Plus eins. 2012; 7 (4): e34700. doi: 10.1371 / journal.pone.0034700. Epub 2012 Apr 18.
Krüge KK, Schmid S, Di Sebastiano AR, Wang X., Laviolette SR, Lehman MN, Coolen LM.
Quelle
Abteilungen für Anatomie und Zellbiologie, Schulich School of Medicine und Zahnmedizin, University of Western Ontario, London, Ontario, Kanada.
Abstract
Natürliche Belohnung und Drogenmissbrauch treffen auf das mesolimbische System, das Motivation und Belohnungsverhalten vermittelt. Drogen induzieren in diesem System neuronale Anpassungen, einschließlich transkriptioneller, morphologischer und synaptischer Veränderungen, die zur Entwicklung und zum Ausdruck drogenbezogener Erinnerungen und Sucht beitragen. Zuvor wurde berichtet, dass sexuelle Erfahrungen bei männlichen Ratten, ein natürliches Belohnungsverhalten, eine ähnliche Neuroplastizität im mesolimbischen System induzieren und die natürliche Belohnung und das drogenbezogene Verhalten beeinflussen.
Die vorliegende Studie untersuchte, ob sexuelle Erfahrungen zu dauerhaften Veränderungen bei der Paarung oder beim Transport oder der Funktion des ionotropen Glutamatrezeptors im Nucleus accumbens (NAc) führen, und zwar nach 3 verschiedenen Abstinenzperioden für Belohnungen: 1 Tag, 1 Woche oder 1 Monat nach der letzten Paarung..
Männliche Sprague-Dawley-Ratten paarten sich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen (sexuelle Erfahrung) oder blieben sexuell naiv, um als Kontrollgruppe zu dienen. Sexuell erfahrene Männchen zeigten zu jedem Zeitpunkt eine Erleichterung der Initiierung und Durchführung der Paarung. Als nächstes wurde die intrazelluläre und Membranoberflächenexpression von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA: NR1-Untereinheit) und α-Amino-3-Hydroxy-5-Methylisoxazol-4-Propionat (AMPA: GluA1, GluA2 Untereinheiten) Rezeptoren in der NAc wurde mittels eines Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS(3))-Protein-Cross-Linking-Tests und einer anschließenden Western Blot-Analyse bestimmt.
Der NR1-Ausdruck war nach eintägiger Abstinenz sowohl an der Oberfläche als auch intrazellulär erhöht, nahm jedoch nach einer Woche Abstinenz an der Oberfläche ab. GluA2 war nach einer Woche intrazellulär erhöht und nach einem Monat Abstinenz an der Oberfläche. Schließlich wurde durch Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie festgestellt, reduziertes AMPA/NMDA-Verhältnis der synaptischen Ströme in NAc-Schalenneuronen nach Stimulation kortikaler Afferenzen bei sexuell erfahrenen Männern nach allen Belohnungsabstinenzperioden.
Zusammen zeigen diese Daten, dass sexuelle Erfahrung langfristige Veränderungen in der Glutamat-Rezeptor-Expression und -Funktion in NAc verursacht. Obwohl diese Sexualerfahrungs-induzierte Neuroplastizität nicht identisch ist, hat sie Ähnlichkeiten mit denen, die durch Psychostimulanzien verursacht werden, was auf gemeinsame Mechanismen zur Verstärkung von Natur- und Drogenbelohnung hindeutet.
Einführung
Das mesolimbische System besteht aus miteinander verbundenen Hirnarealen, darunter dem ventralen tegmentalen Areal, dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und dem Nucleus accumbens (NAc). [1].. Gemeinsam vermitteln diese Gehirnbereiche natürlich belohnendes Verhalten, einschließlich der Fütterung [2]., [3]., [4]., [5].trinken [6]., mütterliches Verhalten [7]., soziale Bindung [8]., [9]. und Sexualverhaltenr [10]., [11]., [12]., [13]., [14].. Verhaltensstudien haben gezeigt, dass das Sexualverhalten männlicher Ratten lohnend und verstärkend ist, da männliche Ratten eine konditionierte Ortspräferenz für die Kopulation entwickeln. [15]., [16]., [17]., entwickeln Sie schnellere Laufgeschwindigkeiten in T-Labyrinthen [18]., Start- und Landebahn mit geradem Arm [19]. oder Hürdenklettern [20].und führen operante Aufgaben aus, um Zugang zu sexuell empfänglichen Weibchen zu erhalten [21]., [22].. Außerdem Sexuelle Erfahrung erleichtert nachfolgendes Sexualverhalten, einschließlich erhöhter sexueller Motivation und Leistung [23]. und beeinflusst den Ausdruck konditionierter Ortspräferenz für die Paarung [15].. Diese Verhaltensänderungen deuten auf das Auftreten von natürlichem belohnungsbezogenem Lernen und Gedächtnis hin, von dem angenommen wird, dass es durch Veränderungen im mesolimbischen System vermittelt wird, die durch Erfahrungen mit dem Paarungsverhalten hervorgerufen werden. [11]..
Zur Unterstützung dieser Hypothese haben wir zuvor gezeigt, dass sexuelle Erfahrungen eine Hochregulierung von DeltafosB im NAc verursachten, was wiederum für die Erleichterung der Einleitung und Durchführung sexuellen Verhaltens nach sexuellen Erfahrungen von entscheidender Bedeutung war. [23]..
Darüber hinaus verursachte sexuelle Erfahrung eine Zunahme der dendritischen Verzweigung und der Anzahl der Stacheln im NAc [11].. Ähnliche Veränderungen in der Transkription und Morphologie werden durch Psychostimulanzien induziert [24]., [25]., [26].. Es hat sich gezeigt, dass sexuelle Erfahrungen die Reaktion auf Drogen verändern, einschließlich der Sensibilisierung für durch Psychostimulanzien induzierte Bewegungsaktivität (Kreuzsensibilisierung) und einer verstärkten Psychostimulanzienbelohnung. [10]., [11]., [27].. Es wurde nachgewiesen, dass eine Entzugs- oder Abstinenzphase nach dem Drogenkonsum entscheidend für ein erhöhtes Verlangen nach der Droge ist, die sogenannte Inkubation des Verlangens. [28].. Ebenso ist eine Paarungsabstinenzperiode nach sexueller Erfahrung entscheidend für die durch sexuelle Erfahrung hervorgerufene Verstärkung der psychostimulierenden Belohnung und die vermehrte dendritische Verzweigung und Stachelbildung im NAc. [11].. Sexuelle Erfahrungen und der darauf folgende Verzicht auf diese natürliche Belohnung führen daher zu langfristigen Veränderungen im mesolimbischen System, die den durch Psychostimulanzien hervorgerufenen Veränderungen ähneln und die Verhaltensreaktionen sowohl auf natürliche als auch auf medikamentöse Belohnungen beeinflussen.
Es gibt Berichte über Psychostimulanzien, die zahlreiche weitere Veränderungen in der NAc hervorrufen, von denen einige von einer Zeit der Arzneimittelabstinenz abhängen. Zu diesen Veränderungen gehören Veränderungen im Transport und der Funktion des Glutamatrezeptors [29]., [30].. Wiederholter Kokainkonsum gefolgt von einer langen Abstinenzperiode (3–7 Wochen), führt zu einer Erhöhung in der Oberflächenexpression von α-Amino-3-Hydroxy-5-Methylisoxazol-4-Propionat (AMPA)-Rezeptor-Untereinheiten und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptoruntereinheiten, während nach einer kurze Abstinenzzeit (1 Tag).
Darüber hinaus werden verschiedene Untereinheiten der AMPA- und NMDA-Rezeptoren durch die Arzneimittelexposition und die darauffolgenden Abstinenzperioden unterschiedlich beeinflusst, da die Oberflächenexpression von GluA2-freien AMPARs nach längeren Abstinenzperioden (5–7 Wochen) hochreguliert wird. [31]., [32].. Der PFC liefert einen wichtigen glutamatergen Input für den NAc [33]. und elektrophysiologische Studien haben gezeigt, dass wiederholter Kokainkonsum Veränderungen im AMPA/NMDA-Verhältnis in PFC-reagierenden NAc-Schalenneuronen und Veränderungen in der intrinsischen Erregbarkeit von NAc-Neuronen verursacht, die von einer Drogenabstinenzperiode und einer NAc-Subregion abhängig sein können. [34]., [35]., [36]., [37]., [38]., [39]., [40]., [41].Eine solche durch Medikamente induzierte neuronale Plastizität trägt zu Veränderungen in der Verhaltenssensibilisierung gegenüber Psychostimulanzien bei. [42]., [43]., [44]., [45]. und Drogensuche [31]., [46]., [47]..
Es ist derzeit nicht bekannt, ob ähnliche Anpassungen des Glutamatrezeptortransports und der Glutamatrezeptorfunktion nach dem Erleben einer natürlichen Belohnung und dem darauffolgenden Verzicht auf natürliche Belohnung auftreten. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Hypothese zu testen, dass sexuelle Erfahrungen Veränderungen im AMPA- oder NMDA-Rezeptortransport im NAc und Veränderungen der synaptischen Stärke von PFC-reagierenden NAc-Schalenneuronen verursachen. Darüber hinaus wurden diese Werte zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach der letzten Paarung bestimmt, um die Auswirkungen einer Abstinenzperiode von natürlicher Belohnung (3 Woche oder 1 Monat nach der letzten Paarung) auf die Plastizität im NAc im Vergleich zu einer Periode ohne Abstinenz (1 Tag nach der letzten Paarung) zu untersuchen.
Ergebnisse
Experiment 1: Sexuelle Erleichterung
Ziel des ersten Experiments war es, einen zeitlichen Verlauf für die Erleichterung des Sexualverhaltens nach sexueller Erfahrung zu bestimmen. Zuvor wurde eine Erleichterung des Sexualverhaltens bis zu einer Woche nach der letzten Paarung festgestellt. [23]., aber es wurde bisher nicht untersucht, ob die durch Sexualerfahrung hervorgerufene Erleichterung des Sexualverhaltens nach einer längeren Abstinenzperiode erhalten bleibt. Hier wurden zwei Gruppen männlicher Ratten auf langfristige Ausprägung der Erleichterung des Sexualverhaltens getestet, entweder 1 Woche oder 1 Monat nach der letzten Paarung. Erstens zeigten beide Gruppen eine Erleichterung des Sexualverhaltens während fünf täglicher Paarungssitzungen, was durch signifikant kürzere Latenzen bis zum Aufreiten demonstriert wurde. (Abbildung 1A; 1 Woche, p
=0.028; 1 Monat, p=0.019), Intromission (Abbildung 1B; 1 Monat, p=0.016; Trend nach 1 Woche, p=0.078) und Ejakulation (Abbildung 1C; 1 Woche, p=0.016; 1 Monat, p=0.008) am 5. Tag im Vergleich zum 1. Tag der sexuellen Erfahrung. Darüber hinaus Die Erleichterung des Sexualverhaltens blieb sowohl 1 Woche als auch 1 Monat nach der letzten Paarung bestehen. da die Latenzen bis zu den Paarungsparametern am Testtag (1 Woche oder 1 Monat nach Tag 5 der sexuellen Erfahrung) kürzer waren als am Paarungstag 1 (Abbildung 1A: Mount-Latenz, 1 Monat, p=0.016; Abbildung 1B: Intromissionslatenz, 1 Monat, p=0.046; Abbildung 1C: Ejakulationslatenz, 1 Woche, p=0.016; 1 Monat, p=0.008) und es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Paarungstag 5 und dem Testtag für irgendeinen Verhaltensparameter zu irgendeinem Zeitpunkt (außer für die Latenzzeit beim Aufsteigen nach 1 Monat; p=0.016). Somit blieb die erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens während einer einmonatigen Periode der Paarungsabstinenz erhalten.
Experiment 2: Umverteilung/Expression der ionotropen Glutamatrezeptor-Untereinheit
Ziel des zweiten Experiments war es, die Expression von ionotropen Glutamatrezeptor-Untereinheiten bei sexuell erfahrenen und unerfahrenen Männchen nach unterschiedlichen Paarungsabstinenzperioden zu bestimmen. Die Oberflächen- und intrazellulären Pools der AMPAR- und NMDAR-Untereinheiten wurden mithilfe eines membranundurchlässigen Vernetzungsreagenzes (BS) quantifiziert.3), das selektiv modifiziertes oberflächenexprimiertes Protein ermöglicht, das mittels SDS-PAGE und Western Blot-Analyse von unmodifizierten intrazellulären Proteinen unterschieden werden kann. Repräsentative Blots, die Oberflächen- (hohes Molekulargewicht, >250 kDa) und intrazelluläre Banden darstellen, sind in Abbildung 2M.
Einen Tag nach dem sexuellen Erlebnis war die Expression der NR1-Untereinheit an der Oberfläche (S), intrazellulär (I) und insgesamt (S+I) signifikant erhöht (S, Abbildung 2A, S.=0.025; ich, Abbildung 2D, S.=0.035; Abbildung 2J, S.=0.023) bei sexuell erfahrenen Tieren im Vergleich zu sexuell naiven Kontrolltieren (Abbildung 2N). Eine Woche nach der letzten Paarung kam es zu einem signifikanten Rückgang der Expression von NR1 im Verhältnis von Oberfläche zu intrazellulärem Anteil (S/I-Verhältnis; Abbildung 2GUnd p=0.024) ohne signifikante Veränderungen in der Oberflächen- oder intrazellulären Expression im Vergleich zu sexuell naiven Tieren. Die Expression von GluA2 nahm eine Woche nach der letzten Paarung signifikant zu, sowohl in der intrazellulären als auch in der Gesamtexpression, ohne Veränderungen in der Oberflächenexpression (I, Abbildung 2E, S.=0.026; Abbildung 2K, S.=0.014) bei sexuell erfahrenen Tieren im Vergleich zu naiven (Abbildung 2O). Einen Monat nach der letzten Paarung war GluA2 im S/I-Verhältnis signifikant erhöht (Abbildung 2HUnd p=0.046), begleitet von einem statistischen Trend zu einer Zunahme der Oberflächenexpression (Abbildung 2BUnd p=0.055) bei sexuell erfahrenen Tieren im Vergleich zu naiven Kontrolltieren. Veränderungen in GluA1 wurden 1 Tag oder 1 Woche nach der letzten Paarung nicht festgestellt. Nach 1 Monat schienen die GluA1-Oberflächen- und S/I-Verhältnisexpression bei sexuell erfahrenen Tieren im Vergleich zu naiven Kontrolltieren erhöht zu sein, obwohl nur statistische Trends festgestellt wurden (S, Abbildung 2C, S.=0.098; Abbildung 2I, S.=0.083). Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass zunächst nach einem Tag Abstinenz eine insgesamt erhöhte Expression von NR1 festgestellt wurde, gefolgt von einer erhöhten intrazellulären Expression von GluA1 nach einer Woche Abstinenz und einer erhöhten Oberflächenexpression von GluA2 und GluA1 nach einem Monat Abstinenz (letzteres nur als statistischer Trend).
Experiment 3: Elektrophysiologie
Ziel des dritten Experiments war es, festzustellen, ob sexuelle Erfahrung die synaptische Stärke in PFC-reagierenden NAc-Schalenneuronen verändert. Synaptische Ströme wurden in mittelgroßen stacheligen Neuronen in der NAc-Schale von sexuell erfahrenen und unerfahrenen Männern nach Stimulation von Fasern aufgezeichnet, die vermutlich aus dem PFC stammen. Das AMPA/NMDA-Verhältnis war bei sexuell erfahrenen Tieren 3 Tag lang signifikant reduziert (p=0.005), 1 Woche (p=0.016) und 1 Monat (p=0.005) nach der letzten Paarung im Vergleich zur sexuell naiven Kontrollgruppe (Abbildung 3A, B, C). Um festzustellen, ob sich die Wahrscheinlichkeit der präsynaptischen Transmitterfreisetzung geändert hat, wurden die Paarpulsverhältnisse untersucht. Das Ausmaß der Erleichterung der Transmitterfreisetzung, die als Reaktion auf die Paarpulsstimulation auftrat, unterschied sich bei sexuell erfahrenen und unerfahrenen Tieren zu keinem Zeitpunkt (Abbildung 3D).
Diskussion
Die vorliegende Studie zeigte, dass sexuelle Erfahrung Veränderungen in der Verteilung und Funktion des ionotropen Glutamatrezeptors im NAc männlicher Ratten verursacht und dass einige dieser Veränderungen mit der Dauer der Abstinenzperiode vom sexuellen Verhalten variierten. Im Vergleich zu sexuell unerfahrenen Männchen zeigten sexuell erfahrene Männchen einen kurzfristigen Anstieg der gesamten NR1-Untereinheitsexpression aufgrund von Zunahmen sowohl der oberflächlichen als auch der intrazellulären Rezeptorpools. Die GluA2-Expression war nach 1 Woche bzw. 1 Monat Belohnungsabstinenz intrazellulär und an der Oberfläche erhöht. Schließlich wurde die GluA1-Expression zu keinem Zeitpunkt signifikant verändert. Darüber hinaus wurde bei sexuell erfahrenen Tieren im Vergleich zu naiven Kontrolltieren ein sofortiger und lang anhaltender Rückgang des AMPA/NMDA-Verhältnisses anhand von PFC-reagierenden NAc-Schalenneuronen festgestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Transport am Glutamatrezeptor von der Länge einer Abstinenzperiode vom Sexualverhalten abhängt, während dies bei Veränderungen der synaptischen Stärke an Synapsen, die durch präfrontale kortikale Afferenzen zur NAc-Schale gebildet werden, nicht der Fall ist. Diese Hauptergebnisse ähneln Berichten nach wiederholtem Kokainkonsum hinsichtlich einer erhöhten Oberflächenexpression der AMPAR-Untereinheit nach langer Drogenabstinenz und einer sofortigen Abnahme des AMPA/NMDA-Verhältnisses, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der kurzfristigen Expression der NMDAR-Untereinheit und einer anhaltenden Abnahme des AMPA/NMDA-Verhältnisses.
Sexuelles Verhalten ist sehr lohnend und verstärkend. Wenn eine männliche Ratte sexuelle Erfahrung sammelt, zeigt sie eine erhöhte sexuelle Motivation und Leistung, die sich in kürzeren Latenzen bis zum Beginn der Paarung und der Ejakulation sowie einer erhöhten Kopulationseffizienz zeigt. [10]., [23].. Hier wurde bestätigt, dass diese Erleichterung des Sexualverhaltens 1 Woche nach der Paarung vorhanden war, und es wurde festgestellt, dass das erleichterte Sexualverhalten bis zu einem Monat Paarungsabstinenz anhielt. Das zeitliche Profil der durch Sexualerfahrung induzierten Erleichterung des Sexualverhaltens entspricht unserer vorherigen Studie, die eine Kreuzsensibilisierung gegenüber den die Fortbewegung induzierenden Wirkungen von Amphetamin zeigte, wenn es in denselben Paarungsabstinenzperioden getestet wurde [11].. Frühere Studien haben gezeigt, dass NAc ein Vermittler für die Aufrechterhaltung erleichterten Sexualverhaltens ist. Sowohl NAc-Kern- als auch -Schalenneuronen werden durch Paarung oder mit der Paarung verbundene Signale aktiviert. [48].und sexuelle Erfahrung führt zu vermehrten dendritischen Verzweigungen und Stacheln im NAc-Kern und der Schale eine Woche nach der Paarung [11].. Darüber hinaus schwächt die Verringerung der Aktivität des Transkriptionsfaktors deltaFosB im NAc durch viralen Vektor-vermittelten Gentransfer die erfahrungsbedingte Erleichterung des Sexualverhaltens ab. [23]., [49].. TDiese Ergebnisse legen nahe, dass NAc speziell mit der Verstärkung des Sexualverhaltens verbunden ist und möglicherweise für die kreuzsensibilisierten Arzneimitteleffekte des sexuellen Erlebens von entscheidender Bedeutung ist. [23]..
Die vorliegende Studie zeigte, dass sexuelle Erfahrungen Veränderungen in der AMPAR-Synthese und/oder im AMPAR-Transport verursachten, die von der Länge der sexuellen Abstinenzperiode abhängig waren. Erstens war nach einer Woche ein Anstieg der intrazellulären Expression von GluA2 erkennbar, was möglicherweise auf eine erhöhte GluA1-Rezeptorsynthese und/oder Endozytose hinweist. Einen Monat nach der letzten Paarung wurde dann ein erhöhtes GluA2-Oberflächen-/Intrazellular-Verhältnis (größtenteils aufgrund der Zunahme an der Oberfläche) festgestellt, was auf eine Umverteilung der Rezeptoren auf die Zelloberfläche schließen lässt. Veränderungen im AMPAR-Handel nach Kokainkonsum waren auch von der Länge der Drogenabstinenzzeit abhängig [50].Im Allgemeinen sind die GluA1- und GluA2/3-Werte an der Zelloberfläche und in den Synapsen nach einer Woche Kokainabstinenz erhöht und bleiben bis zu 3 Wochen nach der letzten Kokaininjektion auf erhöhtem Niveau. [51]., [52]., [53]., [54]., [55].. Nach einer längeren Zeit der Arzneimittelabstinenz (5 Wochen) blieb die GluA1-Oberflächenexpression erhöht und es gab einen geringen Rückgang des GluA2-Oberflächen-/Intrazellular-Verhältnisses, sodass GluA2-defiziente AMPARs hochreguliert wurden [31]., [56].. Diese erhöhte Expression von GluA2-fehlenden Rezeptoren an der Oberfläche wurde nach längerem Entzug (5–7 Wochen) von der Selbstverabreichung von Kokain mit verlängertem Zugang festgestellt, nicht jedoch nach längerem Entzug von nicht-kontingentem Kokain. [32].Darüber hinaus verhinderte die Blockade des GluA2-defizienten AMPAR die Arzneimittelsuche [31]., [57].. Die Veränderungen im AMPA-Rezeptor-Transport nach sexueller Erfahrung und Abstinenz unterscheiden sich geringfügig von den durch Kokain hervorgerufenen Veränderungen. In Bezug auf die erhöhte GluA1-Oberflächenexpression deuten die vorliegenden Daten auf einen bescheidenen Anstieg der GluA1-Rezeptoren auf der Membranoberfläche hin, der einen Monat nach dem sexuellen Erlebnis keine statistische Signifikanz erreichte, und legen daher nahe, dass die GluA1-Oberflächenexpression möglicherweise längere Abstinenzperioden für eine weitere Hochregulierung erfordert, ähnlich den durch Kokain hervorgerufenen Veränderungen nach 1 Wochen Abstinenz. [31].. Darüber hinaus unterscheiden sich die vorliegenden Daten in Bezug auf GluA2, das nach 5 oder mehr Wochen ohne Kokain einen geringen Rückgang erfuhr, während sexuelle Erfahrung und 1 Monat Abstinenz zu einer erhöhten GluA2-Oberflächenexpression führten. Wir vermuten, dass die Hochregulierung des AMPA-Rezeptors in NAc für die langfristigen Auswirkungen sexueller Erfahrung auf das nachfolgende Belohnungsverhalten und eine erhöhte Amphetaminbelohnung entscheidend sein könnte. [11]. nach den in der vorliegenden Studie getesteten längeren Abstinenzperioden. Im Gegensatz dazu sind Veränderungen in der AMPA-Rezeptorexpression oder im AMPA-Traffic nicht entscheidend für die kurzfristigen Auswirkungen sexueller Erfahrungen auf das Belohnungsverhalten. Zur Unterstützung haben zahlreiche Berichte gezeigt, dass eine veränderte AMPAR-Übertragung für eine durch Medikamente induzierte Verhaltenssensibilisierung gegenüber Psychostimulanzien nicht notwendig ist (zur Überprüfung [30].). Sensibilisierung und Kreuzsensibilisierung wurden nach einem Tag Belohnungsabstinenz ohne Änderungen der AMPAR-Hochregulierung beobachtet. [11]., [53].. Darüber hinaus wurde eine Verhaltenssensibilisierung bei wiederholter Exposition gegenüber dem Psychostimulans Amphetamin nachgewiesen, die jedoch nicht mit Veränderungen der AMPAR-Übertragung in Verbindung gebracht wurde. [50]., [53]., [58]..
Die Rolle von NMDARs in Bezug auf Verhaltenssensibilisierung und Rezeptortransport wurde viel weniger untersucht als die von AMPARs. Ein nichtselektiver NMDAR-Antagonist (MK-801) verhinderte die Entwicklung einer Bewegungssensibilisierung mit Kokain oder Amphetamin, konnte jedoch die Expression dieser Sensibilisierung nicht blockieren. [59]., [60].. Die Rolle von NMDAR im Sexualverhalten wurde nur minimal untersucht, indem MK-801 systemisch oder intramedial im präoptischen Bereich verabreicht wurde, was das Sexualverhalten bei naiven und erfahrenen männlichen Ratten beeinträchtigte. [61]., [62]., [63].. NMDAR vermittelt auch andere natürliche Belohnungen, da NMDAR-Antagonisten die Nahrungsaufnahme bei Pavianen verringerten [64]. und gesteigertes Verlangen nach Nahrung bei Ratten [65].. Der NMDAR-Ausdruck im NAc wird durch Kokainexposition verändert, und längere (3 Wochen), aber nicht kurze (1 Tag) Abstinenzperioden von wiederholtem Kokainkonsum erhöhten den Ausdruck von NMDAR-Untereinheiten (NR1, NR2A, NR2B). [55]., [60].. Die aktuellen Ergebnisse zeigen, dass sexuelle Erfahrungen innerhalb eines Tages zu einem Anstieg der gesamten NR1-Expression führten, und zwar aufgrund erhöhter Werte sowohl in den oberflächlichen als auch den intrazellulären Rezeptorpools, zusätzlich zu einem verringerten Oberflächen-/Intrazellulär-Verhältnis nach einer einwöchigen Abstinenzperiode. Daher gehen wir von der Hypothese aus, dass ein anfänglicher Anstieg der NMDAR-Übertragung für die kurzfristigen Auswirkungen sexueller Erfahrungen auf das nachfolgende Belohnungsverhalten entscheidend sein könnte.
Darüber hinaus kann der kurzfristige Anstieg der NR1-Untereinheit nach sexueller Erfahrung ein Hinweis auf die durch sexuelle Erfahrung hervorgerufene Bildung stiller Synapsen sein. Huang et al [66]. zeigte, dass wiederholter Kokainkonsum stille Synapsen in der NAc-Schale erzeugte, wobei die postsynaptische Rekrutierung neuer NMDAR entscheidend war. Stille glutamaterge Synapsen exprimieren funktionelle NMDAR-vermittelte Ströme in Abwesenheit von AMPAR-vermittelten Strömen [67]., [68]., [69].. Es wurde nachgewiesen, dass früherer Kokainkonsum stille Synapsen im gesamten Gehirn erzeugen kann und dass diese neu erzeugten Synapsen ein Substrat für nachfolgende Erfahrungen bilden. [66]., [70].. NMDAR bestehen aus mindestens einer NR1-Untereinheit in Kombination mit einer oder mehreren NR2-Untereinheiten (A–D). NR1 ist für die Bildung funktioneller Kanäle erforderlich; daher können Änderungen der NR1-Expression einen Hinweis auf Änderungen der Anzahl funktioneller NMDA-Rezeptoren liefern. Wiederholte Kokaingabe fördert die Insertion von NR1- und NR2B-haltigen NMDARs und erzeugt stille Synapsen in der NAc-Schale. Diese NR2B-haltigen stillen Synapsen wurden während der Kokaingabe gehemmt, was die nachfolgende Bewegungssensibilisierung durch Kokain abschwächte. [71].. Die Anzahl der stillen Synapsen nahm nach mehreren Tagen Kokainabstinenz ab, während die Bewegungssensibilisierung bestehen blieb, was darauf hindeutet, dass unreife Synapsen an der Bildung neuer plastischer Schaltkreise beteiligt sein könnten, die (möglicherweise durch Belohnungsabstinenz) verändert werden können, um diese anhaltenden Verhaltensweisen zu vermitteln. Daher vermuten wir, dass die Hochregulierung der Gesamtexpression von NR1 kurz nach sexueller Erfahrung auf die erhöhte Anzahl von NMDAR in neu gebildeten stillen Synapsen zurückzuführen sein könnte. Darüber hinaus kann sexuelle Erfahrung, gefolgt von langwieriger Abstinenz, zu einer Verringerung der stillen Synapsen führen, was sowohl das verringerte NR1-Oberflächen-/Intrazellularverhältnis als auch die Zunahme der AMPAR-Untereinheiten bei längeren Abstinenzperioden erklärt, da die Synapsen nicht stillgelegt sind.
Die aktuellen Erkenntnisse, dass sexuelle Erfahrungen und Perioden der Belohnungsabstinenz Veränderungen im Transport und der Expression von Glutamatrezeptoren verursachten, deuteten auf Veränderungen der synaptischen Stärke an erregenden Synapsen im NAc hin. Daher wurde ein elektrophysiologisches Verfahren basierend auf einer früheren Studie von Thomas und Kollegen [72]. wurde verwendet, um die Funktion des Glutamatrezeptors in NAc-Schalenneuronen nach denselben Abstinenzperioden zu untersuchen, die nachweislich zu sensibilisiertem Sexual- und Drogenverhalten sowie zur Umverteilung des Glutamatrezeptors führen. Ähnlich wie in früheren Studien nach Kokainexposition wurde die Plastizität in NAc-Schalensynapsen bestimmt, die auf PFC-Eingabe reagierten. Es ist gut bekannt, dass PFC eine Schlüsselrolle bei zwanghaftem Verhalten und Drogenmissbrauch spielt [73]., [74].. Ebenso ist der PFC von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung oder den Ausdruck zwanghaften Sexualverhaltens, da PFC-Läsionen bei männlichen Ratten zu maladaptivem Suchen nach Sexualverhalten führen. [75].. Die aktuellen Daten zeigten, dass sexuelle Erfahrungen einen sofortigen und lang anhaltenden Rückgang des AMPA/NMDA-Verhältnisses in den PFC-reagierenden NAc-Schalenneuronen verursachten.
Bisher wurde angenommen, dass der Hauptunterschied zwischen natürlicher und medikamentöser Belohnung darin besteht, dass Änderungen des AMPA/NMDA-Verhältnisses nach natürlicher Belohnung vorübergehend sind und mit der Zeit verschwinden, während durch Medikamente hervorgerufene Änderungen bestehen bleiben. [76].. Diese Hypothese basierte auf Erkenntnissen, dass Kokain, nicht aber Nahrungsmittel oder Saccharose, einen lang anhaltenden Anstieg des AMPA/NMDA-Verhältnisses im VT verursachten.A [76].. Im Gegensatz dazu zeigt die vorliegende Studie, dass sexuelle Erfahrungen tatsächlich eine dauerhafte Veränderung des AMPA/NMDA-Verhältnisses im NAc bewirkten.
Die durch Sex induzierte Plastizität der NAc-Schale unterscheidet sich jedoch von der nach Kokainexposition, die nachweislich mit einer bidirektionalen Veränderung der durch AMPAR vermittelten Erregbarkeit einhergeht.Nach Kokainkonsum und einem Tag Drogenabstinenz kam es zu einer Reduktion des AMPA/NMDA-Verhältnisses [72]. und Abnahme der Feuerungsleistung [34]. wurde festgestellt, ähnlich den Ergebnissen, die für kurzfristige Auswirkungen sexueller Erfahrungen erzielt wurden. Nach einer 14-tägigen Abstinenzperiode von Kokain haben NAc-Schalenneuronen jedoch erhöhte AMPA/NMDA-Verhältnisse, was darauf hindeutet, dass die Abstinenz von Kokain die synaptische Stärke im NAc erhöht. [54].. HFolglich führt der Kokainkonsum zu einer bidirektionalen Änderung der synaptischen Plastizität mit verringerten AMPA-vermittelten Reaktionen kurz nach dem Konsum des Medikaments, jedoch zu einer erhöhten AMPAR-vermittelten Erregbarkeit bei längerer Drogenabstinenz. Im Gegensatz dazu führte eine längere Abstinenz von sexuellen Erfahrungen zu einer verringerten AMPAR-vermittelten Erregbarkeit in der NAc-Schale, obwohl während dieser Abstinenzperioden eine Sensibilisierung der Bewegungsaktivität und eine mit Amphetamin verbundene Belohnung beobachtet werden. [11].. Andere Berichte haben jedoch gezeigt, dass sowohl im Kern als auch in der Schale bei kurzer und langer Abstinenzzeit nach Kokainexposition eine verringerte intrinsische Membranerregbarkeit auftritt. [35]., [36]., [37]., [38]., [39]., [40]., [41]., die einen Mangel an bidirektionalen Veränderungen zeigen, ähnlich den Auswirkungen sexueller Erfahrungen. Darüber hinaus zeigen die aktuellen Ergebnisse, dass sexuelle Erfahrungen keine Veränderungen in der Wahrscheinlichkeit der präsynaptischen Glutamatfreisetzung verursachen, da es zwischen den Gruppen keine Unterschiede im Verhältnis der gepaarten Pulse gibt. Kalivas und Kollegen haben gezeigt, dass wiederholter Kokainkonsum Veränderungen in Mediatoren der extrazellulären nicht-synaptischen Glutamatpools im NAc hervorruft. Ob solche Veränderungen bei sexuellen Erfahrungen auftreten, muss noch ermittelt werden (zur Überprüfung [77].).
Es ist wahrscheinlich, dass glutamaterge Eingänge zum NAc aus anderen Gehirnbereichen als dem PFC eine funktionelle Rolle bei den Auswirkungen sexueller Erfahrungen auf das nachfolgende Belohnungsverhalten spielen.. TDer NAc erhält glutamatergen Input von der basolateralen Amygdala (BLA) und dem ventralen Subiculum des Hippocampus. [78].. Der BLA spielt eine Rolle im natürlichen Belohnungssuchverhalten [79]., [80]., ist entscheidend für die Assoziation von Umweltreizen mit sexueller Belohnung [81]. und für instrumentelles Verhalten zur Einleitung der Paarung [82].. Daher ist es verlockend, zu spekulieren, dass durch sexuelle Erfahrungen auch Veränderungen der synaptischen Stärke an BLA-reagierenden Synapsen hervorgerufen werden.
Das verringerte AMPA/NMDA-Verhältnis an PFC-Synapsen in der NAc-Schale stimmt mit der erhöhten Expression von NR1 kurz nach sexueller Erfahrung überein, ist jedoch nicht mit erhöhten GluA2- und GluA1-Werten nach längeren Abstinenzperioden vereinbar. Eine Erklärung ist, dass Rezeptortransport an Synapsen stattfand, die glutamatergen Input aus anderen Gehirnbereichen als dem PFC erhielten. Außerdem schließt die Einbeziehung des NAc-Kerns zusätzlich zur NAc-Schale in die Proteinproben die Möglichkeit aus, genaue Korrelationen zwischen der Proteinexpression und den Daten zur synaptischen Stärke herzustellen. Dennoch zeigen die aktuellen Erkenntnisse deutlich, dass natürliches Belohnungsverhalten und anschließende Belohnungsabstinenz eine synaptische Plastizität im NAc verursachen, die Ähnlichkeiten und Unterschiede zu der durch Psychostimulanzien hervorgerufenen Plastizität aufweist.
IAbschließend lässt sich sagen, dass sexuelle Erfahrung und anschließende Abstinenz von Belohnungen bei männlichen Ratten eine sofortige und lang anhaltende Erleichterung des Sexualverhaltens bewirken, ähnlich den Auswirkungen sexueller Erfahrung auf die Sensibilisierung für die lokomotorischen Wirkungen von Amphetaminen.ne [11]., und war mit einer sofortigen und lang anhaltenden Abnahme der AMPA/NMDA-Verhältnisse in den Synapsen der NAc-Schale verbunden. Darüber hinaus verursachte sexuelle Erfahrung eine schnelle Hochregulierung von NMDAR und eine sich langsam entwickelnde Umverteilung von AMPAR an die Oberfläche von NAc-Neuronen. Daher kann natürliches Belohnungsverhalten, ähnlich wie Psychostimulanzien, dauerhafte Veränderungen bei der Expression, dem Transport und der Erregbarkeit von Glutamatrezeptoren hervorrufen. aber, eine längere Abstinenz von sexuellen Erfahrungen, anders als nach Kokainkonsum, führte zu einer anhaltenden Abnahme des AMPA/NMDA-Verhältnisses in der NAc-Schale. Es wurden eine Reihe überprüfbarer Hypothesen für mögliche zugrunde liegende Faktoren vorgeschlagen, die zu dieser Diskrepanz beitragen, darunter Veränderungen der BLA-reagierenden Synapsen nach natürlichen Belohnungserfahrungen. Diese Daten verdeutlichen erneut sowohl Ähnlichkeiten als auch Unterschiede zwischen den langfristigen Folgen natürlicher und medikamentöser Belohnungsexposition und können zu einem besseren Verständnis der möglichen Auswirkungen von Medikamenten auf diesen natürlichen Belohnungspfad beitragen.
Methoden
Ethik-Erklärung
Alle Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Western Ontario genehmigt und entsprachen den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care für die Einbeziehung von Wirbeltieren in die Forschung.
Tiere
Erwachsene männliche Sprague Dawley-Ratten (Experiment 1 und 2: 10–12 Wochen; Experiment 3: 8–10 Wochen zum Zeitpunkt des Beginns der Experimente) wurden von Charles River Laboratories (Senneville, QC, Kanada) bezogen. Gleichgeschlechtliche Tiere wurden paarweise in Plexiglaskäfigen mit einem Tunnelrohr in einem temperaturgeregelten Raum untergebracht, in dem ein 12/12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus herrschte und in dem Futter und Wasser verfügbar waren. ad libitum außer während Verhaltenstests. Stimulus-Weibchen (210–220 Gramm) für Paarungssitzungen erhielten nach beidseitiger Ovariektomie ein subkutanes Implantat mit 5 % Estradiolbenzoat und 95 % Cholesterin. Die sexuelle Empfänglichkeit wurde durch die Verabreichung von 500 µg Progesteron in 0.1 ml Sesamöl etwa 4 Stunden vor dem Test herbeigeführt.
Sexuelle Erfahrung
Alle männlichen Ratten waren vor Beginn der Experimente sexuell unerfahren. Die Paarungssitzungen fanden während der frühen Dunkelphase (zwischen 2 und 6 Stunden nach Beginn der Dunkelperiode) unter schwacher roter Beleuchtung statt. Während jeder Paarungssitzung durften die männlichen Ratten bis zur Ejakulation oder bis zu einer Stunde kopulieren, und Parameter für das Sexualverhalten wurden aufgezeichnet, darunter: Latenzzeit beim Aufreiten (ML; Zeit von der Einführung des Weibchens bis zum ersten Aufreiten), Latenzzeit beim Einführen (IL; Zeit von der Einführung des Weibchens bis zum ersten Aufreiten mit vaginaler Penetration) und Latenzzeit beim Ejakulieren (EL; Zeit von der ersten Einführung bis zur Ejakulation). [83].. Sexuell unerfahrene Kontrolltiere wurden angefasst, in denselben Räumen wie die sich paarenden Tiere untergebracht und so denselben Lärmpegeln, allgemeinen Störungen und entfernten Gerüchen brünstiger Weibchen ausgesetzt, durften jedoch weder mit paarungsbereiten Weibchen interagieren noch sich mit ihnen paaren.
Experiment 1: Sexuelle Erleichterung
Männliche Sprague-Dawley-Ratten paarten sich in ihren Käfigen fünfmal täglich hintereinander. Die Tiere wurden in zwei Versuchsgruppen aufgeteilt und entweder eine Woche oder einen Monat nach der letzten Paarung auf ihr Sexualverhalten getestet (Testtag; n=7 pro Gruppe). Die Gruppen wurden nach Parametern des Sexualverhaltens zugeordnet und es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich irgendeines Sexualverhaltensmaßes während der Paarungszeit und beim Sammeln sexueller Erfahrungen festgestellt werden.
Datenanalyse
Innerhalb der Gruppen wurden Vergleiche an Tag 1 und 5 des sexuellen Erlebnisses angestellt, um die Erleichterung des Sexualverhaltens mit sexuellem Erlebnis zwischen Tag 1 und Testtag und zwischen Tag 5 und Testtag (entweder 1 Woche oder 1 Monat nach Tag 5) hinsichtlich der Latenzen bei Aufreiten, Eindringen und Ejakulation zu bestimmen. Hierzu wurde der Wilcoxin-Vorzeichen-Rang-Test mit einer Signifikanzstufe von 5 % verwendet.
Experiment 2: Umverteilung/Expression der ionotropen Glutamatrezeptor-Untereinheit
Zur Untersuchung der Umverteilung ionotroper Rezeptoren wurde ein dem Experiment 1 ähnliches Paradigma verwendet. Sexuell naive männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in sexuell erfahrene und naive Gruppen unterteilt. Die sexuell erfahrenen Gruppen sammelten ihre sexuelle Erfahrung durch 5 aufeinanderfolgende tägliche Paarungssitzungen (wie oben beschrieben). Die sexuell erfahrenen Männchen wurden dann in 3 Versuchsgruppen (mit übereinstimmenden Parametern des Sexualverhaltens) unterteilt, um entweder 1 Tag, 1 Woche oder 1 Monat nach der letzten Paarungssitzung Gewebe zu sammeln. Gehirne von sexuell naiven Kontrollpersonen (wie oben beschrieben behandelt) wurden zu identischen Zeitpunkten nach der letzten Behandlung gesammelt. Die Gruppen umfassten: sexuell erfahren (AMPAR: 1D, n=9; 1W, nein=12; 1M, nein=12; NMDAR: 1D, n=9, 1W oder 1M, n=6) oder sexuell naiv (AMPAR: 1D, n=9; 1W, nein=12; 1M, nein=12; NMDAR: 1D, n=9, 1W oder 1M, n=6).
Oberflächenrezeptor-Vernetzung
Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital (270 mg/kg; ip) getötet und anschließend enthauptet. Nach der Enthauptung wurde jedes Gehirn schnell entfernt und sofort in eiskalte Kochsalzlösung gelegt. Bilaterales NAc wurde mithilfe einer Rattenhirnmatrix (ASI Instruments, Warren, MI, USA) und einer Skalpellklinge gemäß den von Paxinos & Watson (1998) definierten NAc-Grenzen seziert. Anschließend wurde das NAc-Gewebe mithilfe eines McIlwain-Gewebeschneiders (Vibratome, St. Louis, MO, USA) in 400×400 µm große Würfel geschnitten. Die Methodik zur Vernetzung der AMPA- und NMDA-Rezeptoruntereinheiten basierte auf Boudreau & Wolf [53].. Unmittelbar nach dem Zerkleinern wurde das Gehirngewebe rasch in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, das 1 ml eiskalte aCSF enthielt, die mit dem Proteinvernetzungsreagenz Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3, 2 mM; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) und 30 Minuten lang auf einem Wippentisch bei 4 °C inkubiert. BS3 durchdringt keine Zellmembranen und kann daher selektiv oberflächenexprimierte Proteine mit Sulfidbindungen vernetzen und so Aggregate mit hohem Molekulargewicht bilden, während intrazelluläre Proteine unverändert bleiben. Diese Reaktion ermöglicht die Unterscheidung von oberflächlichen und intrazellulären Proteinpools anhand des Molekulargewichts mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot-Analyse. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 100 µl 1 M Glycin für 10 Minuten bei 4 °C gestoppt. Das Gewebe wurde durch Zentrifugation bei 14 U/min für 000 Minuten bei 2 °C pelletiert und der Überstand verworfen. Die Pellets wurden in 4 µl eiskaltem Lyse-Puffer [400 mM Hepes (pH 25), 7.4 mM NaCl, 500 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 20 % Nonidet P-0.1 (40 %), Proteaseinhibitor-Cocktail (Ministop, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und 0.1× Phosphataseinhibitor-Cocktail (Phosstop, Roche Diagnostics GmbH,)] resuspendiert. Die Proben wurden 1 Sekunden lang mit Ultraschall behandelt, um das Gewebe aufzubrechen, dann 5 min bei 14 °C bei 000 U/min zentrifugiert und sofort wieder in einen Eisblock gelegt. Das Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt, aus dem 2 µl der Probe auf Eis gelegt und das verbleibende Überstand bei −4 °C für die Western-Blot-Analyse aufbewahrt wurde. Für jede Probe wurde die Proteinkonzentration der vernetzten Lysate mithilfe eines BCA-Tests (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA) und eines NanoDrop ND-30-Spektrophotometers (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA) bestimmt.
Western-Blot-Analyse
Proteinproben (20 µg) wurden geladen und auf 4–15 % Gradienten-Tris-HCl-Gelen (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, Ontario, Kanada) elektrophoretisch aufgetrennt. Dafür wurde ein Mini Trans-Blot Cell-System (Bio-Rad Laboratories Ltd.) und Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer [25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1 % SDS (pH 8.3)] verwendet. Als Molekulargewichtsmarker wurden Precision Plus Protein All Blue-Standards (Bio-Rad Laboratories Ltd.) verwendet. Nach der Trennung wurden die Proteine für das Immunoblotting auf Millipore Immobilon-FL Polyvinylidenfluoridmembranen (PVDF; Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen. Dafür wurde das Trans-Blot Cell-Nassblotting-System (Bio-Rad Laboratories Ltd.) verwendet. Der Proteintransfer wurde in Transferpuffer (20 % Methanol und 0.037 % SDS in Tris-Glycin [25 mM Tris, 192 mM Glycin (pH 8.3)] bei 82 V für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Alle Proben wurden mindestens doppelt durchgeführt und über die Gruppen und die einzelnen Gele hinweg ausgewogen.
Anschließend wurden die Membranen in einem 2![[Verhältnis]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
3 Lösung von Odyssey Blocking Buffer (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) und Tris-gepufferter Salzlösung (TBS; 50 mM Tris und 150 mM NaCl (pH8.0)) für 1 Stunde auf einem Schütteltablett bei RT. Die Membranen wurden dann einzeln für 16 Stunden auf einem Schüttler bei 4°C mit entweder polyklonalem Kaninchen-Anti-GluA1 (∼106 kDa; 11K; Millipore, Kat.-Nr. AB1504) und GluA2 (∼100 kDa; 14K; Millipore, Kat.-Nr. AB1768) oder monoklonaler Maus-Anti-NR1 (∼130 kDa; 12K; Upstate (Millipore), Kat.-Nr. 05-432). Diese primären Antikörper wurden bereits früher verwendet und validiert [84]., [85]., und erzeugte ein einzelnes Band mit dem entsprechenden Molekulargewicht, das durch die Vorabsorption des Antikörpers mit Peptid bei Verwendung auf nicht vernetztem Gewebe verhindert wurde. Alle Antikörper wurden in einer 23 Mischung aus Odyssey Blocking Buffer mit TBS-T (TBS+0.05% Tween-20 (pH 8.0). Nach drei 10-minütigen Waschungen in TBS-T wurden die Membranen in sekundären Antikörpern inkubiert, die in einem 23 Mischung aus Odyssey Blocking Buffer und TBS-T für 1 Stunde bei RT. Die sekundären Antikörper umfassten Alexa-680 konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen (15K; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) oder IR Dye800 CW-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-Antigen (110K; LI-COR Biosciences). Die fluoreszierende Immunreaktivität wurde visualisiert und die Bilder mit einem Odyssey 2.1-Scanner (LI-COR Biosciences) aufgenommen.
Quantifizierung und statistische Analysen
Für jede Proteinprobe wurden die Fluoreszenzintensitätsstufen für jedes Band (hohes MW, >250 kDa für Oberflächenexpression und Bänder mit dem oben aufgeführten spezifischen MW für intrazelluläre Expression) mithilfe der Odyssey-Software bestimmt und Durchschnittswerte für jedes Tier berechnet. Oberflächen- (S), intrazelluläre (I), Verhältnis- (S/I, Maß für die Verteilung der Rezeptoruntereinheiten) und Gesamtbanddichtewerte (S+I, Maß für die gesamte Expression der Rezeptoruntereinheiten) wurden auf die Mittelwerte der entsprechenden sexuell naiven Kontrollgruppen normalisiert. Es gab keinen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den Replikaten jeder Probe (aufgeladen in verschiedene Gele), was den Mangel an Variabilität bei der Beladung der Proteinproben bestätigt. Alle Western Blot-Daten wurden zwischen sexuell erfahrenen und sexuell naiven Kontrollpersonen zum gleichen Zeitpunkt mithilfe ungepaarter t-Tests mit einem Signifikanzniveau von 0.05 analysiert.
Experiment 3: Elektrophysiologie
Für die Experimente 1 und 2 wurde der gleiche Versuchsaufbau wie oben beschrieben verwendet. Sexuell erfahrene Männchen wurden in 3 Versuchsgruppen aufgeteilt, die nach Sexualverhalten und basierend auf dem Zeitpunkt der Gewebeentnahme 1 Tag, 1 Woche oder 1 Monat nach der letzten Paarung (1 Tag, n=7; 1 Woche, n=9; 1 Monat, n=10). Das Sexualverhalten dieser jüngeren männlichen Ratten unterschied sich nicht von dem Sexualverhalten der älteren männlichen Ratten in den Experimenten 1 und 2. Die Ratten wurden mit Natriumpentobarbital (270 mg/kg; ip) anästhesiert, gefolgt von einer transkardialen Perfusion mit eiskaltem Sauerstoff (95 % O2, 5% CO2) Präparationslösung mit [250 mM Saccharose, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO44 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM Glucose, 3 mM Myoinositol, 2 mM Natriumpyruvat und 0.5 mM Ascorbat]. Das Gehirn wurde herausgeschnitten und in eine eiskalte, sauerstoffhaltige Präparationslösung gelegt. Von jedem Tier wurden mit einem Vibratom (Microm, Walldorf, Deutschland) sagittale Gehirnscheiben mit einer Dicke von 400 µm entnommen. Insgesamt 4 Scheiben pro Gehirn wurden in eine Haltekammer mit künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) [125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO41.3 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 26.2 mM NaHCO3 und 10 mM Glucose], 32 Minuten lang auf 30 °C erhitzt und dann mindestens 1 Stunde lang auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, bevor eine einzelne Scheibe in eine Aufzeichnungskammer gelegt wurde. Diese Kammer wurde mit sauerstoffhaltigem aCSF bei 22 °C überflutet. Es gab keine Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Parameter des sexuellen Verhaltens. Gehirne wurden von sexuell unerfahrenen Kontrollpersonen zu jedem der 3 Zeitpunkte nach der letzten Handhabung gesammelt (n=3–4 jeweils).
Schalenneuronen wurden in medialen NAc-Scheiben untersucht, die kein dorsales Striatum enthielten [72].. Bipolare Mikroelektroden aus rostfreiem Stahl wurden in der prälimbischen Kortex-NAc-Grenze rostral zur Aufzeichnungselektrode platziert, um die afferenten Fasern des Kortex präsynaptisch zu stimulieren. Vitale mittelgroße Stachelneuronen wurden visuell anhand ihrer Somagröße (ca. 30–35 µm Durchmesser) und eines relativ negativen Ruhemembranpotentials von −75 bis −85 mV identifiziert. Die Aufzeichnungen erfolgten mit einem Axopatch 200A-Verstärker und einer Abtastrate von 20 kHz (Digidata 1340) mit einem 10-kHz-Tiefpassfilter. PClamp 9.0 wurde für die Versuchsprotokolle und -analysen verwendet. Afferenzen wurden mit gepaarten Impulsen (50 ms ISI) bei 0.1 Hz und Neuronen mit einer bipolaren konzentrischen Wolframelektrode stimuliert. Die Zellen wurden bei −80 mV spannungsgeklemmt und 40 ms lang auf +500 mV depolarisiert, bevor sie synaptisch stimuliert wurden, um die Magnesiumblockade der NMDA-Ströme aufzuheben. Die AMPA/NMDA-Verhältnisse wurden bestimmt, indem der Durchschnitt der EPSCs bei +40 mV in Abwesenheit oder Anwesenheit des NMDAR-Antagonisten AP5 (50 µM; Gesamtzellströme 30× Kontrolle und 30× in Anwesenheit von AP5) ermittelt wurde. Die NMDA-Reaktion wurde berechnet, indem AP5-Aufzeichnungen von der Kontrolle abgezogen wurden. Der Peak von AMPAR EPSC wurde durch den Peak von NMDAR EPSC geteilt, um ein AMPA/NMDA-Verhältnis zu erhalten. Um gepaarte Pulsverhältnisse zu bestimmen, wurden Messungen bei −80 mV mit präsynaptischer Stimulation (30×) durchgeführt.
Datenanalyse
Die Daten der sexuell naiven Kontrollgruppe wurden zu einer Kontrollgruppe zusammengefasst (n=10 Neuronen bei 10 Tieren), da keine statistischen Unterschiede zwischen den Zeitpunkten innerhalb der Kontrollen festgestellt wurden. Sexuell erfahrene Gruppen (1 Tag, n=7; 1 Woche, n=9; 1 Monat, n=10 Neuronen (normalerweise ein Neuron pro Tier) wurden mit der sexuell naiven Kontrollgruppe verglichen. Dabei wurde eine einfaktorielle ANOVA (Faktoren: Zeitintervall) verwendet, gefolgt von einem Fisher LSD für Post-hoc- Vergleiche mit einem Signifikanzniveau von 5 %.
Anerkennungen
Wir danken Dr. Marina E. Wolf und Mike Milovanovic von der Rosalind Franklin University of Medicine and Science für ihre technische Beratung.
Fußnoten
Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Finanzierung: Canadian Institutes of Health Research an LMC und ARD und Natural Sciences and Engineering Research Council an LMC und KKP. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Veröffentlichungsentscheidung oder Manuskripterstellung.
Referenzen