DeltaFosB reguliert indirekt die Cck-Promotoraktivität (2010)

Brain Res. 2010 kann 6; 1329: 10 – 20.

Online veröffentlicht 2010 März 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ mit einem Colleen A. McClung^{2, *}

Autoreninformation ► Urheber- und Lizenzinformationen ►

Die endgültig bearbeitete Version dieses Artikels des Herausgebers finden Sie unter Brain Res.

Siehe andere Artikel in PMC zitieren der veröffentlichte Artikel.

Abstract

Einige der wichtigen biochemischen, strukturellen und Verhaltensänderungen, die durch chronische Exposition durch Missbrauchsmedikamente hervorgerufen werden, scheinen durch den hochstabilen Transkriptionsfaktor ΔFosB vermittelt zu werden. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Überexpression von ΔFosB in Mäusen über 2-Wochen zu einer Erhöhung der Expression zahlreicher Gene im Striatum führt, von denen die meisten später nach 8-Wochen der ΔFosB-Expression herunterreguliert werden. Interessanterweise wurde eine große Anzahl dieser Gene auch in Mäusen hochreguliert, die den Transkriptionsfaktor CREB überexprimieren. Aus dieser Studie war jedoch nicht klar, ob kurzzeitiges ΔFosB diese Gene über CREB reguliert. Hier stellen wir fest, dass 2-Wochen der ΔFosB-Überexpression die CREB-Expression im Striatum erhöhen, ein Effekt, der sich nach 8-Wochen auflöst. Die frühe Induktion ist mit einer erhöhten CREB-Bindung an bestimmte Zielgenpromotoren in dieser Gehirnregion verbunden. Überraschenderweise war ein Gen, das aufgrund früherer Berichte ein vermutetes CREB-Ziel war, Cholecystokinin (Cck)wurde im striatum nicht von CREB kontrolliert. Weitere Untersuchung der Regulierung von Cck Nach der Überexpression von ΔFosB bestätigten wir, dass die kurzfristige Überexpression von ΔFosB beide erhöht Cck Promotoraktivität und Genexpression. Es erhöht auch die Bindungsaktivität an einer möglichen CREB - Bindungsstelle (CRE) in der Cck Promoter. Die CRE-Site ist jedoch für den normalen Basalausdruck von notwendig Cckist es für die ΔFosB-Induktion von nicht erforderlich Cck. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass, während die kurzzeitige & Dgr; FosB-Induktion die CREB-Expression und -aktivität bei bestimmten Genpromotoren erhöht, dies nicht der einzige Mechanismus ist, durch den Gene unter diesen Bedingungen hochreguliert werden.

Stichwort: Nucleus Accumbens, Transkription, Sucht

EINFÜHRUNG

Die chronische Exposition mit Missbrauchsmedikamenten verursacht biochemische und strukturelle Veränderungen in verschiedenen Gehirnregionen. Es wird angenommen, dass diese Änderungen Änderungen der Genexpressionsprofile im mesolimbischen System beinhalten. Dieses System besteht aus dopaminergen Neuronen, die aus dem ventralen Tegmentalbereich (VTA) im Mittelhirn auf mittlere stachelige Neuronen im Nucleus accumbens (NAc) (ventrales Striatum) sowie eine Reihe anderer Gehirnregionen vorstehen. Es wurden Änderungen der Aktivität der beiden Transkriptionsfaktoren, des cAMP-Response-Element-Bindungsproteins (CREB) und des ΔFosB-Proteins (ein Protein der Fos-Familie) vorgeschlagen, um viele der biochemischen, strukturellen und Verhaltensänderungen zu vermitteln, die bei chronischer Exposition mit Missbrauchsdrogen beobachtet werden ( rezensiert von Nestler, 2005).

CREB ist ein allgegenwärtig exprimierter Transkriptionsfaktor, der zur CREB / ATF-Familie gehört. CREB-Homodimere binden an Variationen einer CRE-Sequenz (Konsensus: TGACGTCA), die in den Promotoren vieler Gene gefunden werden. Die Phosphorylierung von CREB (vorwiegend bei Serin 133, obwohl andere Stellen identifiziert wurden) kann durch mehrere Signalkaskaden stimuliert werden, einschließlich der stromabwärts von Dopaminrezeptoren (Cole et al., 1995). Nach der Phosphorylierung bei Serin 133 rekrutiert CREB das Coaktivator CREB - Bindungsprotein (CBP) oder verwandte Proteine, was zu einer erhöhten Genexpression führt (Übersicht von Johannessen et al., 2004). Die chronische Exposition gegenüber Medikamenten gegen Opiate oder Psychostimulanzien führt zu einer vorübergehenden Erhöhung der CREB-Aktivität im Nucleus Accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchmanet al., 2002, 2003), ein Anpassungsgedanke, um die lohnenden Eigenschaften dieser Medikamente zu verringern und zum negativen emotionalen Zustand des Drogenentzugs beizutragen (Nestler, 2005).

LEs wird angenommen, dass die dauerhafte Anpassung an Missbrauchsdrogen zum Teil durch ΔFosB, eine sehr stabile Spleißvariante von FosB, vermittelt wird (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Mitglieder der Fos-Familie dimerisieren mit Mitgliedern der Jun-Familie, um einen Aktivatorprotein-1 (AP-1) -Komplex zu bilden. AP-1-Transkriptionskomplexe binden an Variationen des AP-1-Antwortelements (Konsens: TGACTCA), um die Transkription zu regulieren (Übersicht von Chinenov und Kerppola, 2001). Während die akute Exposition mit Missbrauchsmedikamenten zur kurzzeitigen Induktion (Std.) Von Mitgliedern der Fos-Familie führt (sowie zu einer erhöhten CREB-Aktivität), führt eine wiederholte Medikamentenexposition zur Anhäufung des hochstabilen ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrottiet al., 2008), dessen Ausdruck wochenlang anhält.

Bi-transgene Mäuse, die entweder ΔFosB oder CREB im erwachsenen Striatum überexprimieren, zeigen viele der biochemischen und Verhaltens-Phänotypen, die bei Tieren auftreten, die wiederholt Psychostimulanzien oder anderen Drogen ausgesetzt sind. EINBei der Analyse von Genexpressionsänderungen in diesen transgenen Tieren wurden zahlreiche Gene identifiziert, die durch kurzzeitige (2-Wochen) Überexpression von ΔFosB hochreguliert wurden, Änderungen, die mit einer gleichzeitigen Abnahme der Wirkstoffbelohnung verbunden sind. Die Veränderungen der Genexpression und Verhaltensreaktion mit kurzfristigem ΔFosB waren bemerkenswert ähnlich denen, die bei Tieren beobachtet wurden, die CREB für 2- oder 8-Wochen überexprimierten (McClung und Nestler, 2003). Im Gegensatz dazu verringerte die langfristige Überexpression (8-Wochen) von ΔFosB die Expression vieler dieser gleichen Gene und führte zu einer Erhöhung der Wirkstoffbelohnung (Kelz et al., 1999; McClung und Nestler, 2003).

Ein in diesen Studien identifiziertes Gen ist Cholecystokinin (Cck), ein Neuropeptid, das in mehreren Hirnregionen produziert wird, einschließlich des Striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK kann die dopaminerge Übertragung modulieren (Vaccarino, 1992) ist an der Belohnung und Verstärkung von Medikamenten beteiligt (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002) und wird durch chronisches Kokain im Striatum induziert (Ding und Mocchetti, 1992). Zusätzlich die Cck Es wurde gezeigt, dass der Promotor sowohl auf CREB- als auch auf AP-1-Komplexe reagiert (Haun und Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Da viele der Gene (einschließlich Cck), die eine erhöhte Expression sowohl nach CREB als auch nach der kurzzeitigen ΔFosB-Expression zeigten, waren bekannte oder vermutete CREB-Zielgene (McClung und Nestler, 2003) wollten wir herausfinden, ob die kurzfristige ΔFosB-Expression zur Regulierung dieser Gene führt (mit Fokus auf Cck) durch die Regulierung von CREB oder durch komplexere Mechanismen der Genregulation.

ERGEBNISSE

Durch die Überexpression von ΔFosB werden die CREB-Werte vorübergehend erhöht

Wir verwendeten Western-Blotting, um zu untersuchen, ob die ΔFosB-Überexpression die CREB-Protein-Spiegel im Striatum von Mäusen erhöht. Für diese Studie verwendeten wir bi-transgene Mäuse (Linie 11A), die sowohl ein NSE-tTA-Transgen als auch ein TetOp-ΔFosB-Transgen tragen. In Abwesenheit von Doxycyclin zeigen diese Mäuse eine robuste Zunahme der ΔFosB-Expression in den Dynorphin-positiven Neuronen im Striatum (Kelz et al., 1999). Diese Methode der Überexpression von ΔFosB wurde ausführlich dokumentiert und ermöglicht eine regionalspezifische Überexpression, die der ΔFosB-Induktion von Tieren entspricht, die chronischem Kokain ausgesetzt sind (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Wir fanden heraus, dass in 11A-Mäusen, die ΔFosB überexprimieren, die CREB-Proteingehalte nach 2-Expressionswochen signifikant hochreguliert wurden und diese Werte nach 8-Expressionswochen wieder auf den Ausgangswert zurückkehrten (Abbildung 1An = 8). Um festzustellen, ob die Änderungen der CREB-Spiegel mit kurzfristiger ΔFosB-Überexpression in einem anderen System repliziert werden konnten, haben wir ΔFosB in PC12-Zellen vorübergehend überexprimiert und festgestellt, dass die CREB-Spiegel im Vergleich zu Kontrollen signifikant anstiegen (p <0.05) (Abbildung 1B, n = 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die kurzfristige & Dgr; FosB-Expression die CREB-Protein-Spiegel erhöht.

Die CREB-Spiegel nehmen mit der Überexpression von ΔFosB zu. Western Blot Analyse von Lysaten aus (A) Mausstriata aus 11A - Mäusen aus Dox für 2 oder 8 Wochen oder (B) PC12-Zellen, die ΔFosB überexprimieren. Daten in A werden als prozentuale Veränderung in off dox verglichen ...

Sowohl ΔFosB als auch CREB binden an Promotoren spezifischer Zielgene im Striatum nach kurzfristiger ΔFosB-Überexpression

Wir verwendeten ChIP-Tests (Chromatin-Immunopräzipitation) von striatalem Gewebe, um zu bestimmen, ob die Bindung von ΔFosB oder CREB an bestimmten Zielgen-Promotoren erfolgte und ob diese Bindung nach einer kurzzeitigen Überexpression von ΔFosB erhöht war. Wir haben die Bindung am analysiert BDNF mit einem Cck Promotoren, da beide Gene nach kurzfristiger ΔFosB-Überexpression, CREB-Überexpression oder chronischer Kokainbehandlung (McClung und Nestler, 2003). Wir haben auch die Bindung an der analysiert CDK5 Promotor, da es ein bekanntes direktes Ziel von ΔFosB ist (Chen et al., 2000; Bibb ua, 2001; Kumaret al., 2005). Zum Schluss haben wir die Bindung am gemessen Prodynorphin Promotor, da in früheren Studien festgestellt wurde, dass es unter verschiedenen Bedingungen sowohl von ΔFosB als auch von CREB gebunden werden kann (Andersson et al., 2001; Zachariouet al., 2006).

Die ChIP-Analyse wurde an Striata von 11A-Mäusen durchgeführt, die ΔFosB über 2-Wochen überexprimierten, wobei Antikörper verwendet wurden, die CREB oder ΔFosB erkennen. Unter normalen Bedingungen haben wir festgestellt, dass ΔFosB an das bindet CDK5 mit einem Prodynorphin Promotoren, während es keine nachweisbare Bindung an der gibt BDNF or Cck Förderer (Tabelle 1). Darüber hinaus erhöhte ΔFosB Überexpression die Bindung von ΔFosB am CDK5 Veranstalter, aber nicht am Prodynorphin Promoter. Als nächstes haben wir die CREB-Bindung an diesen Promotoren gemessen und festgestellt, dass CREB an das bindet CDK5, BDNF mit einem Prodynorphin Förderer, aber nicht auf die Cck Promotor im normalen Striatum und die ΔFosB-Überexpression für 2-Wochen erhöht die CREB-Bindung am BDNF mit einem Prodynorphin Förderer, aber nicht die CDK5 Promoter. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass ΔFosB und CREB beide an bestimmte Genpromotoren wie z. B. binden können Prodynorphin mit einem CDK5Die CREB-Bindung ist jedoch spezifisch für andere Promotoren wie z BDNF. Darüber hinaus führt die ΔFosB-Überexpression wie erwartet zu einer Erhöhung der ΔFosB-Bindung bei bestimmten Promotoren, aber auch zur CREB-Bindung an spezifische Promotoren, was mit der zu diesem Zeitpunkt beobachteten ΔFosB-vermittelten CREB-Induktion übereinstimmt.

Bindung von putativen regulatorischen Proteinen an verschiedene Promotoren in Mäusen, die ΔFosB zwei Wochen lang überexprimieren.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Änderungen der Genexpression, die durch langfristige ΔFosB-Überexpression induziert werden, mit Chromatinmodifikationen, insbesondere Acetylierung von Histon H3, an spezifischen Genpromotoren (Kumaret al., 2005). Um zu bestimmen, ob dies auf Änderungen der Genexpression bei einer kürzeren ΔFosB-Überexpression zurückzuführen ist, haben wir die Bindung von acetyliertem Histon H3 (einer mit transkriptional aktivem Chromatin assoziierten Histonmodifikation) oder einem methylierten Histon H3 (Lys9, einer mit Transkription assoziierten Histonmodifikation) gemessen inaktives Chromatin). Wir fanden heraus, dass die Überexpression von ΔFosB für 2-Wochen bei keinem der untersuchten Genpromotoren zu Bindungsänderungen von acetyliertem H3 führte (Tabelle 1). Wir fanden eine signifikante Abnahme der Bindung von methyliertem Histon H3 am Prodynorphin Veranstalter, aber keine Bindung an den Cck Veranstalter und keine Änderung der Bindung am CDK5 mit einem BDNF Promotoren, was darauf hindeutet, dass dies kein allgemeiner Mechanismus ist, durch den ΔFosB kurzfristig die Genexpression reguliert. Wir waren überrascht und daran interessiert, dass wir in unseren ChIP-Assays keine Unterschiede fanden, die für die Erhöhung von verantwortlich sind Cck mRNA-Expression in den 11A-Mäusen nach 2-Wochen der ΔFosB-Expression und beschloss, diesen Mechanismus weiter zu untersuchen.

Kurzfristig erhöht sich ΔFosB Cck Ausdruck in mehreren Systemen

Microarray-Charakterisierung von bi-transgenen 11A-Mäusen, die ΔFosB im Striatum überexprimieren, fand dies Cck Die Expressionsniveaus steigen nach 2-Wochen der Überexpression an und nehmen dann mit längeren Zeiträumen der ΔFosB-Expression allmählich ab (Abbildung 2A, n = 3). Wir haben diesen Effekt für validiert Cck mit Echtzeit-PCR an einer separaten Gruppe von Tieren in den Wochen 2 und 8 und stellte fest, dass die Ergebnisse zu den beiden Zeitpunkten der Microarray-Analyse ähnelten (Daten nicht gezeigt).

Die kurzfristige Überexpression von ΔFosB nimmt zu Cck Genexpression. (A) Cck mRNA-Expression im Striatum nach ΔFosB-Überexpression in 11A-Mäusen für 1-, 2-, 4- oder 8-Wochen. Die Microarray-Analyse wurde an striatalen Proben und durchgeführt Cck Level ...

Weitere Untersuchung der Regulierungsfähigkeit von ΔFosB Cck Expression verwendeten wir PC12-Zellen, die transient mit a transfiziert wurden Cck-Luciferase-Reporterplasmid und entweder ein ΔFosB-Expressionsplasmid oder eine gleiche Menge an pCDNA. Sowohl zwei (n = 5-9) als auch drei (n = 11-13) Tage der ΔFosB-Überexpression führten zu einem signifikanten Anstieg der Cck-Luciferase-Expression. Darüber hinaus führte eine dreitägige Überexpression von ΔFosB zu einer signifikanten Steigerung Cck-Luciferase-Induktion im Vergleich zu zwei Tagen Überexpression (Abbildung 2B). Die Überexpression von ΔFosB induzierte nicht die Expression eines Promoterless-Luciferase-Konstrukts (Daten nicht gezeigt). Unter keinen Behandlungsbedingungen war eine Reduktion von Cck-Luciferaseaktivität offensichtlich. Diese Ergebnisse zeigen, dass die kurzfristige ΔFosB-Expression die Aktivität von erhöht Cck Promotor und lässt den Mechanismus unbeantwortet, durch den die langfristige ΔFosB-Überexpression unterdrückt wird Cck Ausdruck.

ΔFosB Überexpression erhöht die Bindung an einer putativen CREB-Bindungsstelle im Cck Promoter

Unsere Analysen haben das gefunden Cck Die Expression ist nach kurzfristiger ΔFosB-Expression erhöht, jedoch haben unsere ChIP-Assays festgestellt, dass weder CREB noch ΔFosB an das bindet Cck Promoter. Um festzustellen, ob es an der Proteinbindung irgendwelche Veränderungen gibt Cck Promotor nach ΔFosB-Überexpression verwendeten wir elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) mit einer Sonde, die die putative CRE-ähnliche Stelle enthielt, die in der vorhanden ist Cck Promoter. Unter Verwendung von Kernextrakten aus Striata von 11A-Mäusen, die ΔFosB für 2-Wochen überexprimierten, fanden wir eine Zunahme der Bindung an die putative CRE-Stelle in der Cck Förderer (Abbildung 3 A, C, n = 4). Interessanterweise überexprimieren 11A-Mäuse ΔFosB für 8-Wochen, die eine Abnahme von zeigen Cck Ausdruck, zeigte auch eine erhöhte Bindung an dieser Stelle (Abbildung 3B, C, n = 4). Zum Vergleich untersuchten wir die Bindung an eine Consensus-CRE-Stelle in Mäusen, die ΔFosB für 2-Wochen überexprimierten, und fanden eine robuste CRE-Bindung in Striatalextrakten, jedoch keine Erhöhung der Bindung nach der Induktion von ΔFosB (Abbildung 3F, n = 4). Trotz eines durch ΔFosB induzierten Anstiegs der gesamten CREB-Spiegel zu diesem Zeitpunkt stimmen diese Ergebnisse mit unseren ChIP-Assays überein, die feststellen, dass eine erhöhte CREB-Bindung an Promotoren nach einer ΔFosB-Überexpression nur für bestimmte Gene spezifisch ist und kein globales Phänomen ist . Um festzustellen, ob CREB an das gebunden ist Cck Promotor In unserer EMSA-Analyse führten wir Supershift-Assays mit einem CREB-spezifischen Antikörper durch. In Übereinstimmung mit unseren ChIP-Assays fanden wir keine Bindung von CREB an a Cck Probe, die die putative CRE-Stelle in EMSA-Assays enthielt, während CREB eine Consensus-CRE-Stelle signifikant binden und überschieben hat (Abbildung 3D, E, n = 4). Die DNA-Bindungsaktivität am Cck Der Promotor wurde auch nicht durch einen Antikörper gegen & Dgr; FosB (Daten nicht gezeigt) beeinflusst, unter Bedingungen, die in mehreren früheren Studien gezeigt wurden, um die Bindung von & Dgr; FosB an günstige AP-1-Stellen zu blockieren (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Wir führten auch ChIP-Assays mit Striata von 11A-Tieren nach 8-Wochen der ΔFosB-Expression durch und fanden immer noch keine Bindung von CREB oder ΔFosB am Cck Promotor (Daten nicht gezeigt). Somit führt die ΔFosB-Expression zu einer Erhöhung der Proteinbindung am Cck Promotor nach 2- und 8-Wochen der Expression; Die Identität dieser Faktoren bleibt jedoch unbekannt.

Proteinbindung am Cck Promoter. (A, B) Elektrophoretischer Verschiebungsassay unter Verwendung des Cck CRE-ähnliche Stelle mit striatalem Gewebe von Tieren, die ΔFosB für 2-Wochen (A) oder 8-Wochen (B) überexprimieren. In (A) Wettbewerb mit übermäßigem, nicht gekennzeichnetem Wettbewerber ...

Die vermeintliche CRE-Site in der Cck Der Promotor ist nicht verantwortlich für eine erhöhte Promotoraktivität

Da fanden wir eine Erhöhung der Proteinbindung mit einem Fragment der Cck Der Promotor, der die mutmaßliche CRE-Site enthält, sollte nach einer ΔFosB-Überexpression festgestellt werden, ob diese Site für die Erhöhung erforderlich ist Cck Ausdruck nach ΔFosB-Überexpression. Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir PC12-Zellen mit a transfiziert Cck-Luciferase-Plasmid, das seine intakte CRE-ähnliche Stelle enthält, oder eine, die eine Mutation in der Stelle enthält, die jegliche Interaktion mit CREB aufheben würde. Interessanterweise nahm die Mutation der CRE-ähnlichen Stelle basal ab Cck Promotoraktivität um 32% (Abbildung 4A, n = 9), beeinflusste jedoch nicht Cck Induktion des Promotors durch ΔFosB-Überexpression (Abbildung 4B, n = 11-13). Dies deutet darauf hin, dass die Cck Für den Promotor ist eine intakte CRE-ähnliche Stelle für die vollständige Basisaktivität erforderlich. Die durch ΔFosB-Überexpression induzierte erhöhte Promotoraktivität erfordert nicht die CRE-ähnliche Sequenz.

Die Cck-wie CRE-Site ist nicht erforderlich Cck Induktion durch ΔFosB. (A) Cck-Luciferase-Aktivität wurde 2 Tage nach Transfektion mit einem der beiden Normalwerte gemessen Cck-Luciferase oder eine, in der die CRE-ähnliche Stelle mutiert war. * p <0.05 (B) Cck-luciferase ...

cFos bindet an das Cck Promoter

Frühere Studien haben das gefunden cFos Die mRNA steigt mit der kurzfristigen ΔFosB-Expression an, jedoch wird nach längerer ΔFosB-Expression die Fähigkeit der Kokainbehandlung, cFos im Striatum zu induzieren, verringert (McClung und Nestler, 2003; Renthalet al., 2008). Daher kann es möglich sein, dass cFos zur Steigerung von beiträgt Cck Ausdruck nach kurzfristiger ΔFosB-Expression. Wir haben ChIP-Assays mit einem für cFos spezifischen Antikörper durchgeführt und die cFos-Bindung am gemessen Cck Promotor mit und ohne kurzfristige ΔFosB-Expression. Während wir festgestellt haben, dass cFos an das bindet Cck Promotor, diese Bindung stieg nach der Überexpression von ΔFosB nicht signifikant an (Figure 5, n = 5). Dies legt nahe, dass da cFos das bindet Cck Projektträger, kann es zur allgemeinen Regulierung von Cck Ausdruck, aber es ist wahrscheinlich nicht an der Regulierung der beteiligt Cck Promotor durch ΔFosB.

cFos bindet an das Cck Promoter. Immunpräzipitationstests mit Chromatin wurden mit einem spezifischen Antikörper für cFos unter Verwendung von striatalem Gewebe aus ΔFosB-überexprimierenden Mäusen entweder auf dox oder nach 2-Wochen der Entfernung von dox durchgeführt. Echtzeit-PCR-Analyse war ...

DISKUSSION

Diese Studie bestätigt und erweitert frühere Ergebnisse, die zeigen, dass ΔFosB die Genexpression im Striatum reguliert, und wir stellen fest, dass dies nach kurzfristiger Expression durch mehrere Mechanismen geschieht. Wir zeigen, dass ΔFosB nach 2-Wochen der Überexpression in bestimmten Genen direkt an die Promotoren bindet, was zu Änderungen der Expression führt (d. H CDK5). Darüber hinaus erhöht es den CREB-Proteinspiegel, eine Wirkung, die sowohl in kultivierten Zellen als auch im Striatum beobachtet wird, was zu einer erhöhten CREB-Bindung bei anderen Genpromotoren führt (d. H Dynorphin mit einem BDNF). In einer früheren Studie haben wir herausgefunden, dass eine kurzfristige Überexpression von ΔFosB in Striatum zu den gleichen Genexpressionsänderungen führt, die bei einer Überexpression von CREB festgestellt werden, und zu ähnlichen Verhaltensreaktionen bei Messungen der Kokainpräferenz führt (McClung und Nestler, 2003). Somit hilft die vorliegende Feststellung, dass ΔFosB zu einer Induktion von CREB sowie zur Bindung von CREB an bestimmte Genpromotoren führt, zu erklären, warum so viele der Genexpressionsänderungen von diesen beiden Transkriptionsfaktoren gemeinsam genutzt wurden.

Die Induktion von CREB durch ΔFosB ist interessant, da gezeigt wurde, dass Missbrauchsmedikamente Veränderungen der 133-phosphorylierten Serin-CREB-Spiegel induzieren (Mattson et al., 2005) und die CRE-vermittelte Transkription erhöhen (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchmanet al., 2002, 2003), ohne das Gesamtniveau von CREB zu ändern. Es ist möglich, dass Änderungen der CREB-Spiegel vorübergehend sind und daher in anderen Studien leicht übersehen werden. In unseren Händen haben wir in bestimmten Experimenten Kokain-induzierte Erhöhungen der CREB-mRNA beobachtet, dieser Effekt ist jedoch sehr unterschiedlich (unveröffentlichte Beobachtung). Da sowohl die transgenen 11A-Mäuse als auch die PC-12-Zellen nach einer kurzzeitigen ΔFosB-Überexpression eine CREB-Induktion zeigen, deutet dies darauf hin, dass CREB tatsächlich durch ΔFosB (oder ein Ziel von ΔFosB) induziert wird Ausdruck.

Überraschenderweise haben wir festgestellt, dass weder CREB noch ΔFosB an das bindet Cck Promoter obwohl Cck Die Expression ist nach der kurzfristigen ΔFosB-Expression deutlich hochreguliert. Cck ist ein reichlich vorhandenes Neuropeptid, das sowohl in VTA als auch in NAc exprimiert wird (Hokfelt et al., 1980) und ist wahrscheinlich an Verhaltensreaktionen auf Drogenmissbrauch beteiligt (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). In Zellkultur-Assays wird der Cck Der Promotor wurde umfassend charakterisiert und erwies sich als ansprechend auf die Mitglieder der CREB - und AP - 1 - Familie (überprüft durch Hansen, 2001). Haun und Dixon (1990) zeigten, dass AP-1-Komplexe an das binden können Cck CRE-ähnliche Site in vitround es wurde später unter Verwendung von SK-N-MC-Neuroblastomzellen gezeigt, dass die Mutation der CRE-ähnlichen Stelle die Promotorreaktion auf überexprimiertes cFos / cJun reduzierte (Rourke et al., 1999). In der Tat finden wir auch vermehrt Cck Projektträgeraktivität (Figure 2) und Bindung am oder um das CRE-ähnliche Element (Figure 3) bei Überexpression von ΔFosB, einem anderen Mitglied der AP-1-Familie, aber wir finden keine direkte Bindung von ΔFosB an das Cck Promoter in vivo or in vitroauch bei seiner Überexpression.

Viel Arbeit hat gezeigt, dass CREB bei der Regulierung von Cck Promotoraktivität. Das Cck CRE-ähnliche Stelle wird über die Wirbeltiere hinweg konserviert (Hansen, 2001) und in einigen Zellkultur-Assays binden sowohl CREB- als auch AP-1-Komplexe an diese Stelle und sind dafür notwendig Cck Projektträgeraktivität (Haun und Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Außerdem sind mehrere Aktivatoren von bekannt Cck Es wurde gezeigt, dass die Expression (einschließlich bFGF, PACAP, Peptonen und Depolarisation) über CREB wirkt (Hansen et al., 1999; Deavall et al., 2000; Bernard et al., 2001; Gevrey et al., 2002; Hansen et al., 2004). Unsere Cck-Luciferase-Reporter-Gen-Daten unterstützen eine wichtige Rolle für die CRE-ähnliche Stelle bei der Regulation von Cck Promotoraktivität, da die Mutation dieser Stelle basal reduziert Cck Promotoraktivität und CckDie durch VP16-CREB, eine konstitutiv aktive Form von CREB, induzierte Expression von Luciferase geht verloren, wenn diese Stelle mutiert wird (unveröffentlichte Beobachtung). Daher waren wir überrascht, dass CREB anscheinend nicht an das bindet Cck Promotor in striatalen Extrakten entweder bei Studienbeginn oder bei kurzfristiger ΔFosB-Überexpression, wenn die CREB-Spiegel erhöht werden. Dies argumentiert die CREB-Stufen an sich Dies ist nicht der einzige Faktor bei der Bestimmung der Bindungsmenge an dieser Site. Dies wird durch die Arbeit anderer unterstützt (Cha-Molstad et al., 2004). Da die Promotoren anderer, zuvor identifizierter CREB-Target-Gene, wie z BDNF mit einem Prodynorphinhaben CREB gebunden, wir sind zuversichtlich, dass CREB nicht an das bindet Cck Promotor in striatalen Kernextrakten. Weiterhin ist die Induktion von Cck-Luciferase-Aktivität durch ΔFosB war nicht von der intakten CRE-ähnlichen Stelle abhängig, was darauf hindeutet, dass ΔFosB nicht reguliert Cck Ausdruck durch Regulieren der direkten Bindung von CREB an die Cck Promoter.

Unsere Unfähigkeit, CREB zu erkennen, die mit dem interagieren Cck Veranstalter wird unterstützt von Renthal et al. (2009), die einen ChIP-Chip-Ansatz verwendeten, um globale Veränderungen der phosphorylierten CREB (pCREB) - und ΔFosB-Bindung im Striatum nach chronischer Kokain-Exposition zu untersuchen. In diesen Experimenten wurden DNA-Protein-Komplexe mit ΔFosB- oder pCREB-Antikörpern immunpräzipitiert und die präzipitierte DNA nach Markierung mit einem Promotor-Microarray hybridisiert. Während viele zuvor charakterisierte CREB-Zielgene mit diesem Ansatz identifiziert wurden (z. B. BDNF, Prodynorphin), Cck wurde nicht identifiziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Bindung von CREB an eine Consensus-CRE-Stelle zwischen den kultivierten Zelllinien stark variiert (Cha-Molstad et al., 2004). Alle früheren Studien, in denen CREB - Interaktionen mit der Cck Der Promotor wurde in Zellkultur durchgeführt (nicht im Gehirn, von dem unsere EMSA- und ChIP-Proben abgeleitet wurden) und verwendete Gel-Shift-Assays, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen. Während eine EMSA das Potenzial eines Faktors zur Bindung an eine DNA-Sequenz beurteilen kann, bieten ChIP-Assays einen neuen Blick auf diese Wechselwirkungen in vivo. Darüber hinaus zeigen viele der Daten entweder Induktion von Cck Promotoraktivität oder CREB-Bindung an die Cck Promotor wurden aus Zellen erhalten, die durch Faktoren wie Peptonen stimuliert wurden (Bernard et al., 2001), Depolarisation (Hansen et al., 2004) oder eine Vielzahl von Aktivatoren intrazellulärer Signalkaskaden einschließlich cAMP und ERK (Hansenet al., 1999). In unseren Experimenten war der einzige "Stimulus" die Überexpression von ΔFosB, die zur Induktion ausreicht Cck Ausdruck. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass die Fähigkeit von CREB besteht, an das zu binden (und möglicherweise zu regulieren) Cck Der Promotor hängt stark vom Zelltyp und der Aktivierung bestimmter Signalwege ab. Zusätzlich die Cck Das CRE-ähnliche Promotorelement (zumindest in nicht-induzierten PC12-Zellen und im Mausstriatum) ist kein direktes Ziel von CREB oder ΔFosB. Interessanterweise ist die Regulierung von FosB Die Expression durch CREB ist auch spezifisch für den Zelltyp und die Art der Stimulation. Eine Studie von Andersson et al. fanden heraus, dass die Injektion von CREB-Antisense-Oligonukleotiden in das Mäuse-Striatum die Induktion von FosB folgende Kokainverabreichung (Andersson et al., 2001). Sie fanden jedoch auch die Fähigkeit von L-Dopa zu induzieren FosB Die Expression in 6-OHDA-läsiertem Striatum wurde nicht durch die Anwesenheit von CREB-Antisense-Oligonukleotiden beeinflusst.

Da CREB und ΔFosB das indirekt zu regulieren scheinen Cck Promotor und Veränderungen in der Chromatinstruktur wurden als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen dokumentiert, die ΔFosB induzieren (Tsankova et al., 2004; Kumaret al., 2005; Renthalet al., 2008), schlussfolgerten wir, dass ΔFosB die Promotoraktivität indirekt durch Veränderung der Chromatinstruktur modulieren könnte. Bei Mäusen, die ΔFosB für 2-Wochen überexprimierten, trat jedoch keine Änderung der Histon-H3-Acetylierung an der Mäuse auf Cck Förderer (Tabelle 1). Dies wird durch die ChIP-Chip-Daten von unterstützt Renthal et al. (2009), der keine Veränderung der acetylierten H3 - Bindung am Cck Promotor bei Mäusen, die chronischem Kokain ausgesetzt sind. Seit der Cck Da der Promotor im Striatum aktiv ist, wurde keine repressive methylierte Histon-H3-Bindung erwartet oder beobachtet. Interessanterweise haben wir auch keine Veränderung aufgrund der ΔFosB-Überexpression in der acetylierten H3-Bindung am beobachtet BDNF Promotor (der eine erhöhte CREB-Bindung zeigte) oder am CDK5 mit einem Prodynorphin Promotoren (die eine erhöhte Bindung von ΔFosB zeigten). Da es eine Vielzahl von Histon - Modifikationen gibt, die mit Änderungen der Promotoraktivität zusammenhängen (überprüft von Rando und Chang, 2009) gibt es wahrscheinlich andere Chromatinmodifikationen, die mit der Induktion dieser Gene zusammenhängen. Jede einzelne Chromatin-Modifikation kann sich, obwohl sie häufig das Ausmaß der Promotoraktivität vorhersagt, während der Aktivierung eines bestimmten Gens nicht ändern. In zukünftigen Arbeiten wäre es interessant, andere mögliche Änderungen in der Chromatinstruktur in der Umgebung von Cck Promotor nach ΔFosB-Überexpression. Interessanterweise chronisches Kokain (wahrscheinlich ΔFosB-Induktion) induziert die Expression von Sirtuin 1 und 2, Klasse-III-Histon-Deacetylasen, die die neuronale Physiologie, die ERK-Signalgebung und Verhaltensreaktionen auf Kokain zu beeinflussen scheinen (Renthalet al., 2009). Die Induktion einer Histon-Deacetylase hätte die Fähigkeit, gleichzeitig die Expression einer großen Anzahl von Genen zu regulieren globale Änderungen in der Chromatinstruktur.

Ein möglicher Kandidat, der beteiligt ist Cck Die Regulierung nach der Überexpression von ΔFosB war das Mitglied der AP-1-Familie cFos. Die Expression von cFos wird durch CREB reguliert (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004) und cFos Überexpression (konkordant mit Überexpression des Bindungspartners cJun) steigt Cck Projektträgeraktivität (Rourke et al., 1999). Daher könnten erhöhte CREB-Spiegel aufgrund einer kurzfristigen ΔFosB-Überexpression die cFos-Spiegel erhöhen und zu einer erhöhten Bindung an das führen Cck CRE-ähnliche Site. cfos mRNA wird in Mäusen nach zweiwöchiger Überexpression von ΔFosB induziert (McClung und Nestler, 2003) und bei Mäusen, die chronischem Kokain ausgesetzt waren, oder einer langfristigen ΔFosB-Überexpression (Renthalet al., 2008). Hier finden wir, dass cFos direkt an das bindet Cck Promotor in striatalem Gewebe, jedoch erhöht ΔFosB Überexpression die Bindung nicht signifikant. Dies legt nahe, dass cFos zwar in die Regulierung involviert sein könnte Cck Im Allgemeinen ist eine Änderung der Bindung von cFos allein nicht wahrscheinlich der Mechanismus, durch den ΔFosB reguliert Cck Ausdruck. Es ist jedoch möglich, dass ΔFosB entweder posttranslationale Änderungen in cFos induziert (z. B. eine veränderte Phosphorylierung) oder die Expression eines Bindungspartners (wie cJun) oder eines Coaktivatorproteins induziert. Da jedoch die intakte CRE-ähnliche Stelle (die zuvor als Bindungsstelle für AP-1-Komplexe gezeigt wurde, siehe Haun und Dixon, 1990) ist für die Erhöhung nicht erforderlich Cck Promotoraktivität, die bei der ΔFosB-Überexpression beobachtet wurde (wie in unseren Reportergenexperimenten beurteilt), liegt nahe, dass auch andere trans-wirkende Faktoren durch ΔFosB reguliert werden.

Die Cck Das in unseren Luciferase-Reportergenexperimenten verwendete Promotorfragment enthält eine konservierte Sp1-Bindungsstelle und eine E-Box (im Überblick von Hansen, 2002). Insbesondere wurde gezeigt, dass E-Box-Sequenzen zahlreiche Transkriptionsfaktoren binden (Übersicht von Forrest und McNamara, 2004). Mit PC12-Zellen haben wir gesehen, dass die Mutation der E-Box abnimmt Cck Promotoraktivität, ändert aber nicht die Antwort des Promotors auf ΔFosB (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise a Cck-Luciferase-Reporter, der Mutationen sowohl in der CRE-Stelle als auch in der E-Box enthält, weist keine nachweisbare Basalaktivität auf und reagiert nicht auf die Überexpression von ΔFosB (unveröffentlichte Beobachtung). Ein weiterer potenzieller Vermittler der ΔFosB-Wirkung auf die Cck Promotor sind ATFs, von denen bekannt ist, dass bestimmte Formen im Striatum durch chronische Exposition mit Psychostimulanzien induziert werden (Green et al., 2008). Wir haben jedoch keinen Beweis für die ΔFosB-Induktion dieser ATFs gefunden (Daten nicht gezeigt), und es wird nicht erwartet, dass ATFs an die mutierte CRE-ähnliche Stelle an der DNA binden Cck Promoter.

Ein Nachteil dieser Studie besteht darin, dass wir ein übertragendes System verwenden, um ΔFosB zu überexprimieren. Daher muss man konservativ sein, um Parallelen zwischen diesem Paradigma und der Verabreichung von chronischem Kokain zu ziehen. Die transgenen 11A-Mäuse bieten jedoch die einzigartige Gelegenheit, die spezifischen Auswirkungen von ΔFosB im Striatum zu untersuchen, da die Überexpression auf diese Gehirnregion beschränkt ist (Chen et al., 1998), während die Verabreichung von Kokain Veränderungen in einer Vielzahl anderer Gehirnregionen induziert, die dann indirekt das Striatum beeinflussen können. Darüber hinaus haben mehrere Studien ähnliche Verhaltens- und molekulare Phänotypen in den 11A-Mäusen im Vergleich zu nicht-transgenen Tieren dokumentiert, die mit chronischem Kokain behandelt wurden (Kelz et al., 1999; McClung und Nestler, 2003; Renthalet al., 2009). Zusätzlich, Bibb et al. (2001) berichteten über ähnliche Mengen an Striatal Cdk5 mRNA- und Proteininduktion in diesem gleichen 11A-Stamm im Vergleich zu mit Kokain behandelten, nicht transgenen Wurfgeschwistern sowie ähnlichen Änderungen in den CDK5-Targets, p35 und DARPP-32.

Zusammenfassend stellen wir fest, dass die kurzfristige Expression von ΔFosB zur Induktion von Genen im Striatum durch mehrere Mechanismen führt. Dazu gehören die direkte Promotorbindung, die Induktion von CREB-Protein und -Aktivität sowie die Chromatinmodifikation zusätzlich zu den noch zu bestimmenden Wegen.

EXPERIMENTELLE VERFAHREN

Tiere

Männliche bi-transgene 11A-Tiere (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) wurden in dieser Studie verwendet und sind in charakterisiert Kelz et al., 1999. Um ΔFosB zu überexprimieren, wurden Mäuse zwischen 3 und 6 im Alter von Doxycyclin entfernt, während Kontrollmäuse auf Doxycyclin gehalten wurden. Alle Mäuse wurden in Gruppen gehalten und in einem 12: 12-Hell / Dunkel-Zyklus gehalten, die Lichter waren bei 7 am eingeschaltet und die Lichter bei 7 pm, mit ad lib Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Mausexperimente entsprachen den Protokollen, die vom Animal Care and Use Committee des Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt wurden.

Reporter- und Expressionsplasmide

Der Wildtyp (WT) Cck Der Promotor-Luciferase-Reporter wurde durch Einfügen eines ungefähr 200-bp-PCR-Fragments in den pGL3-luc-Vektor (Promega) hergestellt. Dieses Fragment wurde aus genomischer Maus-DNA (Primer: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGCG 3' stromaufwärts und 5 'TACCTTTGGATGGGAAATCG 3' stromabwärts) erhalten und zunächst in den pGEM-T Easy-Vektor (Promega, #A1360) eingefügt. Das Promotorfragment wurde dann in die Kpn1 / Xho1-Restriktionsenzymstellen von pGL3-luc kloniert.

So erstellen Sie die CRE-Punktmutation im Cck Promotor, ein mutagener Primer, der gegen eine zuvor berichtete CRE-ähnliche Stelle gerichtet ist (Sense-Primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', Antisense-Primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') . Dadurch wird die gemeldete CRE-ähnliche Site (ACTGCGTCAGC) in ACTGAGCTCC konvertiert. Alle Reporterplasmide wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das & Dgr; FosB-Expressionsplasmid enthält eine & Dgr; FosB-Sequenz voller Länge, die in die Mehrfachklonierungsstelle von pCDNA 3.1 inseriert ist und zuvor beschrieben wurde (Ulery und Nestler, 2007).

Zellkultur und DNA-Transfektionen

Ratten-Phäochromozytom (PC12) -Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium F-12 gehalten, ergänzt mit 10% Pferdeserum, 5% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C und 5% CO₂. Die Zellen wurden durch Elektroporation unter Verwendung eines BTX 360-Elektroporators (350 V, 0 Ohm und 850 & mgr; F) in 800 & mgr; l Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung in Küvetten mit 4 mm Spalt mit 10 & mgr; g des Reporters und 5 & mgr; g des Expressionskonstrukts transfiziert. Leeres Vektorplasmid (pCDNA) wurde verwendet, um die Gesamtmenge an DNA zu normalisieren. Nach der Transfektion wurden die Zellen für die angegebenen Zeiträume auf mit 35 mm Kollagen beschichteten Schalen gezüchtet.

Luciferase-Assays

Zwei oder drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen dreimal in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und lysiert (unter Verwendung von 3 mM Glycylglycin, 25 mM MgSO)₄4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), gesammelt und durch Zentrifugation geklärt. 30 μL Lysat wurde mit 140 μL Luciferase Assaypuffer (25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO) kombiniert₄4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM Kaliumphosphat, 1 mM Coenzym A, pH 7.8). Die Lumineszenzaktivität wurde unter Verwendung eines FLx-800-Mikroplatten-Fluoreszenz-Lesegeräts nach einer automatisierten Injektion von 40 μL 1 mM Luciferin pro Vertiefung gemessen. Die Luciferase-Aktivität wurde auf den Gesamtproteingehalt normalisiert, wie durch einen BioRad-Proteinassay bestimmt wurde.

Assay zur elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung

Kernextrakte aus bilateralen Striatumschnitten aus bi-transgenen 11A-Mäusen (die auf XYUMX- oder 2-Wochen auf oder außerhalb von Doxycyclin erhalten wurden) (McClung und Nestler, 2003) wurden entsprechend vorbereitet Huang und Walters (1996). ³²P-markierte doppelsträngige Oligonukleotidsonden wurden unter Verwendung des Promega-Gel-Shift-Assay-Systemprotokolls (#E3300) hergestellt und die Sonden wurden unter Verwendung von Roche Quick Spin Columns gereinigt. Die Konsensus-CRE- und AP-1-Sondensequenzen stammten von Promega (#E328A bzw. E320B) und der Cck CRE-Sequenzen waren (Cck-CRE-Sense: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE-Antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTTT).

Bindungsreaktionen und Elektrophorese wurden unter Verwendung von Modifikationen des Promega Gel Shift Assay-Systemverfahrens (#E3300) durchgeführt. 50,000 CPM der markierten Sonde wurde mit 10 μg striatalem Kernextrakt kombiniert. Kalte Konkurrenz-DNA oder -Antikörper wurden vor der Einführung der radioaktiv markierten Sonden zugegeben. Für Supershift-Experimente wurde 2 μg CREB-Antikörper (Upstate Biotechnology # 06-083) verwendet. Die Reaktionen wurden auf 4-Polyacrylamid-Gelen elektrophoretisiert, getrocknet und einem Film ausgesetzt (unter Verwendung von Verstärkungssieben für 1-Stunde bis 2-Tage).

Immunoblotting

Für PC12-Zellen wurden 35 mm-Platten transfizierter Zellen in eiskalter Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und Lysate in eiskaltem RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Desoxycholat, 1) hergestellt % Triton X-100, 0.1% Natriumdodecylsulfat) mit Proteaseinhibitoren. Nach Ultraschallbehandlung, Clearing und Bradford-Protein-Assay wurden die Lysate vollständig denaturiert und 50 & mgr; g jeder Probe wurden auf 10% SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran übertragen, 1 Stunde lang in 3% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Salzlösung, die 0.1% Tween-20 (TBS-T-Milch) enthielt, blockiert und über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern (CREB-) untersucht. Upstate Biotechnology # 06-083, verwendet bei 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, verwendet bei 1: 80,000), verdünnt in TBS-T-Milch. Nach mehrmaligem Waschen in TBS-T wurden die Blots eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Verwendung von alkalischen Phosphatase-konjugierten Sekundärantikörpern (Sigma) untersucht, die 1: 5,000 in TBS-T-Milch verdünnt waren. Nach mehrmaligem Waschen in Tris-gepufferter Salzlösung wurde die Farbreaktion gemäß den Anweisungen von BioRad (Nr. 170-6432) durchgeführt. Die Membranen wurden über Nacht getrocknet, auf einem Flachbettscanner gescannt und die Densitometrie unter Verwendung von ImageJ durchgeführt (siehe unten).

Für striatale Extrakte wurden Western-Blot-Assays wie zuvor veröffentlicht durchgeführt (Hope et al., 1994). Gewebe wurde von enthaupteten Mäusen entnommen, auf Eis gelegt und auf einer Gehirnmatrix mit einer Dicke von 1 mm geschnitten. Dann wurden Gewebestempel genommen und bis zur Verwendung bei -80 ° C eingefroren. Das Gewebe wurde auf Eis in einem modifizierten Detergenspuffer mit Phosphatase- und Proteaseinhibitoren (Roche, Sigma) beschallt. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Proben in kochendem Wasser denaturiert und bei 15,000xg für 15 Minuten zentrifugiert; Überstand wurde anschließend gesammelt und verarbeitet; Die Proteinkonzentrationsmengen wurden dann unter Verwendung eines Bradford-Assays (Bio-Rad) quantifiziert. Die Proben wurden auf einem 10% Acrylamid / Bisacrylamidgel laufen gelassen, auf eine PVDF-Membran übertragen, in 5% Milch geblockt und mit primären Antikörpern (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY) inkubiert. Anschließend wurden die Blots mit einem Chemilumineszenzsystem (Pierce) sichtbar gemacht. Alle Proben wurden auf GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA) normiert. Es wurden Standardkurven erstellt, um sicherzustellen, dass wir uns im linearen Bereich des Assays befinden.

Densitometrie-Analyse

Für PC12-Immunoblots wurde eine Densitometrieanalyse unter Verwendung von ImageJ mit Rodbard-Kalibrierung durchgeführt. Das durchschnittliche Hintergrundsignal wurde von jeder Messung abgezogen und das Verhältnis von CREB zu GAPDH-Signal wurde für jede Probe berechnet. Für striatale Immunoblots und die EMSA-Analyse wurde Scion Image 1.62c mit Hintergrundsubtraktion verwendet.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

ChIP-Assays wurden nach den Methoden von durchgeführt Tsankova et al. (2004) mit einem Kumar et al. (2005). Kurz gesagt wurden bilaterale Striatalproben von 11A-Mäusen, die auf oder neben Doxycyclin gehalten wurden, mit 1% Formaldehyd vernetzt und die Vernetzung wurde mit Glycin gequencht (Endkonzentration von 0.125 M). Diese Proben stammten aus ganzen Hirnschnitten, die auf Höhe des Nucleus accumbens entnommen wurden, wobei der Cortex entfernt wurde. Chromatin wurde durch Ultraschallbehandlung auf ungefähr 0.2 bis 1 kb Fragmente geschert, mit Protein G-Kügelchen (Thermo Scientific # 22852) geklärt und Eingangsproben bei -80ºC eingefroren. Für jede Fällung wurden zwischen 60 und 100 µg Chromatin verwendet. Von jedem Primärantikörper wurden 5-10 μg verwendet (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetyliertes H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methyliertes H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Antikörper-Chromatin-Komplexe wurden mit Protein G plus Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Scientific # 22852) immunpräzipitiert. Nach der umgekehrten Vernetzung der eingegebenen und präzipitierten Proben wurde jede Probe einer quantitativen PCR (qPCR) unterzogen. Die Verwendung all dieser Antikörper für ChIP wurde umfassend validiert (Tsankova et al., 2004; Kumaret al., 2005; Renthalet al., 2009).

Die Proteinbindungsniveaus an jedem interessierenden Genpromotor wurden durch Messen der Menge an assoziierter DNA durch qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA) bestimmt. Input- oder Gesamt-DNA (nicht immunpräzipitiert) und immunopräzipitierte DNA wurden dreifach in Gegenwart von SYBR Green (Applied Biosystems, CA) amplifiziert. Ct-Werte von jeder Probe wurden mit der Sequence Detector 1.1-Software erhalten. Die relative Quantifizierung der Template-DNA wurde mit der ΔΔCt-Methode durchgeführt (Tsankova et al., 2004). Verwendete Primer: BDNF-Promotor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5-Promotor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck-Promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin-Promotor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

statistische Analyse

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Der statistische Unterschied wurde durch den zweiseitigen t-Test von Student bestimmt (p <0.05). Bei mehreren Vergleichen wurden die p-Werte unter Verwendung der Bonferroni-Korrektur angepasst.

Danksagungen

Wir möchten uns bei Will Renthal und Arvind Kumar für hilfreiche Diskussionen bedanken. Wir möchten uns auch bei NIDA für die Finanzierung dieser Experimente bedanken.

Fußnoten

Haftungsausschluss des Herausgebers: Dies ist eine PDF-Datei eines unbearbeiteten Manuskripts, das zur Veröffentlichung angenommen wurde. Als Service für unsere Kunden stellen wir diese frühe Version des Manuskripts zur Verfügung. Das Manuskript wird vor der Veröffentlichung in seiner endgültigen zitierfähigen Form einer Vervielfältigung, einem Satz und einer Überprüfung unterzogen. Bitte beachten Sie, dass während des Produktionsprozesses Fehler entdeckt werden können, die sich auf den Inhalt auswirken können, und alle rechtlichen Disclaimer, die für das Journal gelten.

Klassifizierungsbedingungen:

Abschnitt: #1 Zelluläre und molekulare Biologie von Nervensystemen

Referenzen

Andersson M., Konradi C., Cenci, MA. Das cAMP-Antwortelement-Bindungsprotein ist für die Dopamin-abhängige Genexpression im intakten, nicht aber im Dopamin-denervierten Striatum erforderlich. J Neurosci. 2001; 21: 9930 – 43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, O Berton, Eisch AJ, Impey S, DR Storm, Neve RL, Yin JC, V. Zachariou, Nestler EJ. Die CREB-Aktivität in der Nucleus Accumbens-Schale kontrolliert die Steuerung der Verhaltensreaktionen auf emotionale Reize. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435-40. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Die Behandlung mit Kokain erhöht das extrazelluläre Cholecystokinin (CCK) im Nucleus Accumbens von wachen, sich frei bewegenden Ratten, ein Effekt, der bei verhaltensempfindlichen Ratten gegenüber Kokain verstärkt wird. J Neurochem. 2002; 81: 1021 – 7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones stimulieren die intestinale Cholecystokinin-Gentranskription über zyklische Adenosinmonophosphat-Reaktionselement-Bindungsfaktoren. Endokrinologie. 2001; 142: 721 – 9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Die Auswirkungen der chronischen Kokainbelastung werden durch das neuronale Protein Cdk5 reguliert. Natur. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, DM Keller, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Zelltyp-spezifische Bindung des Transkriptionsfaktors CREB an das cAMP-Response-Element. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572-7. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hoffnung BT, Nestler EJ. Regulation von Delta-FosB- und FosB-ähnlichen Proteinen durch Elektrokrampfanfälle und Kokainbehandlungen. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880 – 9. [PubMed]
Chen J, MB Kelz, G. Zeng, N. Sakai, C. Steffen, PE Shockett, MR Picciotto, RS Duman, EJ Nestler. Transgene Tiere mit induzierbarer, zielgerichteter Genexpression im Gehirn. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J., Zhang Zhang, MB Kelz, Steffen C., Ang ES, L. Zeng, Nestler EJ. Induktion der Cyclin-abhängigen Kinase 5 im Hippocampus durch chronische elektrokonvulsive Anfälle: Rolle von ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965 – 71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Enge Begegnungen vieler Art: Fos-Jun-Interaktionen, die die regulatorische Spezifität der Transkription vermitteln. Onkogen 2001; 20: 2438 – 52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronale Anpassung an Amphetamin und Dopamin: molekulare Mechanismen der Prodynorphingenregulation im Rattenstriatum. Neuron. 1995; 14: 813 – 23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontrolle der CCK-Gentranskription durch PACAP in STC-1-Zellen. Am J Physiol Gastrointestleberphysiol. 2000; 279: G605 – 12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminerge Regulation des Cholecystokinin-mRNA-Gehalts im Rattenstriatum. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77 – 83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id-Familie von Transkriptionsfaktoren und Bildung vaskulärer Läsionen. Arterioskler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014 – 20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Co-Anforderung an cyclische AMP- und Calcium-abhängige Proteinkinasen für die transkriptionelle Aktivierung des Cholecystokiningens durch Proteinhydrolysate. J Biol Chem. 2002; 277: 22407 – 13. [PubMed]
Green TA, Alibhai, IN, Unterberg S., Neve RL, Ghose S., Tamminga CA, Nestler EJ. Induktion aktivierender Transkriptionsfaktoren (ATFs) ATF2, ATF3 und ATF4 im Nucleus Accumbens und deren Regulation des emotionalen Verhaltens. J Neurosci. 2008; 28: 2025 – 32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Überlauf von Dopamin und Cholecystokinin im Nucleus Accumbens der Ratte als Reaktion auf akute Medikamentenverabreichung. Synapse 2000; 38: 238 – 42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, FC Nielsen. Mitogen-aktivierte Proteinkinase- und Proteinkinase-A-Signalwege stimulieren die Cholecystokinin-Transkription durch Aktivierung des cyclischen Adenosin-3 ', 5'-Monophosphat-Antwortelement-Bindungsproteins. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Regulation der neuronalen Cholecystokinin-Gentranskription. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61 – 7. [PubMed]
Hansen TV. Cholecystokinin-Gentranskription: Promotorelemente, Transkriptionsfaktoren und Signalwege. Peptide. 2001; 22: 1201 – 11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl und Forskolin regulieren die Cholecystokinin-Genexpression synergistisch durch koordinierte Aktivierung von CREB und des Coaktivators CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15 – 23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Ein Transkriptionsverstärker, der für die Expression des Ratten-Cholecystokinin-Gens wesentlich ist, enthält eine Sequenz, die mit dem -296-Element des humanen c-fos-Gens identisch ist. J Biol Chem. 1990; 265: 15455 – 63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H., Saudou F., Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Wesentliche Rolle des fosB-Gens bei molekularen, zellulären und Verhaltensaktivitäten bei chronischen elektrokonvulsiven Anfällen. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952 – 62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Nachweis der Koexistenz von Dopamin und CCK in meso-limbischen Neuronen. Natur. 1980; 285: 476 – 8. [PubMed]
Hope BT, MB Kelz, Duman RS, Nestler EJ. Chronische Elektrokrampfanfälle (ECS) führen zur Expression eines langlebigen AP-1-Komplexes im Gehirn mit veränderter Zusammensetzung und Eigenschaften. J Neurosci. 1994; 14: 4318 – 28. [PubMed]
Hoffnung BT, Nye HE, Kelz MB, Selbst DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Induktion eines langanhaltenden AP-1-Komplexes aus veränderten Fos-ähnlichen Proteinen im Gehirn durch chronisches Kokain und andere chronische Behandlungen. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminerge Regulation der DNA-Bindungsaktivität des AP-1-Transkriptionsfaktors im Rattenstriatum. Neurowissenschaften 1996; 75: 757 – 75. [PubMed]
Impey S., McCorkle SR, Cha-Molstad H., Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S., Dunn JJ, Mandel G., Goodman RH. Definition des CREB-Regulons: Eine genomweite Analyse der regulatorischen Regionen des Transkriptionsfaktors. Zelle. 2004; 119: 1041 – 54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Was macht CREB an? Zellensignal. 2004; 16: 1211 – 27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Gegenläufige Wirkungen von CCK (A) - und CCK (B) -Antagonisten auf die Entwicklung konditionierter Aktivität bei Ratten. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505 – 512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Nachweis für die Beteiligung des CCK (A) -Rezeptors an der Akquisition konditionierter Aktivität bei Ratten. Brain Res. 1997; 763: 93 – 102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J., Carlezon WA, Jr., Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., DW, Tkatch T., Baranauskas G., Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Die Expression des Transkriptionsfaktors deltaFosB im Gehirn steuert die Empfindlichkeit gegenüber Kokain. Natur. 1999; 401: 272 – 6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W., Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatin-Remodelling ist ein Schlüsselmechanismus, der der Kokain-induzierten Plastizität im Striatum zugrunde liegt. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D., Kreuter JD, Hope BT. Die durch Kokain induzierte CREB-Phosphorylierung in Nucleus Accumbens von mit Kokain sensibilisierten Ratten wird durch die verstärkte Aktivierung extrazellulärer, mit dem Signal in Zusammenhang stehender Kinase, nicht jedoch der Proteinkinase A, J Neurochem. 2005; 95: 1481 – 94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulation der Genexpression und Kokainbelohnung durch CREB und DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: ein molekularer Schalter für die langfristige Anpassung im Gehirn. Gehirn Res Mol Gehirn Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, MB Kelz, Chen JS. ΔFosB: Ein molekularer Mediator für langfristige neuronale und Verhaltensplastizität. Brain Res. 1999; 835: 10 – 17. [PubMed]
Nestler EJ. Gibt es einen gemeinsamen molekularen Weg für die Sucht? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkriptionsmechanismen der Abhängigkeit: Rolle von DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 55. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Perrotti LI, Weber Weaver, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, DJ Knapp, Selley DE, Martin BR, L-Simelle S, Bachtell RK, DW, Nestler EJ. Eindeutige Muster der DeltaFosB-Induktion im Gehirn durch Missbrauchsdrogen. Synapse 2008; 62: 358-69. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Genomweite Ansichten der Chromatinstruktur. Annu Rev. Biochem. 2009; 78: 245 – 71. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Labyrinth I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A., Montgomery RL, Olson DE, Nestler EJ. Delta FosB vermittelt die epigenetische Desensibilisierung des c-fos-Gens nach chronischer Amphetamin-Exposition. J Neurosci. 2008; 28: 7344 – 9. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington ER, 3rd, Labyrinth I, Sikder D., Robison AJ, LaPlant Q, DM Dietz, Russo SJ, V. Vialou, Chakravarty, Kodadek TJ, Stapel A, Kabbaj M, Nestler EJ. Die genomweite Analyse der Chromatinregulierung durch Kokain zeigt eine Rolle für Sirtuine. Neuron. 2009; 62: 335 – 48. [PMC freier Artikel] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinin-Modulation der mesolimbischen Dopaminfunktion: Regulation des motivierten Verhaltens. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404 – 13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C., Rehfeld JF, Nielsen FC. Negative Kooperativität zwischen nebeneinander angeordneten E-Box- und cAMP / TPA-Elementen im Cholecystokinin-Gen-Promotor. FEBS Lett. 1999; 448: 15 – 8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L., Zachariou V., Impey S., Duman RS, Sturm D, Nestler EJ. Regionale und zelluläre Kartierung der CRE-vermittelten Transkription während des Naltrexon-präzipitierten Morphin-Entzugs. J Neurosci. 2002; 22: 3663 – 3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Sturm D, Nestler EJ. Regulation der CRE-vermittelten Transkription im Mausgehirn durch Amphetamin. Synapse 2003; 48: 10 – 7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ICH. Membrandepolarisation und Calcium induzieren die c-fos-Transkription durch Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB. Neuron. 1990; 4: 571 – 82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histon-Modifikationen an Genpromotorregionen im Hippocampus von Ratten nach akuten und chronischen elektrokonvulsiven Anfällen. J Neurosci. 2004; 24: 5603 – 10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulation der Transkriptionsaktivität von DeltaFosB durch Ser27-Phosphorylierung. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Dopamin-CCK-Wechselwirkungen des Nukleus accumbens bei der Belohnung mit Psychostimulanzien und verwandten Verhaltensweisen. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V., Bolanos CA, Selley DE, Theobald D., Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T., O. Berton, Sim-Selley L., DiLeone RJ, A. Kumar, Nestler EJ. ΔFosB: Eine wesentliche Rolle von ΔFosB im Nucleus Accumbens bei der Morphiumwirkung. Nature Neurosci. 2006; 9: 205 – 11. [PubMed]