Das Journal der Neurowissenschaft, 6 September 2006, 26 (36): 9196-9204; doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1124-06.2006
Peter Olausson1, J. David Jentsch2, Natalie Tronson1, Rachel L. Neve3, Eric J. Nestler4 und Jane R. Taylor1
1.Korrespondenz sollte an Jane R. Taylor, Abteilung für Psychiatrie, Abteilung für Molekulare Psychiatrie, Yale University School of Medicine, Ribicoff Forschungseinrichtungen, Connecticut Mental Health Center, 34 Park Street, New Haven, CT 06508 adressiert werden.[E-Mail geschützt]
Abstract
Veränderungen in der Motivation wurden mit der Pathophysiologie verschiedener psychiatrischer Störungen, einschließlich Substanzmissbrauch und Depression, in Verbindung gebracht. Es ist bekannt, dass die wiederholte Exposition gegenüber Missbrauchs- oder Streßdrogen den Transkriptionsfaktor ΔFosB im Nucleus accumbens (NAc) und im dorsalen Striatum persistent induziert, von denen angenommen wird, daß sie zu Neuroadaptationen in Dopamin-regulierten Signalwegen beitragen. Über die spezifische Beteiligung von ΔFosB bei der Dysregulation von appetitiv motivierten Verhaltensweisen ist jedoch wenig bekannt. Wir zeigen hier die induzierbare Überexpression von & Dgr; FosB in NAc und dorsalem Striatum von bitransgenen Mäusen oder spezifisch in dem NAc-Kern von Ratten durch Verwendung von viral-vermitteltem Gentransfer, verbesserter nahrungsmittelverstärkter instrumenteller Leistung und progressivem Reaktionsverhältnis. Sehr ähnliche Verhaltenseffekte wurden nach vorheriger wiederholter Exposition gegenüber Kokain, Amphetamin, MDMA [(+) - 3,4-Methylendioxymethamphetamin] oder Nikotin bei Ratten gefunden. Diese Ergebnisse zeigen die starke Regulation von Motivationsprozessen durch ΔFosB und liefern Hinweise darauf, dass medikamenteninduzierte Veränderungen der Genexpression durch Induktion von ΔFosB innerhalb des NAc-Kerns eine entscheidende Rolle beim Einfluss von motivationalen Einflüssen auf instrumentelles Verhalten spielen können.
Einführung
Wiederholte Arzneimittelexposition verursacht zeitlich dynamische Veränderungen in der Gentranskription, die dauerhafte Neuroadaptationen innerhalb des Nucleus accumbens (NAc) hervorrufen (Nestler, 2004). Diese Hirnregion spielt eine entscheidende Rolle sowohl bei den Prozessen der Arzneimittel- als auch bei der natürlichen Verstärkung (Kelley und Berridge, 2002), obwohl nur wenig über die Transkriptionsfaktoren bekannt ist, die sich auf das Verhalten auswirken, das durch nicht-drug, appetitive Suppressors wie Nahrung motiviert ist. ΔFosB ist ein Transkriptionsfaktor, der im NAc und dorsalen Striatum durch chronische Arzneimittelexposition aktiviert wird (Konradi et al., 1994; Nye et al., 1995; Chen et al., 1997; Pich et al., 1997; Shaw-Lutchmanet al., 2003) und zwanghaftes Radlaufen (Werme et al., 2002). Es wird auch in diesen Regionen durch verschiedene Formen von chronischem Stress induziert (Perrottiet al., 2004). Die Verstärkung von Arzneimittelverstärkungsprozessen, die mit der Induktion von striatalem ΔFosB assoziiert sind, ist gut etabliert (Kelz et al., 1999; Colby et al., 2003; Zachariouet al., 2006). Die Auswirkungen erhöhter ΔFosB-Spiegel in diesen Regionen auf das durch natürliche Verstärker motivierte instrumentelle Verhalten sind jedoch nicht bekannt.
Die Durchführung von instrumentellen Reaktionen ist ein notwendiger Bestandteil des Drogenkonsums, der mit fortschreitendem Übergang zur Sucht dysreguliert oder unflexibel werden kann (Jentsch und Taylor, 1999; Berke und Hyman, 2000; Berridge und Robinson, 2003; Everitt und Robbins, 2005). Der NAc ist in mehrere Aspekte des instrumentellen Verhaltens mit Relevanz für die Sucht involviert (Balleine und Killcross, 1994; Corbitet al., 2001; de Borchgrave et al., 2002; Di Ciano und Everitt, 2004b; Everitt und Robbins, 2005). Es ist daher wahrscheinlich, dass medikamenteninduzierte Neuroadaptationen innerhalb des NAc die Durchführung von instrumentellen Handlungen beeinflussen könnten. Tatsächlich erhöht eine chronische Kokainexposition die sucroseverstärkte instrumentelle Leistung (Miles et al., 2004) und Manipulationen, die vermutlich die Neuroplastizität innerhalb des NAc-Kerns blockieren, einschließlich der Hemmung der PKA (Proteinkinase A) oder Proteinsynthese, beeinflussen die instrumentell belohnten Reaktionen (Baldwin et al., 2002a; Hernandezet al., 2002). Der NAc-Kern vermittelt auch den motivationalen Einfluss konditionierter Einflüsse auf instrumentelles Verhalten (Parkinson et al., 1999; Corbitet al., 2001; Hall et al., 2001; Di Ciano und Everitt, 2004a; Ito et al., 2004), wodurch ein neurobiologisches Substrat zur Verfügung gestellt wird, wobei die ΔFosB-Induktion die instrumentelle Leistung und Motivation für appetitive Verstärker wie Nahrung, Wasser oder Drogen mißbrauchen könnte.
Hier untersuchten wir die Auswirkungen von ΔFosB auf essen-motivierten instrumentellen Verhalten mit zwei komplementären genetischen Ansätze: (1) induzierbare Überexpression von ΔFosB innerhalb der NAc und dorsalen Striatum von transgenen Mäusen (NSE-tTA × TetOp-ΔFosB) und (2) Überexpression von ΔFosB im NAc-Kern spezifisch durch Verwendung von viral-vermitteltem Gentransfer bei Ratten. Wir haben auch untersucht, ob die vorherige wiederholte Exposition gegenüber Kokain, Amphetamin, (+) - 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) oder Nikotin unter Bedingungen, von denen berichtet wird, dass sie ΔFosB erhöhen, die nahrungsmittelverstärkte instrumentelle Reaktion und / oder Motivation verstärken würde. wie es für die drogenverstärkte Selbstverabreichung gezeigt wurde (Horgeret al., 1990, 1992; Piazza et al., 1990; Vezina et al., 2002; Miles et al., 2004). Unsere Ergebnisse zeigen anhaltende Effekte von ΔFosB auf das instrumentelle Verhalten und legen nahe, dass dieser Transkriptionsfaktor im NAc-Kern als Regulator der motivationalen Funktion fungieren könnte.
Materialen und Methoden
Tiere und Tierpflege
Experimentell naive Sprague-Dawley-Ratten wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erworben. Männliche, bitransgene 11A-Mäuse stammten von einer Kreuzung zwischen homozygoten transgenen Mäusen, die ein Neuronen-spezifisches Enolase (NSE) -tTA-Tetracyclin-Transaktivatorprotein (Linie A) exprimieren, und Mäusen, die TetOp (Tetracyclin-responsiver Promotor) -ΔFosB exprimieren (Linie 11); die Elternlinien wurden auf einem gemischten gemischten Hintergrund gehalten (50% ICR und 50% C57BL6 × SJL) (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999). Diese bitransgenen 11A-Mäuse exprimieren ΔFosB nur dann, wenn: (1) beide Transgene in der gleichen Zelle vorhanden sind und (2) die Transkriptionsaktivierung durch tTA nicht durch die Anwesenheit von Tetracyclin-Antibiotika wie Doxycyclin inhibiert wird. Die Verabreichung von Doxycyclin an diese Mäuse kann somit eine zeitliche Kontrolle über die Expression von ΔFosB ausüben und verwendet werden, um die Expression während der Entwicklung zu verhindern; tatsächlich ist die Doxycyclin-Verabreichung mit keiner nachweisbaren Leckexpression von ΔFosB assoziiert (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999). Darüber hinaus wurde die 11A-Linie von bitransgenen Mäusen für die vorliegenden Experimente ausgewählt, da sie ein Expressionsmuster aufweisen, das hauptsächlich auf Dynorphin-enthaltende striatale Neuronen (sowohl NAc als auch dorsales Striatum) beschränkt ist, sehr ähnlich zu dem Muster der ΔFosB-Induktion durch chronisches Arzneimittel Exposition (Kelz et al., 1999). Darüber hinaus wurde die Quantifizierung dieser striatalen Expression von ΔFosB zuvor quantifiziert (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999). Die Mäuse wurden an der University of Texas Southwestern generiert und in den Einrichtungen von Yale gewartet und getestet. Während der gesamten Trächtigkeit und Entwicklung wurden alle Mäuse bis zum Alter von 8-9 bei einer Konzentration von 100 & mgr; g / ml im Trinkwasser auf Doxycyclin gehalten, Bedingungen, von denen bekannt ist, dass sie TetOp-getriebene Transgene im "Aus" -Zustand halten und 6 verwenden Wochen Doxycyclin, wenn die ΔFosB-Expression maximal wird (Kelz et al., 1999). Alle Experimente beinhalteten den Vergleich von Wurfmutter-Bitransgenen Mäusen gegenüber Doxycyclin, was an sich kein Einfluss auf das motivierte Verhalten hat (Kelz et al., 1999; McClung und Nestler, 2003; Zachariouet al., 2006).
Alle Versuchspersonen wurden in Paaren (Ratten) oder in Gruppen (Mäuse; vier bis fünf pro Käfig) unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen unter einem 12 h-Hell / Dunkel-Zyklus (Licht an 7: 00 AM und aus an 7: 00) gehalten PM). Sie durften mindestens 7 d vor jeder Studie an die Wohneinrichtungen anpassen. Die Tiere hatten jederzeit Zugang zu Wasser und beschränkten Zugang zu Nahrung, wie nachstehend beschrieben. Die gesamte Tierverwendung wurde in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurde von den Animal Care and Use Committees der University of Texas Southwestern und der Yale University genehmigt.
Drogen
Kokainhydrochlorid [freundlicherweise vom Nationalen Institut für Drogenmissbrauch (NIDA) zur Verfügung gestellt], d-Amphetaminsulfat (Sigma, St. Louis, MO), MDMA-Hydrochlorid (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von NIDA) und (-) - Nikotinhydrogentartrat (Sigma ) wurden in steriler physiologischer Kochsalzlösung (0.9%) gelöst und intraperitoneal in einem Volumen von 5 ml / kg (Mäuse) oder 2 ml / kg (Ratten) injiziert. Der pH-Wert der Nikotinlösung wurde vor der Injektion mit Natriumbicarbonat eingestellt.
Virale Vektoren
Der virale vermittelte Gentransfer wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Carlezon et al., 1998; Perrottiet al., 2004). Kurz gesagt, cDNAs, die für die spezifischen Proteine kodieren, wurden in das Herpes Simplex Virus (HSV) Amplicon HSV-PrPUC inseriert und unter Verwendung des Helfers 5dl1.2 in das Virus verpackt. Die Vektoren, die die Expression von entweder HSV-LacZ, kodierend für das Kontrollprotein β-Galactosidase, oder HSV-ΔFosB, kodierend für ΔFosB, antreiben, wurden anschließend gemäß dem experimentellen Protokoll in den NAc-Kern infundiert.
Versuchsverfahren
Gliederung.
Experiment 1 untersuchte die Wirkungen der vorherigen wiederholten Arzneimittelexposition auf die nahrungsmittelverstärkte instrumentelle Leistung und das progressive Verhältnis, das darauf anspricht. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Versuchsgruppen eingeteilt (n = 9-10 / Gruppe). Diese Gruppen erhielten zweimal täglich Injektionen (intraperitoneal; bei 9: 00 AM und 5: 00 PM) mit Kochsalzlösung oder einem der folgenden Medikamente: Nikotin, 0.35 mg / kg; MDMA, 2.5 mg / kg; Kokain, 15 mg / kg; oder Amphetamin, 2.5 mg / kg für 15 aufeinanderfolgende Tage. Die Dosen wurden basierend auf unseren zuvor veröffentlichten Daten ausgewählt (Taylor und Jentsch, 2001; Olausson et al., 2003) und die medikamenteninduzierte lokomotorische Stimulation wurde an den Behandlungstagen 1 und 15 überwacht. Nach 5 d des Entzugs wurden die Tiere auf eine instrumentelle Reaktion auf 10-aufeinanderfolgende Tage trainiert und anschließend mit einem progressiven Verhältnis getestet, das am nächsten Tag reagierte. Zwei Tiere wurden von der statistischen Analyse ausgeschlossen, da sie die instrumentelle Antwort nicht erhalten haben und nicht mehr als eine aktive Hebelreaktion bei jeder der drei abschließenden Trainingseinheiten gemacht haben.
Experimente 2 und 3 untersuchten die Auswirkungen der induzierbaren striatalen Überexpression von ΔFosB in bitransgenen Mäusen auf die instrumentelle Leistung und reagierten auf ein progressives Verstärkungsverhältnis. Es wurde zuvor gezeigt, dass die induzierbare Überexpression von ΔFosB in diesen Mäusen die Effekte wiederholter Arzneimittelexposition in der lokomotorischen Aktivität und konditionierten Platzpräferenzparadigmen (Kelz et al., 1999; Zachariouet al., 2006). Diese Mäuse können wichtige Informationen über den Beitrag des striatalen ΔFosB zu spezifischen Verhaltensprozessen liefern. Genotypisierte männliche Mäuse wurden auf Doxycyclin gehalten oder wurden im 8-Wochenalter auf Leitungswasser umgestellt. Die Experimente wurden nach 6-Wochen des Doxycyclin-Entzugs begonnen, zu welcher Zeit die Transgenexpression maximal ist (Kelz et al., 1999). Im Experiment 2 wurden Tiere (n = 16) für die 10-aufeinanderfolgenden Tage mit Nahrungsmitteln eingeschränkt und auf das unten beschriebene instrumentelle Verfahren (siehe unten, Instrumentelle Reaktion und progressive Verhältnisprüfung) trainiert. Nach Abschluss der instrumentellen Tests wurde Kokain-induzierte lokomotorische Stimulation in diesen Mäusen ausgewertet. Im Experiment 3 wurde eine separate Gruppe von Mäusen (n = 18) auf die instrumentelle Reaktion für 10 aufeinanderfolgende Tage unter Bedingungen trainiert, bei denen ein Maximum an 50-Verstärker verabreicht wurde. Am Tag 11 wurden alle Mäuse auf die Reaktion mit progressivem Verhältnis getestet. Am Tag 12 haben wir die Auswirkungen der Abwertung des Verstärkers durch Vorziehen des progressiven Verhältnisses bestimmt.
Die Experimente 4 und 5 untersuchten die Effekte der viralen Überexpression von ΔFosB spezifisch innerhalb der NAc. Experiment 4 testete die Auswirkungen der ΔFosB-Überexpression auf die instrumentelle Leistung. Hier wurden Ratten mit HSV-ΔFosB (n = 8) oder HSV-LacZ (n = 8) in den NAc-Kern infundiert und an der instrumentellen Prozedur trainiert, die später mit 40 begann. Nach den täglichen 10-Trainingseinheiten wurden die Ausgangsaktivitätswerte für alle Tiere in der Überwachungsausrüstung für die Bewegungsaktivität wie unten beschrieben bewertet (siehe unten, Lokomotorische Aktivität). Experiment 5 bewertete die Auswirkungen der NAc-ΔFosB-Überexpression spezifisch auf die Antwort des progressiven Verhältnisses. Hier wurden die Ratten zunächst für 15-aufeinanderfolgende Tage trainiert, Versuchsgruppen zugeordnet und anschließend mit HSV-ΔFosB (n = 8) oder HSV-LacZ (n = 7) in den NAc-Kern infundiert. Die Tiere wurden für 4 d ungetestet und unbehandelt gelassen, um eine maximale Expression von ΔFosB zu ermöglichen. Am Tag 5 nach der Infusion wurden alle Tiere auf die Hebelpressung mit dem progressiven Verhältnisplan getestet. Nach dem letzten Testtag wurden alle Ratten getötet und die Platzierung von Infusionskanülen im NAc-Kern histochemisch verifiziert. Basierend auf der Platzierung der Infusionskanülen wurden zwei Ratten vom Experiment 4 und eine Ratte vom Experiment 5 ausgeschlossen.
Die Charakterisierung der Genexpression wurde in einer separaten Gruppe von Tieren durchgeführt. Hier wurde HSV-LacZ in den NAc-Kern infundiert und Tiere wurden später 3 getötet. Die Expression von β-Galactosidase wurde anschließend immunhistochemisch beurteilt.
Lokomotivaktivität.
Die lokomotorische Aktivität wurde unter Verwendung von Aktivitätsmessgeräten (Digiscan Animal Activity Monitor; Omnitech Electronics, Columbus, OH) gemessen. Die Aktivitätsmesser wurden mit zwei Reihen von Infrarot-Photosensoren ausgestattet, wobei jede Reihe aus 16-Sensoren bestand, die 2.5 cm voneinander beabstandet waren. Die Aktivitätsmesser wurden von den Aktivitätsmessern gesteuert, die von einem PC-Computer unter Verwendung der Micropro-Software (Omnitech Electronics) gesammelt wurden.
Die Versuchstiere wurden in durchsichtigen Plastikboxen (25 × 45 × 20 cm) platziert, die in die Aktivitätsmessgeräte gegeben wurden. Die Tiere durften sich anfangs an das Aufzeichnungsgerät für die Bewegungsaktivität für 30 min gewöhnen. In einigen Experimenten wurden die Tiere anschließend herausgenommen, mit Kokain, Amphetamin, Nikotin oder Vehikel gemäß dem experimentellen Design injiziert und wieder in die Kästen zurückgestellt. Die lokomotorische Aktivität wurde dann für 60 min aufgezeichnet, wobei 5 min nach der Arzneimittelinjektion begonnen wurde, um unspezifische Injektions-induzierte Hypermotilität zu vermeiden. Alle Experimente wurden während der leichten Phase der Tiere (zwischen 9: 00 AM und 6: 00 PM) durchgeführt.
Instrumentelle Reaktion und progressive Verhältnisprüfung.
Die instrumentelle Reaktion wurde unter Verwendung von Standardoperantenkammern für Ratten (30 × 20 × 25 cm) oder Mäusen (16 × 14 × 13 cm), die von der MedPC-Software (Med Associates, St. Albans, VT) kontrolliert wurden, bewertet. Jede Kammer war in einer schalldämpfenden äußeren Kammer untergebracht, die mit einem Generator für weißes Rauschen und einem Ventilator ausgestattet war, um die Auswirkungen von Außengeräuschen zu reduzieren. Ein an der Rückwand angebrachtes Hauslicht erhellte die Kammer. Ein Pelletspender lieferte Futterpellets (20 oder 45 mg; Bio-Serv, Frenchtown, NJ) als Verstärker in das Magazin. Kopfeinträge wurden durch eine Photozelle detektiert, die über der Verstärkeraufnahme angebracht war. In diesem Magazin war ein Stimulus-Licht. Bei Ratten wurde ein Hebel auf jeder Seite des Magazins angeordnet. Bei Mäusen wurden zwei Nasenlochöffnungen an der Rückwand der Kammern (dh gegenüber dem Verstärkermagazin) angeordnet.
Während der 5 d unmittelbar vor dem Beginn des Trainings waren die Tiere auf 90 min Zugang zu Nahrungsmitteln pro Tag beschränkt und in ihren Heimkäfigen Getreidekorn-Nahrungspellets (Mäuse, 20 mg; Ratten, 45 mg) ausgesetzt. Während des Testzeitraums waren Nahrungspellets in den operanten Kammern nach dem Verhaltensprotokoll (siehe unten) sowie in unbegrenzter Menge im Heimkäfig für 90 min, beginnend 30 min nach der täglichen Testsitzung, intermittierend verfügbar. Dieser Speiseplan erlaubt jedem einzelnen Tier, seinen individuellen Sättigungspunkt zu erreichen und verringert die Variabilität, die durch den Wettbewerb zwischen dominanten und untergeordneten Tieren verursacht wird. In unseren Händen ermöglicht dieser Zeitplan eine langsame Gewichtszunahme nach dem anfänglichen Gewichtsverlust zu ~85-90% der freilaufenden Gewichte. Die Tiergewichte wurden während des gesamten Experiments überwacht.
Alle Probanden wurden anfänglich an die Testvorrichtung für 2 d gewöhnt; Während dieser Sitzungen wurden die Futterpellets mit einem zeitlich festgelegten 15-Zyklus (FT-15) in das Verstärkermagazin geliefert. Ab dem nächsten Tag erhielten die Probanden tägliche Trainingseinheiten für 10-Folgetage. Die Reaktion auf Lebensmittel wurde anhand früher veröffentlichter instrumenteller Konditionierungsverfahren getestet (Baldwinet al., 2002b). Das Reagieren auf den richtigen (dh aktiven) Hebel / Nasenspieker wurde verstärkt, wohingegen das Reagieren auf den anderen (nicht aktiven) Hebel / Nasensporn keine programmierten Konsequenzen hatte. Die Position des aktiven Nasensporns oder -hebels (links / rechts) war für alle experimentellen Gruppen ausgeglichen. Die Erfüllung der Antwortanforderung (siehe unten) führte zum Einsetzen des Magazin-Stimuluslichts, gefolgt von 1 s später durch die Lieferung eines einzelnen Nahrungspellets. Zwei Sekunden später wurde das Stimuluslicht ausgeschaltet. Die ersten 10-Verstärker wurden nach erfolgreichem Abschluss des Ansprechens gemäß einem festen Verhältnis (FR1) -Plan erhalten, wonach Pellets nach Reaktion mit einem variablen Verhältnis (VR2) -Plan verfügbar waren. Die Sitzung dauerte für 15 min.
Experimente 3 (Mäuse) und 5 (Ratten) verwendeten alternative Trainingspläne, um den möglichen Einfluss von Unterschieden in der instrumentellen Leistung während des Trainings auf die nachfolgende progressive Verhältnisantwort zu vermeiden (siehe unten). Im Experiment 3 wurden Mäuse in einem FR1-Zeitplan für 2 d und dann in einem FR2-Zeitplan für 8 d trainiert. Das erste 3 d des Tests verwendete 60 min-Sitzungen. An den letzten 7-Schulungstagen wurde die Sitzung beendet, als 50-Verstärker erworben wurden. Im Experiment 5 wurden die Ratten auf dem FR1 / VR2-Plan in 15 min-Sitzungen trainiert, wie oben für alle anderen Experimente mit zwei Ausnahmen beschrieben. Zuerst wurde eine maximale Anzahl von 150-Pellets / Sitzung geliefert. Zweitens erhielten diese Tiere 5 zusätzliche Trainingstage (dh insgesamt 15 d), um vor jeder experimentellen Manipulation eine stabile Leistung zu erzielen.
Die Tiere wurden auch getestet, indem sie auf Nahrungsmittel mit einem progressiven Verhältnis der Verstärkung antworteten. In diesem Test wurde die Reaktionserfordernis, Nahrung zu erhalten, als ein FR1-Plan initiiert, aber progressiv um 2 erhöht, um einen nachfolgenden Verstärker zu erhalten (dh 1-, 3-, 5-, 7 ..., X + 2-Antworten). In dem Arzneimittelbehandlungsexperiment unter Verwendung von Ratten wurde der Zeitplan durch 5 progressiv erhöht, was einen endgültigen Zeitplan von 1, 6, 11, 16 ..., X + 5 ergab. Alle anderen Parameter wurden mit dem oben beschriebenen Trainingsverfahren identisch gehalten. Der Test wurde beendet, wenn für 5 min keine aktive Antwort erfolgte.
Reinforcer Abwertung.
Die Wirkung der Verstärkerabwertung wurde mit verstärkerspezifischen Voreinstellungen untersucht. Hier durften Mäuse während ihres 3 h unbegrenzt Getreide-basierte Futterpellets in ihrem Heimkäfig fressen, bevor sie mit dem oben beschriebenen Progressionsschema der Verstärkung getestet wurden.
Chirurgische Techniken.
Die Tiere wurden unter Verwendung von Equithesin [einer Mischung, die Pentobarbital (35 mg / kg) und Chloralhydrat (183.6 mg / kg) in Ethanol (10% v / v) und Propylenglycol (39% v / v) enthielt, anästhesiert; verabreicht bei 4.32 ml / kg, ip]. Kanülen (Plastics One, Roanoke, VA) wurden chirurgisch oberhalb des NAc-Kerns implantiert, wobei Kopf stereotaktische Ausrüstung verwendet wurde. Die stereotaktischen Koordinaten, die relativ zu Bregma verwendet wurden, waren wie folgt: anterior / posterior, + 1.5 mm; lateral / medial, ± 1.5 mm; ventral / dorsal, -6.0 mm (Paxinos und Watson, 1986). Die Kanülen wurden mit Schrauben und Zahnzement am Schädel verankert. Obturatoren wurden in die Führungskanülen eingesetzt, um ein Blockieren zu verhindern. Nach der Operation wurden die Tiere einer standardmäßigen postoperativen Behandlung unterzogen und konnten sich vor Beginn eines Experiments für 5 d erholen.
Infusionen.
Intrazerebrale Infusionen viraler Vektoren wurden bilateral 40 h vor Beginn des Trainings durchgeführt (siehe unten). Injektionsspritzen (31-Messgerät), die sich 1 mm unterhalb der Spitze der Führungskanülen erstreckten, wurden langsam gleichzeitig in den linken und rechten NAc abgesenkt, und 1.0 & mgr; l / Seite wurde über eine 4 min-Periode bei einer Infusionsgeschwindigkeit von 0.25 & mgr; l / infundiert. min mit einer Mikroinfusionspumpe (PHD-5000; Harvard Apparatus, Holliston, MA). Die Infusionsnadeln wurden für 1 min nach Beendigung der Infusion an Ort und Stelle belassen und die Blindkanülen wurden ersetzt. Kanülenplatzierungen wurden nach Abschluss der Verhaltensexperimente histologisch verifiziert (siehe Abb. 6B), und nur Tiere mit korrekt platzierten Kanülen wurden in die statistische Analyse der experimentellen Daten einbezogen.
Histologische Analysen und Immunfärbung.
Nach Abschluss der Experimente wurden Tiere, die im Rahmen des Experiments operiert worden waren, mit Equithesin anästhesiert und nach Standardverfahren transkardial mit 0.1 m PBS (5min) und 10% Formalin (10min) perfundiert. Die Gehirne wurden in Formalin nachfixiert und anschließend in eine phosphatgepufferte Saccharoselösung (30%) gegeben. Alle Gehirne wurden dann in 40 & mgr; m Sektionen auf einem Mikrotom geschnitten und für histologische Analysen der Kanülenplatzierung und Proteinexpression verwendet.
Die Kanülenposition wurde in Abschnitten hergestellt, die mit Neutralrot gegengefärbt und auf Mikroskopobjektträgern in Distyren-Weichmacher und Xylol (DPX) nach Ethanoldehydratisierung aufgebracht wurden. Immunhistochemie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Hommel et al., 2003). Kurz gesagt wurde die Expression von β-Galactosidase nach HSV-LacZ-Infusion durch Immunofluoreszenzfärbung unter Verwendung eines Ziegen-anti-β-Galactosidase-Primärantikörpers (1: 5000; Biogenesis, Kingston, NH) bestimmt. Nach Inkubation über Nacht wurden die Schnitte gespült und anschließend mit einem sekundären, an Cy2 (1: 200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) konjugierten sekundären Esel-Anti-Ziegen-Antikörper inkubiert. Die Schnitte wurden erneut gewaschen, gefolgt von Dehydratisierung mit Ethanol und Montieren in DPX. Benachbarte Kontrollabschnitte wurden identisch ohne die Einbeziehung von primären Antikörpern behandelt. Die Immunfluoreszenz wurde bei 520 nm unter Verwendung von a bewertet Zeiss (Oberkochen, Deutschland) Mikroskop mit FITC - Filter und Bilder bei identischen Belichtungszeiten mit aufgenommen Zeiss Axiovision Digital Imaging System.
Statistiken
Die Daten aus allen Experimenten wurden unter Verwendung einer Ein-, Zwei- oder Drei-Wege-ANOVA ausgewertet, gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Scheffe oder Dunnett, wobei gegebenenfalls mehrere Vergleiche unter Verwendung des Holm-Tests zur sequentiellen Zurückweisung korrigiert wurden. Ein Wert von p ≤ 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse
Experiment 1: Effekte der wiederholten Arzneimittelexposition auf die instrumentelle Leistung und die progressive Reaktion auf das Verhältnis
Um zu bestätigen, dass unser Paradigma der wiederholten Arzneimittelexposition funktionell signifikante Neuroadaptationen hervorbrachte, untersuchten wir zunächst die lokomotorische Sensibilisierung als prototypisches Verhaltensmaß für die chronische Arzneimittelwirkung. Die Ratten erhielten zweimal tägliche Injektionen von Nikotin (0.35 mg / kg), MDMA (5 mg / kg), Kokain (15 mg / kg) oder Amphetamin (2.5 mg / kg), und die lokomotorische Aktivität wurde nach der ersten Injektion getestet Behandlungstage 1 und 15 (ergänzend Abb. 1A-E, erhältlich bei www.jneurosci.org als Ergänzungsmaterial). Statistische Analyse ergab eine signifikante Behandlung durch Tag Interaktion (F(4,42) = 9.335; p ≤ 0.0001). Mit Ausnahme von MDMA (p = 0.62) induzierten alle Arzneimittel am Tag 15 im Vergleich zum Tag 1 signifikant höhere lokomotorische Aktivität (dh Sensibilisierung) (Nikotin, p ≤ 0.001; Kokain, p ≤ 0.001; Amphetamin, p ≤ 0.01). Wiederholte Kochsalzlösungsinjektionen hatten keine Wirkung. Keine der medikamentösen Behandlungen veränderte die während der Habituation am Tag 15 gemessene basale lokomotorische Aktivität (ergänzend Abb. 2A, verfügbar bei www.jneurosci.org als Ergänzungsmaterial).
Fünf Tage nach der letzten Arzneimittelinjektion untersuchten wir die Auswirkungen der vorherigen wiederholten Nikotin-, MDMA-, Kokain- oder Amphetamin-Exposition auf das durch Nahrungsmittel verstärkte instrumentelle Verhalten. Die Daten werden für jedes Medikament getrennt in Figure 1A-H unter Verwendung der gleichen Kochsalzlösungskontrollgruppe für Vergleiche. Wir fanden heraus, dass die vorherige Exposition gegenüber jedem dieser Medikamente signifikant und selektiv die nahrungsmittelverstärkte instrumentelle Reaktion erhöhte (Behandlung durch Hebel nach dem Trainingstag, F(36,378) = 1.683; p ≤ 0.01; Post-hoc-Analyse: Nikotin, p ≤ 0.01; MDMA, p ≤ 0.05; Kokain, p ≤ 0.01; Amphetamin, p ≤ 0.001). Die bei asymptotischer Leistung beobachtete persistierende Erhöhung des instrumentellen Ansprechens ließ auf eine mögliche Steigerung der Motivation schließen, die mit den zuvor gemeldeten Erhöhungen nach wiederholter Exposition durch Psychostimulanz übereinstimmt (siehe Diskussion). Wir testeten daher, ob die vorherige wiederholte Arzneimittelexposition die Motivation unter Verwendung eines progressiven Verhältnisplans erhöhte. Es gab einen statistischen Effekt der vorherigen Arzneimittelexposition auf das Ansprechen auf den aktiven Hebel (Behandlung durch Hebelinteraktion, F(4,42) = 3.340; p ≤ 0.05) (Abb. 2A) sowie der endgültige Knickpunkt (F(4,42) = 5.560; p ≤ 0.001) (Abb. 2B). Zusätzliche Analysen zeigten, dass bei allen Behandlungen sowohl die Anzahl der aktiven Antworten (Nikotin, p ≤ 0.001; MDMA, p ≤ 0.05; Kokain, p ≤ 0.001; Amphetamin, p ≤ 0.001) als auch der Brechpunkt (Nikotin, p ≤ 0.001; MDMA p ≤ 0.01; Kokain, p ≤ 0.0001; Amphetamin, p ≤ 0.0001), was mit einer Wirkung dieser Behandlungen auf die Motivation übereinstimmt. Angesichts der fehlenden Wirkung der Medikamente auf die Bewegungsaktivität der Ausgangsmuskulatur und der fehlenden Wirkung auf inaktive Hebelpressen ist es unwahrscheinlich, dass die erhöhte Reaktion auf Nahrung unter diesen Bedingungen unspezifische Erhöhungen der motorischen Aktivität widerspiegelt.
Abbildung 1.
Wirkung von wiederholten wiederholten Injektionen von Nikotin (0.35 mg / kg), MDMA (2.5 mg / kg), Kokain (15 mg / kg) oder Amphetamin (2.5 mg / kg) zweimal täglich für 15 d bei anschließendem instrumentellen Verhalten. Die Tiere wurden zusammen getestet, aber aus Gründen der Klarheit werden die Wirkungen jedes Arzneimittels getrennt dargestellt, wobei die gleiche mit Kochsalzlösung behandelte Kontrollgruppe verwendet wird. A (aktive Antworten) und B (inaktive Antworten) zeigen die Auswirkungen der vorherigen Nikotinbelastung; C, D, MDMA; E, F, Kokain; G, H, Amphetamin. Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.
Abbildung 2.
Wirkung der vorherigen wiederholten Behandlung (zweimal täglich, 15 Tage) mit Kochsalzlösung, Nikotin (0.35 mg / kg), MDMA (2.5 mg / kg), Kokain (15 mg / kg) oder Amphetamin (2.5 mg / kg) auf das instrumentelle Ansprechen auf einem progressiven Verhältnis Zeitplan der Verstärkung. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. *** p <0.001; ** p <0.01; * p <0.05. Sal, Kochsalzlösung; Nic, Nikotin; Coc, Kokain; Amph, Amphetamin; PR, progressives Verhältnis.
Die vorherige Medikamentenexposition hatte auch keinen Einfluss auf das Körpergewicht, das vor der Nahrungseinschränkung aufgezeichnet wurde, am ersten oder letzten Tag des instrumentellen Trainings oder unmittelbar vor dem Test mit dem progressiven Verhältnis (ergänzend Abb. 2B, erhältlich bei www.jneurosci.org als Ergänzungsmaterial). Der eingeschränkte Zugang zu Nahrungsmitteln für 3 d hat anfangs das Körpergewicht auf durchschnittlich 91-92% der frei fütternden Gewichte reduziert. Am Ende des Verhaltenstests waren die Gewichte zu 97-99% des Körpergewichts vor der Restriktion zurückgekehrt und es wurden keine Unterschiede zwischen den mit Arzneimittel behandelten und den mit Kochsalzlösung behandelten Tieren beobachtet. Veränderungen des Körpergewichts und Unterschiede in Hunger oder Appetit sollten daher nicht signifikant zur beobachteten Verstärkung der instrumentellen Leistung oder Motivation beitragen.
Versuch 2: induzierbare Überexpression von ΔFosB in bitransgenen Mäusen; instrumentale Leistung
Als nächstes wurde untersucht, ob die instrumentelle Leistung auch in bitransgenen Mäusen erhöht war, die ΔFosB mit ausgeprägter Selektivität im NAc und dorsalen Striatum induzierbar überexprimieren (Kelz et al., 1999). In diesem Experiment wurden ΔFosB-überexprimierende Mäuse mit Wurfmittelkontrollen verglichen, die ΔFosB nicht überexprimieren, da sie auf Doxycyclin gehalten werden (siehe Materialien und Methoden). Wir fanden, dass die Überexpression von ΔFosB signifikant die nahrungsverstärkte Reaktion erhöhte (Genexpression durch Hebel am Trainingstag, F(9,126) = 3.156; p ≤ 0.01) (Abb. 3EIN). Die Anzahl der in der inaktiven Öffnung vorgenommenen Nasenblattreaktionen unterschied sich nicht zwischen den beiden Gruppen (Abb. 3B). Zusammen zeigen diese Daten, dass die ΔFosB-Überexpression in NAc und dorsalem Striatum die instrumentelle Leistung selektiv erhöhte
Figure 3
Effekt der induzierbaren striatalen Überexpression von ΔFosB in bitransgenen Mäusen auf die instrumentelle Leistung. A, Aktive Antworten. B, Inaktive Antworten. Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.
Um auszuschließen, dass die Verbesserung der instrumentellen Leistung bei ΔFosB-überexprimierenden Tieren durch Veränderungen des Appetits oder des Hungers erklärt werden kann, wurde das Körpergewicht vor der Nahrungsrestriktion und am ersten und letzten Trainingstag aufgezeichnet. ΔFosB hatte keine Wirkung auf das Körpergewicht vor der Nahrungsrestriktion, noch hatte es eine Auswirkung auf das Körpergewicht während des Verhaltenstests. Hier reduzierte der beschränkte Zugang zu Lebensmitteln für 3 d das Körpergewicht auf einen Durchschnitt von 87-89% der frei fütternden Gewichte. Am Ende des Verhaltenstests waren die Tiergewichte 97-99% des Körpergewichts vor der Restriktion, wobei äquivalente Veränderungen in den ΔFosB- und Kontrollmäusen beobachtet wurden (ergänzend Fig. 3A, erhältlich bei www.jneurosci.org als Ergänzungsmaterial). Es ist daher unwahrscheinlich, dass mögliche Auswirkungen der ΔFosB-Überexpression auf Hunger oder Appetit für die beobachtete Verstärkung der instrumentellen Reaktion verantwortlich sein könnten.
Wenn die Prüfung der instrumentellen Leistung abgeschlossen war, veränderte die ΔFosB-Überexpression die während einer 30 min-Periode gemessene Ausgangsbewegungsaktivität nicht (zusätzliche Abb. 3B, erhältlich bei www.jneurosci.org als Ergänzungsmaterial). Diese Beobachtung unterstützt die Ansicht, dass unspezifische Veränderungen in der Aktivität nicht zu der verbesserten instrumentellen Leistung bei diesen Tieren beitragen. Es wurde jedoch berichtet, dass & Dgr; FosB-überexprimierende, bitransgene Mäuse verbesserte lokomotorische Reaktionen auf akutes und wiederholtes Kokain zeigen (Kelz et al., 1999). Da wir einen etwas anderen Zeitplan für den Entzug von Doxycyclin zur Induktion der Genexpression (6-Wochen mit Nahrungsrestriktion) gewählt haben, haben wir uns entschlossen, diesen Phänotyp zu bestätigen. In der Tat zeigten ΔFosB-überexprimierende Mäuse einen signifikant größeren Anstieg der lokomotorischen Aktivität, wenn Kokain injiziert wurde, verglichen mit ihren Wurfsterminalkontrollen, die auf Doxycyclin gehalten wurden (Behandlung durch Genexpression, F(1,44) = 4.241; p ≤ 0.05) (ergänzend Abb. 3C, verfügbar bei www.jneurosci.org als Ergänzungsmaterial).
Versuch 3: induzierbare Überexpression von ΔFosB in bitransgenen Mäusen; progressives Verhältnis
Angesichts der Tatsache, dass die vorherige Arzneimittelexposition striatales ΔFosB (Nestler et al., 2001) und wurde hier gefunden, um die Antwort des progressiven Verhältnisses zu erhöhen, und wir testeten als nächstes, ob die transgene striatale Überexpression von ΔFosB auch die Leistung bei einem progressiven Verhältnis der Verstärkung erhöht. Eine neue Gruppe von Mäusen wurde auf instrumentelles Ansprechen unter Bedingungen trainiert (siehe Materialien und Methoden), die keine signifikanten Unterschiede in der instrumentellen Leistung zeigten, bevor sie auf das progressive Verhältnis reagierten (F(1,16) <1). Im Progressive-Ratio-Test beobachteten wir jedoch eine signifikante Genexpression durch Hebelinteraktion (F.(1,16) = 5.30; p ≤ 0.05) (Abb. 4A) und fanden heraus, dass ΔFosB-überexprimierende Mäuse, verglichen mit Kontrollmäusen, die am Doxycyclin gehalten wurden, eine größere Anzahl aktiver Reaktionen (p ≤ 0.05) zeigten, wohingegen die Anzahl der inaktiven Hebelreaktionen nicht unterschiedlich war. ΔFosB-überexprimierende Mäuse erreichten ebenfalls einen höheren Knickpunkt (F(1,16) = 5.73; p ≤ 0.05) (Abb. 4B). Diese Daten deuten darauf hin, dass die striatale Überexpression von ΔFosB, ähnlich wie bei früheren Psychostimulanzien, die Motivation erhöht. Da die Anzahl der inaktiven Antworten bei den ΔFosB-überexprimierenden Mäusen nicht verändert war, ist es unwahrscheinlich, dass unspezifische Erhöhungen der Aktivität zu diesen Effekten beitragen. Diese Ansicht wurde durch Beurteilungen der Ausgangsbewegungsaktivität, bei der kein Unterschied bestand zwischen Mäusen, die ΔFosB überexprimieren, und Kontrollmäusen, die auf Doxycyclin gehalten wurden, bestätigt. Keine großen Unterschiede im Körpergewicht zwischen ΔFosB-überexprimierenden und Kontrolltieren waren offensichtlich, gemessen am Testtag. Obwohl also ΔFosB-überexprimierende Tiere mehr nahrungsmittel-motivierte instrumentelle Reaktionen auslösen, scheinen sie nicht mehr Nahrung zu konsumieren, wenn sie frei verfügbar ist. Die wahrscheinlichste Erklärung für diese Beobachtung ist, dass, obwohl die Motivation bestimmt, wie hart ein Tier arbeiten wird, um einen Verstärker zu erhalten, zahlreiche zusätzliche Faktoren (Appetit, Sättigung, Stoffwechselzustand, etc.) das Fressverhalten und den tatsächlichen Verzehr von Nahrung beeinflussen.
Abbildung 4.
Einfluss der induzierbaren Überexpression von FosB in bitransgenen Mäusen auf die instrumentelle Reaktion auf einen progressiven Verstärkungsplan vor und nach der sättigungsinduzierten Abwertung des Verstärkers. A, B, Grundlinie: Hebelantworten (A), Haltepunkt (B). C, D, Nach Abwertung des Verstärkers: Hebelreaktionen (C), Bruchstelle (D). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. * p <0.05.
Die hier verwendeten & Dgr; FosB-bitransgenen Mäuse exprimieren & Dgr; FosB im gesamten Striatum. Während das ventrale Striatum (einschließlich des NAc) in motivationale Prozesse involviert ist, wird argumentiert, dass das dorsale Striatum am Erwerb instrumenteller Gewohnheiten beteiligt ist (Yinet al., 2004; Faureet al., 2005). Obwohl wir während der Trainingsphase keine Unterschiede in der instrumentellen Leistung feststellten, verwendeten wir einen Zeitplan mit einem niedrigen Verhältnis mit maximalen Verstärkungslimits, Bedingungen, die relativ widerstandsfähig gegenüber der Entwicklung instrumenteller Gewohnheiten waren (Dickinson, 1985) ist es möglich, dass die Etablierung von Gewohnheiten die Reaktion im Rahmen des progressiven Verhältnisses beeinflussen könnte. Diese Möglichkeit wurde direkt getestet, indem der Effekt der Abwertung des Verstärkers durch Vorfuttern auf die Antwort des progressiven Verhältnisses untersucht wurde. Eine solche Vorfütterung löschte die Wirkung von ΔFosB auf die Antwort des progressiven Verhältnisses aus, wobei keine Unterschiede in den Ansprech- oder Unterbrechungspunkten zwischen ΔFosB-überexprimierenden und Kontrollmäusen (F(1,16) <1) (Abb. 4CD). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die striatale Überexpression von ΔFosB die Sensitivität gegenüber Veränderungen des Werts von belohnten Ergebnissen bei Verwendung dieses Testplans nicht veränderte. Vielmehr scheint das im progressiven Verhältnistest beobachtete instrumentelle Ansprechen zielgerichtet zu sein, und der bei ΔFosB-überexprimierenden Mäusen beobachtete erhöhte Bruchpunkt ist wahrscheinlich auf eine erhöhte Motivation und nicht auf eine erhöhte gewohnheitsähnliche Reaktion zurückzuführen.
Experiment 4: Virus-vermittelte Überexpression von ΔFosB im NAc-Kern: instrumentelle Leistung
Um zu beurteilen, ob eine ΔFosB-Überexpression selektiv in der NAc für das in den bitransgenen Mäusen beobachtete Verhalten verantwortlich ist, infundierten wir HSV-ΔFosB oder HSV-LacZ selektiv in den NAc-Kern von Ratten und untersuchten die Wirkung dieser Manipulation auf Nahrung verstärkte instrumentale Aufführung (Abb. 5A, B). Nach dem Training wurde HSV-ΔFosB oder HSV-LacZ vor dem Beginn des Verhaltenstests in den NAc-Kern 40 h infundiert. Der Ort der Infusion und das Ausmaß der Virus-vermittelten Genexpression sind in gezeigt Figure 6, A und B. NAc-Infusionen von HSV-ΔFosB bewirkten einen anhaltenden Anstieg der Anzahl von aktiven Antworten (Genexpression durch Hebel, F(1,12) = 8.534; p ≤ 0.05) (Abb. 5A), die während des gesamten Experiments anhielt. Diese Effekte waren selektiv, da es keine signifikanten Auswirkungen der ΔFosB-Überexpression innerhalb des NAc-Kerns auf die Anzahl der inaktiven Antworten gab (Abb. 5B) oder zu Beginn der lokomotorischen Aktivität aufgezeichnet am Tag nach Beendigung des Experiments (Daten nicht gezeigt). Eine Überexpression von & Dgr; FosB in der NAc imitierte somit die Verhaltenseffekte der vorherigen Arzneimittelexposition oder striatalen Überexpression von & Dgr; FosB.
Abbildung 5.
Wirkung von Infusionen von HSV-ΔFosB in den NAc-Kern vor dem Training auf instrumentelles Ansprechen. A, Aktive Antworten. B, Inaktive Antworten. Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.
Abbildung 6.
A, Platzierung von Infusionsstellen für die viralen Vektorexperimente. Oben, Die gefüllten schwarzen Kreise entsprechen der beabsichtigten Infusionsstelle. Nur Infusionen innerhalb ~ gemacht0.5 mm dieses Bereichs (dh innerhalb des NAc-Kerns), wie durch den Kreis angezeigt, wurden als akzeptabel angesehen. Tiere mit Infusionen, die außerhalb dieses Bereichs hergestellt wurden, wurden von statistischen Analysen ausgeschlossen. Unten, Infusionsstelle innerhalb der NAc in einem repräsentativen Tier. B, Immunhistochemische Überprüfung der Proteinexpression nach Infusion von HSV-LacZ. Die oberen Felder zeigen die β-Galactosidase-Expression innerhalb des NAc-Kerns (2.5- und 10 × -Vergrößerung). Die unteren Felder zeigen das Fehlen der Immunfluoreszenz in benachbarten Kontrollabschnitten unter Verwendung des gleichen immunhistochemischen Verfahrens ohne den Einschluss des primären Antikörpers.
Experiment 5: Virusvermittelte Überexpression von ΔFosB im NAc-Kern: progressives Verhältnis
Im abschließenden Experiment wurde direkt festgestellt, ob eine eingeschränkte Überexpression von ΔFosB im NAc-Kern unter Verwendung des viral vermittelten Gentransferverfahrens ausreichend ist, um die Motivation bei Ratten zu steigern. Hier wurde HSV-ΔFosB erst nach Abschluss des instrumentellen Trainings infundiert, wodurch ein möglicher Einfluss der ΔFosB-Überexpression während des Trainings auf den nachfolgenden Progressive Ratio-Test eliminiert wurde. Eine neue Gruppe von Ratten wurde wie zuvor trainiert und basierend auf ihrer Leistung an den letzten Trainingstagen in ausgewogene experimentelle Gruppen eingeteilt. Die Tiere erhielten anschließend bilaterale Infusionen von HSV-ΔFosB oder HSV-LacZ in den NAc-Kern und wurden auf das progressive Verhältnis getestet, das nach 5 d der Überexpression ansprach. Die statistische Analyse ergab eine signifikante Genexpression durch Hebelinteraktion (F(1,12) = 14.91; p ≤ 0.01) (Abb. 7EIN). Ratten, die mit HSV-ΔFosB infundiert wurden, zeigten im Vergleich zu denen, die mit HSV-LacZ infundiert worden waren, eine aktivere Reaktion (p ≤ 0.01), während die Reaktion auf den inaktiven Hebel nicht betroffen war. In Übereinstimmung mit dieser Zunahme hatten Ratten, die mit HSV-ΔFosB infundiert wurden, auch einen höheren Bruchpunkt (F(1,12) = 18.849; p ≤ 0.001) (Abb. 7B) als mit HSV-LacZ infundierte Tiere. Es gab keine Auswirkung von ΔFosB auf die getestete 1 h-Grundlinienaktivität vor dem Progressive-Ratio-Test (ergänzende Abb. 4A, erhältlich bei www.jneurosci.org als ergänzendes Material). Es gab auch keine Unterschiede im Körpergewicht am Tag des Progressive Ratio-Tests (ergänzende Abb. 4B, erhältlich unter www.jneurosci.org als ergänzendes Material). Diese Ergebnisse unterstützen unsere Beobachtungen mit transgenen ΔFosB-überexprimierenden Mäusen und deuten darauf hin, dass eine selektive Überexpression von ΔFosB in der NAc ausreichend ist, um die Motivation im Zusammenhang mit Nahrungsmitteln zu erhöhen.
Abbildung 7.
Wirkung von Infusionen von HSV-ΔFosB 5 d vor dem Testen auf die instrumentelle Reaktion auf einen Verstärkungsplan mit progressivem Verhältnis. A, Hebelantworten. B, Haltepunkt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. *** p <0.001; ** p <0.01.
Diskussion
Die vorliegende Studie zeigt, dass die Überexpression von ΔFosB in der NAc das mit Lebensmitteln verstärkte instrumentelle Verhalten erhöhtr. Durch die vorherige Exposition gegenüber Kokain, Amphetamin, MDMA oder Nikotin erhöhte sich die bleibende instrumentelle Leistungsfähigkeit nachhaltig. Diese Medikamentenexposition erhöhte auch das nahrungsmittelmotivierte Verhalten bei einem progressiven Verhältnis der Verstärkung. Diese Auswirkungen der vorherigen Arzneimittelexposition wurden durch eingeschränkte Überexpression von ΔFosB im Striatum unter Verwendung von induzierbaren bitransgenen Mäusen (NSE-tTA × TetOP-ΔFosB) oder durch Verwendung eines neuen viralen Vektors zur selektiven Expression von ΔFosB in der NAc nachgeahmt. Insbesondere die Überexpression von ΔFosB im NAc-Kern verstärkte die Motivation für Nahrungsmittel im Rahmen des progressiven Verhältnisses, nachdem das instrumentelle Ansprechen bereits erworben worden war. Zusammen identifizieren unsere Ergebnisse, dass ΔFosB im NAc-Kern ein potenzieller Mediator medikamenteninduzierter Neuroadaptationen ist, der instrumentelles Verhalten fördern kann, wobei die Rolle dieses Transkriptionsfaktors erweitert wird, um Prozesse mit Relevanz für motivierende Einflüsse auf die Leistung von nahrungsmittelverstärktem Verhalten einzubeziehen. Sie erhöhen auch die Möglichkeit, dass Bedingungen, die eine ΔFosB-Expression in der NAc induzieren, die motivationalen Eigenschaften von sowohl natürlichen als auch Arzneimittelverstärkern beeinflussen können.
ΔFosB akkumuliert im Dynorphin exprimierenden Medium spiny Neuronen sowohl des NAc als auch des dorsalen Striatum nach chronischer, aber nicht akuter Exposition mit Missbrauchsdrogen. Dieses regionale Expressionsmuster wird in den hier verwendeten induzierbaren bitransgenen ΔFosB-überexprimierenden Mäusen reproduziert. In diesen Mäusen Erhöhte Striatalspiegel von ΔFosB erhöhen die Empfindlichkeit der Tiere gegenüber Kokain und Morphin, gemessen anhand der Präferenz für konditionierte Orte (Kelz et al., 1999; Zachariouet al., 2006). Es erhöht auch das progressive Verhältnis, das auf Kokain reagiert, was darauf hindeutet, dass die Motivation zur Selbstverabreichung von Kokain durch striatale ΔFosB-Überexpression (Colby et al., 2003). Hier fanden wir, dass die striatale ΔFosB-Überexpression in diesen Mäusen auch das progressive Verhältnis steigerte, das auf einen Nahrungsmittelverstärker reagierte, und dass diese Effekte durch eingeschränkte viral-vermittelte Überexpression von ΔFosB im NAc-Kern bei Ratten reproduziert wurden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass ΔFosB als transkriptioneller Modulator der Motivation für Primärverstärker wirken kann, sei es Nahrung, Drogen oder vielleicht auch Bewegung. Eine Idee, die mit den vorläufigen Beobachtungen übereinstimmt, dass die striatale Expression von ΔFosB nach chronischem Radlauf oder Saccharose-Trinken (McClung et al., 2004). Diese Daten legen nahe, dass die Überexpression von ΔFosB durch NAc die Motivationswirkung sowohl von natürlichen als auch von Medikamentenverstärkern verbessern kann.
Subregionen der NAc wurden argumentiert, um den Einfluss von Pavlovianischen oder instrumentellen Anreizprozessen auf die instrumentale Leistung differenziell zu vermitteln (Corbitet al., 2001; de Borchgrave et al., 2002), während allgemeinere motivationale Einflüsse auf die Instrumentalleistung von anderen Regionen wie dem zentralen Kern der Amygdala codiert werden können (Corbit und Balleine, 2005). Es wurde jedoch auch vorgeschlagen, dass der NAc-Kern ein kritischer Ort für den Erwerb zielorientierten instrumentellen Lernens ist (Smith-Roe und Kelley, 2000; Baldwin et al., 2002a,b; Kelley, 2004). Wir zeigen äquivalente Auswirkungen früherer Arzneimittelexpositionen und der transgenen striatalen ΔFosB-Überexpression auf die Verbesserung des instrumentellen Verhaltens. Infusionen von HSV-ΔFosB, die auf den NAc-Kern beschränkt sind, verstärkten auch die Reaktion von Nahrungsmitteln mit verstärkten Instrumenten. Obwohl diese Experimente einen Beitrag des dorsalen Striatums bei diesen Verhaltensweisen nicht ausschließen, deuten sie stark darauf hin, dass ΔFosB-induzierte Genexpressionsveränderungen innerhalb der NAc ausreichend sind, um die Reaktion auf Lebensmittel zu erhöhen. Da die Reaktion auf progressive Ratio auch verbessert wurde, wenn ΔFosB ausgedrückt wurde, nachdem zuvor eine stabile instrumentelle Leistung erreicht worden war, scheint eine Rolle für motivierende Einflüsse auf das instrumentale Verhalten wahrscheinlich. Die Möglichkeit, dass unsere Manipulationen auch instrumentelle Lernprozesse beeinflussen, kann jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zur Unterstützung unserer Schlussfolgerungen ist der Anstieg der instrumentellen Leistung, die nach einer vorherigen oralen Kokain-Exposition (Miles et al., 2004) wurde argumentiert, motivierende Veränderungen einzubeziehen, die mit der Fähigkeit einer chronischen Nikotinbehandlung übereinstimmen, das progressive Verhältnis von Mäusen zu erhöhen (Brunzell et al., 2006). Darüber hinaus zeigen Dopamin-Transporter-Knock-Out-Mäuse, bei denen die extrazellulären Dopamin-Spiegel erhöht sind, sowohl eine erhöhte ΔFosB-Immunreaktivität als auch eine durch Lebensmittel verstärkte Motivation, nicht jedoch ein verändertes Lernen (Cagniard et al., 2006). Zudem zeigtfanden wir, dass die Überexpression von striatalem ΔFosB in Mäusen die Leistung nicht beeinflusste, wenn die Nahrung durch Vorfütterung "abgewertet" wurde. Diese Daten zeigen, dass Tiere auf den motivationalen Wert des Verstärkers empfindlich waren und dass die Reaktion zielgerichtet war.
Eine vorherige wiederholte Arzneimittelexposition kann auch die Verhaltenssteuerung verbessern, die durch konditionierte Stimuli in Verbindung mit natürlichen Verstärkern ausgeübt wird, gemessen mit dem pavlovianischen Ansatz (Harmer und Phillips, 1998; Taylor und Jentsch, 2001; Olausson et al., 2003), konditionierte Verstärkung (Taylor und Horger, 1999; Olausson et al., 2004) und die Übertragung von Pavlov nach Instrument (Wyvell und Berridge, 2001). Es gibt jetzt zwingende Beweise dafür, dass der NAc-Kern im Gegensatz zur Hülle an der Kontrolle drogenmotivierten Verhaltens durch pavlovianische konditionierte Stimuli beteiligt ist (Parkinson et al., 1999, 2002; Hall et al., 2001; Dalley et al., 2002; Ito et al., 2004). Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass die medikamenteninduzierte Induktion von ΔFosB in der NAc ein Mechanismus sein kann, durch den die Verhaltenssteuerung bei diesen Verfahren verbessert wird. Es ist auch möglich, dass pavlovsche konditionierte Stimuli, die als konditionierte Verstärker wirken, zu den gegenwärtigen Verhaltenseffekten beitragen. Eine verbesserte Kontrolle des Verhaltens durch solche konditionierten Stimuli, die durch Erhöhungen des striatalen ΔFosB vermittelt werden, kann ebenfalls zur Wirkung des Proteins auf die medikamenteninduzierte konditionierte Platzpräferenz beitragen (Kelz et al., 1999; Zachariouet al., 2006) und progressives Verhältnis für Kokain (Colby et al., 2003). Es wurde vermutet, dass Veränderungen in den Motivationsprozessen zur Entwicklung und Aufrechterhaltung von Suchtverhalten beitragen (Robinson und Berridge, 1993; Jentsch und Taylor, 1999; Robbins und Everitt, 1999; Nestler, 2004). Die vorliegenden Daten stimmen auch mit anderen Theorien überein, die mehrere instrumentelle und pavlovianische Prozesse im Suchtverhalten betonen (Everitt und Robbins, 2005). Es sind nun zusätzliche Arbeiten erforderlich, um die Rolle von medikamenten- und ΔFosB-induzierten Neuroadaptationen in NAc und anderen limbisch-striatalen Subregionen in Bezug auf die spezifischen assoziativen oder motivationalen Faktoren zu definieren, die die instrumentelle Leistung fördern und zu zwanghaftem Verhalten beitragen können.
Die genauen molekularen Mechanismen, durch die Änderungen in der NAc das durch primäre oder konditionierte Verstärker motivierte Verhalten beeinflussen, sind nicht bekannt (Kelley und Berridge, 2002), werden die GABAergen mittelstacheligen Neuronen des NAc als kritisches Substrat für die drogen- und erfahrungsabhängige Plastizität angesehen. Hier konvergieren dopaminerge Eingaben aus dem ventralen tegmentalen Bereich und glutamatergische Eingaben aus kortikolimbischen Afferenzen auf gemeinsame Dendriten und dendritische Stacheln (Sesack und Pickel, 1990; Smith und Bolam, 1990). Chronische psychostimulierende Exposition erhöht die Dichte solcher Stacheln auf Neuronen in der NAc-Schale und im Kern (Robinson und Kolb, 1999; Robinson et al., 2001; Li et al., 2003, 2004). Kürzlich wurde die Induktion der Verhaltenssensibilisierung spezifisch mit einem Anstieg der dendritischen Stacheln im NAc-Kern assoziiert (Li et al., 2004). Bemerkenswerterweise bestehen Kokain-induzierte Zunahmen der Wirbelsäulendichte nur in D1-positive Neuronen, die ΔFosB koexprimieren (Robinson und Kolb, 1999; Lee et al., 2006). ΔFosB im NAc-Kern könnte somit zu einer dauerhaften synaptischen Plastizität beitragen, die das instrumentelle Verhalten beeinflussen könnte. Tatsächlich spielt eine wichtige Rolle für die Dopamin-Glutamat-Neurotransmission (Smith-Roe und Kelley, 2000), Proteinkinase A-Aktivität (Baldwin et al., 2002a) und de novo Proteinsynthese (Hernandezet al., 2002) innerhalb des NAc-Kerns über instrumentelle Leistungen wurden bereits berichtet. Wir identifizieren jetzt ΔFosB als einen Transkriptionsfaktor, der die nahrungsmittelverstärkte Reaktion persistent verbessern kann, wenn er im NAc-Kern überexprimiert wird. Die spezifischen Gene oder Proteine, die an diesen Effekten beteiligt sind, bleiben genau definiert. ΔFosB reguliert die Expression mehrerer Proteine im NAc, die an der Neuroplastizität beteiligt sind (McClung und Nestler, 2003). Eine kürzlich durchgeführte Microarray-Analyse charakterisierte Genexpressionsmuster in der NAc der hier verwendeten btransgenen Mäuse, die ΔFosB exprimieren, und identifizierte eine Untergruppe von Genen, die durch eine relativ kurzfristige Expression von ΔFosB reguliert wurden (McClung und Nestler, 2003). BDNF war ein solches Gen und es ist bekannt, dass BDNF in diesem neuralen Kreislauf die Reaktion auf Drogen- und Nahrungsmittel-assoziierte Hinweise verstärkt (Horgeret al., 1999; Grimm et al., 2003; Lu et al., 2004). Ein zusätzliches Gen von Interesse ist Cyclin-abhängige Kinase 5 (Bibb ua, 2001), die ebenfalls durch ΔFosB induziert wird, und kann sowohl die Kokain-induzierte strukturelle Plastizität (Norrholm et al., 2003) und Motivation gemessen durch progressive Verhältnisantwort für natürliche oder Drogenverstärker (JR Taylor, unveröffentlichte Beobachtungen). Noch weitere Kandidaten sind die GluR2-Untereinheit von AMPA-Glutamatrezeptoren (Kelz et al., 1999) und der Transkriptionsfaktor NFκB (nuklearer Faktor κB) (Ang et al., 2001). Es wäre wichtig, diese und andere regulierte Proteine in NAc-Subregionen als Kandidaten für die Vermittlung der Auswirkungen von ΔFosB auf die instrumentelle Leistung und Motivation zu untersuchen.
Die Die vorliegende Reihe von Experimenten liefert Beweise dafür, dass die Überexpression von ΔFosB innerhalb der NAc das ernährungsmotivierte Verhalten verstärken und dadurch die instrumentelle Leistung regulieren kann, wie zuvor für Arzneimittelbelohnungen gezeigt wurde. Diese Daten liefern neue Belege dafür, dass & Dgr; FosB als ein allgemeiner molekularer Schalter wirken kann, der mit Verbesserungen in den Motivationsaspekten von Verstärkern für zielgerichtetes Verhalten verbunden ist. Unsere Ergebnisse werfen die Möglichkeit auf, dass die Induktion von NAc & Dgr; FosB durch beispielsweise Suchtmittel, Stress oder möglicherweise hoch lohnende Nahrungsmittel ein kritischer Mechanismus sein kann, durch den dysfunktionale Motivationszustände zu psychischen Störungen führen, die mit zwanghaftem Verhalten einhergehen.
Fußnoten
o März 15, 2006 empfangen.
o Revision erhielt Juni 23, 2006.
o Akzeptiert August 2, 2006.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Drogenmissbrauch, des National Institute of Mental Health und des National Institute of Alcohol Abuse and Alcoholism unterstützt. Wir danken dankbar für die wertvolle Unterstützung von Dilja Krüger, Drew Kiraly, Dr. Ralph DiLeone, Robert Sears und Dr. Jonathan Hommel von der Abteilung für Psychiatrie an der Yale University. Wir danken Dr. Jennifer Quinn und Dr. Paul Hitchcott für hilfreiche Kommentare zu diesem Manuskript.
Korrespondenz sollte an Jane R. Taylor, Abteilung für Psychiatrie, Abteilung für Molekulare Psychiatrie, Yale University School of Medicine, Ribicoff Forschungseinrichtungen, Connecticut Mental Health Center, 34 Park Street, New Haven, CT 06508 adressiert werden.[E-Mail geschützt]
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