründlich mit 70% Ethanollösung gereinigt und frisches Bettzeug wurde zwischen Paarungssitzungen hinzugefügt. Sexuelles Verhalten wurde während der Dunkelphase (2-6 h nach Beginn der Dunkelheit) durchgeführt. Nur Tiere, die während mindestens vier der fünf Paarungssitzungen ejakulierten, wurden als sexuell erfahren und in Experimente eingeschlossen. Alle Paarungssitzungen wurden beobachtet und sexuelles Verhalten wurde aufgezeichnet. Die Anzahl der Halterungen (M) Intros (IMs), Halterungslatenz (ML; Zeit von der Einführung des Weibchens bis zum ersten Halter), Intrusions Latenz (IL; Zeit von der Einführung des Weibchens bis zur ersten Intrusion) und Ejakulationslatenz (EL; Zeit von der ersten Intrusion bis zur Ejakulation) aufgezeichnet (Agmo, 1997). Naive Tiere wurden in einen sauberen Testkäfig für 1 h gleichzeitig mit sexuell erfahrenen Männchen gesetzt, die sich in demselben Raum paaren, so dass sie entfernten weiblichen Gerüchen ausgesetzt waren, und ähnliche Grade an Störung und Umweltneuheit wie erfahrene Männchen.

Immunfluoreszenzmarkierung

Die Tiere wurden unter Verwendung von Natriumpentobarbital (270 mg / kg, ip) tief anästhesiert und intrakardial mit 50 ml 0.9% Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von 500 ml 4% Paraformaldehyd in 0.1 m Natriumphosphatpuffer (PB). Die Gehirne wurden entfernt und für 1h bei Raumtemperatur (RT) in dem gleichen Fixiermittel nachfixiert und dann in 20% Saccharose und 0.01% Natriumazid in 0.1 m PB zur Lagerung bei 4 ° C eingetaucht. Koronale Schnitte wurden bei 35 & mgr; m auf einem Gefriermikrotom (H400R, Microm) geschnitten und in vier parallelen Reihen in einer Kälteschutzlösung (30% Saccharose, 30% Ethylenglykol in 0.1 m PB) gesammelt und dann bei 20 ° C gelagert. Alle Inkubationen wurden bei RT unter leichtem Rühren und reichlichen Spülungen mit 0.1 m PBS, pH 7.35, zwischen den Inkubationen durchgeführt. Die Schnitte wurden 1% H ausgesetzt2O2 für 10 min, um endogene Peroxidasen zu zerstören, dann blockiert für 1h in Inkubationslösung (PBS +: PBS enthaltend 0.4% Triton X-100; Sigma-Aldrich) und 0.1% Rinderserumalbumin (Jackson Immuno Research Laboratories). Als nächstes wurden die Abschnitte über Nacht bei Raumtemperatur in einem Maus-Tyrosinhydroxylase (TH) -Antikörper inkubiert (1: 20 000; Millipore). Nach der Inkubation des primären Antikörpers wurden die Schnitte mit XFUMM 555-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper (1: 100; Invitrogen, Eugene, OR) für 30 min inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte mit 0.1 m PB gewaschen, auf Superfrost Plus-Glasobjektträgern aufgebracht, getrocknet und mit Gelvatol, das das Antiverblassungsmittel 1,4-Diazabicyclo (2,2) -octan (DABCO; 50 mg / ml, Sigma-Aldrich; Lennette, 1978).

Datenanalyse: Neuronen-Soma-Größe.

Bilder von TH-immunoreaktiven (IR) Neuronen in der VTA wurden bei 40 × Vergrößerung bei drei rostralen bis kaudalen Ebenen (Balfour et al., 2004). Es wurden keine Unterschiede zwischen den Zellen auf den verschiedenen Ebenen festgestellt. Die Soma-Größe von TH-IR-Neuronen wurde unter Verwendung von ImageJ (National Institutes of Health) analysiert. Die mittlere Fläche, der Umfang und die Zirkularität wurden wie beschrieben gemessen Sklair-Tavronet al. (1996). Ein Durchschnitt von 25-Zellen pro Tier (kombiniert alle 3-VTA-Spiegel) wurde analysiert und nur Zellen mit einem deutlich sichtbaren Kern wurden eingeschlossen. Für jedes Tier wurden die mittlere Fläche, der Umfang und die Kreisform berechnet. Für die statistische Analyse wurde eine Zwei-Wege-ANOVA verwendet [Faktoren: sexuelle Erfahrung (geschlechtsabhängig oder sexuell naiv) und Zeit (1, 7 oder 31 d)] gefolgt von Post-hoc- Vergleiche mit der Holm-Sidak-Methode mit einem Signifikanzniveau von 0.05.

VTA nicht-Dopamin-Veränderungen

Zweiwöchige Paarungssitzungen.

Um zu testen, ob sexuelle Erfahrung während täglicher Paarungssitzungen für eine Abnahme der TH-IR-Neuronen-Soma-Größe erforderlich ist, wurden VTA-Dopamin-Neuronen von Tieren, die sich während fünf zweiwöchiger Paarungssitzungen verpaart hatten, analysiert. Paarungssitzungen waren wie oben beschrieben, aber über einen Zeitraum von 2.5 Wochen. Gehirne wurden 7 d nach der letzten Paarung oder Handhabung gesammelt.

Immunoperoxidase-Markierung.

Zusätzlich wurde getestet, ob die Verwendung von sensitiven Färbetechniken mit Immunoperoxidase- und Chromogen-Detektion auch die Visualisierung von TH-IR-Soma-Größenänderungen ermöglichen würde. Die Perfusions- und Gewebeverarbeitung erfolgte wie oben beschrieben. Nach Behandlung mit 1% H2O2 und PBS + Sektionen wurden über Nacht bei RT in einem polyklonalen Tyrosinhydroxylase (TH) -Antikörper der Maus inkubiert (1: 20 000; Millipore). Nach der primären Antikörperinkubation wurden die Schnitte mit Biotin-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1h, 1: 500 in PBS +; Vector Laboratories), Avidin-Biotin-Meerrettichperoxidase (1h, ABC-Elite; 1: 1 000 in PBS) inkubiert (Vector Laboratories) und 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (10min, 0.02%, DAB; Sigma-Aldrich), verstärkt mit Nickelsulfat in (0.02% in 0.1 m PB) mit Wasserstoffperoxid (0.015%). Die Schnitte wurden gründlich in 0.1 m PB gewaschen, um die Reaktion zu beenden, und auf kodierten Superfrost plus Glasobjektträgern (Fisher) mit 0.3% Gelatine in ddH befestigt2O. Nach der Dehydratisierung wurden alle Objektträger mit einem DPX-Träger (Dibutylphthalat Xylol; Sigma-Aldrich) eingedeckt.

Datenanalyse: Neuronen-Soma-Größe.

TH-IR-Zellen wurden wie oben beschrieben auf Fläche, Umfang und Zirkularität analysiert. Zusätzlich wurden TH-IR-Zellen in Substantia nigra (SN) in denselben Abschnitten analysiert, die für die Analyse von VTA-TH-IR-Zellen verwendet wurden. Schließlich wurden nach der Analyse von VTA- und SN-TH-IR-Zellen Schnitte unter Verwendung von Cresylviolett gegengefärbt und Nicht-TH-IR-Zellen wurden unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben beschrieben analysiert. Die Unterschiede zwischen naiven und erfahrenen Gruppen wurden mit zweiseitigen Studenten verglichen t Tests mit einem Signifikanzniveau von 0.05.

Auswirkungen von Naloxon auf erfahrungsinduzierte Dopamin-Soma-Größenreduktion

Um zu bestimmen, ob MORs eine Rolle bei sexuell erfahrenen Veränderungen der Dopamin-Neuronen-Soma-Größe spielten, wurden MOR während des Sexualverhaltens blockiert. Die Hälfte der Tiere erhielt sexuelle Erfahrung, während die andere Hälfte behandelt wurde, aber sexuell naiv blieb. Sexuell erfahrene Tiere durften sich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen paaren. Innerhalb der sexuell erfahrenen und naiven Gruppen wurden die Tiere vor der Einführung der Frau (erfahren) oder vor der Handhabung mit dem nichtselektiven MOR-Antagonisten Naloxon (10 mg / kg, sc; Sigma-Aldrich, gelöst in 0.9% Kochsalzlösung) oder Kochsalzlösung 30 min behandelt (naiv); Dadurch entstehen vier experimentelle Gruppen: sexuell naive Kochsalzlösung (Naive Sal), sexuell naives Naloxon (Naive NLX), sexuell erfahrene Kochsalzlösung (Exp Sal) und sexuell erfahrenes Naloxon (Exp NLX; n = 5-8 pro Gruppe). Die Behandlung mit Naloxon hatte keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf irgendeinen Parameter des Sexualverhaltens auf irgendeinem der 5 d, und die mit Naloxon und Kochsalzlösung behandelten Gruppen waren in ihrer sexuellen Erfahrung identisch. Alle Tiere wurden nach der letzten Paarungssitzung über die intrakardiale Perfusion 7 d getötet. Sektionierung, Immunhistochemie und Datenanalyse (Zweiwege-ANOVA; Faktoren: Sex-Erfahrung und Arzneimittelbehandlung) für die Dopamin-Soma-Größe wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

Morphin bedingte Präferenz

Experimentelles Design.

Zuvor Russoet al. (2007) zeigte, dass chronisches Morphin Toleranz gegenüber Morphin-Belohnung induziert. Da sexuelle Erfahrung und chronisches Morphin eine ähnliche Abnahme der Soma-Größe von Dopamin-Neuronen in der VTA verursachen, wurde die funktionelle Relevanz der geschlechtsinduzierten morphologischen Veränderungen auf Morphin-Belohnung getestet. Sexuell erfahrene und naive Tiere wurden in sechs verschiedene Versuchsgruppen eingeteilt (n = 9-13 pro Gruppe) basierend auf sexuellem Verhalten (sexuell naiv oder erfahren) und Morphindosis (0.5, 5.0 oder 10.0 mg / kg, ip) und wurden auf Morphin-induzierte konditionierte Präferenz (CPP) getestet.

Morphin-CPP.

Die Konditionierung erfolgte 1 d nach der letzten Paarungssitzung und die Gruppen wurden für die sexuelle Leistung während der letzten Paarungssitzung abgestimmt. Das verwendete CPP-Paradigma bestand aus einem Vortest, Konditionierungstagen und Nachtest, und der Apparat basierte auf Tenket al. (2009). Kurz gesagt bestand die CPP-Apparatur (MED Associates) aus drei verschiedenen Kammern. Zwischen jeder Sitzung wurde die Apparatur gründlich mit 70% iger Ethanollösung gereinigt, um verbleibende olfaktorische Hinweise zu minimieren. Um die individuellen Präferenzen zu bestimmen, wurde ein Vortest durchgeführt, bei dem den Tieren 15 Minuten lang freier Zugang zum gesamten Gerät gewährt wurde. Als Gruppe zeigten die Tiere keine signifikante Präferenz für eine bestimmte Kammer, aber jedes einzelne Tier hatte eine leichte anfängliche Präferenz. Ratten, die während des Vortests eine wesentliche Präferenz für eine der Kammern zeigten (> 200 s Unterschied zwischen der in jeder der Kammern verbrachten Zeit; <5% der Tiere), wurden von der Studie ausgeschlossen. Während des Konditionierens wurde das Arzneimittel unter Verwendung eines unvoreingenommenen Paradigmas entweder mit einer anfänglich bevorzugten oder einer nicht bevorzugten Kammer gepaart (Tzschentke, 2007) und Tiere wurden für 30 min in die Kammern eingesperrt. Den Tieren wurde morgens Kochsalzlösung (ip) injiziert (9: 00 AM bis 12: 00 PM) und auf die Kochsalzlösung gepaarte Kammer (Kontrolle) beschränkt. Am Nachmittag (1: 00-4: 00 PM) wurde den Tieren Morphin (ip, 0.5 mg / kg, 5.0 mg / kg oder 10.0 mg / kg; Morphinsulfat gelöst in 0.9% Kochsalzlösung, Johnson Matthey) injiziert und eingesperrt zu der Morphin-gepaarten Kammer. Die Tiere wurden zwei Konditionierungstagen unterzogen. Am nächsten Tag (3 d nach dem letzten Tag der Paarung) wurde ein post-test, der mit dem Vortestverfahren identisch war, durchgeführt. Für die statistische Analyse wurde die Zeit, die in der Morphin-gepaarten Kammer während des Nach-Tests verbracht wurde, mit der Zeit verglichen, die in der Salz-gepaarten Kammer während des Nach-Tests für sexuell naive oder erfahrene Männer innerhalb jeder Dosis unter Verwendung eines Paares verbracht wurde t Test. p <0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Zusätzliche Kontrollgruppen von sexuell naiven und erfahrenen Tieren erhielten sowohl in gepaarten als auch in ungepaarten Kammern Kochsalzlösung, um als negative Kontrollen zu dienen. Für beide Gruppen wurden keine Zeitunterschiede zwischen den Kammern festgestellt.

Auswirkungen von systemischem Naloxon auf erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens

Experimentelles Design.

Sexuelle Erfahrung führt zur Erleichterung des Sexualverhaltens, das mindestens für den 1-Monat aufrechterhalten wird (Pitcher et al., 2012). Um den Effekt der Blockierung von MOR auf die erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens zu untersuchen, erhielten sexuell erfahrene Tiere entweder Naloxon oder Kochsalzlösung vor den fünf aufeinanderfolgenden Paarungssitzungen (n = Jeweils 12) wie oben beschrieben. Eine Woche nach der letzten Paarungssitzung wurde ein abschließender Paarungstest durchgeführt, bei dem allen Tieren erlaubt wurde, sich bis zu einer Ejakulation oder bis zu 1 h zu paaren. Vor der Paarung am letzten Testtag wurde keine Behandlung mit Naloxon oder Kochsalzlösung verabreicht. Die Parameter der Paarung wurden verglichen, um zu bestimmen, ob Naloxon die geschlechtserfahrungsinduzierte Erleichterung der Paarung (Tag 1 vs. Tag 5) oder die Aufrechterhaltung dieser Erleichterung (Tag 5 vs Test) unter Verwendung einer Zweiwege-ANOVA beeinflusste [Faktoren: Behandlung (Kochsalzlösung gegen Naloxon ) und Tag (Tag 1, Tag 5 oder Test)] und Holm-Sidak-Methode für Post-hoc- Vergleiche. Für alle statistischen Tests, p <0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Zusätzliche Kontrollexperimente

Systemisches Naloxon am Testtag.

Um zu zeigen, dass das veränderte Sexualverhalten am letzten Paarungstesttag nicht auf das Fehlen von Naloxon zurückzuführen war, verabreichten wir entweder Naloxon oder Kochsalzlösung am letzten Paarungstesttag an Tiere, die Paarung mit Naloxon erhielten, während sie sexuelle Erfahrung machten. Insbesondere erhielten alle Tiere Naloxoninjektion (10 mg / kg, sc) 30 min vor der Paarung mit einer Ejakulation während 5 aufeinanderfolgenden Tagen. Am Testtag 7 d später erhielt etwa die Hälfte der Tiere eine Injektion von Naloxon (10 mg / kg, n = 7) oder Kochsalzlösung (n = 6) 30 min vor Einführung einer empfangenden Frau. Sexuelles Verhalten wurde beobachtet und aufgezeichnet. Die Parameter der Paarung wurden verglichen, um zu bestimmen, ob Naloxon die geschlechtserfahrungsinduzierte Erleichterung der Paarung (Tag 1 vs. Tag 5) oder die Aufrechterhaltung dieser Erleichterung (Tag 5 vs Test) unter Verwendung einer Zweiwege-ANOVA beeinflusste [Faktoren: Behandlung (Kochsalzlösung gegen Naloxon ) und Tag (Tag 1, Tag 5 oder Test)] und Holm-Sidak-Methode für Post-hoc- Vergleiche. Für alle statistischen Tests, p <5% wurden als statistisch signifikant angesehen.

Auswirkungen von Naloxon auf die kurzfristige Expression von erleichtertem Sexualverhalten.

Die Auswirkungen der Behandlung mit Naloxon (10 mg / kg, sc) während der Paarung wurden auf das nachfolgende sexuelle Verhalten während eines abschließenden Paarungstesttages getestet, der nur 1 d nach der letzten Paarung durchgeführt wurde (Kochsalzlösung, n = 5; Naloxon, n = 4).

Systemische Naloxon-Vorbehandlung.

Um festzustellen, ob wiederholte Behandlung von Naloxon allein verursacht Beeinträchtigung des sexuellen Verhaltens 7 d nach der letzten Behandlung erhielten sexuell naive Tiere fünfmal Naloxon (10 mg / kg, sc) oder Kochsalzlösung Injektionen an aufeinanderfolgenden Tagen vor einem Paarungstest 7 d nach dem endgültigen Naloxon oder Kochsalzlösung Injektion. An diesem letzten Testtag erhielten die Tiere keine Injektion. Sexuelles Verhalten wurde beobachtet und aufgezeichnet, wie oben beschrieben. Die Paarungsparameter wurden zwischen Gruppen mit ungepaarter Paarung verglichen t Tests. Für alle statistischen Tests, p <5% wurden als statistisch signifikant angesehen.

Systemische Naloxon und Sex Belohnung.

Eine Möglichkeit für die abschwächenden Wirkungen von Naloxon auf die Anzeige der Aufrechterhaltung eines erleichterten Sexualverhaltens besteht darin, dass Naloxon die belohnenden Wirkungen des Sexualverhaltens blockiert. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde das CPP-Paradigma für sexuelles Verhalten unmittelbar nach der Injektion von Naloxon oder Kochsalzlösung bei Männern ohne vorherige sexuelle Erfahrung durchgeführt. Das CPP-Verfahren war ähnlich wie oben für Morphin-CPP beschrieben, einschließlich Vortest, Konditionierungstage und Nach-Test.

Das Sexualverhalten wurde mit der ursprünglich nicht bevorzugten Kammer gepaart. Ausbalanciert erhielt jedes Tier eine Injektion von Naloxon (n = 12) oder Kochsalzlösung (n = 11) 30 min vor Erhalt des Zugangs zu einer empfangenden Frau. Die durchschnittliche Dauer der Paarungssitzung betrug ~13 min. Eine Minute nach der Ejakulation wurde das Tier für 30 min in die gepaarte Kammer gelegt. An dem anderen Konditionierungstag erhielten die Tiere eine Injektion von entweder Naloxon oder Kochsalzlösung (was auch immer sie vor der Paarung erhielten) und wurden für 30 min in die ungepaarte Kammer gegeben. Als nächstes wurde ein Post-Test durchgeführt, der mit dem Vortest identisch war. Um die Kammerpräferenz zu bestimmen, wurde die in der gepaarten Kammer während des Vortests und des Nachtests verbrachte Zeit verglichen. Für die statistische Analyse gepaart t Tests wurden verwendet, um die Präferenz- und Differenz-Scores und die Zeit in der gepaarten Kammer während des Pretests und des Post-Tests zu vergleichen, um zu bestimmen, ob ein signifikanter CPP für das Sexualverhalten gebildet wurde. p <0.05 wurde als signifikant angesehen.

Auswirkungen von Intra-VTA-Naloxon auf erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens

Experimentelles Design.

Um zu bestimmen, ob die EOP-Wirkung spezifisch in der VTA für die Wirkungen sexueller Erfahrung-induzierter Veränderungen auf das Sexualverhalten verantwortlich war, unterzogen sich Tiere einer lokalen Infusion von Naloxon oder Kochsalzlösung in die VTA vor fünf täglichen Paarungssitzungen. Das Verhaltensparadigma war dem systemischen Naloxon-Experiment ähnlich. Sexuell erfahrene Tiere durften sich während 5 aufeinanderfolgenden Tagen bis zu einer Ejakulation oder bis zu 1 h paaren. Fünfzehn Minuten vor dem Einführen des empfänglichen Weibchens erhielten die männlichen Ratten bilaterale Infusionen von entweder Naloxon (10 & mgr; g / & mgr; l pro Hemisphäre; 0.5 & mgr; l Volumen; gelöst in 0.9% Kochsalzlösung) oder Kochsalzlösung (0.5 & mgr; l pro Hemisphäre). Bilaterale Mikroinjektionen wurden mit einer Flussrate von 0.5 & mgr; l / min über ein 1 min-Intervall verabreicht, gefolgt von einem zusätzlichen 1 min, wobei die Injektionskanüle zur Diffusion an Ort und Stelle belassen wurde. Die Injektionskanüle wurde dann durch die Blindkanüle und die Staubkappe ersetzt. Eine Woche nach dem letzten Tag der Paarung (Testtag) passten alle Tiere erneut zur Ejakulation ohne eine Infusion von Naloxon oder Kochsalzlösung. Figure 3A skizziert das experimentelle Design. Die Datenanalyse wurde wie im systemischen Naloxon-Experiment beschrieben durchgeführt.

Kanülierungsoperation.

Männliche Ratten wurden mit einer intraperitonealen Injektion (0.1 ml / kg) Ketamin (0.87 mg / ml) und Xylazin (0.13 mg / ml) anästhesiert und in eine stereotaktische Vorrichtung (Kopf Instruments) gegeben. Bilaterale 21-Gauge-Führungskanülen (Plastics One) wurden durch kleine Bohrlöcher im Schädel in das Gehirn in Richtung der VTA bei -4.8 mm AP, ± 0.75 mm ML von Bregma und -7.8 mm DV von der Oberseite des Schädels nach gesenkt Paxinos und Watson (2013). Die Kanülen wurden mit Dental-Acryl befestigt, das an drei in den Schädel gesetzten Schrauben anhaftete. Die Tiere erhielten eine 2-Woche-Erholungsphase und wurden täglich für die Gewöhnung an Handhabungs- und Injektionsverfahren behandelt, die während des Verhaltenstests verwendet wurden.

Überprüfung der Kanülenplatzierung

Die Platzierung der Kanülen wurde unter Verwendung von TH-Immunfärbung untersucht, um zu bestätigen, dass die VTA genau zielgerichtet war. Nur Tiere mit korrekten Platzierungen wurden in die Analysen einbezogen (endgültige Gruppengrößen: erfahrene Kochsalzlösung) n = 8; erfahrenes Naloxon n = 6). Drei weitere Tiere, die Intra-VTA-Naloxon-Injektionen erhielten, die außerhalb der VTA gerichtet waren, wurden in einer "verpassten" Injektionsgruppe zusammengefasst. Die verpasste Gruppe wurde getrennt analysiert, um als anatomische Kontrollen und Mann-Whitney zu dienen U Der Test wurde verwendet, um das Verhalten am letzten Testtag mit Naloxon und Kochsalzlösung behandelten Männern zu vergleichen.

Mating-assoziierte kontextabhängige Cue-induzierte pERK-Expression

Experimentelles Design.

Die Exposition gegenüber dem Käfig, in dem Männchen eine Paarungserfahrung erworben haben, hat gezeigt, dass sie eine MOR-Aktivierung in der VTA und eine neurale Aktivität in VTA und NAc verursacht (Balfour et al., 2004). Daher dient die Paarungsumgebung als ein konditionierter Hinweis auf sexuelle Belohnung. Die aktuelle Studie testete, ob eine MOR-Aktivierung während der sexuellen Erfahrung für eine nachfolgende konditionierte Cue-induzierte neurale Aktivierung erforderlich ist. Naloxon oder Kochsalzlösung wurde systemisch (ip) 30 min vor der Platzierung in der Paarungsarena und der Einführung einer empfänglichen Frau zur Paarung (erfahren) oder vor der Kontrollmanipulation verabreicht, die aus der Platzierung im Behandlungskäfig ohne Präsentation der Frau (neutral) bestand Umwelt; naiv). So wurden vier experimentelle Gruppen erstellt: Naive Sal, Naive NLX, Exp Sal ​​und Exp NLX. Eine Woche nach der letzten Paarungssitzung war die Hälfte der Tiere in jeder Gruppe dem Paarungskäfig ausgesetzt (exp. Männchen: geschlechtsassoziierte konditionierte Signale) oder handhabendem Käfig (naive Männchen: nicht-neutrale / neutrale Signale), während die andere Hälfte nicht exponiert war irgendwelche Hinweise und stattdessen blieb in den Hauskäfigen (um Ausgangswert pERK Ausdruck zu bestimmen). Dieses experimentelle Paradigma erzeugte 8-Gruppen: Naive Sal-No Cue, Naive Sal + Cue, Naive NLX-No Cue, Naive NLX + Cue, Exp Sal-No Cue, Exp Sal ​​+ Cue, Exp NLX-No Cue, Exp NLX + Cue (n = 4 jeder außer Naive NLX-No Cue, n = 3). Die Tiere wurden nach der Belichtung mit 10-15 min perfundiert. Kontrolltiere wurden aus ihren Hauskäfigen entfernt und gleichzeitig perfundiert.

Immunhistochemie.

Sektionierung und Immunhistochemie wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Hier verwendeten wir einen polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen p42 und p44-MAP-Kinasen ERK1 und ERK2 (pERK; 1: 4 000; Zellsignaltechnologie). Der primäre Antikörper wurde in der Literatur umfassend charakterisiert (Roux und Blenis, 2004; Murphy und Blenis, 2006; Frohmaderet al., 2010b). Darüber hinaus verhinderte das Weglassen des primären Antikörpers jegliche Immunreaktivität und die Western-Blot-Analyse von Rattenhirngewebe zeigte zwei Banden bei den geeigneten Molekulargewichten.

Datenanalyse.

pERK-immunoreaktive (-IR) -Zellen wurden in einer Anzahl von Gehirnregionen unter Verwendung eines an eine a Leica DMRD-Mikroskop: NAc [Kern (C) und Schale (S); 400 × 600 & mgr; m; mediale präfrontale Kortex; mPFC; anterior cingulate Bereich (ACA); prälimbischer Kortex (PL); infralimbischer Kortex (IL); 600 × 800 & mgr; m], Caudate-Putamen (CP; 800 × 800 & mgr; m) und basolaterale Amygdala (BLA; 900 × 1200 & mgr; m; Balfour et al., 2004; Frohmaderet al., 2010b; Pitcher et al., 2010b). Zwei Abschnitte wurden pro Hirnregion gezählt, und die Anzahl der Zellen in den Standardbereichen der Analysen wurde dann als Anzahl der Zellen pro mm berechnet2. Die zwei Zählungen wurden für die Berechnung der Gruppenmittel pro Tier gemittelt. Gruppendurchschnitte in sexuell erfahrenen oder naiven Gruppen wurden mit Zweiwege-ANOVA [Faktoren: medikamentöse Behandlung (NLX oder Sal) und Cue (Cue oder No Cue)] gefolgt von Post-hoc- Vergleiche mit dem Holm-Sidak- oder Mann-Whitney-Summen-Test gegebenenfalls mit einem Signifikanzniveau von p <0.05. In der NAc-Schale sexuell erfahrener Tiere gab es einen starken Trend zur Signifikanz der Faktoren, und daher wurden paarweise Vergleiche durchgeführt, um nur die Gruppen mit Kochsalzlösung (Sal-No Cue) und Kochsalzlösung (Sal + Cue) zu vergleichen.

Bilder.

Die digitalen Bilder wurden mit einer CCD - Kamera (Macrofire, Optronics) aufgenommen, die an eine Leica Mikroskop (DM5000B) mit festen Kameraeinstellungen. Bilder wurden in die Adobe Photoshop 9.0-Software importiert. Bilder wurden in keiner Weise verändert, außer für die Einstellung von Helligkeit und Kontrast.

Die Ergebnisse

Sex-Erfahrung-induzierte Veränderungen in VTA-Dopamin-Zellen

Sexuelle Erfahrung führte zu einer Abnahme der VTA-Dopamin-Soma-Größe (Abb.. 1A-C). Sexuelle Erfahrung reduziert Bereich und Umfang des Soma von VTA TH-IR Zellen (Bereich: F(1,31) = 23.068, p <0.001; Umfang, F(1,31) = 18.225, p <0.001). Es gab auch einen wesentlichen signifikanten Zeiteffekt (Bereich: F(2,31) = 6.377, p = 0.005; Umfang, F(2,31) = 4.389, p = 0.021) und eine signifikante Interaktion zwischen Erfahrung und Zeit (Bereich: F(2,31) = 5.284, p = 0.011; Umfang, F(2,31) = 4.347, p = 0.022). Paarweise Vergleiche zeigten, dass die Fläche und der Umfang der TH-IR-Zellen nach dem letzten Tag des sexuellen Verhaltens bei sexuell erfahrenen Tieren im Vergleich zu sexuell naiven Kontrollen signifikant reduziert waren 1 und 7 d [Abb.. 1B, Bereich: p = 0.002 (1 d), p <0.001 (7 d); C, Umfang: p = 0.009 (1 d), p <0.001 (7 d)]. Die Wirkung des Sexualverhaltens verschwand, wenn die Periode der Belohnungsabstinenz folgte, da die Somagröße der TH-IR-Neuronen nach der letzten Paarungssitzung auf den Ausgangswert 31 d zurückfiel (Abb.. 1B, Bereich: p = 0.798; C, Umfang: p = 0.785). Sexuelle Erfahrungen induzierte Veränderungen wurden zu keinem der Zeitpunkte in der Zirkularität entdeckt (Abb.. 1D). VTA-Dopamin-Soma-Größenreduktion war nicht von täglichen Paarungssitzungen abhängig, da Paarungserfahrungen während fünf zweiwöchiger Paarungssitzungen auch eine reduzierte VTA-Dopamin-Soma-Größe erzeugten (Abb.. 2A,B, E-H, Bereich: p = 0.004; Umfang: p <0.001). Im Gegensatz dazu hatte die Sexualerfahrung keinen Einfluss auf die TH-IR-Somagröße in der Substantia nigra (Abb.. 2C, Ich-J, Bereich: p = 0.13; Umfang: p = 0.16) oder veränderte Soma-Größe in benachbarten VTA-Nicht-TH-IR-Neuronen (Abb.. 2D, E-H, Bereich: p = 0.46; Umfang: p = 0.45).

Abbildung 1. 

Endogene Opioid-induzierte Soma-Größenveränderungen von VTA-Dopamin-Neuronen. A, Repräsentative Bilder von VTA-Dopamin-Neuronen von sexuell naiven und erfahrenen Tieren, die die Reduktion der Soma-Größe 7 d nach der letzten Paarungssitzung zeigen. Maßstabsbalken, 5 μm. Quantitative Daten, die zeigen, dass sexuelle Erfahrung (Exp, schwarze Balken) eine signifikante Verringerung der Fläche verursachte (B; in μm2) und Umfang (C; in μm) von VTA - Dopaminzellen, 1 d (Naive, Exp; n = 6) und 7 d (Naiv, n = 5; Exp, n = 6), aber nicht 31 d (Naive, n = 6; Exp, n = 8) nach der endgültigen Paarung, verglichen mit sexuell naiven Kontrollen (Naive, weiße Balken). Die Fläche wurde bei erfahrenen Männern auf 84% reduziert im Vergleich zu naiven Kontrollen bei 1 oder 7 d. Perimeter wurde in erfahrenen Gruppen auf 91.6 und 90% reduziert verglichen mit der Kontrolle bei 1 und 7 d resp. Es gab keinen Einfluss auf die Rundheit (D). Diese Plastizität der Dopamin-Zellen im Bereich (E) und Umfang (F) wurde durch Naloxon (NLX, n = 8), aber nicht salinisch (Sal, n = 7) während der Paarung, 7 d nach der letzten Paarung im Vergleich zu sexuell naiven Kontrollen (Sal, n = 5; NLX, n = 6). Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM; * zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu sexuell naiven Kontrollen desselben Tages (B, C) oder im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten sexuell naiven Kontrollen und mit Naloxon behandelten sexuell erfahrenen Männern (E, F).

Abbildung 2. 

Sexuelle Erfahrungen verringerten die Soma-Größe in Substantia nigra-Dopamin-Neuronen oder VTA-Nonopamin-Neuronen nicht. VTA TH-IR-Neuronen-Soma-Bereich (A; in μm2) und Umfang (B; in μm) bei sexuell naiven (weißen) und erfahrenen (schwarzen) Tieren, die durch Paarung zwei Mal pro Woche und nicht an aufeinanderfolgenden Tagen Erfahrungen gesammelt haben. Substantia nigra TH-IR Soma-Bereich (C) und VTA Nicht-TH-IR-Soma-Bereich (D) bei sexuell naiven (weiß) und erfahrenen (schwarzen) Tieren. Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM; * zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu sexuell naiven Kontrollen. Repräsentative Bilder, die TH-IR (braun) Neuronen in VTA von sexuell naiv zeigen (E) und erfahren (F) Männer. G, HEin Bild mit höherer Vergrößerung des Neurons, das durch den Pfeil in angezeigt wird E und F beziehungsweise. Nissl-gefärbte Neuronen sind in diesen Bildern blau dargestellt. Repräsentative Bilder, die TH-IR-Neuronen im SN von sexuell naiven zeigen (I) und erfahren (J) Männer. Maßstabsbalken: E-J, 20 & mgr; m.

Sex-Erfahrung-induzierte Soma-Größenreduktion von VTA-Dopamin-Neuronen ist abhängig von Opioid-Rezeptor-Aktivierung

Die durch sexuelle Erfahrung verursachte Verringerung der VTA-Dopamin-Neuronen-Soma-Größe wurde durch den nicht-selektiven MOR-Antagonisten Naloxon blockiert, der vor jeder Paarungssitzung verabreicht wurde. Die Behandlung mit Naloxon vor der Paarung hatte eine signifikante Auswirkung auf die Fläche (F(1,22) = 4.738, p = 0.041) und zu einer signifikanten Auswirkung auf den Perimeter (F(1,22) = 2.892, p = 0.052). Eine signifikante Interaktion zwischen Erfahrung und Naloxon-Behandlung wurde für den Bereich gefunden (F(1,22) = 5.578, p = 0.027) und Umfang (F(1,22) = 8.167, p = 0.009). Paarweise Vergleiche zeigten, dass sexuelle Erfahrung in mit Kochsalzlösung behandelten Tieren die Fläche und den Umfang der VTA-Dopamin-Neuronen 7 d nach der letzten Paarungssitzung verglichen mit Kochsalzlösung-behandelten sexuell naiven Männern signifikant reduzierte (Abb.. 1E, Bereich: p = 0.018; F, Umfang: p = 0.007). Im Gegensatz dazu unterschieden sich sexuell erfahrene Naloxon-behandelte Tiere nicht von Naloxon-behandelten naiven Männchen (Abb.. 1E, Bereich: p = 0.483; F, Umfang: p = 0.330). Darüber hinaus war die Soma-Größe von erfahrenen Kochsalztieren im Vergleich zu erfahrenen Naloxon-Tieren signifikant verringert (Abb.. 1E, Bereich: p = 0.002; F, Umfang: p = 0.002). Diese Wirkung von Naloxon war spezifisch für die sexuelle Erfahrung, da die Naloxon-Behandlung allein bei sexuell naiven Naloxon-behandelten Männern die TH-IR-Zellen-Soma-Größe im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen nicht beeinflusste (Abb.. 1E,F). Darüber hinaus war dieser Effekt von Naloxon auf die erfahrungsinduzierte Soma-Größenreduktion nicht auf Wirkungen von Naloxon auf das Sexualverhalten zurückzuführen, da sich das Paarungsverhalten zwischen Naloxon- und Kochsalzlösung-behandelten Männchen nicht signifikant unterschied, abgesehen von einer längeren Paarungszeit nach der Ejakulation (nach Ejakulationsintervall) bei Naloxon behandelten Männern während der ersten und fünften Paarungssitzung (p = 0.03 und p = 0.004, jeweils). Beide mit Kochsalzlösung und Naloxon behandelten Männchen kopulierten während jeder der fünf Paarungssitzungen zur Ejakulation.

Sexuelle Erfahrung-induzierte Morphin-Belohnungstoleranz

Die Auswirkungen der sexuellen Erfahrung auf die VTA-Dopamin-Soma-Größe durch die Wirkung von EOP in der VTA sind ähnlich denen, die für exogene Opiate (Sklair-Tavron et al., 1996; Russo et al., 2007). Daher wurde getestet, ob die durch natürliche Belohnung induzierte VTA-Dopamin-Zellplastizität die Belohnung für das Opiat-Morphin beeinflusst. In der Tat, sexuelle Erfahrung verursacht Morphin Belohnung Toleranz, ähnlich wie die Auswirkungen von chronischen Opiate (Russo et al., 2007). Sexuell erfahrene Männer konnten keine CPP für 0.5 mg / kg Morphindosis entwickeln; wohingegen sexuell naive Männer eine CPP für diese Dosis bildeten, was dadurch angezeigt ist, dass während der Nachuntersuchung eine längere Zeit in der Morphin-gepaarten Kammer verglichen mit der Salz-gepaarten Kammer verbracht wurde (Abb.. 3; p = 0.039). Sowohl sexuell naive als auch erfahrene Gruppen verbrachten signifikant mehr Zeit in der Morphin-gepaarten Kammer, verglichen mit der Kochsalzlösung gepaarten Kammer mit höheren Morphindosen: 5.0 mg / kg (Abb.. 3; Naiv: p = 0.029; Exp .: p = 0.012) und 10.0 mg / kg (Abb.. 3; Naiv: p <0.001; Exp: p = 0.002).

Abbildung 3. 

Die Auswirkungen der sexuellen Erfahrung auf Morphium belohnen. Zeiten in Kochsalzlösung (Sal) oder Morphin-gepaarten (Mor; 0.5, 5 oder 10 mg / kg Körpergewicht) Kammern während der Nachuntersuchung in sexuell naiven (Naive, n = 10-13) oder erfahren (Exp, n = 9-13) Männer. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM; * zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Sal-gepaarten Kammer bei gleichen Tieren. NS, nicht signifikant.

Sex-Erfahrung-induzierte Erleichterung des Paarungsverhaltens ist abhängig von Opioid-Rezeptor-Aktivierung

Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass EOP, das in der VTA während der täglichen kurzen Paarungssitzungen von 5 wirkt, Plastizität der VTA-Dopaminneuronen verursacht, die den Wirkungen der chronischen Morphin- oder Heroin-Selbstverwaltung ähnlich ist (Russo et al., 2007; Mazei-Robison et al., 2011). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verringerung der VTA-Dopamin-Soma-Größe für das Belohnungslernen und speziell für die Sex-Experience-induzierte Erleichterung des Sexualverhaltens in Bezug auf Motivation und Leistung entscheidend ist. Diese Hypothese wurde getestet, indem man MOR unter Verwendung von Naloxon während der Paarung blockierte und die Auswirkungen auf die Erleichterung des sexuellen Verhaltens, das durch sexuelle Erfahrung während der fünf täglichen Paarungssitzungen induziert wurde, untersuchte. Daten sind in dargestellt Figure 4 nur für die erste und fünfte Paarungssitzung, da dies die Daten sind, die die erfahrungsbedingte Erleichterung des Paarungsverhaltens am besten veranschaulichen. Darüber hinaus werden die längerfristigen Wirkungen der Naloxonbehandlung während der Paarungssitzungen auf die Aufrechterhaltung der erfahrungsbedingten Erleichterung des Paarungsverhaltens während eines abschließenden Paarungstests 1 Woche später getestet. Figure 4A zeigt das experimentelle Design. Es gab einen signifikanten Haupteffekt der Paarungssitzung auf alle Parameter des Sexualverhaltens (Mount Latency: F(2,55) = 11.286, p <0.001; Intromissionslatenz: F(2,55) = 8.767, p <0.001; Ejakulationslatenz: F(2,55) = 10.368, p <0.001) und Naloxonbehandlung bei Latenzzeiten (F(1,55) = 6.585, p = 0.013) und Intrusion (F(1,55) = 7.863, p = 0.007). Paarweise Vergleiche zeigten, dass die Behandlung mit Naloxon das sexuelle Verhalten während der ersten Paarungssitzung beeinflusste, da die Naloxon-Tiere signifikant längere Latenzen aufwiesen als die ersten (p = 0.002) und Intrusion (p = 0.002) im Vergleich zu Kochsalzkontrollen am ersten Tag der Paarung. Dieser Naloxon-Effekt auf das anfängliche Sexualverhalten wurde durch sexuelle Erfahrung verringert und während keiner der folgenden Paarungssitzungen beobachtet (Tabelle 1). Darüber hinaus verhinderte die Verabreichung von Naloxon vor jeder der fünf Paarungssitzungen nicht die anfängliche Erleichterung des Sexualverhaltens mit sexueller Erfahrung. In Übereinstimmung mit den verstärkenden Effekten der sexuellen Erfahrung zeigten saline-behandelte Männer verringerte Latenzen, umAbb.. 4B; p = 0.032) Intrusion (Abb.. 4C; p = 0.033) und Ejakulation (Abb.. 4D; p <0.001) während der fünften Paarungssitzung im Vergleich zur ersten Paarungssitzung, was auf eine Erleichterung des sexuellen Verhaltens hinwies. In ähnlicher Weise zeigten mit Naloxon behandelte Männer signifikant kürzere Latenzzeiten (Abb.. 4B; p <0.001), Intromission (Abb.. 4C; p <0.001) und Ejakulation (Abb.. 4D; p = 0.017) am fünften verglichen mit dem ersten Tag. Darüber hinaus unterschieden sich Naloxon-behandelte Männer in keiner der Latenzen während der fünften Paarungssitzung von Kochsalzlösungskontrollen.

Abbildung 4. 

Endogene Opioide spielen eine entscheidende Rolle bei der erfahrungsbedingten Förderung von Sexualverhalten. A, Experimentelles Design. B-D, Sexualverhaltensparameter für Männer, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden (Sal, weiße Balken, n = 11) oder Naloxon (NLX; schwarze Balken, n = 12) mit systemischer Verabreichung. Die angezeigten Daten beziehen sich auf die Latenzzeit (B; Sekunden), Intrusion (C; Sekunden) und Ejakulation (D; Sekunden) an den Tagen 1 und 5 an fünf aufeinanderfolgenden Tagen der Paarung. Zusätzlich werden Daten für den finalen Paarungstest 7 d nach der fünften Paarungssitzung gezeigt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt; + zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Tagen 1 und 5 innerhalb der Behandlung an; * zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Testtag und Tag 5 innerhalb der Behandlung an; # zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Naloxon und Salzlösungsgruppen innerhalb eines Tages an.

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Tabelle 1. 

Die Verabreichung von Naloxon vor der Paarung erhöhte die Latenzen für die Einbringung und die Einkreuzung nur am ersten Tag der Paarung

Im Gegensatz dazu stört die Behandlung mit Naloxon während der sexuellen Erfahrung die Aufrechterhaltung der erfahrungsbedingten Erleichterung des Sexualverhaltens am letzten Paarungstesttag. Der Testtag wurde 7 d nach der letzten Paarungssitzung in Abwesenheit einer Naloxoninjektion durchgeführt. Kochsalzlösung behandelte Kontrollmännchen zeigten die erwartete erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens. Insbesondere unterschieden sich Latenzzeiten, Einsetzbarkeit und Ejakulation zwischen der fünften Paarungssitzung und dem letzten Testtag nicht (Abb.. 4B-D). Dagegen zeigten Naloxon-behandelte Männer einen signifikanten Anstieg der Latenzzeiten (Abb.. 4B; p = 0.033), Intrusion (Abb.. 4C; p = 0.036) und Ejakulation (Abb.. 4D; p = 0.049) am Testtag verglichen mit der fünften Paarungssitzung. Auch am Testtag wurde festgestellt, dass Naloxon-Tiere signifikant langsamer waren als mit Kochsalzlösung behandelte Männer, was durch längere Latenzzeiten angezeigt wird (Abb.. 4B; p = 0.017) und Intrusion (Abb.. 4C; p = 0.043). Somit blockierte die Naloxonbehandlung die Aufrechterhaltung, aber nicht die anfängliche Entwicklung der erfahrungsbedingten Erleichterung des Sexualverhaltens. Diese Befunde weisen auf eine kritische Rolle der EOP-induzierten VTA-Dopamin-Neuron-Plastizität bei langfristiger Expression der Verstärkung des natürlichen Belohnungsverhaltens hin.

Mehrere zusätzliche Kontrollexperimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, dass die Wirkungen der Opioidrezeptorblockade auf den Verlust der langfristigen Verstärkung des Sexualverhaltens unabhängig von einem Mangel an Naloxonverabreichung am letzten Paarungstesttag auftraten (Abb.. 5A,B), waren spezifisch für den Verlust der langfristigen, aber nicht kurzfristigen Aufrechterhaltung der Paarungserleichterung (Abb.. 5E,F), wurden nicht durch tägliche Exposition gegenüber Naloxon allein verursacht (Abb.. 5C,D), und wurden nicht durch einen Verlust der sexuellen Belohnung bei Naloxon behandelten Männern verursacht (Abb.. 5G,H). Um zu zeigen, dass ein verändertes Sexualverhalten beim letzten Paarungstest nicht auf das Fehlen von Naloxon zurückzuführen war, wurde Naloxon oder Kochsalzlösung am letzten Paarungstesttag Tieren verabreicht, die Paarung mit Naloxon erhielten, während sie sexuelle Erfahrung machten (Abb.. 5A). Es gab einen signifikanten Haupteffekt des Paarungstages auf Latenzzeiten (Abb.. 5B; F(2,27) = 30.031, p = 0.038) und Intrusion (Tabelle 2; F(2,27) = 10.686, p = 0.048). Es gab keinen Haupteffekt des Paarungstages auf die Latenz bis zur Ejakulation (Tabelle 2; F(2,27) = 2.388, p = 0.109) Ähnlich wie oben beschrieben, beeinträchtigte die Behandlung mit Naloxon während der Paarung nicht die Erleichterung des Sexualverhaltens während der ersten fünf Sitzungen mit sexueller Erfahrung. Beide Gruppen (Kochsalz- und Naloxon-behandelte Gruppen, bestimmt durch Behandlung während des letzten Paarungstests; beide erhielten Naloxon während der Paarung) zeigten am Tag 5 im Vergleich zum Tag 1 ein erleichtertes Sexualverhalten und zeigten signifikant kürzere Latenzen bis zur ersten Haltung (Abb.. 5B; Kochsalzlösung: p = 0.033; Naloxon: p = 0.014) und Intrusion (Tabelle 2; Kochsalzlösung: p = 0.034; Naloxon: p = 0.026). Tiere, die am letzten Paarungstest entweder Naloxon oder Kochsalzlösung erhielten, wiesen längere Latenzen auf (Abb.. 5B; Kochsalzlösung: p = 0.018; Naloxon: p = 0.029) und Intrusion (Tabelle 2; Kochsalzlösung: p = 0.019; Naloxon: p = 0.020) verglichen mit dem fünften Tag der Paarungserfahrung. Daher beeinflusste die Verabreichung von Naloxon oder Kochsalzlösung am Testtag unmittelbar vor der Paarung nicht die Wirkung der Naloxonbehandlung während sexueller Erfahrungssitzungen und die Abschwächung der langfristigen Erleichterung des Sexualverhaltens war identisch mit der bei Tieren, die keine Injektion erhielten am letzten Paarungstesttag (Abb.. 4).

Abbildung 5. 

Endogene Opioide sind wichtig, um die erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens langfristig auszudrücken. AExperimentelles Design für einen Versuch zur Wirkung der NLX-Behandlung am Testtag. BLatenz an den Tagen 1 und 5 an fünf aufeinander folgenden Tagen der Paarung und am letzten Paarungstesttag (Test) nach Kochsalzlösung (grau) oder Naloxon (schwarz) Injektion. Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM. * zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Tag 1 und Tag 5 innerhalb der Behandlung an. # zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Testtag und Tag 5 innerhalb der Behandlung an. CExperimentelles Design für ein Experiment, um die Wirkung der Naloxon-Vorbehandlung allein ohne sexuelle Erfahrung auf das Paarungsverhalten zu testen. D, Mount-Latenz am letzten Paarungstesttag, 7-Tage nach 5-Tagen entweder mit Kochsalzlösung oder Naloxon-Injektion ohne Paarung. Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM. EExperimentelles Design für ein Experiment, um zu testen, ob die Naloxon-Behandlung die kurzzeitige Manifestation von erleichtertem Sexualverhalten bei sexuell erfahrenen Tieren beeinflusst. FLatenz an Tag 1 und Tag 5 an fünf aufeinanderfolgenden Tagen der Paarung und am letzten Paarungstesttag, 1 5 Tag für Tag in Gegenwart von Kochsalzlösung (grau) oder Naloxon (schwarz) injizieren. Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM. * zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Tag 1 und Tag 5 innerhalb der Behandlung an. GExperimentelles Design für ein Experiment, um zu testen, ob Naloxon die lohnende Wirkung von sexuellem Verhalten blockiert. H, Zeit, die für die Paarung der gepaarten Kammer (in Sekunden) während des Pretests (weiß) und der Nachuntersuchung (schwarz) für Tiere verbracht wurde, die vor der Paarung Naloxon oder Kochsalzlösung erhielten. Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM; * zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zum Vortest.

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Tabelle 2. 

Die gezeigten Daten sind Latenzzeiten für Intrusion und Ejakulation (Sekunden) aus Kontrolluntersuchungen, die durchgeführt wurden, um zu bestimmen, dass die Wirkungen der MOR-Blockade auf den Verlust der Langzeitverstärkung des Sexualverhaltens unabhängig von einem Mangel an Naloxonverabreichung am letzten Paarungstesttag auftraten

Um zu bestimmen, ob es Naloxon Behandlung war, wenn gepaart mit sexuellen Erfahrungen und nicht zu Naloxon per se wiederholt, die zu einer Beeinträchtigung des sexuellen Verhaltens 7 d nach der letzten Behandlung, sexuell naive Tiere erhielten entweder fünf tägliche Injektionen von Naloxon oder Kochsalzlösung Injektionen vor einem endgültigen Paarungstest 7 d später (Abb.. 5C). Bei keinem Paarungsparameter zwischen Kochsalzlösung und Naloxon-vorbehandelten Gruppen wurden signifikante Unterschiede festgestellt (Abb.. 5D; Mount-Latenz; Intrusions-Latenz: Salzlösung 139.7 ± 40.3 vs Naloxon 121.83 ± 42.55; Ejakulationslatenz: Kochsalzlösung 887.9 ± 70.0 vs Naloxon 1050.8 ± 327.31). Diese Ergebnisse zeigen, dass Naloxon alleine nicht ausreicht, um das nachfolgende Sexualverhalten zu verändern, ähnlich wie das Fehlen von Wirkungen von Naloxon alleine auf die VTA-Dopamin-Neuron-Plastizität.

Wir stellen die Hypothese auf, dass die Behandlung mit Naloxon während des Erwerbs von sexueller Erfahrung den langfristigen Ausdruck sexuell erlebter sexueller Erleichterung des Sexualverhaltens stört. Um dies weiter zu untersuchen, wurden die Auswirkungen der Naloxonbehandlung während der Paarung auf das nachfolgende Sexualverhalten während eines abschließenden Paarungstests getestet, der nur 1 d nach der letzten Paarung durchgeführt wurde (experimentelles Design; Abb.. 5E). Es gab einen signifikanten Haupteffekt des Paarungstages auf dem Berg (Abb.. 5F; F(2,20) = 19.780, p <0.001) und Intromissionslatenzen (Tabelle 2; F(2,20) = 19.041, p <0.001). Es gab keinen signifikanten Haupteffekt des Tages auf die Ejakulationslatenz (Tabelle 2; F(2,20) = 3.042, p = 0.070). Ähnlich wie oben beschrieben, zeigten alle Männchen (trotz Kochsalz- oder Naloxon-Behandlungen) eine Erleichterung des Sexualverhaltens während der fünf Sitzungen mit sexueller Erfahrung, die durch signifikant kürzere Latenzzeiten angezeigt waren (Abb.. 5F; Kochsalzlösung: p = 0.002; Naloxon: p = 0.018) und Intrusion (Tabelle 2; Kochsalzlösung: p = 0.006; Naloxon: p = 0.009) am Tag 5 im Vergleich zum Tag 1. In ähnlicher Weise wurde das erleichterte Sexualverhalten am Testtag im Vergleich zum Tag 1 demonstriert, der durch signifikant kürzere Latenzen beim Montieren angezeigt wurde (Abb.. 5F; Kochsalzlösung: p = 0.001; Naloxon: p = 0.020) und Intrusion (Tabelle 2; Kochsalzlösung: p = 0.004; Naloxon: p = 0.009). Noch wichtiger ist, dass die Behandlung mit Naloxon während der Paarung die Sex-Erfahrung-induzierte Erleichterung des Sexualverhaltens nicht signifikant beeinflusste, wenn 1 d nach der Sex-Erfahrung getestet wurde, unabhängig von der Naloxon-Behandlung an diesem letzten Paarungstesttag.

Schließlich testeten wir die Möglichkeit, dass die abschwächenden Wirkungen von Naloxon auf die langfristige Expression von erleichtertem Sexualverhalten auf einer blockierenden Wirkung von Naloxon auf die belohnenden Eigenschaften von Sexualverhalten beruhen. Naloxon, das unmittelbar vor der Paarung verabreicht wurde, veränderte jedoch nicht die Bildung von CPP zur Paarung (Abb.. 5G), was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit Naloxon die sexuelle Belohnung nicht verändert hat. Beide Kochsalzlösung- und Naloxon-behandelten Gruppen bildeten eine signifikante CPP für sexuelles Verhalten, wie durch signifikant erhöhte Zeit in geschlechts-gepaarten Kammer angezeigt (Abb.. 5H; Kochsalzlösung: p = 0.038; Naloxon: p = 0.002) während des Post-Tests verglichen mit dem Vortest. Daher übt Naloxon seine schädliche Wirkung auf die Aufrechterhaltung eines erleichterten Sexualverhaltens nicht aus, indem es die mit sexuellem Verhalten verbundene Belohnung blockiert.

Die Erleichterung des Sexualverhaltens hängt von der EOP-Aktion in der VTA ab

Um zu bestätigen, dass EOP speziell in der VTA handeln, um eine langfristige Erleichterung des Sexualverhaltens zu induzieren, wird das in Figure 3A wurde mit Intra-VTA-Naloxon-Infusionen anstelle von systemischen Injektionen wiederholt. Die Ergebnisse waren identisch mit der oben beschriebenen systemischen Verabreichung. Es gab einen signifikanten Haupteffekt des Paarungstages auf alle Parameter des Sexualverhaltens (Abb.. 6A, Latenzzeit: F(2,33) = 4.494, p = 0.019; BIntromissivität: F(2,33) = 4.042, p = 0.027; CEjakulationslatenz: F(2,33) = 5.309, p = 0.010) und Intra-VTA-Naloxon-Behandlung bei Latenzzeiten (F(1,33) = 7.345, p = 0.011) und Intrusion (F(1,33) = 6.126, p = 0.019). Intra-VTA-Naloxon verhinderte die initiale erfahrungsinduzierte Erleichterung des Sexualverhaltens während der 5-d-Paarung nicht, da Naloxon-behandelte Männchen geringere Latenzzeiten zeigten (Abb.. 6A; p = 0.001), Intrusion (Abb.. 6B; p <0.001) und Ejakulation (Abb.. 6C; p = 0.001) am Tag 5 im Vergleich zum Tag 1. Naloxon-behandelte Männer unterschieden sich am fünften Tag der Paarung in keiner der Latenzen von mit Salzlösung behandelten Männern. Intra-VTA-Naloxon-Behandlung führte wie systemische Verabreichung zu einer signifikant erhöhtenAbb.. 6A; p <0.001) und Intromissionslatenzen (Abb.. 6B; p <0.001) am ersten Paarungstag im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Männern, was bei nachfolgenden Paarungssitzungen nicht beobachtet wurde (während derer sich mit Naloxon und Kochsalzlösung behandelte Männer nicht unterschieden). Eine unerwartete Beobachtung war, dass in diesem Experiment mit Kochsalzlösung behandelte Männer keine statistisch signifikante Erleichterung der Mount- oder Intromissionslatenz zeigten (wie in allen oben beschriebenen Experimenten gezeigt wurde) und nur die Ejakulationslatenz am fünften Tag im Vergleich zum ersten Tag kurzgeschlossen war (Kochsalzlösung: p = 0.001).

Abbildung 6. 

Endogene Opioide in der VTA vermitteln erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens und dessen langfristige Erhaltung. Parameter des Sexualverhaltens bei Männern, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden (Sal, weiße Balken, n = 8) oder NLX (schwarze Balken, n = 6) mit Intra-VTA-Administration. Die angezeigten Daten beziehen sich auf die Latenzzeit (A), Intrusion (B) und Ejakulation (C) an den Tagen 1 und 5 an fünf aufeinander folgenden Tagen der Paarung. Zusätzlich werden Daten für den letzten Paarungstesttag, 7 d nach dem Tag 5 in Abwesenheit von Kochsalzlösung oder Naloxoninjektion gezeigt. Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM; + zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Tagen 1 und 5 innerhalb der Behandlung an; * zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Testtag und Tag 5 innerhalb der Behandlung an; # zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Naloxon und Sal-Gruppen innerhalb eines Tages an. Schematische Darstellung koronaler VTA-Schnitte (H, -4.60; I, -5.00; J, -5.25 aus Bregma), die für alle Tiere im Experiment 5 Intra-VTA-Injektionsstellen anzeigen (Kochsalzlösung; weiß; Naloxon, schwarz; verpasst, grau), Verwenden von Vorlagenzeichnungen von Swanson Brain Maps (Swanson, 2004). Kanülen waren bilateral, aber Injektionsstellen sind einseitig zur Erleichterung der Präsentation dargestellt. fr, Fasciculus retroflexus; ML, medialer Lemniscus; SN, Substantia nigra.

Eine Intra-VTA-Naxolon-Behandlung blockierte die Aufrechterhaltung eines erleichterten Sexualverhaltens, das bei sexuell erfahrenen Männern beobachtet wurde, ähnlich den Wirkungen von systemischem Naloxon. Speziell am letzten Testtag hatten Naloxon-behandelte Männer längere Latenzzeiten (Abb.. 6A; p = 0.011), Intrusion (Abb.. 6B; p = 0.010) und Ejakulation (Abb.. 6C; p = 0.015) im Vergleich zu ihrer fünften Paarungssitzung und verglichen mit den mit Salzlösung behandelten Männchen am letzten Testtag (Abb.. 6A, p = 0.006; B, p = 0.008). Im Gegensatz dazu unterschieden sich mit Kochsalzlösung behandelte Tiere nicht in den Latenzzeiten, um zwischen dem letzten Testtag und dem Tag 5 der Paarung zu steigen und zu intromissionieren. Diese Effekte waren spezifisch für die Abgabe von Naloxon an die VTA, wie Männer mit Kanülierungsstellen in der Nähe, aber nicht auf die VTA (Abb.. 6D; n = 3) zeigten eine langfristige Erleichterung des Sexualverhaltens, ähnlich wie mit Kochsalzlösung behandelte Kontrollen (ML, IL = 53 ± 6.245, EL = 389 ± 299.5 und signifikant unterschiedlich im Vergleich zu Intra-VTA-Naloxontieren am letzten Paarungstesttag (ML, IL: p = 0.029; EL: p = 0.0395).

EOP-Aktion ist für geschlechtsassoziierte konditionierte Cue-induzierte neurale Aktivierung erforderlich

Auf der Grundlage der bisherigen Ergebnisse stellten wir die Hypothese auf, dass die EOP-Aktivierung in VTA während der Paarungserfahrungen und die anschließende VTA-Dopamin-Soma-Größenreduktion für die Zuschreibung von Anreizsalienien auf Paarungs-belohnungsassoziierte Reize und folglich die Aufrechterhaltung von sexuellem Verhalten entscheidend sind. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Effekte der Blockierung von Opioidrezeptoren während der Paarungserfahrung auf neurale Aktivität untersucht, die durch nachfolgende Exposition gegenüber konditionierten kontextuellen Hinweisen, die eine sexuelle Belohnung vorhersagen (geschlechtsassoziierte kontextuelle Hinweise), untersucht wurde. Sexuell naive Tiere wurden auch Umwelteinflüssen ausgesetzt, aber diese waren nicht mit früheren Paarungserfahrungen verbunden und waren daher neutrale Hinweise. Schließlich wurden die Ausgangs-pERK-Spiegel in sexuell erfahrenen und naiven Kontrollgruppen bestimmt, die in den häuslichen Käfigen verblieben und keinen Hinweisen ausgesetzt waren ("No Cue"). Bestätigung und Erweiterung früherer Erkenntnisse (Balfour et al., 2004), die Exposition gegenüber kontextuellen Hinweisen, die mit früherem Geschlecht assoziiert waren, erhöhte signifikant die pERK-Expression bei sexuell erfahrenen Männern in NAc (Abb.. 7) und mPFC (Abb.. 8A-C), verursachte jedoch keine neuronale Aktivierung in der BLA (Abb.. 8D) oder CPu (Daten nicht gezeigt). Es gab Haupteffekte der Cue-Exposition in NAc-Kern (F(1,12) = 12.1941, p = 0.004), ACA (F(1,12) = 5.541, p = 0.038) und PL (F(1,12) = 5.241, p = 0.041) und Naloxonbehandlung im NAc-Kern (F(1,12) = 6.511, p = 0.025), ACA (F(1,12) = 15.242, p = 0.002) und PL (F(1,12) = 7.336, p = 0.019). Es gab signifikante Wechselwirkungen im NAc-Kern (F(1,12) = 10.107, p = 0.008), ACA (F(1,12) = 16.060, p = 0.002), PL (F(1,12) = 8.235, p = 0.014) und IL ((F(1,12) = 6.965, p = 0.022). Erstens erhöhte mating-assoziierte Cue-Exposition signifikant pERK in Kochsalzlösung-behandelten sexuell erfahrenen Tieren (Exp Sal ​​+ Cue) im Vergleich zu Kontrollen, die keinen Hinweisen ausgesetzt waren und aus dem Heimkäfig (Exp Sal-No Cue) in NAc-Kern (Abb.. 7A; p <0.001) und mPFC-Subregionen ACA (Abb.. 8A; p = 0.001), PL (Abb.. 8B; p = 0.003) und IL (Abb.. 8C; p = 0.029). Im Gegensatz dazu induzierte in salzbehandelten, sexuell naiven Tieren die Exposition gegenüber den kontextuellen Hinweisen, die nicht mit sexueller Belohnung assoziiert waren, kein pERK in irgendeinem der Gehirnbereiche (Naive Sal + Cue verglichen mit naivem Sal-No Cue; Feigen. 7, 8), die zeigen, dass die Induktion von pERK spezifisch für die Exposition der sexuellen Erfahrung-assoziierten Hinweise ist. Darüber hinaus veränderte die sexuelle Erfahrung allein nicht die Ausgangs-pERK-Expression in irgendeinem der Gehirnregionen, da es keine Unterschiede zwischen Gruppen gab, die aus den häuslichen Käfigen genommen wurden, seien sie sexuell naiv oder erfahren und mit Salzlösung oder Naloxon behandelt.

Abbildung 7. 

Endogene Opioidwirkung ist für die neurale Aktivierung in NAc erforderlich, die durch geschlechtsassoziierte konditionierte Signale induziert wird. Anzahl der pERK-IR-Zellen pro mm2 im Nucleus Accumbens Kern (A) und Schale (B) bei sexuell naiven (weiß) und erfahrenen (exp; schwarz) Tieren, die während der Paarungssitzungen (Exp. Männchen) oder bei Handhabungssitzungen (Naive Männchen) mit systemischer NLX oder Kochsalzlösung (Sal) vorbehandelt wurden. Gruppen wurden entweder kontextabhängigen Hinweisen (Cue) ausgesetzt, die Paarungs-assoziierte Hinweise bei Exp-Männchen und neutralen Zeichen bei Naive-Tieren waren, oder aus den Hauskäfigen genommen (kein Stichwort, angezeigt durch das Fehlen eines Stichwort-Kennzeichens). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt; * zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu mit Kochsalzlösung vorbehandelten Kontrollpersonen, denen kein Hinweis gegeben wurde (Naive Sal-No Cue und Exp Sal-No Cue); # zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Sal-behandelten Cue-exponierten Exp-Gruppe (Exp Sal ​​+ Cue). Repräsentative Bilder von pERK-IR-Zellen pro mm2 im NAc-Kern von sexuell erfahrenen Männern mit Sal (C, D) oder NLX (E, F) die entweder aus dem Heimkäfig (No Cue, C, E) stammen oder den Paarungs-assoziierten kontextuellen Hinweisen (Cue; D, F). N = 4 jede Gruppe außer Naive NLX (No Cue), n = 3. ac, anteriore Kommissur. Maßstabsbalken, 100 μm.

Abbildung 8. 

Die Auswirkungen von Naloxon auf Paarungs-induzierte pERK-Expression in anderen VTA-Zielregionen. Anzahl der pERK-IR-Zellen pro mm2 bei sexuell naiven (weiß) und erfahrenen (Exp; schwarz) Tieren, die während der Paarungssitzungen mit systemischer NLX oder Kochsalzlösung (Sal) vorbehandelt wurden und den kontextuellen Hinweisen (Cue) oder Heimkäfigen (keine Hinweise) in der ACA ausgesetzt waren (A), PL (B), IL (C) und BLA (D). Die Daten sind repräsentativ für den Mittelwert ± SEM; * zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu mit Kochsalzlösung vorbehandelten Kontrollpersonen, denen kein Hinweis gegeben wurde (Naive Sal-No Cue und Exp Sal-No Cue); # zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu Sal-behandelten, sexuell naiven Kontrollpersonen (Naive Sal + Cue).

Zur Untermauerung unserer Hypothese hat die Naloxonbehandlung während der sexuellen Erfahrung die pERK-Induktion durch die geschlechtsassoziierten konditionierten Signale signifikant abgeschwächt. Die pERK-Expression in diesen mit Naloxon behandelten, exponierten, exponierten erfahrenen Männern (Exp NLX + Cue) unterschied sich nicht von der Ausgangs-pERK-Expression in den sexuell naiven oder erfahrenen Kontrollgruppen aus den Heimkäfigen (Naive Sal-No Cue oder Naive NLX- Kein Stichwort). Darüber hinaus war die pERK-Expression in den mit Naloxon behandelten, exponierten, exponierten männlichen Tieren (Exp NLX + Cue) signifikant niedriger im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten exponierten erfahrenen Tieren (Exp Sal ​​+ Cue) im NAc-Kern (Abb.. 7A; p = 0.002) und mPFC-Subregionen (Abb.. 8A, ACA: p <0.001; B, PL: p = 0.002; C, IL: p = 0.015).

In der NAc-Shell ergab die Zweiwege-ANOVA-Analyse keine statistisch signifikanten Effekte der Faktoren Cue-Exposition und Naloxon-Behandlung. Ein paarweiser Vergleich zeigte jedoch, dass die Exposition mit dem Stichwort pERK in der mit Kochsalzlösung behandelten sexuell erfahrenen Gruppe (Exp SAL + Cue) verglichen mit der Kontrollgruppe ohne Salpetersäure (Abb.. 7B; Naive SAL-No Cue: p = 0.0163).

Diskussion

Die aktuelle Studie zeigt, dass EOP, das während des sexuellen Verhaltens in der VTA wirkt, ein natürliches Belohnungsverhalten, eine robuste, aber vorübergehende Verringerung der Soma-Größe von VTA-Dopamin-Zellen verursacht. Die Verringerung der Soma-Größe wurde weder in VTA-Nicht-Dopamin-Neuronen noch in Dopamin-Neuronen in der nahe gelegenen Substantia Nigra beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Veränderung spezifisch für VTA-Dopamin-Zellen war. Diese VTA-Dopamin-Plastizität scheint der durch chronische Opiatexposition induziertenSklair-Tavron et al., 1996; Russo et al., 2007; Mazei-Robison et al., 2011) und verursachte ähnliche Toleranz gegenüber exogenem Opiat (Morphin) Belohnung. Wir haben gezeigt, dass die VTA-Dopamin-Plastizität entscheidend für die langfristige (Erhaltung), aber nicht kurzfristige (Entwicklung), Verstärkung des Sexualverhaltens und Belohnungs-assoziierte Stichwort-induzierte neurale Aktivität (pERK) in VTA-Zielregionen ist: NAc und mPFC. Diese Befunde zeigen eine Rolle für die VTA-Dopamin-Plastizität bei der langfristigen Ausprägung der Anreiz-Salienz von natürlichen belohnungs-prädiktiven Signalen oder Belohnungsgedächtnis.

Es ist gut dokumentiert, dass sexuelle Erfahrung zu einer Erleichterung des nachfolgenden sexuellen Verhaltens führt, einschließlich eines schnelleren Beginns der Paarung und einer gesteigerten Leistung (Balfour et al., 2004; Pitcher et al., 2010a,b, 2012). Diese Erleichterung oder Verstärkung des sexuellen Verhaltens wird für mindestens 28 d nach der Paarung aufrechterhalten (Pitcher et al., 2012). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Sexualverhalten und konditionierte Hinweise auf Sexualbelohnung eine Internalisierung von MOR in der VTA verursachen und neuronale Aktivierung im gesamten mesolimbischen System induzieren, einschließlich VTA (Dopamin- und Nonopaminneuronen), NAc, PFC und BLA (Balfour et al., 2004, 2006). Es ist gut bekannt, dass VTA-Dopamin-Neuronen eine entscheidende Rolle beim Lernen und Zuschreiben der Anreizsalienz von belohnungsassoziierten Stimuli spielen (Berridge und Robinson, 1998; Berridge et al., 2009; Flagel et al., 2011) und sind kritisch für die Belohnungsvorhersage (Schultz, 2010). Die aktuellen Ergebnisse erweitern unser aktuelles Wissen, indem wir zeigen, dass die Belohnungs-induzierte VTA-Neuroplastizität für diese Funktionen kritisch ist und abhängig von der MOR-Aktivierung durch EOP in der VTA ist. Es ist derzeit unbekannt, welche EOP der MOR-Ligand ist, der während des männlichen Sexualverhaltens in der VTA wirkt. Obwohl sowohl β-Endorphin als auch Enkephalin an der Motivation von Nahrungsverstärkern beteiligt waren (Haywardet al., 2002), bleibt dies für männliches Sexualverhalten festgelegt. Wir haben zuvor gezeigt, dass β-Endorphin-Neuronen nicht während der Paarung aktiviert werden, noch gibt es einen Anstieg der POMC-mRNA; Dies legt nahe, dass β-Endorphin möglicherweise nicht die kritische EOP ist, die während der Paarung in der VTA wirkt (Davis et al., 2007). Diese VTA-Dopamin-Plastizität war essentiell für die neuronale Aktivität in mPFC, NAc und VTA nach der Exposition mit den die sexuelle Belohnung voraussagenden Umweltzeilen. Darüber hinaus war die VTA-Dopamin-Plastizität entscheidend für die langfristige Expression einer erhöhten Initiation und Leistung des Sexualverhaltens. Im Gegensatz dazu war die durch sexuelle Erfahrung verursachte VTA-Neuroplastizität für die hedonische Reaktion nicht erforderlich, da die sexuelle Belohnung (bestimmt durch CPP) und die kurzfristige Förderung der sexuellen Motivation und Leistung (während der Sexualerfahrung oder später 1) trotz MOR-Blockade während der Paarung intakt blieben (Mehrara und Baum, 1990). Stattdessen deuten die Daten darauf hin, dass die VTA-Dopaminneuroplastizität längerfristig vermittelt (7 d nach dem letzten Sexualleben; Pitcher et al., 2012) Ausdruck des "Wollens" von sexueller Belohnung und erhöhter motivierter Reaktionen auf Paarungshinweise (Miller und Baum, 1987; Berridge und Robinson, 1998).

Sexuell erfahrene Tiere zeigten eine Kreuztoleranz gegenüber einer Morphinbelohnung, ähnlich den Wirkungen eines Radlaufs bei Mäusen, ein anderes natürliches Belohnungsverhalten, ein Effekt, der durch Naloxonbehandlung blockiert wurde (Lett et al., 2001, 2002) und von der VTA-Dopaminzellplastizität abhängig ist (aktuelle Befunde). Ähnlich wie bei natürlichen Belohnungen führt die wiederholte Exposition gegenüber den Opiaten Morphin oder Heroin zu einer vorübergehenden Verringerung der VTA-Dopamin-Soma-Größe (Sklair-Tavron et al., 1996; Spiga et al., 2003; Russo et al., 2007; Mazei-Robison et al., 2011). Außerdem führt eine Opiat-Exposition mit kurzen Wartezeiten zu einer Belohnungstoleranz, da höhere Dosierungen des Arzneimittels zur Bildung von Belohnungsassoziationen erforderlich sind (Shippenberg et al., 1987; Russo et al., 2007) und bewirkt, dass sich selbst verabreichende Tiere die Drogenaufnahme eskalieren (Ahmed et al., 2000; Walker ua, 2003). Daher wirken EOP und Opiate auf gemeinsame neurale Substrate, um eine Belohnungstoleranz während des frühen Entzugs zu induzieren, was einen kompensatorischen homöostatischen Mechanismus widerspiegeln könnte, um der Stimulation durch wiederholte Exposition entgegenzuwirken (Koob und Le Moal, 2005). Im Gegensatz dazu wird die Toleranz während der Opiatabstinenz zu einer Empfindlichkeit gegenüber den lohnenden Eigenschaften des Arzneimittels umgekehrt (Harris und Aston-Jones, 2003; Aston-Jones und Harris, 2004; Harris und Gewirtz, 2004). Interessanterweise wurde festgestellt, dass die sexuelle Erfahrung, gefolgt von einer sexuellen Abstinenzperiode von 7-28 d, eine Kreuzsensibilisierung für die psychostimulierende Belohnung verursacht (Pitcher et al., 2010a), die von der Paarungsinduzierten deltaFosB-Expression und der Dopaminrezeptor-1-Aktivierung in der NAc abhängt (Pitcher et al., 2013). Daher verursacht die sexuelle Belohnung Erfahrung gleichzeitige Opiat Belohnung Toleranz und psychostimulierende Belohnung Sensibilisierung, obwohl eine längere Sex Abstinenz Zeitraum auf Morphin Belohnung Toleranz noch getestet werden muss. Wir postulieren, dass diese gegensätzlichen Effekte auf die Belohnung durch verschiedene Formen der neuralen Plastizität in den verschiedenen Bereichen des mesolimbischen Systems vermittelt werden können: VTA EOP Aktion und Dopamin Plastizität vermitteln die Opiat-Belohnungstoleranz (aktuelle Studie), während NAc deltaFosB Expression die psychostimulierende Sensibilisierung steuert (Pitcher et al., 2013). Beide Ereignisse können zu Eskalationen von Drogenkonsum beitragen (Ahmed und Koob, 1998, 1999; Ahmed et al., 2000, 2002, 2003; Walker ua, 2003).

Die molekularen Mechanismen, durch die EOP die VTA-Dopamin-Neuronen während des natürlichen Belohnungsverhaltens beeinflussen, sind unbekannt. Der IRS2-Akt-mTORC2-Signalweg ist ein Hauptmediator für eine verminderte Soma-Größe in der VTA, verursacht durch wiederholtes Morphin (Jaworski et al., 2005; Russo et al., 2007; Mazei-Robison et al., 2011). Wiederholte Morphinverabreichung induzierte Veränderungen in der Größe von Dopaminneuronen in der VTA können durch Intra-VTA-Infusionen von im Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktoren (BDNF; Sklair-Tavron und Nestler, 1995). BDNF aktiviert diesen Weg durch TrkB-Signalisierung (Russo et al., 2007), eine Rezeptorkinase mit hoher Affinität für BDNF und Teil des IRS2-Akt-Signalweges (Seroogie und Gall, 1993; Numan und Seroogie, 1999), und auf Dopamin und GABA-Neuronen in der VTA exprimiert. Die Herunterregulierung der verschiedenen Komponenten des IRS2-Akt-Signalweges unter Verwendung der Technologie des viralen Vektor-Gentransfers imitiert die Wirkungen chronischer Opiat-Exposition. Darüber hinaus können die Auswirkungen der Opiat-Exposition durch Wiederherstellung dieses Signalweges (Russo et al., 2007) und die Überexpression einer Komponente von mTORC2 verhindert die Morphin-induzierte VTA-Dopamin-Soma-Reduktion (Mazei-Robison et al., 2011). Vorangegangene Arbeiten zur Untersuchung der Wirkungen chronischer Opiate auf die VTA-Dopamin-Soma-Größe zeigen daher, dass die morphininduzierte Herunterregulation des IRS2-Akt-mTOR-Signalwegs ausreichend und notwendig für diesen Effekt ist (Mazei-Robison und Nestler, 2012). Es ist daher verlockend zu spekulieren, dass die Auswirkungen sexueller Erfahrungen auf die VTA-Dopaminneuroplastizität ähnlich durch BDNF und den IRS2-Akt-mTORC2-Signalweg vermittelt werden.

Zusammenfassend zeigt die aktuelle Studie, dass die VTA Neuroplastizität durch Erfahrung mit natürlichem Belohnungsverhalten, insbesondere durch wiederholtes männliches Sexualverhalten, verursacht wird. Insbesondere wirken EOP in der VTA, um die Dopamin-Soma-Größe zu reduzieren, von der angenommen wird, dass sie mit erhöhter neuraler Erregbarkeit und weniger Dopamin-Produktion verbunden ist, was zu einem hypodopaminergen System führt und das mesolimbische System als Reaktion auf Hinweise auf sexuelle Belohnung verändert. Darüber hinaus ist VTA Neuroplastizität entscheidend für die Motivation und das Belohnungsgedächtnis, aber nicht für die hedonische Wirkung von sexuellem Verhalten. Schließlich beeinflusst VTA-Neuroplastizität, die durch natürliches Belohnungsverhalten gefolgt von einer kurzen Belohnungsabstinenz verursacht wird, die Opiatbelohnung und kann daher die Anfälligkeit für die Entwicklung von Drogenabhängigkeit beeinflussen.

Fußnoten

  • Empfangen Januar 12, 2014.
  • Revision erhalten Mai 17, 2014.
  • Akzeptiert Mai 20, 2014.

  • Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Canadian Institute of Health Research zu LMC und Natural Sciences and Engineering Research Council zu KKP unterstützt

  • Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

  • Korrespondenz sollte gerichtet werden an Dr. Lique M. Coolen, Universität von Mississippi Medical Center, Abteilung für Physiologie und Biophysik, 2500 North State Street, Jackson, MS 39216-4505. [E-Mail geschützt]

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