Abstract
Eine durch Psychostimulanzien induzierte Veränderung von dendritischen Stacheln auf dopaminozeptiven Neuronen im Nucleus accumbens (NAcc) wurde als eine adaptive neuronale Reaktion angenommen, die mit lang anhaltendem Suchtverhalten in Verbindung steht. NAcc besteht hauptsächlich aus zwei verschiedenen Subpopulationen von mittelgroßen stacheligen Neuronen, die hohe Spiegel von entweder Dopamin D1 oder D2 Rezeptoren exprimieren. In der vorliegenden Studie analysierten wir die dendritische Wirbelsäulendichte nach chronischer Kokainbehandlung in verschiedenen D1- oder D2-Rezeptor-haltigen mittelgroßen stacheligen Neuronen in NAcc. Diese Studien verwendeten transgene Mäuse, die EGFP unter der Kontrolle des D1- oder D2-Rezeptor-Promotors (Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP) exprimierten. Nach 28-Tagen mit Kokainbehandlung und 2-Tagen mit Entzug war die Wirbelsäulendichte sowohl in Drd1-EGFP- als auch in Drd2-EGFP-positiven Neuronen erhöht. Jedoch wurde der Anstieg der Wirbelsäule Dichte nur in Drd1-EGFP-positiven Neuronen 30 Tage nach Drogenentzug erhalten. Bemerkenswerterweise wurde eine erhöhte ΔFosB-Expression auch in Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-positiven Neuronen nach 2-Tagen nach Arzneimittelentzug beobachtet, jedoch nur in Drd1-EGFP-positiven Neuronen nach 30-Tagen nach Arzneimittelentzug. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die nach chronischer Kokainbehandlung beobachtete erhöhte Wirbelsäulendichte nur in D1-Rezeptor-enthaltenden Neuronen stabil ist und dass die ΔFosB-Expression mit der Bildung und / oder dem Erhalt von dendritischen Dornen in D1- sowie D2-Rezeptor-enthaltenden Neuronen assoziiert ist in NAcc.
Der mesolimbische dopaminerge Weg besteht aus Neuronen im ventralen Tegmentum, die den Nucleus accumbens (NAcc), den Tuberculum olfactorius, den präfrontalen Kortex und die Amygdala innervieren (1), während nigrostriatale dopaminerge Neurone in der Substantia nigra (pars compacta) eine aufsteigende Projektion auf das dorsale Striatum bieten (2). Psychostimulanzien erhöhen synaptische Konzentrationen von Dopamin in NAcc: Kokain, indem sie die Dopaminaufnahme aus dem synaptischen Spalt blockieren, und Amphetamin, indem sie die Dopaminfreisetzung aus den Nervenendigungen fördern (3-5). Wiederholte, intermittierende Verabreichung von Psychostimulanzien führt zu verstärkten Verhaltensreaktionen (Sensibilisierung) auf die akute stimulierende Wirkung dieser Medikamente (6-8). Die meisten Beweise deuten darauf hin, dass adaptive Veränderungen im ventralen Tegmentum-Bereich - das dopaminerge System von NACC - zentral für Veränderungen in der erfahrungsabhängigen Plastizität sind, die dem medikamenteninduzierten Verhalten zugrunde liegen.
Zusätzlich zu Dopamin wird Glutamat für die Entwicklung einer Sensibilisierung als Reaktion auf Psychostimulanzien benötigt (9, 10). Mittlere stachelige Neuronen (MSNs) im ventralen Striatum erhalten exzitatorische glutamaterge Projektionen vom präfrontalen Kortex, die auf die Köpfe der dendritischen Stacheln synapsen. MSNs sind auch das Hauptangriffsziel für dopaminerge Axone, die an den Hals der Wirbelsäule synapsen (1, 11, 12). Daher stellen dendritische Stacheln in MSNs das zelluläre Kompartiment dar, in dem dopaminerge und glutamaterge Transmission anfangs integriert sind.
Dopamin wirkt auf zwei Hauptrezeptor-Unterfamilien, die D1-Unterfamilie (D1 und D5-Subtypen) und die D2-Unterfamilie (D2, D3 und D4-Subtypen) (13). Im dorsalen Striatum haben anatomische Studien gezeigt, dass striatonigrale MSN hohe Konzentrationen an D1-Rezeptoren (zusammen mit Substanz P und Dynorphin) enthalten, während striatopallidale MSN überwiegend D2-Rezeptoren exprimieren (zusammen mit Enkephalin) (14-17). Die Projektionen von NAcc sind komplexer als im dorsalen Striatum, wobei die Schalen- und Kernteile der NAcc zu bestimmten Unterregionen des ventralen Pallidums und zum ventralen Tegmentum und Substantia nigra projizieren (18). Während D2-Rezeptoren und Enkephalin in Projektionen zum ventralen Pallidum stark exprimiert werden, sind die D1-Rezeptoren und die Substanz P gleichmäßig in den Projektionen zum ventralen Pallidum und zum ventralen Tegmentum verteilt (19). Studien von Agonisten und Antagonisten, die für D1- oder D2-Rezeptoren selektiv sind, zeigten, dass sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren für psychostimulanzabhängige Verhaltensänderungen erforderlich sind (20-25). Die Rollen dieser Rezeptoren scheinen jedoch unterschiedlich zu sein. Beispielsweise dämpft die Stimulation von D1-Rezeptoren Kokainsucht, die durch Kokain-Priming-Injektionen und Kokain-bezogene Umweltsignale induziert wird, während die Stimulation von D2-Rezeptoren Kokain-induzierte Wiederherstellung erleichtert (26-28).
Die mit der psychostimulierenden Sucht verbundenen Verhaltensauffälligkeiten sind extrem langlebig. Daher bestand ein großes Interesse daran, lang anhaltende medikamenteninduzierte Veränderungen auf molekularer und struktureller Ebene in neuronalen Schaltkreisen, die durch Dopamin und Glutamat reguliert werden, zu identifizieren (29-32). Bemerkenswerterweise hat eine Langzeit-Exposition gegenüber Kokain oder Amphetamin die Zahl der dendritischen Verzweigungspunkte und Stacheln von MSN in NAcc erhöht (33-35). Diese strukturellen Veränderungen sind bis zu ≈1-3.5 Monate nach der letzten Medikamentenexposition (30, 35), und es wurde vorgeschlagen, dass sie langanhaltenden Veränderungen der synaptischen Plastizität, die mit der Exposition von Psychostimulanzien assoziiert sind, zugrunde liegen.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, Kokain-induzierte strukturelle Veränderungen von dendritischen Stacheln in Subpopulationen von akkumbalischen MSNs zu untersuchen, die entweder D1- oder D2-Rezeptoren exprimieren. In diesen Studien verwendeten wir transgene Mäuse mit bakteriellen artifiziellen Chromosomen (BAC), die EGFP unter der Kontrolle des D1 (Drd1-EGFP) oder D2 (Drd2-EGFP) Dopaminrezeptorpromotors (36). Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl anfänglich eine erhöhte Wirbelsäulendichte bei D1-Rezeptor-enthaltenden MSNs und D2-Rezeptor-enthaltenden MSNs auftritt, die veränderte Wirbelsäulendichte nur in D1-Rezeptor-enthaltenden Neuronen stabil ist. Darüber hinaus finden wir ähnliche Veränderungen in der Expression des Transkriptionsfaktors & Dgr; FosB, was darauf hindeutet, dass & Dgr; FosB an der Bildung und / oder Aufrechterhaltung von dendritischen Dornen in D1 sowie D2-Rezeptor-enthaltenden Neuronen in NAcc beteiligt sein kann.
Ergebnisse
Analyse von MSNs in Drd1-EGFP und Drd2-EGFP BAC transgenen Mäusen.
Das Projektionsmuster von MSNs aus dorsalem und ventralem Striatum in Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-BAC-transgenen Mäusen wurde durch Analyse der GFP-Expression charakterisiert (36). Die differentielle Expression von GFP in MSNs des dorsalen Striatums entspricht im Allgemeinen derjenigen von endogenen D1- bzw. D2-Rezeptoren (36). Wir analysierten die differentielle Expression von GFP in NAcc in Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP Mäusen (Abb. 1a mit einem b). Obwohl ≈58% der Neuronen in NAcc GFP in Drd1-EGFP-Mäusen exprimierten (Abb. 1a), ≈48% der Neuronen in NAcc exprimierten GFP in Drd-2-EGFP Mäusen (Abb. 1b). MSNs repräsentieren 90-95% aller Neuronen in NAcc (12, 37). D1-Rezeptoren werden nur in MSNs exprimiert, und D2-Rezeptoren werden in MSNs und in cholinergen Interneuronen exprimiert, die 1-3% der striatalen Neuronen darstellen (37). Unter Berücksichtigung dieser Faktoren legen die Ergebnisse nahe, dass mindestens 10-15% der MSNs in NAcc wahrscheinlich sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren exprimieren.
Analyse von dendritischen Stacheln in Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen.
Die GFP-Expression in den Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen war nützlich, um neuronale Zellkörper zu färben. Jedoch war das GFP-Signal in Dendriten und dendritischen Dornen zu schwach, um ihre Analyse nach Immunfärbung mit Anti-GFP-Antikörpern zu ermöglichen. Teilchen-vermittelte ballistische Abgabe von Fluoreszenzfarbstoffen wurde kürzlich verwendet, um neuronale Populationen auf schnelle und effiziente Weise zu markieren (38). Ganze Neuronen können mit dieser Technik markiert werden, und die Methode scheint mit der Golgi-Cox-Färbung vergleichbar zu sein. Um die dendritische Morphologie von Neuronen in NAcc zu analysieren, wurden fixierte akkumulierte Scheiben mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff 1,1'-Diotadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat (Dil) unter Verwendung einer Genpistole markiert. Ein Beispiel für eine DiI-gefärbte MSN ist in gezeigt Abb. 1c. Unter den verwendeten Bedingungen beobachteten wir im Allgemeinen markierte Neuronen ohne überlappende Dendriten von anderen markierten Neuronen. Bei höherer Vergrößerung konnte eine detaillierte dendritische Morphologie einschließlich dendritischer Dornen beobachtet werden (Abb. 1d).
Wir verwendeten dann eine Kombination von DiI-Markierung und Immunhistochemie für GFP in Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-transgenen Mäusen, was durch Verwendung einer geringen Konzentration von Detergens für die Gewebepermeabilisierung möglich gemacht wurde (vgl Methoden). Durch sorgfältigen Vergleich der DiI-Färbung und der GFP-Expression in den Zellkörpern von MSN konnten wir DiI- und GFP-positive oder DiI-positive und GFP-negative Neuronen in Drd1-EGFP identifizieren (Abb. 2a) oder Drd2-EGFP (Abb. 2b) Mäuse. Für die folgenden Studien haben wir die dendritische Morphologie nur in DiI- und GFP-positiven Neuronen von Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen untersucht.
Die Behandlung mit chronischem Kokain führt zu einer erhöhten Wirbelsäulendichte in Accumbal MSNs, die entweder Drd1-EGFP oder Drd2-EGFP exprimieren.
Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäuse wurden wiederholt für vier aufeinanderfolgende Wochen mit Kokain (30 mg / kg) oder Kochsalzlösung injiziert (vgl Methoden). Zwei Tage (2WD) oder 30 Tage (30WD) nach der letzten Arzneimittelbehandlung wurden die Gehirne wie oben beschrieben für DiI-Markierung und Immunhistochemie aufbereitet. Eine frühere Studie berichtete, dass eine chronische Behandlung mit Amphetamin die Rückenmarksdichte bei distalen, aber nicht proximalen Dendriten von MSN in NAcc erhöhte (35). Wir haben daher unsere Analyse auf distale Dendriten (dh diejenigen mit Verzweigungen zweiter oder dritter Ordnung), einschließlich terminaler Regionen, beschränkt. Bei der Analyse von 2WD zeigte sich, dass die Spondichte bei Drd1-EGFP-positiven MSNs (128% der Kochsalzgruppe) anstieg (Abb. 3a mit einem c) und in geringerem Maße in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (115% der Kochsalzgruppe) (Abb. 3 b mit einem d). Nach 30WD wurde eine erhöhte Wirbelsäulendichte in Drd1-EGFP-positiven Neuronen aufrechterhalten (118% der Kochsalzlösungskontrolle) (Abb. 3 a mit einem c), aber nicht in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (Abb. 3 b mit einem d).
Die Morphologie von dendritischen Stacheln ist variabel in Bezug auf ihre Länge und die Breite des Wirbelsäulenkopfes. Wir klassifizierten daher dendritische Fortsätze in vier Spinenklassen (Stubby, Mushroom, Thin und Filopodia) bei 2WD aus Kokain (Daten nicht gezeigt). Die Dichte von Pilzen (119.7 ± 4.0%, P <0.01) und dünne Stacheln (120.0 ± 3.4%, P <0.01) wurde durch Kokainbehandlung in Drd1-EGFP-positiven MSNs erhöht, während die Dichte von Stubby (182.4 ± 21.6%, P <0.05) und Pilzstacheln (122.5 ± 5.0%, P <0.01) war in Drd2-EGFP-positiven MSNs erhöht. Es gab keinen signifikanten Anstieg der stumpfen Stacheln in Drd1-EGFP-positiven Neuronen oder der dünnen Stacheln in Drd2-EGFP-positiven Neuronen.
Chronisches Kokain induziert eine ΔFosB-Expression in Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-positiven MSNs in NAcc.
ΔFosB ist ein Mitglied der Fos-Familie der Transkriptionsfaktoren. Während die akute Verabreichung von Kokain eine rasche und vorübergehende Induktion mehrerer Fos-Isoformen in NAcc induziert, erhöht die wiederholte Exposition gegenüber Kokain den Spiegel von ΔFosB. Darüber hinaus bleibt der Anstieg der ΔFosB-Expression in NAcc für Wochen bis Monate nach dem Absetzen der Arzneimittelexposition bestehen und wurde vorgeschlagen, an der langanhaltenden Regulation der Genexpression beteiligt zu sein, selbst nachdem die Arzneimittelaufnahme aufgehört hat (29, 39, 40).
Um die Induktion von ΔFosB in NAcc von Drd1-EGFP- oder Drd2-EGFP-Mäusen nach Kokainbehandlung zu untersuchen, analysierten wir die FosB- und GFP-Expression durch doppelte Markierung (Abb. 4 mit einem Tabelle 1) Der Anti-FosB-Antikörper erkennt alle Formen von FosB, aber wir nehmen an, dass der erhöhte Immunostain für ΔFosB steht (vgl Methoden zur weiteren Diskussion). In mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen exprimierten 16% von Drd1-EGFP-positiven Neuronen und 15% von Drd2-EGFP-positiven Neuronen FosB-Immunreaktivität mit relativ geringer Intensität (Abb. 4 a mit einem b mit einem Tabelle 1). Wiederholte Kokainbehandlung gefolgt von 2WD führte zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl von Drd1-EGFP-positiven Neuronen, die ΔFosB koexprimierten (55% der GFP-positiven Neuronen) (Abb. 4c mit einem Tabelle 1). Ein kleinerer, aber immer noch signifikanter Anstieg der ΔFosB-Expression wurde in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (25% der GFP-positiven Neuronen) gefunden (Abb. 4d mit einem Tabelle 1). Wie bei den Veränderungen der Dorndichte wurde die erhöhte Expression von ΔFosB in Drd1-EGFP-positiven Neuronen (46% der GFP-positiven Neuronen), aber nicht in Drd2-EGFP-positiven Neuronen (15% der GFP-positiven Neuronen) nach erhalten 30WD (Abb. 4 e mit einem f mit einem Tabelle 1). Beachten Sie, dass die erhöhte ΔFosB Expression beobachtet in Abb. 4f ist in Drd2-EGFP-negativen Neuronen vorhanden.
Diskussion
Es wird angenommen, dass lang anhaltende Anpassungen bei der dopaminergen Neurotransmission suchterzeugenden Verhaltensweisen im Zusammenhang mit Psychostimulanzien zugrunde liegen. Insbesondere wurde angenommen, dass durch Psychostimulanzien verursachte Erhöhungen der dendritischen Wirbelsäulendichte von MSNs in NAcc mit der Reorganisation der synaptischen Konnektivität verbunden sind (30). Die NAcc besteht im Wesentlichen aus zwei unterschiedlichen Subpopulationen von MSNs, die hohe Spiegel von entweder D1- oder D2-Dopaminrezeptoren exprimieren. In der vorliegenden Studie haben wir die Wirbelsäule Dichte in verschiedenen D1 oder D2-Rezeptor-haltigen MSN in NAcc nach chronischer Kokain-Behandlung analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass, obwohl anfänglich eine erhöhte Wirbelsäulendichte in D1-Rezeptor-enthaltenden MSNs und D2-Rezeptor-enthaltenden MSNs auftritt, eine veränderte Wirbelsäulendichte nur in D1-Rezeptor-enthaltenden Neuronen stabil ist. Darüber hinaus finden wir ein ähnliches Muster von Veränderungen in der Expression des Transkriptionsfaktors ΔFosB in D1- und D2-Rezeptor-enthaltenden MSNs.
Diese Studien verwendeten BAC-transgene Mäuse, die GFP in spezifischen Subpopulationen von MSN unter der Kontrolle entweder des D1- oder D2-Rezeptor-Promotors exprimieren. Darüber hinaus entwickelten wir eine Doppelmarkierungsmethode, die Immunhistochemie für GFP mit ballistischer Markierung von Neuronen unter Verwendung von Dil kombiniert. Frühere Studien haben die Golgi-Cox-Methode verwendet, um die Wirkung von Psychostimulanzien auf die Wirbelsäulendichte zu analysieren (34), und die hier verwendete DiI - Methode lieferte Ergebnisse, die quantitativ vergleichbar waren. Wir haben die Doppelmarkierungsmethode entwickelt, weil die Golgi-Färbung nicht immunhistochemisch kompatibel ist. Die Immunfärbung erfordert normalerweise eine Gewebepermeabilisierung mit Detergenzien, ein Prozess, der typischerweise zur Solubilisierung von lipophilen Farbstoffen aus der Membran führt (38). In unseren aktuellen Studien erforderte die GFP-Immunfärbung jedoch keine hohe Detergenskonzentration für die Gewebepermeabilisierung und konnte daher in Verbindung mit einer lipophilen Farbstoffmarkierung verwendet werden. Unsere Doppelmarkierungsmethode sollte allgemein für Studien von Strukturveränderungen in dendritischen Stacheln nützlich sein, beispielsweise wenn sie zur Analyse von BAC-transgenen Mäuselinien verwendet werden, wo GFP in spezifischen Populationen von Neuronen im Kortex exprimiert wird (36).
Obwohl noch etwas kontrovers diskutiert, wird angenommen, dass D1- und D2-Rezeptoren weitgehend anatomisch zu den direkten (striatonigral) bzw. indirekten (striatopallidalen) striatalen Projektionsneuronen getrennt sind (17, 41). Die anfängliche Charakterisierung der Lokalisierung von GFP in den Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen stimmte mit dieser Schlussfolgerung überein (36). Darüber hinaus ist unsere Analyse der Anzahl von GFP-positiven Neuronen in NAcc von Drd1-EGFP- und Drd2-EGFP-Mäusen konsistent mit der Schlussfolgerung, dass & Dgr; 50% von MSNs nur D1-Rezeptoren exprimieren, dass & Dgr; 35-40% nur D2-Rezeptoren exprimieren. und dass 10-15% sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren coexprimiert. Dieser Wert der Koexpression ist ähnlich dem, der durch Studien des dorsalen Striatums impliziert wurde, die eine Patch-Clamp-Analyse einzelner striataler Neuronen mit RT-PCR-Techniken zur Isolierung und Amplifikation von mRNAs kombinierten (≈17% Coexpression von Enkephalin und Substanz P) (42). Es sollte angemerkt werden, dass unsere aktuellen Studien nicht die Frage der Expression von D3-, D4- und D5-Rezeptoren behandeln, noch das Problem der niedrigen Expressionsniveaus von D1-Rezeptoren in MSNs, die hohe Mengen an D2-Rezeptoren exprimieren oder umgekehrt.
Mehrere frühere Studien haben die neuronale Lokalisierung der durch Psychostimulanzien induzierten Fos-Expression und die Rolle von D1- und D2-Rezeptoren untersucht (43-45). Diese Studien unterstützten die Schlussfolgerung, dass die Induktion von Fos und ΔFosB durch die Aktivierung von D1-Rezeptoren vermittelt wird. Die zelluläre Lokalisation der Fos-Expression wird jedoch durch den Umweltkontext beeinflusst, in dem Psychostimulanzien verabreicht werden (46, 47). Zum Beispiel induziert Amphetamin oder Kokain, das in dem Heimkäfig gegeben wird, unmittelbar frühe Gene (einschließlich Fos) vorzugsweise in Substanz P-positiven Zellen, die D1-Rezeptoren koexprimieren. Im Gegensatz dazu können diese Arzneimittel die Fos-Expression sowohl in D1- als auch D2-Rezeptor-enthaltenden MSNs induzieren, wenn sie in einer neuen Umgebung verabreicht werden. Das Protokoll, das in unseren aktuellen Studien verwendet wurde, beinhaltete keine Paarung von Arzneimittelinjektionen unter Exposition gegenüber einer neuartigen Umgebung. Wir können jedoch nicht eine Art kontextabhängigen Stress ausschließen, der für die ΔFosB-Expression in D2-Rezeptor-enthaltenden MSNs verantwortlich ist.
Ein bemerkenswertes Merkmal der vorliegenden Ergebnisse war das parallele Muster von erhöhter Dorndichte und ΔFosB-Expression. Bei MSN, die Drd1-EGFP und Drd2-EGFP exprimierten, traten anfänglich erhöhte Rückenmarksdichten und ΔFosB-Expression auf. Diese Veränderungen waren jedoch nur in D1-Rezeptor-enthaltenden Neuronen stabil. Eine mögliche Erklärung für die Beobachtung, dass eine erhöhte Wirbelsäulendichte und ΔFosB-Expression in D2-Rezeptor-enthaltenden Neuronen vorübergehend gefunden wurde, ist, dass dies in dem kleinen Bruchteil von MSNs auftrat, die sowohl D1- als auch D2-Dopaminrezeptoren koexprimieren. Daher könnte die vorübergehende Natur dieser Zunahmen mit antagonistischen Effekten der D2-Rezeptoraktivierung auf D1-abhängige Signalwege (48). Es ist von Interesse, dass die Veränderungen in der Dichte der Spine und der ΔFosB-Expression reversibel waren, was die Fähigkeit von D2-Rezeptor-abhängigen Signalwegen widerspiegeln könnte, die Stabilität von ΔFosB zu beeinflussen.
Die Beobachtung, dass es parallele Änderungen in der Expression von ΔFosB und der Rückenmarksdichte gibt, steht im Einklang mit der Idee, dass ΔFosB an der anfänglichen Bildung und der anschließenden Aufrechterhaltung von dendritischen Stacheln in D1-Rezeptor-enthaltenden Neuronen in NAcc beteiligt ist. Die Expression von ΔFosB wird durch den D1 / DARPP-32 / PP1-abhängigen Signalweg in MSNs gesteuert (49). Mehrere Studien haben gezeigt, dass ΔFosB eine wichtige Rolle bei der Belohnungs- und lokomotorisch aktivierenden Wirkung von Psychostimulanzien spielt (39), wahrscheinlich durch Beeinflussung der Expression mehrerer Gene, die Neurotransmitterrezeptoren, Signalproteine und Proteine umfassen, die an der Regulation der neuronalen Morphologie beteiligt sind (50). Die spezifischen molekularen Mechanismen, die bei der chronischen Kokain-induzierten Bildung der Wirbelsäule eine Rolle spielen, sind derzeit nicht bekannt. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die intraaccumbale Infusion des Cdk5-Inhibitors Roscovitin die kokaininduzierte Zunahme der51). Darüber hinaus ist Cdk5 ein Downstream-Zielgen für ΔFosB und wurde mit kompensatorischen adaptiven Veränderungen im Zusammenhang mit chronischer Kokainbehandlung in Verbindung gebracht (52). Daher ist die Veränderung der Cdk5-abhängigen Phosphorylierung ein plausibler Mechanismus, der der Kokain-induzierten Bildung der Wirbelsäule und / oder der Stabilität der Wirbelsäule zugrunde liegt. PAK (53), β-Catenin (54), PSD-95 (55) und Spinophilin (56) sind Substrate für Cdk5 und alle an der Regulation der Morphogenese der57-60). Eine weitere Charakterisierung dieser und anderer Cdk5-Substrate in Stacheln wird hoffentlich die Mechanismen erklären, die bei der Regulierung der Wirbelsäulenbildung durch Psychostimulanzien eine Rolle spielen.
Methoden
Tiere.
Mäuse, die ein EGFP-Transgen unter der Kontrolle der D1- oder D2-Dopaminrezeptoren tragen, wurden durch das Gensat-BAC-Transgenprojekt (36). Die transgenen Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, waren 4-5 Wochen alt und befanden sich auf einem Swiss-Webster-Hintergrund. Die Mäuse wurden in einem 12: 12-h-Hell / Dunkel-Zyklus gehalten und in Gruppen von 2-5 mit Nahrung und Wasser, die ad libitum verfügbar waren, untergebracht. Alle Tierprotokolle entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health zur Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Rockefeller University genehmigt.
Medikamentöse Behandlung.
Es wurde berichtet, dass eine chronische Kokainbehandlung (30 mg / kg, täglich) eine robuste Zunahme der Wirbelsäulendichte von MSN sowohl im Kern als auch in der Schale von NAcc aus der Ratte hervorbrachte, aber eine geringere Dosis (15 mg / kg) erhöhte die Dorndichte nur in die Muschel (61). Wir verwendeten daher die höhere Kokaindosis, um eine strukturelle Modifikation in beiden Teilen von NAcc zu induzieren. Mäuse erhielten eine Injektion (ip) von 30 mg / kg Kokain-HCl (oder Kochsalzlösung) jeden Tag für 5 aufeinanderfolgende Tage, gefolgt von 2-Injektionsfreien Tagen, und dieses Verfahren wurde für 4 aufeinanderfolgende Wochen wiederholt. Injektionen wurden im Heimkäfig durchgeführt. 2WD oder 30WD, Mausgehirne wurden für DiI-Markierung und / oder Immunhistochemie verarbeitet.
Ballistische Markierung mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiI.
Die Mäuse wurden mit 80 mg / kg Natriumpentobarbital anästhesiert und transcardial mit 5 ml PBS perfundiert, gefolgt von einer schnellen Perfusion mit 40 ml 4% Paraformaldehyd in PBS (20 ml / min). Die Gehirne wurden schnell aus dem Schädel entfernt und in 4% Paraformaldehyd für 10 min postfixiert. Hirnschnitte (100 & mgr; m) wurden durch ballistische Abgabe von Fluoreszenzfarbstoff DiI (Molecular Probes) markiert, wie in Ref.-Nr. 38. Eine kombinierte DiI-Markierungs-Immunhistochemie-Methode wurde mit einer geringen Konzentration an Detergens entwickelt. DiI-markierte Abschnitte wurden mit 0.01% Triton X-100 in PBS für 15 min permeabilisiert und dann in 0.01% Triton X-100 und 10% normalem Ziegenserum in PBS für 1 h inkubiert, um unspezifische Markierung zu minimieren. Die Gewebeschnitte wurden dann mit 1% normalem Ziegenserum / 0.01% Triton X-100 und Anti-GFP-Antikörper (Abcam, Cambridge, MA) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und in einer 1: 1,000-Verdünnung von FITC inkubiert. konjugierter sekundärer Antikörper (Molecular Probes). Die Schnitte wurden auf Objektträger gelegt und mit Eindeckmedium abgedeckt. Die ballistische Markierungsmethode erlaubte eine detaillierte Analyse der dendritischen Wirbelsäulenstruktur, und die erhaltenen Ergebnisse waren qualitativ und quantitativ vergleichbar mit früheren Untersuchungen mit der Golgi-Cox-Imprägnierungsmethode in Rattenhirnschnitten (34). Im Gegensatz zu früheren Studien beobachteten wir jedoch selten zweiköpfige Stacheln in Dil-gefärbten Neuronen. Dieser Unterschied kann durch die Empfindlichkeit von Färbemethoden oder Variabilität von Maus (diese Studie) gegenüber Rattengewebe (34).
Immunhistochemie.
Die Tiere wurden wie oben beschrieben anästhesiert und perfundiert. Die Gehirne wurden entfernt und über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4ºC gelagert. Die Gehirne wurden zur Kryoprotektion in PBS-Lösung in 30% Sucrose überführt. Koronale Schnitte (12 & mgr; m) wurden auf einem Gefriermikrotom (Leica) geschnitten und dann zur Immunhistochemie verarbeitet. Hirnschnitte wurden dann in 0.3% Triton X-100 in PBS für 15 min permeabilisiert und zweimal in PBS gespült. Die Schnitte wurden in 10% normalem Ziegenserum in PBS für 1h bei 37 ° C vorinkubiert, über Nacht bei 1 ° C primären Antikörpern (verdünnt in 4% normalem Ziegenserum in PBS) ausgesetzt und dann in PBS gespült und mit Sekundär inkubiert Antikörper für 1 h bei 37 ° C. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-Pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), Maus-Anti-NeuN (Chemicon), Kaninchen-Anti-GFP, FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG und Rhodamin- konjugiertes Anti-Maus-IgG (Molecular Probes). Zur dreifachen Markierung (ΔFosB, NeuN und GFP) wurden Hirnschnitte zuerst mit Anti-Pan-FosB-Antikörper und Anti-NeuN-Antikörper immungefärbt und dann mit sekundären Antikörpern (Rhodamin-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG und Cyan-konjugiertem Anti-Maus-IgG) inkubiert ). Doppelgefärbte Hirnschnitte wurden für die GFP-Immunfärbung unter Verwendung der Zenon-Markierungstechnologie (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes) weiterverarbeitet. Der Anti-Pan-FosB-Antikörper wurde an den N-Terminus von FosB angehoben und erkennt ΔFosB und FosB voller Länge (62). Basierend auf früheren Studien, die zeigten, dass & Dgr; FosB, aber nicht FosB oder andere Fos-verwandte Antigene nach chronischer Kokainbehandlung stabil exprimiert werden, nehmen wir an, dass die lang anhaltende Zunahme der Immunoreaktivität eine stabile Expression von & Dgr; FosB repräsentiert. Die Identität des immunreaktiven FosB-Signals, das in mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen beobachtet wurde, ist jedoch unbekannt. Statistische Analyse in Tabelle 1 benutzte die des Studenten t Test.
Dendritische Wirbelsäulenanalyse.
Einzelne MSNs im NAcc wurden für die Wirbelsäulenanalyse basierend auf mehreren Kriterien ausgewählt. (i) Es gab minimale oder keine Überlappung mit anderen markierten Zellen, um sicherzustellen, dass Prozesse von verschiedenen Zellen nicht miteinander verwechselt werden. (ii) Mindestens drei primäre Dendriten müssen sichtbar sein, damit die Zellen für die Analyse verwendet werden können. (iii) Distale Dendriten (terminale Dendriten oder nahe am terminalen Dendriten) wurden untersucht. Dendriten von beiden MSNs im Kern und in der Hülle des NAcc wurden analysiert. Obwohl wir dünn gesponnene MSNs (stacheliger Typ II) beobachteten, analysierten wir nur dicht gesponnene MSNs (stacheliger Typ I). Zur Berechnung der Wirbelsäulendichte wurde eine Dendritenlänge (> 20 μm lang) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Zeiss LSM 510) mit einer Ölimmersionslinse (× 40) verfolgt. Alle Bilder von Dendriten wurden unterschiedlich aufgenommen z Niveaus (0.5-1 & mgr; m Tiefenintervalle), um die Morphologie von dendritischen Stacheln zu untersuchen. Alle Messungen wurden mit Metamorph-Bildanalysesoftware (Universal Imaging, Downingtown, PA) durchgeführt. Die statistische Analyse verwendete den Kolmogorov-Smirnov-Test.
Vorsprünge von Dendriten wurden basierend auf ihrer Länge in vier Typen klassifiziert, wie in Ref. Beschrieben. 63 mit einem 64. Vorsprünge der Klasse 1, auch stumpfe Ausstülpungen genannt, waren <0.5 μm lang, hatten keinen großen Wirbelsäulenkopf und schienen keinen Hals zu haben; Klasse 2 oder pilzförmige Stacheln waren zwischen 0.5 und 1.25 μm lang und zeichneten sich durch einen kurzen Hals und einen großen Wirbelsäulenkopf aus; Klasse 3 oder dünne Stacheln lagen zwischen 1.25 und 3.0 μm und hatten verlängerte Stachelhälse mit kleinen Köpfen; Klasse 4 oder filopodiale Extensionen waren lange filamentöse Vorsprünge, denen ein erkennbarer Wirbelsäulenkopf fehlte.
Anerkennungen
Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen Public Health Service Grant DA10044 (an PG und ACN) sowie von der Simons Foundation, der Peter J. Sharp Foundation, der Picower Foundation und der FM Kirby Foundation unterstützt.
Abkürzungen
- NAcc
- Nucleus accumbens
- MSN
- mittelgroßes stacheliges Neuron
- BAC
- bakterielles künstliches Chromosom
- Drd1
- Dopaminrezeptor D1-Promotor-getrieben
- Drd2
- Dopaminrezeptor D2-Promotor-getrieben
- DiI
- 1,1'-Diotadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat
- 2WD
- 2 Tage nach der letzten medikamentösen Behandlung
- 30WD
- 30 Tage nach der letzten medikamentösen Behandlung.
Referenzen