Abstract
Eine durch Psychostimulanzien induzierte Veränderung von dendritischen Stacheln auf dopaminozeptiven Neuronen im Nucleus accumbens (NAcc) wurde als eine adaptive neuronale Reaktion angenommen, die mit lang anhaltendem Suchtverhalten in Verbindung steht. NAcc besteht hauptsächlich aus zwei verschiedenen Subpopulationen von mittelgroßen stacheligen Neuronen, die hohe Spiegel von entweder Dopamin D1 oder D2 Rezeptoren exprimieren. In der vorliegenden Studie analysierten wir die dendritische Wirbelsäulendichte nach chronischer Kokainbehandlung in verschiedenen D1- oder D2-Rezeptor-haltigen mittelgroßen stacheligen Neuronen in NAcc. Diese Studien verwendeten transgene Mäuse, die EGFP unter der Kontrolle des D1- oder D2-Rezeptor-Promotors (Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP) exprimierten. Nach 28-Tagen mit Kokainbehandlung und 2-Tagen mit Entzug war die Wirbelsäulendichte sowohl in Drd1-EGFP- als auch in Drd2-EGFP-positiven Neuronen erhöht. Jedoch wurde der Anstieg der Wirbelsäule Dichte nur in Drd1-EGFP-positiven Neuronen 30 Tage nach Drogenentzug erhalten. Bemerkenswerterweise wurde eine erhöhte ΔFosB-Expression auch in Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-positiven Neuronen nach 2-Tagen nach Arzneimittelentzug beobachtet, jedoch nur in Drd1-EGFP-positiven Neuronen nach 30-Tagen nach Arzneimittelentzug. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die nach chronischer Kokainbehandlung beobachtete erhöhte Wirbelsäulendichte nur in D1-Rezeptor-enthaltenden Neuronen stabil ist und dass die ΔFosB-Expression mit der Bildung und / oder dem Erhalt von dendritischen Dornen in D1- sowie D2-Rezeptor-enthaltenden Neuronen assoziiert ist in NAcc.
Der mesolimbische dopaminerge Pfad besteht aus Neuronen im ventralen Tegmentum, die den Nucleus accumbens (NAcc), den Tuberculum olfactorium, den präfrontalen Cortex und die Amygdala innervieren ( 1 ). Nigrostriatale dopaminerge Neuronen in der Substantia nigra (Pars compacta) projizieren hingegen aufsteigend zum dorsalen Striatum ( 2 ). Psychostimulanzien erhöhen die synaptische Dopaminkonzentration im NAcc: Kokain durch Blockierung der Dopamin-Wiederaufnahme in den synaptischen Spalt und Amphetamin durch Förderung der Dopamin-Freisetzung aus den Nervenendigungen ( 3–5 ) . Wiederholte, intermittierende Gabe von Psychostimulanzien führt zu verstärkten Verhaltensreaktionen (Sensibilisierung) auf die akuten stimulierenden Wirkungen dieser Substanzen ( 6–8 ) . Die meisten Indizien deuten darauf hin, dass adaptive Veränderungen im dopaminergen System zwischen ventralem Tegmentum und Nucleus accumbens eine zentrale Rolle bei den Veränderungen der erfahrungsabhängigen Plastizität spielen, die dem drogeninduzierten Verhalten zugrunde liegt.
Neben Dopamin ist Glutamat für die Entwicklung einer Verhaltenssensibilisierung als Reaktion auf Psychostimulanzien erforderlich ( 9 , 10 ). Mittelgroße Stachelneuronen (MSNs) im ventralen Striatum erhalten exzitatorische glutamaterge Projektionen aus dem präfrontalen Kortex, die an den Köpfen der dendritischen Dornen synaptisch verankern. MSNs sind zudem das Hauptziel dopaminerger Axone, die an den Dornenhälsen synaptisch verankern ( 1 , 11 , 12 ). Daher stellen die dendritischen Dornen in MSNs das zelluläre Kompartiment dar, in dem die dopaminerge und glutamaterge Transmission initial integriert wird.
Dopamin wirkt auf zwei Hauptrezeptor-Subfamilien, die D1-Subfamilie (Subtypen D1 und D5) und die D2-Subfamilie (Subtypen D2, D3 und D4) ( 13 ). Anatomische Studien im dorsalen Striatum haben gezeigt, dass striatonigrale MSNs hohe Konzentrationen an D1-Rezeptoren (zusammen mit Substanz P und Dynorphin) aufweisen, während striatopallidale MSNs überwiegend D2-Rezeptoren (zusammen mit Enkephalin) exprimieren ( 14–17 ). Die Projektionen des Nucleus accumbens (NAcc ) sind komplexer als im dorsalen Striatum. Sowohl der äußere als auch der innere Teil des NAcc projizieren in unterschiedliche Subregionen des ventralen Pallidums sowie in die ventrale Tegmentumregion und die Substantia nigra ( 18 ) . Während D2-Rezeptoren und Enkephalin in Projektionen zum ventralen Pallidum stark exprimiert werden, finden sich D1-Rezeptoren und Substanz P gleichmäßig verteilt in Projektionen zum ventralen Pallidum und zum ventralen Tegmentum ( 19 ) . Studien mit selektiven Agonisten und Antagonisten für D1- oder D2-Rezeptoren zeigten, dass sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren für psychostimulanzienabhängige Verhaltensänderungen erforderlich sind ( 20–25 ). Die Funktionen dieser Rezeptoren scheinen jedoch unterschiedlich zu sein. So schwächt beispielsweise die Stimulation von D1-Rezeptoren das durch Kokain-Priming-Injektionen und kokainbezogene Umweltreize induzierte Kokainverlangen ab, wohingegen die Stimulation von D2-Rezeptoren die durch Kokain induzierte Wiederaufnahme des Konsums fördert ( 26–28 ).
Die mit Psychostimulanzienabhängigkeit einhergehenden Verhaltensauffälligkeiten sind extrem lang anhaltend. Daher besteht großes Interesse daran, die langfristigen drogeninduzierten Veränderungen auf molekularer und struktureller Ebene in neuronalen Schaltkreisen zu identifizieren, die durch Dopamin und Glutamat reguliert werden ( 29–32 ). Insbesondere wurde festgestellt, dass der Langzeitkonsum von Kokain oder Amphetamin die Anzahl dendritischer Verzweigungen und Dornen von MSNs im NAcc erhöht ( 33–35 ). Diese strukturellen Veränderungen persistieren bis zu etwa 1–3.5 Monate nach der letzten Drogenexposition ( 30, 35 ) und gelten als Grundlage für die mit Psychostimulanzienexposition verbundenen, lang anhaltenden Veränderungen der synaptischen Plastizität.
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung kokaininduzierter Strukturveränderungen dendritischer Dornen in Subpopulationen von Nucleus accumbens (NAcc), die entweder D1- oder D2-Rezeptoren exprimieren. Hierfür verwendeten wir transgene Mäuse mit bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC), die EGFP unter der Kontrolle des D1- (Drd1-EGFP) oder D2-Dopaminrezeptor-Promotors (Drd2-EGFP) exprimieren ( 36 ). Die Ergebnisse zeigen, dass die Dornendichte zwar anfänglich sowohl in D1- als auch in D2-Rezeptor-haltigen MSNs erhöht ist, die veränderte Dornendichte jedoch nur in D1-Rezeptor-haltigen Neuronen stabil bleibt. Darüber hinaus fanden wir ähnliche Veränderungen in der Expression des Transkriptionsfaktors ΔFosB, was darauf hindeutet, dass ΔFosB an der Bildung und/oder Aufrechterhaltung dendritischer Dornen in D1- und D2-Rezeptor-haltigen Neuronen des NAcc beteiligt sein könnte.
Ergebnisse
Analyse von MSNs in Drd1-EGFP und Drd2-EGFP BAC transgenen Mäusen.
Das Projektionsmuster von MSNs aus dem dorsalen und ventralen Striatum von Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-BAC-transgenen Mäusen wurde durch Analyse der GFP-Expression charakterisiert ( 36 ). Die differentielle GFP-Expression in MSNs des dorsalen Striatums entspricht im Allgemeinen der Expression endogener D1- bzw. D2-Rezeptoren ( 36 ). Wir analysierten weiterhin die differentielle GFP-Expression im Nucleus accumbens (NAcc) von Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen ( Abb. 1a und b ) . Während in Drd1-EGFP-Mäusen ca. 58 % der Neuronen im NAcc GFP exprimierten ( Abb. 1a ) , waren es in Drd2-EGFP-Mäusen ca. 48 % ( Abb. 1b ) . MSNs machen 90–95 % aller Neuronen im NAcc aus ( 12 , 37 ). D1-Rezeptoren werden ausschließlich in MSNs exprimiert, D2-Rezeptoren hingegen sowohl in MSNs als auch in cholinergen Interneuronen, die 1–3 % der Striatumneuronen ausmachen ( 37 ). Unter Berücksichtigung dieser Faktoren legen die Ergebnisse nahe, dass mindestens ≈10–15 % der MSNs im NAcc wahrscheinlich sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren exprimieren.
Analyse von dendritischen Stacheln in Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen.
Die GFP-Expression in den Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen erwies sich als nützlich zur Anfärbung neuronaler Zellkörper. Das GFP-Signal in Dendriten und dendritischen Dornen war jedoch nach Immunfärbung mit Anti-GFP-Antikörpern zu schwach für eine Analyse. Die partikelvermittelte ballistische Applikation von Fluoreszenzfarbstoffen wurde kürzlich zur schnellen und effizienten Markierung neuronaler Populationen eingesetzt ( 38 ). Mit dieser Technik lassen sich ganze Neuronen markieren, und die Methode scheint mit der Golgi-Cox-Färbung vergleichbar zu sein. Zur Analyse der dendritischen Morphologie von Neuronen im Nucleus accumbens (NAcc) wurden fixierte Schnitte des Nucleus accumbens mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff 1,1′-Diotadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI) mittels einer Genkanone markiert. Ein Beispiel für einen DiI-gefärbten MSN ist in Abb. 1c dargestellt . Unter den verwendeten Bedingungen beobachteten wir im Allgemeinen markierte Neuronen ohne überlappende Dendriten anderer markierter Neuronen. Bei höherer Vergrößerung konnte die detaillierte dendritische Morphologie, einschließlich der dendritischen Dornen, beobachtet werden ( Abb. 1d ).
Anschließend kombinierten wir die DiI-Markierung mit der Immunhistochemie für GFP in transgenen Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen. Dies wurde durch die Verwendung einer niedrigen Detergenskonzentration zur Gewebepermeabilisierung ermöglicht (siehe Methoden ). Durch sorgfältigen Vergleich der DiI-Färbung und der GFP-Expression in den Zellkörpern der MSNs konnten wir DiI- und GFP-positive bzw. DiI-positive und GFP-negative Neuronen in Drd1-EGFP- ( Abb. 2a ) oder Drd2-EGFP-Mäusen ( Abb. 2b ) identifizieren . In den folgenden Untersuchungen analysierten wir die dendritische Morphologie ausschließlich in DiI- und GFP-positiven Neuronen von Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen.
Die Behandlung mit chronischem Kokain führt zu einer erhöhten Wirbelsäulendichte in Accumbal MSNs, die entweder Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP exprimieren.
Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen wurde über vier aufeinanderfolgende Wochen wiederholt Kokain (30 mg/kg) oder Kochsalzlösung injiziert (siehe Methoden ). Zwei Tage (2WD) bzw. 30 Tage (30WD) nach der letzten Medikamentengabe wurden die Gehirne wie oben beschrieben für die DiI-Markierung und Immunhistochemie präpariert. Eine frühere Studie berichtete, dass die chronische Behandlung mit Amphetamin die Spinedichte an distalen, nicht aber an proximalen Dendriten von MSNs im NAcc erhöhte ( 35 ). Daher beschränkten wir unsere Analyse auf distale Dendriten (d. h. solche mit Verzweigungen zweiter oder dritter Ordnung), einschließlich der terminalen Regionen. Die Analyse zwei Tage nach der letzten Gabe (2WD) ergab eine erhöhte Spinedichte in Drd1-EGFP-positiven MSNs (128 % der Kochsalzlösungsgruppe) ( Abb. 3a und c ) und in geringerem Maße in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (115 % der Kochsalzlösungsgruppe) ( Abb. 3b und d ) . Nach 30 Tagen war die erhöhte Spinedichte in Drd1-EGFP-positiven Neuronen (118 % der Salzlösungskontrolle) ( Abb. 3 a und c ) erhalten geblieben, nicht jedoch in Drd2-EGFP-positiven Neuronen ( Abb. 3 b und d ).
Die Morphologie dendritischer Dornen variiert hinsichtlich ihrer Länge und der Breite des Dornenkopfes. Daher klassifizierten wir dendritische Ausstülpungen zwei Wochen nach Kokainkonsum in vier Dornenklassen (stummelig, pilzförmig, dünn und Filopodien) (Daten nicht gezeigt). Die Dichte pilzförmiger (119.7 ± 4.0 %, p < 0.01) und dünner Dornen (120.0 ± 3.4 %, p < 0.01) war in Drd1-EGFP-positiven MSNs nach Kokainbehandlung erhöht, während die Dichte stummeliger (182.4 ± 21.6 %, p < 0.05) und pilzförmiger Dornen (122.5 ± 5.0 %, p < 0.01) in Drd2-EGFP-positiven MSNs erhöht war. Es gab keinen signifikanten Anstieg von kurzen Dornfortsätzen in Drd1-EGFP-positiven Neuronen oder von dünnen Dornfortsätzen in Drd2-EGFP-positiven Neuronen.
Chronisches Kokain induziert eine ΔFosB-Expression in Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-positiven MSNs in NAcc.
ΔFosB gehört zur Fos-Familie der Transkriptionsfaktoren. Während die akute Verabreichung von Kokain eine schnelle und vorübergehende Induktion verschiedener Fos-Isoformen im Nucleus accumbens (NAcc) bewirkt, erhöht wiederholter Kokainkonsum den ΔFosB-Spiegel. Darüber hinaus bleibt die erhöhte ΔFosB-Expression im NAcc nach Absetzen des Kokains über Wochen bis Monate bestehen und scheint an der langfristigen Regulation der Genexpression beteiligt zu sein, selbst nach Beendigung der Drogeneinnahme ( 29 , 39 , 40 ).
Um die Induktion von ΔFosB in NAcc von Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen nach Kokainbehandlung zu untersuchen, analysierten wir die FosB- und GFP-Expression durch doppelte Markierung (Abb. 4 und Tabelle 1) Der Anti-FosB-Antikörper erkennt alle Formen von FosB, aber wir nehmen an, dass der erhöhte Immunostain für ΔFosB steht (vgl Methoden zur weiteren Diskussion). In mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen exprimierten 16% von Drd1-EGFP-positiven Neuronen und 15% von Drd2-EGFP-positiven Neuronen FosB-Immunreaktivität mit relativ geringer Intensität (Abb. 4 a und b und Tabelle 1). Wiederholte Kokainbehandlung gefolgt von 2WD führte zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl von Drd1-EGFP-positiven Neuronen, die ΔFosB koexprimierten (55% der GFP-positiven Neuronen) (Abb. 4c und Tabelle 1). Ein kleinerer, aber immer noch signifikanter Anstieg der ΔFosB-Expression wurde in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (25% der GFP-positiven Neuronen) gefunden (Abb. 4d und Tabelle 1). Wie bei den Veränderungen der Dorndichte wurde die erhöhte Expression von ΔFosB in Drd1-EGFP-positiven Neuronen (46% der GFP-positiven Neuronen), aber nicht in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (15% der GFP-positiven Neuronen) nach erhalten 30WD (Abb. 4 e und f und Tabelle 1). Beachten Sie, dass die erhöhte ΔFosB Expression beobachtet in Abb. 4f ist in Drd2-EGFP-negativen Neuronen vorhanden.
Diskussion
Langfristige Anpassungen der dopaminergen Neurotransmission gelten als Grundlage für Suchtverhalten im Zusammenhang mit Psychostimulanzien. Insbesondere wird vermutet, dass die durch Psychostimulanzien induzierte Erhöhung der dendritischen Dornendichte von MSNs im Nucleus accumbens (NAcc) mit einer Reorganisation der synaptischen Konnektivität zusammenhängt ( 30 ). Der NAcc besteht größtenteils aus zwei unterschiedlichen Subpopulationen von MSNs, die hohe Konzentrationen entweder von D1- oder D2-Dopaminrezeptoren exprimieren. In der vorliegenden Studie analysierten wir die Dornendichte in verschiedenen D1- bzw. D2-Rezeptor-haltigen MSNs im NAcc nach chronischer Kokainbehandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dornendichte zwar anfänglich sowohl in D1- als auch in D2-Rezeptor-haltigen MSNs erhöht ist, die veränderte Dornendichte jedoch nur in D1-Rezeptor-haltigen Neuronen stabil bleibt. Darüber hinaus fanden wir ein ähnliches Muster von Veränderungen in der Expression des Transkriptionsfaktors ΔFosB in D1- und D2-Rezeptor-haltigen MSNs.
Diese Studien nutzten BAC-transgene Mäuse, die GFP in spezifischen Subpopulationen von MSNs unter der Kontrolle des D1- oder D2-Rezeptorpromotors exprimieren. Darüber hinaus entwickelten wir eine Doppelmarkierungsmethode, die die Immunhistochemie für GFP mit der ballistischen Markierung von Neuronen mittels DiI kombinierte. Frühere Studien verwendeten die Golgi-Cox-Methode zur Analyse des Effekts von Psychostimulanzien auf die Spinedichte ( 34 ), und die hier verwendete DiI-Methode lieferte quantitativ vergleichbare Ergebnisse. Wir entwickelten die Doppelmarkierungsmethode, da die Golgi-Färbung nicht mit der Immunhistochemie kompatibel ist. Die Immunfärbung erfordert üblicherweise eine Gewebepermeabilisierung mit Detergenzien, ein Prozess, der typischerweise zur Solubilisierung lipophiler Farbstoffe aus der Membran führt ( 38 ). In unseren aktuellen Studien benötigte die GFP-Immunfärbung jedoch keine hohe Detergenzkonzentration zur Gewebepermeabilisierung und konnte daher in Kombination mit der Markierung lipophiler Farbstoffe eingesetzt werden. Unsere Doppelmarkierungsmethode dürfte generell nützlich sein für Untersuchungen von Strukturveränderungen in dendritischen Dornen, beispielsweise bei der Analyse von BAC-transgenen Mauslinien, bei denen GFP in spezifischen Populationen von Neuronen im Kortex exprimiert wird ( 36 ).
Obwohl dies noch nicht abschließend geklärt ist, geht man davon aus, dass D1- und D2-Rezeptoren anatomisch weitgehend auf die direkten (striatonigralen) bzw. indirekten (striatopallidalen) striatalen Projektionsneuronen beschränkt sind ( 17 , 41 ). Die erste Charakterisierung der GFP-Lokalisation in Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen bestätigte diese Annahme ( 36 ). Darüber hinaus stützt unsere Analyse der Anzahl GFP-positiver Neuronen im Nucleus accumbens (NAcc) von Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen die Schlussfolgerung, dass ca. 50 % der MSNs ausschließlich D1-Rezeptoren, ca. 35–40 % ausschließlich D2-Rezeptoren und ca. 10–15 % sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren exprimieren. Dieser Wert der Koexpression ähnelt dem in Studien des dorsalen Striatums ermittelten Wert, in denen Patch-Clamp-Analysen einzelner Striatumneuronen mit RT-PCR-Techniken zur Isolierung und Amplifikation von mRNAs kombiniert wurden (≈17 % Koexpression von Enkephalin und Substanz P) ( 42 ). Es sei angemerkt, dass unsere aktuellen Studien weder die Expression von D3-, D4- und D5-Rezeptoren noch die Frage der niedrigen Expression von D1-Rezeptoren in MSNs mit hoher D2-Rezeptorexpression oder umgekehrt untersuchen.
Mehrere frühere Studien untersuchten die neuronale Lokalisation der durch Psychostimulanzien induzierten Fos-Expression und die Rolle von D1- und D2-Rezeptoren ( 43–45 ). Diese Studien stützten die Schlussfolgerung, dass die Induktion von Fos und ΔFosB durch die Aktivierung von D1-Rezeptoren vermittelt wird. Die zelluläre Lokalisation der Fos-Expression wird jedoch durch den Kontext der Verabreichung von Psychostimulanzien beeinflusst ( 46 , 47 ). Beispielsweise induzieren Amphetamin oder Kokain, die im Heimkäfig verabreicht werden, frühe Gene (einschließlich Fos) bevorzugt in Substanz-P-positiven Zellen , die gleichzeitig D1-Rezeptoren exprimieren. Im Gegensatz dazu können diese Substanzen die Fos-Expression sowohl in D1- als auch in D2-Rezeptor-haltigen MSNs induzieren, wenn sie in einer neuen Umgebung verabreicht werden. Das in unseren aktuellen Studien verwendete Protokoll sah keine Kopplung der Medikamenteninjektion mit der Exposition gegenüber einer neuen Umgebung vor. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass eine Art kontextabhängiger Stress für die ΔFosB-Expression in D2-Rezeptor-haltigen MSNs verantwortlich ist.
Ein bemerkenswertes Merkmal der vorliegenden Ergebnisse war das parallele Muster erhöhter Spinedichte und ΔFosB-Expression. Eine erhöhte Spinedichte und ΔFosB-Expression traten zunächst in MSNs auf, die Drd1-EGFP und Drd2-EGFP exprimierten. Diese Veränderungen waren jedoch nur in D1-Rezeptor-haltigen Neuronen stabil. Eine mögliche Erklärung für die Beobachtung, dass eine erhöhte Spinedichte und ΔFosB-Expression vorübergehend in D2-Rezeptor-haltigen Neuronen auftraten, ist, dass dies in dem kleinen Anteil von MSNs geschah, die sowohl D1- als auch D2-Dopaminrezeptoren koexprimieren. Daher könnte die vorübergehende Natur dieser Erhöhungen mit antagonistischen Effekten der D2-Rezeptor-Aktivierung auf D1-abhängige Signalwege zusammenhängen ( 48 ). Interessanterweise waren die Veränderungen der Spinedichte und der ΔFosB-Expression reversibel, was die Fähigkeit D2-Rezeptor-abhängiger Signalwege widerspiegeln könnte, die Stabilität von ΔFosB zu beeinflussen.
Die Beobachtung paralleler Veränderungen in der Expression von ΔFosB und der Spinedichte stützt die Annahme, dass ΔFosB an der initialen Bildung und dem anschließenden Erhalt dendritischer Dornen in D1-Rezeptor-haltigen Neuronen des Nucleus accumbens (NAcc) beteiligt ist. Die Expression von ΔFosB wird in MSNs durch den D1/DARPP-32/PP1-abhängigen Signalweg reguliert ( 49 ). Mehrere Studien haben gezeigt, dass ΔFosB eine wichtige Rolle bei den belohnenden und lokomotorisch aktivierenden Wirkungen von Psychostimulanzien spielt ( 39 ), vermutlich durch Beeinflussung der Expression verschiedener Gene, darunter Neurotransmitterrezeptoren, Signalproteine und Proteine, die an der Regulation der neuronalen Morphologie beteiligt sind ( 50 ). Die spezifischen molekularen Mechanismen der chronischen Kokain-induzierten Dornenbildung sind jedoch derzeit unbekannt. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die intraakkumbale Infusion des Cdk5-Inhibitors Roscovitin den Kokain-induzierten Anstieg der Spinedichte abschwächte ( 51 ). Darüber hinaus ist Cdk5 ein nachgeschaltetes Zielgen von ΔFosB und wurde mit kompensatorischen Anpassungsmechanismen in Verbindung gebracht, die mit chronischer Kokainbehandlung einhergehen ( 52 ). Daher ist eine Veränderung der Cdk5-abhängigen Phosphorylierung ein plausibler Mechanismus, der der kokaininduzierten Dendritenbildung und/oder -stabilität zugrunde liegt. PAK ( 53 ), β-Catenin ( 54 ), PSD-95 ( 55 ) und Spinophilin ( 56 ) sind Substrate für Cdk5 und alle an der Regulation der Dendritenmorphogenese beteiligt ( 57–60 ). Die weitere Charakterisierung dieser und anderer Cdk5-Substrate in Dendriten wird hoffentlich Aufschluss über die Mechanismen geben , die an der Regulation der Dendritenbildung durch Psychostimulanzien beteiligt sind.
Methoden
Tiere.
Mäuse, die ein EGFP-Transgen unter der Kontrolle der D1- oder D2-Dopaminrezeptoren tragen, wurden im Rahmen des Gensat BAC-Transgenprojekts ( 36 ) erzeugt. Die in dieser Studie verwendeten transgenen Mäuse waren 4–5 Wochen alt und hatten einen Swiss-Webster-Hintergrund. Die Tiere wurden in einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und in Gruppen von 2–5 Tieren mit ad libitum verfügbarem Futter und Wasser untergebracht. Alle Tierversuchsprotokolle entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health (NIH) für die Haltung und Verwendung von Labortieren und wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Rockefeller University genehmigt.
Medikamentöse Behandlung.
Eine chronische Kokainbehandlung (30 mg/kg, täglich) führte zu einem deutlichen Anstieg der Dendritendichte von MSNs sowohl im Kern als auch in der Schale des Nucleus accumbens (NAcc) von Ratten. Eine niedrigere Dosis (15 mg/kg) erhöhte die Dendritendichte jedoch nur in der Schale ( 61 ). Daher verwendeten wir die höhere Kokaindosis, um strukturelle Veränderungen in beiden Teilen des NAcc zu induzieren. Mäuse erhielten fünf Tage lang täglich eine intraperitoneale Injektion (i.p.) von 30 mg/kg Kokain-HCl (oder Kochsalzlösung), gefolgt von zwei injektionsfreien Tagen. Dieses Verfahren wurde über vier Wochen wiederholt. Die Injektionen erfolgten im Heimkäfig. Zwei bzw. dreizehn Tage nach der Behandlung wurden die Mäusehirne für die DiI-Markierung und/oder Immunhistochemie präpariert.
Ballistische Markierung mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiI.
Mäuse wurden mit 80 mg/kg Natrium-Pentobarbital anästhesiert und transkardial mit 5 ml PBS perfundiert, gefolgt von einer schnellen Perfusion mit 40 ml 4%igem Paraformaldehyd in PBS (20 ml/min). Die Gehirne wurden rasch entnommen und 10 min in 4%igem Paraformaldehyd nachfixiert. Hirnschnitte (100 μm) wurden mittels ballistischer Applikation des Fluoreszenzfarbstoffs DiI (Molecular Probes) wie in Ref. 38 beschrieben markiert . Es wurde eine kombinierte DiI-Markierungs-Immunhistochemie-Methode mit einer niedrigen Detergenzkonzentration entwickelt. DiI-markierte Schnitte wurden 15 min mit 0.01% Triton X-100 in PBS permeabilisiert und anschließend 1 h in 0.01% Triton X-100 und 10% normalem Ziegenserum in PBS inkubiert, um unspezifische Markierungen zu minimieren. Die Gewebeschnitte wurden anschließend 2 h bei Raumtemperatur mit 1 % normalem Ziegenserum/0.01 % Triton X-100 und einem Anti-GFP-Antikörper (Abcam, Cambridge, MA) inkubiert, gewaschen und in einer 1:1,000-Verdünnung eines FITC-konjugierten Sekundärantikörpers (Molecular Probes) inkubiert. Die Schnitte wurden auf Objektträger aufgebracht und mit einem Eindeckmedium eingedeckt. Die ballistische Markierungsmethode ermöglichte eine detaillierte Analyse der dendritischen Dornenstruktur. Die Ergebnisse waren qualitativ und quantitativ vergleichbar mit früheren Studien, die die Golgi-Cox-Imprägnierungsmethode an Rattenhirnschnitten anwendeten ( 34 ). Im Gegensatz zu früheren Studien beobachteten wir jedoch selten zweiköpfige Dornen in DiI-gefärbten Neuronen. Dieser Unterschied könnte durch die Sensitivität der Färbemethoden oder die Variabilität von Maus- (diese Studie) im Vergleich zu Rattengewebe ( 34 ) bedingt sein.
Immunhistochemie.
Die Tiere wurden wie oben beschrieben anästhesiert und perfundiert. Die Gehirne wurden entnommen und über Nacht in 4%igem Paraformaldehyd bei 4 °C gelagert. Zur Kryoprotektion wurden die Gehirne in 30%ige Saccharoselösung in PBS überführt. Koronale Schnitte (12 μm) wurden mit einem Gefriermikrotom (Leica) angefertigt und anschließend für die Immunhistochemie weiterverarbeitet. Die Gehirnschnitte wurden 15 min in 0.3%igem Triton X-100 in PBS permeabilisiert und zweimal mit PBS gespült. Die Schnitte wurden 1 h bei 37 °C in 10%igem normalem Ziegenserum in PBS vorinkubiert, über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern (verdünnt in 1%igem normalem Ziegenserum in PBS) inkubiert und anschließend mit sekundären Antikörpern 1 h bei 37 °C inkubiert. Folgende Antikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-Pan-FosB (SC-48, 1:500; Santa Cruz Biotechnology), Maus-Anti-NeuN (Chemicon), Kaninchen-Anti-GFP, FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG und Rhodamin-konjugiertes Anti-Maus-IgG (Molecular Probes). Für die Dreifachmarkierung (ΔFosB, NeuN und GFP) wurden Hirnschnitte zunächst mit Anti-Pan-FosB-Antikörper und Anti-NeuN-Antikörper immungefärbt und anschließend mit Sekundärantikörpern (Rhodamin-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG und Cyan-konjugiertes Anti-Maus-IgG) inkubiert. Doppelt gefärbte Hirnschnitte wurden anschließend mittels Zenon-Markierungstechnologie (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes) für die GFP-Immunfärbung weiterverarbeitet. Der Anti-Pan-FosB-Antikörper wurde gegen den N-Terminus von FosB generiert und erkennt ΔFosB sowie das vollständige FosB-Protein ( 62 ). Basierend auf früheren Studien, die zeigten, dass ΔFosB, nicht aber FosB oder andere Fos-verwandte Antigene, nach chronischer Kokainbehandlung stabil exprimiert wird, gehen wir davon aus, dass die anhaltende Zunahme der Immunreaktivität eine stabile Expression von ΔFosB darstellt. Die Identität des in mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen beobachteten immunoreaktiven FosB-Signals ist jedoch unbekannt. Die statistische Analyse in Tabelle 1 erfolgte mittels Student's t- Test.
Dendritische Wirbelsäulenanalyse.
Einzelne MSNs im NAcc wurden anhand mehrerer Kriterien für die Dornenanalyse ausgewählt: ( i ) Es durfte keine oder nur eine minimale Überlappung mit anderen markierten Zellen geben, um Verwechslungen der Fortsätze verschiedener Zellen auszuschließen. ( ii ) Zellen mussten mindestens drei primäre Dendriten aufweisen, um für die Analyse verwendet zu werden. ( iii ) Distale Dendriten (terminale Dendriten oder solche in der Nähe terminaler Dendriten) wurden untersucht. Analysiert wurden Dendriten sowohl von MSNs im Kern als auch in der Schale des NAcc. Obwohl wir auch spärlich bedornte MSNs (Dornentyp II) beobachteten, analysierten wir ausschließlich dicht bedornte MSNs (Dornentyp I). Zur Berechnung der Dornendichte wurde ein Dendritenabschnitt (>20 μm lang) mithilfe eines Konfokalmikroskops (Zeiss LSM 510) mit Ölimmersionsobjektiv (40-fache Vergrößerung) verfolgt. Alle Dendritenbilder wurden in verschiedenen Tiefenintervallen (0.5–1 μm) aufgenommen, um die Morphologie der dendritischen Dornen zu untersuchen. Alle Messungen erfolgten mit der Bildanalysesoftware Metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA). Die statistische Analyse wurde mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test durchgeführt.
Dendritenfortsätze wurden anhand ihrer Länge in vier Typen eingeteilt (siehe Referenzen 63 und 64) . Fortsätze der Klasse 1, auch als kurze Ausstülpungen bezeichnet, waren <0.5 μm lang, besaßen keinen großen Dornenkopf und schienen keinen Hals zu haben; Fortsätze der Klasse 2, die pilzförmigen Dornen, waren zwischen 0.5 und 1.25 μm lang und zeichneten sich durch einen kurzen Hals und einen großen Dornenkopf aus; Fortsätze der Klasse 3, die dünnen Dornen, waren zwischen 1.25 und 3.0 μm lang und hatten verlängerte Dornenhälse mit kleinen Köpfen; Fortsätze der Klasse 4, die Filopodien, waren lange, fadenförmige Ausstülpungen ohne erkennbaren Dornenkopf.
Anerkennungen
Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen Public Health Service Grant DA10044 (an PG und ACN) sowie von der Simons Foundation, der Peter J. Sharp Foundation, der Picower Foundation und der FM Kirby Foundation unterstützt.
Abkürzungen
- NAcc
- Nucleus accumbens
- MSN
- mittelgroßes stacheliges Neuron
- BAC
- bakterielles künstliches Chromosom
- Drd1
- Dopaminrezeptor D1-Promotor-getrieben
- Drd2
- Dopaminrezeptor D2-Promotor-getrieben
- DiI
- 1,1'-Diotadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat
- 2WD
- 2 Tage nach der letzten medikamentösen Behandlung
- 30WD
- 30 Tage nach der letzten medikamentösen Behandlung.
Referenzen